专利名称：一种基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法
技术领域：
本发明涉及微全分析技术，特别提供了一种基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法。
背景技术：
传统的分析细胞内涵物方法以大量细胞为前提，获取某一内涵物(比如蛋白质，核酸等)含量的总值，该值与细胞数量的比值外推至单细胞内该物质的含量。对于性质相对均一的细胞群来说，此方法可以接受，但在另外一些场合下，比如某些重大疾病的早期阶段，仅有个别细胞的组分发生变化，这时，传统方法将会平均掉该特异变化。因此，单个细胞层面的分析有助于疾病的早期诊断。此外，与传统方法相比，单细胞分析在信息的获取上相对准确；有可能检测活性周期较短的不稳定中间产物。
从技术角度来看，单个细胞的分析可以分为完整的单细胞分析和破碎的单细胞分析。本发明仅涉及后一种技术。在该技术中影响单细胞分析的一个瓶颈问题是如何快速、有效地裂解细胞。目前用于毛细管的细胞裂解的方法主要有化学试剂融膜法、Teala线圈融膜法[xue，Q.，Yeung，E.S.，J.chromatogr.BBiomed.Appl.1996.677，233-240]、脉冲激光融膜法[Sims，C.E.，Meredih，G.D.，Krasieva，T.B.，Bems，M.W.，Tromberg，B.J.，Allbritton，N.L.，Anal.Chem.1998.70，4570-4577]、超声融膜法[Zhang，Z.，Krylov，s.，Arr iaga，E.A.，Polakowski，R.，Dovichi，N.J.，Anal.Chem.2000，72，318-322]、脉冲交变电压法[MaxineA.McClain，Christopher T.Culbertson，Stephen C.Jacobson，NancyL.Allbritton，Christopher E.Sims，J.Michael Ramsey.，Anal.Chem.2003，75，5646-5655]等，但这些方法很难直接应用到微流控芯片的在线快速细胞融膜。
目前文献已经报道的基于微流控芯片的在线快速细胞融膜方法主要有Ramsey[Maxine A.McClain，Christopher T.Culbertson，StephenC.Jacobson，Nancy L.Allbritton，Christopher E.Sims，J.Michael Ramsey.，Anal.Chem.2003，75，5646-5655]等报道的脉冲交流电叠加直流电的快速细胞融膜法，以及方肇伦[Jin Gao，Xue-Feng Yin，Zhao-LunFang.，Lab on a Chip.2004，4，47-52]等报道的通过几组低电压的切换将细胞沉积在通道壁上，然后结合高PH值缓冲液和高电压的快速细胞融膜法。在细胞融膜法中化学试剂法(最常用的是SDS)是最简单的，它不需要其他设备。
微流控芯片(又名芯片实验室，微全分析系统等)作为一种新型分析平台，具有易自动化、集成化程度高等优势，目前在该平台上已经实现的有单细胞的培养，细胞的分离、分选以及细胞的输运、操纵和裂解，但其在单细胞内涵物分析检测方面的工作，世界范围内尚未充分展开。仅有Ramesey等报道[Anal.Chem.1997，69，1564-1568，McClain MA，Culbertson CT，Jacobson SC，Allbritton NL，Sims CE，Ramsey JM]以预先标记了荧光染料的细胞为对象，在玻璃芯片上用缓冲池两端的交变电场实现细胞的破碎和染料的释放，进而完成染料的检测过程。以及方肇伦[Jin Gao，Xue-Feng Yin，Zhao-Lun Fang，Lab on a Chip.2004，4，47-52]通过几组低电压的切换将细胞沉降在通道壁内然后结合高电压及高PH的缓冲液的方法快速裂解人红细胞并检测细胞内的已标记的谷胱甘肽。
现有技术中，用化学试剂裂解细胞的方法是让细胞在流动的过程中裂解，因电泳缓冲液中含有的化学融膜剂SDS必须与存储细胞的生理盐水相互混合并扩散到细胞表面后才能发挥融膜作用，而这一混合过程在微流控芯片中需要较长的时间，且细胞在流动的过程中仅仅通过扩散作用很难接触到SDS，从而导致分离通道的有效长度缩短。
发明内容
本发明涉及微全分析技术，特别提供了一种基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，为微流控芯片在线细胞裂解和内涵物分析提供了一种新的可行的方法。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于将生物素和亲合素体系引入到微流控芯片的单细胞内涵物分析中；把细胞固定在微通道特定位置，然后用化学试剂法裂解；本方法的过程在于(1)首先，在微通道表面制作生物素—亲和素的蛋白吸附微模式，利用生物素和亲和素之间的特异相互作用，介导生物素化的细胞固定在微通道表面的特定位置；(2)然后，用高电压驱动含化学试剂的缓冲液对已经定位的细胞进行裂解，释放内涵物经电泳分离检测。