专利名称：一种检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测分析技术领域中的一种检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
玉米赤霉醇(zeranol，ZER)，属于雷索酸内酯类非甾体类同化激素。ZER作为牛羊促生长剂，能促进蛋白质的合成，能提高胴体瘦肉率及饲料转化率，但它具有弱雌激素作用，在动物组织中的残留会引起人体性机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，还可能致癌。ZER排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染及环境污染。欧盟及我国农业部明确禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖。2002年12月我国农业部公告第235号文规定，在所有食品动物的所有可食组织中不得检出玉米赤霉醇残留。但由于玉米赤霉醇作为牛羊增重剂效果好，经济回报高，违法使用仍很普遍。因此加强对动物性食品中玉米赤霉醇的残留检测是非常必要的。
目前，主要采用仪器分析法检测玉米赤霉醇的残留量，如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)、气-质联机(GC/MS)、液-质联机(HPLC/MS)、毛细管电泳(CE)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。
发明创造内容本发明的目的是提供一种检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒。
本发明所提供的检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒，包括玉米赤霉醇特异性抗体、包被的二抗和酶标玉米赤霉醇。
其中，所述玉米赤霉醇特异性抗体可为玉米赤霉醇单克隆抗体或玉米赤霉醇多克隆抗体；所述玉米赤霉醇单克隆抗体或多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源和豚鼠源抗体，所述玉米赤霉醇单克隆抗体优选为玉米赤霉醇鼠单克隆抗体，所述玉米赤霉醇多克隆抗体优选为玉米赤霉醇兔多克隆抗体。以上抗体均可以用玉米赤霉醇与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)或血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白；所述玉米赤霉醇与载体蛋白的偶联物可通过将玉米赤霉醇和载体蛋白用混合酸酐法进行偶联得到。所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法如戊二醛法，过碘酸盐法交联在玉米赤霉醇上，其中优选为戊二醛法。所述二抗可为抗鼠或抗兔抗抗体。
可作为固定所述二抗的载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。
为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括玉米赤霉醇标准溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液和复溶液。
所述浓缩洗涤液为含有0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液；所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)；所述复溶液为含有2％甲醇的磷酸盐缓冲液。
本发明的检测原理为将二抗吸附于固相载体上，加入样品和酶标玉米赤霉醇，再加入玉米赤霉醇特异性抗体，待测样品中残留的玉米赤霉醇和酶标玉米赤霉醇竞争特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中玉米赤霉醇残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出玉米赤霉醇的含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的玉米赤霉醇标准溶液颜色的比较可判断样品的浓度范围。
本发明的检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物组织、尿样等样品中玉米赤霉醇的残留量；该试剂盒成本低，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；该试剂盒采用高特异性的玉米赤霉醇单克隆抗体或多克隆抗体，主要试剂均以工作液形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品玉米赤霉醇残留检测中发挥重要作用。
图1为检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒的结构示意图具体实施方式
实施例1、抗原及抗体的制备(1)免疫原的合成将玉米赤霉醇和牛血清白蛋白(BSA)采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。
(2)玉米赤霉醇鼠单克隆抗体制备动物免疫程序采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以玉米赤霉醇与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为80-100μg/只，首免时将抗原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
细胞融合与克隆化取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5-10∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106-5×106个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-106个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
(3)玉米赤霉醇兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以玉米赤霉醇与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1mg/kg·b.w.，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10d后采血，测定血清抗体效价，颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
(4)二抗的制备以羊作为免疫动物，以鼠或兔IgG为免疫原进行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗体。
实施例2、检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒(1)检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒的结构试剂盒的结构如图1所示，主要由盒体1、铝膜真空包装96孔/40孔酶标板2、6瓶玉米赤霉醇系列浓度标准品3、酶标记物工作液4、玉米赤霉醇抗体工作液5、底物显色液A液6、底物显色液B液7、终止液8、浓缩洗涤液9、复溶液10和泡沫托架11，泡沫托架11上制有凹孔，上述试剂瓶3-10安放在泡沫托架的凹孔内，泡沫托架11及酶标板2安放在盒体内。其中酶标板2由塑料支架和可拆分的塑料条组成。
(2)所用试剂的配制a.玉米赤霉醇标准溶液玉米赤霉醇系列标准溶液6瓶，1-3ml/瓶。
b.包被缓冲液pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。
