专利名称：快速鉴定小麦品种的毛细管电泳方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦品种的快速鉴定方法，特别是通过毛细管电泳手段快速鉴定小麦品种的方法。
背景技术：
小麦是世界最重要的粮食作物之一，在三大作物中年总产量超仅次于玉米。小麦也是人类粮食消费中重要的蛋白质来源。我国一直是世界小麦生产和消费大国，2002年播种面积2350万km2，总产8929万吨，居世界第一位。近年来我国随着市场经济的不断发展，在小麦种子生产与经营、新品种选育和品种权益保护以及流通加工等领域急需快速高效的小麦品种鉴定方法。目前，鉴定小麦品种主要采用形态鉴定、同工酶鉴定、贮藏蛋白SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)鉴定、反相高效液相色谱(RP-HPLC)鉴定、分子标记鉴定等方法。然而上述些方法均存在不同程度的局限性，如形态特征易受环境因素影响，可靠性差；同工酶、蛋白质电泳分离时间长，费工费时，多数情况下需要1-2天才能获得分析结果，而且分辨率低，对一些亲缘关系近的品种往往无法区分，其分辨度和重复性也较差，难以进行数量化分析和不同实验室所得结果间的比较，另外PAGE方法还须使用有神经毒性的丙烯酰胺以及其他污染试剂；RP-HPLC虽自动化程度高，但仪器设备昂贵，分析成本高，分辨率也难以满足需要；DNA分子标记技术，如PCR、RAPD、AFLP等，近年来研究较多，准确性较高，但技术复杂，费工费时，鉴定成本高，难以广泛应用。因此，现有的小麦品种鉴定方法还不能快速高效地对小麦品种作出鉴定。
小麦种子贮藏蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白组成，它们在组成上具有高度的异质性和复杂性。醇溶蛋白A-PAGE是目前常用的实验室鉴定技术，国际种子检验协会(ISTA)在1987年公布了小麦和大麦品种鉴定A-PAGE标准方法(Draper，1987)。醇溶蛋白是单体蛋白，分子量约在30000-80000道尔顿之间，在单向酸性凝胶电泳条件下，一个品种一般可分离出15-30个组分，双向电泳可分离出多达50个组分，根据其相对迁移率可分为α、β、γ和ω四种醇溶蛋白，它们分别占其总量的25％、30％、30％和15％。醇溶蛋白由1、6部分同源染色体上的Gli-1和Gli-2位点编码，具有很高的多态性，目前已鉴定并命名了100多个等位基因(Metakovsky，1991)。醇溶蛋白组成由基因型决定，不受环境因素的影响，因此可作为鉴定品种的可靠遗传标记。由于醇溶蛋白组成异质性很高，高效的分离技术是品种鉴定的关键。毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis，CE)是近年来分离科学发展起来的一项新技术(Landers，1991；Xu，1993；Bean and Lookhart，2001)，在小麦蛋白质分离和品种鉴定中具有独特的优越性，应用前景广阔。目前毛细管电泳的主要模式是毛细管区带电泳(Capillary Free Zone Electrophoresis，CFZE)，又称毛细管自由电泳，是CE中最基本、应用最普遍的一种分离模式。
毛细管电泳的仪器装置主要包括五个部分高压电源、进样系统、毛细管柱、检测器和记录系统。制作毛细管的材料——熔融硅胶的等电点(pI)为1.5左右，在碱性和微酸性(PH＞2.5)溶液中，熔硅表面的硅羟基(Si-OH)电离成SiO-，使其内表面带负电。负电荷表面在溶液中积聚相反电荷的离子，在管壁和溶液之间形成双电层。在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起的流体整体将朝负极方向移动，该现象被称为电渗(Electroosmosis)。粒子在毛细管内一方面受到电场作用而在缓冲溶液中发生定向移动，即电泳；另一方面受到电渗的影响。粒子最终的迁移速度等于电泳流和电渗流的矢量和。样品中的正离子电泳方向与电渗流方向一致，故最先流出；中性粒子仅在电渗流的作用下流向负极，速度较正离子慢；负离子运动方向与电渗相反，在电渗速度大于电泳速度时，将在中性粒子之后流出，如果负离子泳流速度大于渗流速度，则无法流出。一般来说，电渗流速度大于电泳速度，所以样品中所有组分将朝一个方向移动，这样各种粒子因在毛细管介质中的迁移速度不同实现了分离。影响毛细管区带电泳分离效果的因素较多，主要包括操作电压、温度、缓冲溶液的类型与浓度、pH值、添加剂的选择与浓度的确定，毛细管柱的改性等。在实际应用中，需要针对的具体检测物对这些因素进行优化，以达到最佳分离效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴定小麦品种的毛细管电泳方法，其主要通过小麦种子贮藏蛋白中醇溶蛋白的高效分离与鉴定实现对小麦种子的鉴定，相对于现有的鉴定技术方法，其具有快速、准确、成本低、可重复性好的特点。