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于本方法以双T型通道的微流控芯片为操作平台，其垂直通道两端的液池分别为细胞池(601)和空池(602)，水平通道两端的液池分别为缓冲池(603)和废液池(604)；在缓冲池(603)和废液池(604)分别接高电压和接地。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于对微通道内壁制作生物素—亲和素的蛋白吸附微模式之前先对其进行氨基化处理。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于在微通道表面制作生物素—亲和素的蛋白吸附微模式，生物素和亲和素特异结合的亲和常数为1015M-1，且每个亲和素分子有4个生物素结合位点。生物素和亲和素特异结合的亲和常数及每个亲和素分子有4个生物素结合位点都是确定的，可以根据公知常识得知。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于在微通道表面制作生物素—亲和素的蛋白吸附微模式，利用生物素和亲和素之间的特异相互作用，可介导生物素化的细胞在微通道表面特异性地定位；生物素和亲和素之间的特异相互作用是当生物素结合了大分子量的分子后，仍可被亲和素识别并结合。这里，生物素和亲和素之间的特异相互作用是本领域专业技术人员公知常识。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于在双T型微流控芯片上操作时，将生物素化的细胞液加入到细胞池(601)中；在缓冲池(603)和废液池(604)两端加入磷酸缓冲液；空池(602)中不加缓冲液。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于细胞池(601)中生物素化的细胞在静压力作用下从细胞池流向空池，流经修饰了亲和素的双T型微流控芯片通道，部分细胞吸附在通道内壁上。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于完成细胞吸附后，移走细胞(601)池中的细胞，在细胞池(601)和空池(602)中加入不等量的缓冲液，在二者之间液面高度差产生的静压力作用下，缓冲液由细胞池(601)流向空池(602)，洗脱溶液中没有吸附或吸附不牢的细胞。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于在缓冲池(603)和废液池(604)中加入含十二烷基磺酸钠和染料的缓冲液并在两端施加高电压；用高电压驱动含化学试剂SDS的缓冲液对定位的细胞进行裂解。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于所述十二烷基磺酸钠的浓度范围是0.1％-0.4％，两端施加的电压亦即电泳电压范围是100-600V/cm。
本发明基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于细胞在SDS作用下原位裂解后释放的细胞内涵物和缓冲液的染料结合，在电场驱动下电泳分离并采用激光焦斑检测实现对细胞内涵物的分析。所述激光焦斑检测对应的电泳分离装置是本领域技术人员可以由现有技术中获得的。
本发明将细胞定位在微通道的特定位置，可以保证融膜试剂与细胞充分接触，细胞融膜时间短，并且无需复杂的装置就可实现单个细胞进样、操作、裂解、内涵物的分离、检测。该方法简单，有效，适用于贴壁和悬浮细胞，为微流控芯片在线细胞裂解和内涵物分析提供了一种新的可行的方法。
图1双T型微流控芯片结构示意图；图2分离单个K562/S细胞的核酸电泳谱图；图3细胞吸附及裂解示意图。
具体实施例方式图形说明图1双T型微流控芯片结构示意图细胞吸附集中在如图1中所示细胞池(601)和空池(602)之间的区域(即双T区域)内。
图2分离单个K562/S细胞的核酸电泳谱图运行条件为缓冲液3umYOYO1，20mMBorate Buffer PH9.2，0.2％SDS。电压1400V，RNA由负向正。
图3细胞吸附及裂解示意图凸起部分为芯片通道，A-D展现了细胞的原位在线裂解过程。A图中有3个细胞吸附在通道壁上，B图中随着含十二烷基磺酸钠的缓冲液流经细胞，细胞膜轮廓模糊，C、D图中细胞已完成裂解。
玻璃芯片先用1M盐酸冲洗10分钟，再水洗10分钟，然后用1M氢氧化钠洗30分钟，水洗10分钟，其后在1％APTS中浸泡10分钟，抽干，在120℃条件下烤30分钟以使通道表面氨基化，水洗后通入0.5毫克每毫升磺酸琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰氨基)己酸盐12小时，抽干，通入0.5毫克每毫升亲和素(avidin)10分钟，抽干，1毫克每毫升磺酸琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰氨基)己酸盐(NHS-LC-Biotin)与细胞(浓度约106个/mL)孵育30分钟后再用磷酸缓冲液清洗两遍。取12ul细胞溶液于细胞池(601)，缓冲池(603)和废液池(604)中加入10ul缓冲液，空池(602)中不加液体。