c.封闭液3-10％小牛血清。
d.浓缩洗涤液含0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.4)，为正常使用浓度的15-25倍，30-50ml/瓶，1瓶。
e.玉米赤霉醇抗体工作液将抗体稀释成蛋白浓度为0.5-5.0μg/L使用，5-8ml/瓶，1瓶。
f.酶标记物工作液酶标玉米赤霉醇工作液，5-8ml/瓶，1瓶。
g.底物显色液A液过氧化氢或过氧化脲，5-8ml/瓶，1瓶。
h.底物显色液B液邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)，5-8ml/瓶，1瓶。
i.终止液1-2mol/L硫酸或盐酸，5-8ml/瓶，1瓶。
j.复溶液含有2％甲醇的磷酸盐缓冲液，30-50ml/瓶，1瓶。
(3)酶标板的制备用包被缓冲液将抗兔或抗鼠抗抗体稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例3、样品的前处理(1)动物组织称取5g匀浆后的样品，加入10ml醋酸钠缓冲液和25μl β-葡萄糖醛酸酶，涡动1min，然后37℃过夜。加入8ml乙醚，涡动3min后，3000rpm离心10min。重复一次。将醚相合并，40℃氮气吹干。残留物溶于1ml氯仿中，用2.5ml1M NaOH溶液萃取两次，合并萃取液，涡动1min后，3000rpm离心10min。保留水相，加入0.5ml 12M磷酸盐缓冲液，然后用C18柱纯化，得到待测样品溶液。
(2)尿样取0.5ml尿液，加入3ml 50mM醋酸钠缓冲液，pH4.8，加入8μl β-葡萄糖醛酸酶，37℃孵育3h，然后用C18柱纯化，得到待测样品溶液。
实施例4、检测牛尿样品中残留的玉米赤霉醇(1)取适量新鲜或解冻后的供试尿液，6000rpm离心10min，取上清液过0.45μm滤膜。取500μl尿液加入3ml 50mM pH4.8的醋酸钠缓冲液。加入8μl β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶，涡动30s，37℃恒温箱中静置3h。然后用C18柱纯化。
(2)用3ml 100％甲醇活化C18柱，流速控制在1滴/秒。用2ml 50mM pH4.8的醋酸钠缓冲液淋洗C18柱。加入500μl经步骤(1)提取后的尿液样品。用2ml 50mM pH4.8的醋酸钠缓冲液洗涤C18柱。用3ml 40％的甲醇溶液洗涤C18柱，正压吹干。用1ml 80％的甲醇溶液洗脱并收集滴出液，正压吹干滴尽后的C18柱，以收集完全。60℃下氮气吹干，向吹干后的收集瓶中加入500μl复溶液，涡动30s，作为试样溶液，供ELISA方法测定。
(3)样品检测向用羊抗鼠抗抗体包被的96孔酶标板微孔中加系列标准溶液或样品溶液50μl，然后加入玉米赤霉醇鼠单克隆抗体工作液50μl，再加入辣根过氧化物酶标记玉米赤霉醇工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应1h。倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，30秒后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。每孔加入底物显色液A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15-30min。每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值(OD值)。
本实施例所用的试剂均按照实施例2中的试剂配制方法进行配制。
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100，即百分吸光度值。
公式中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。以玉米赤霉醇浓度(μg/L)的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，相对应每一个样品的浓度(μg/L)可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。整个检测过程只需2.5小时就可以完成，最低检测限为0.3μg/L。
实施例5、试剂盒精密度、准确度和保存期试验(1)试剂盒精密度试验标准可重复性从三批酶联板中，每板各抽出20个微孔，测定同一浓度标准溶液的吸光度值(OD值)，重复测定10次，计算变异系数。结果表明变异系数范围在8-15％。
样品可重复性取不同浓度的玉米赤霉醇标样，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次。分别计算板内，批内，批间变异系数。结果表明牛肉的变异系数均低于18％，羊肉的变异系数均低于18％，牛尿样和羊尿样的变异系数均低于15％。
(2)试剂盒的准确度取4个浓度的玉米赤霉醇标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度设4个平行，分别计算回收率。结果表明牛肉为40-120％，羊肉为40-120％，牛尿样为60-110％，羊尿样为60-110％。
(3)试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、玉米赤霉醇添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。
权利要求
1.一种检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒，包括玉米赤霉醇特异性抗体及包被的二抗和酶标玉米赤霉醇。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括玉米赤霉醇标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液和复溶液。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述玉米赤霉醇特异性抗体为玉米赤霉醇单克隆抗体或玉米赤霉醇多克隆抗体；它们均是用玉米赤霉醇与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的。
4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血兰蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
6.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述二抗为抗鼠或抗兔抗抗体。
7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为含有0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
9.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述复溶液为含有2％甲醇的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒，包括玉米赤霉醇特异性抗体及包被的二抗和酶标玉米赤霉醇。本发明的检测玉米赤霉醇的酶联免疫试剂盒成本低，能同时快速检测大批样品；主要试剂均以工作液形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品玉米赤霉醇残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/547GK1563993SQ20041002980
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月25日 优先权日2004年3月25日
发明者沈建忠, 史为民, 王鹤佳, 张素霞, 丁双阳, 江海洋 申请人:中国农业大学