在显微镜下观察，细胞池(601)中的细胞在静压力作用下向空池流动。流经修饰蛋白的通道时，部分细胞吸附在通道壁上(见图1)，移去细胞池(601)中的细胞液，加入12ulPBS缓冲液，在静压力作用下PBS洗掉未吸附在通道壁上的细胞，然后在水平通道的缓冲池(603)和废液池(604)中各加入12ul硼酸缓冲液(内含0.2％SDS和3uMYOYO-I)，芯片放置到倒置的芯片电泳检测装置中的显微镜检测平台上，两端施加280V/cm电压，此时缓冲液体流经双T区时细胞裂解(裂解过程参见附图3)，释放的核酸与缓冲液中的嵌入染料YOYO1结合，选用激光波长488nm的激光器，核酸在缓冲液池和废液池之间的电压驱动下流过激光焦斑，激发的荧光由光电倍增管，经锁相放大后，用Visual Basic(美国Microsoft公司)自行编制的软件进行数据采集，由计算机输入得到如图2所示的电泳谱图。因YOYO1染料只与核酸发生特异性结合，并且只有结合了核酸后才能激发特定波长的荧光，故初步认定图2中所得的谱峰为单个K562/S细胞的核酸谱图。
权利要求
1.一种基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于将生物素和亲合素体系引入到微流控芯片的单细胞内涵物分析中；把细胞固定在微通道特定位置，然后用化学试剂法裂解；本方法的过程在于(1)首先，在微通道表面制作生物素—亲和素的蛋白吸附微模式，利用生物素和亲和素之间的特异相互作用，介导生物素化的细胞固定在微通道表面的特定位置；(2)然后，用高电压驱动含化学试剂的缓冲液对已经定位的细胞进行裂解，释放内涵物经电泳分离检测。
2.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于本方法以双T型通道的微流控芯片为操作平台，其垂直通道两端的液池分别为细胞池(601)和空池(602)，水平通道两端的液池分别为缓冲池(603)和废液池(604)；在缓冲池(603)和废液池(604)分别接高电压和接地。
3.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于对微通道内壁制作生物素—亲和素的蛋白吸附微模式之前先对其进行氨基化处理。
4.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于在双T型微流控芯片上操作时，将生物素化的细胞液加入到细胞池(601)中；在缓冲池(603)和废液池(604)两端加入磷酸缓冲液；空池(602)中不加缓冲液。
5.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于细胞池(601)中生物素化的细胞在静压力作用下从细胞池流向空池，流经修饰了亲和素的双T型微流控芯片通道，部分细胞吸附在通道内壁上。
6.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于完成细胞吸附后，移走细胞(601)池中的细胞，在细胞池(601)和空池(602)中加入不等量的缓冲液，在二者之间液面高度差产生的静压力作用下，缓冲液由细胞池(601)流向空池(602)，洗脱溶液中没有吸附或吸附不牢的细胞。
7.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于在缓冲池(603)和废液池(604)中加入含十二烷基磺酸钠和染料的缓冲液并在两端施加电压；用高电压驱动含化学试剂SDS的缓冲液对定位的细胞进行裂解。
8.按照权利要求7所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于所述十二烷基磺酸钠的浓度范围是0.1％-0.4％，两端施加的电压范围是100-600V/cm。
9.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于细胞在SDS作用下原位裂解后释放的细胞内涵物和缓冲液的染料结合，在电场驱动下电泳分离并采用激光焦斑检测实现对细胞内涵物的分析。
全文摘要
本发明一种基于微流控芯片的细胞内涵物分析方法，其特征在于引入生物素和亲合素体系；把细胞固定在微通道特定位置并用化学试剂法裂解；其过程在于首先在微通道表面制作生物素―亲和素的蛋白吸附微模式，利用生物素和亲和素之间的特异相互作用，介导生物素化的细胞固定在微通道表面的特定位置；然后用高电压驱动含化学试剂的缓冲液对已经定位的细胞进行裂解，释放内涵物经电泳分离检测。本发明可以保证融膜试剂与细胞充分接触，细胞融膜时间短，并且无需复杂的装置就可实现单个细胞进样、操作、裂解、内涵物的分离、检测。本发明方法简单，有效，适用于贴壁和悬浮细胞，为微流控芯片在线细胞裂解和内涵物分析提供了一种新的可行的方法。
文档编号G01N21/17GK1734265SQ200410021600
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月3日 优先权日2004年8月3日
发明者林炳承, 於林芬, 盖宏伟, 沈铮, 马银法 申请人:中国科学院大连化学物理研究所