本发明的技术方案包括取样及样品制备、毛细管电泳和数据处理分析，其特征是高效毛细管电泳时的电泳缓冲液(buffer)为100-120mm磷酸-甘氨酸缓冲液，该缓冲液pH为2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为毛细管长度25-26cm毛细管内径25μm，50μm运行电压11-15kV毛细管温度35-40℃样品槽温度10-15℃进样8-10kV，5-10sec在上述的技术方案中，为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进行高效毛细管电泳时，对毛细管进行冲洗必须按冲洗程序操作，按照冲洗目的的不同，冲洗程序具体分为以下四种情况(1)对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下H2O 4-6min0.1MNaOH 9-12minH2O 4-6min1MH3PO48-12minBuffer60-70min(2)进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下H2O 5-10min0.1MNaOH 6-8minH2O 5-10min1MH3PO46-8minBuffer25-30min(3)当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗程序如下1MH3PO42-4minH2O 2-3minBuffer1.5-3min(4)检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下1MH3PO44-6minH2O 4-6min0.1MNaOH 2-4minH2O 10-20minN29-11min
本发明的优点是(1)样品用量少只需半粒种子约15mg即可进行多次分析，而且样品可保存一个月以上。利用本方法可在20min内完成一个样品的分离，效率明显高于常规的A-PAGE方法。
(2)分辨度高一个品种一般可分离出25-40个蛋白组分，常规A-PAGE方法只有15-25个组分，而且图谱稳定，不受生长环境、种植年份和贮藏时间(室温5年)的影响。对一些亲缘关系很近以及A-PAGE图谱相同的品种，用本方法仍能有效鉴定。
(3)重复性高峰迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)分别小于0.5％和4％。从进样到结果分析自动化程度高，简便易于操作。
(4)从样品制备到蛋白质分离分析方法简单，每次可连续分离30个样品，均由软件控制。而且分析成本低，只需廉价毛细管和一些常用试剂，用量很少，无毒害，对环境无污染。
图1.普通小麦品种“京411”醇溶蛋白毛细管电泳标准图谱；图2.中国春等七种不同小麦品种醇溶蛋白毛细管电泳比较图谱；图3.中品3号等四种不同小麦品种醇溶蛋白毛细管电泳比较图谱。
具体实施例方式
实施例1指纹标准图谱的构建(1)取样及样品制备取小麦品种“京411”单粒种子，用刀片去掉胚端，准确称量后用硫酸纸和小铁锤扎碎成细粉，放入1ml离心管中；按1mg加7μl的比例加入30％乙醇，室温下震荡提取15min，10000rpm离心10min，上清液用于毛细管电泳(可在4℃下保存4周以上)。
(2)毛细管电泳
①仪器设备采用Bio-Rad公司生产的BioFocus 3000型高效毛细管电泳仪系统(配有软件用于系统操作和数据处理)进行CE分析。
②毛细管弹性石英毛细管柱，内径为25μm、长度为25.5cm(检测长度20cm)，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。
③电泳缓冲液100mm磷酸-甘氨酸缓冲液(pH2.50，添加有20％乙腈和0.05％羟脯氨酰甲基纤维素HPMC)。500ml磷酸-甘氨酸缓冲液的制备方法85％的磷酸1.6ml，甘氨酸2.0g，乙腈100ml，HPMC 0.25g，加入双蒸水定容至500ml，调节pH为2.50，经0.45μm滤膜过滤，4℃保存。
④毛细管柱冲洗方法A.新毛细管预处理程序H2O5min0.1MNaOH9minH2O5min1MH3PO48minBuffer 60minB.进样前冲洗H2O5min0.1MNaOH6minH2O5min1MH3PO46minBuffer 25minC.样品间冲洗程序1MH3PO44minH2O2minBuffer 3minD.结束实验冲洗1MH3PO45minH2O5min0.1MNaOH2minH2O15minN210min⑤电泳参数运行电压 15kV
毛细管温度40℃样品槽温度15℃进样 8kV，5sec电极 由+向-⑥数据处理利用软件进行数据处理，同时将电泳结果转换成ASC码，进行Excel处理分析。
(3)指纹图谱构建对需鉴定的品种和杂交种及亲本，构建标准指纹图谱。
获得小麦品种“京411”的标准图谱如图1所示，从图中可分析不同蛋白组分。
实施例2利用本发明构建标准图谱及对小麦品种进行鉴定。
(1)取样及样品制备选取中国春(Chinese Spring)等七种小麦品种或亲本与杂交种种子，按实施例1中方法提取醇溶蛋白，4℃保存。
(2)毛细管电泳分离①仪器设备采用Bio-Rad公司生产的BioFocus 3000型高效毛细管电泳仪系统(配有软件用于系统操作和数据处理)进行CE分析。
②毛细管弹性石英毛细管柱，内径为50μm、长度为25cm(检测长度20cm)，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。
③电泳缓冲液110mm磷酸-甘氨酸缓冲液(pH2.60，添加有18％乙腈和0.04％羟脯氨酰甲基纤维素HPMC)。按实施例1中方法制备缓冲液，经0.45μm滤膜过滤，4℃保存。
④毛细管柱冲洗方法A.新毛细管预处理程序H2O4min0.1MNaOH12minH2O4min1MH3PO410minBuffer 65minB.进样前冲洗H2O8min0.1MNaOH7min
H2O 8min1MH3PO47minBuffer 27min.
C.样品间冲洗程序1MH3PO42minH2O 3minBuffer 1.5minD.结束实验冲洗1MH3PO44minH2O 4min0.1MNaOH 3minH2O 10minN211min⑤电泳参数运行电压11kV毛细管温度35℃样品槽温度10℃进样 9kV，8sec电极 由+向-⑥数据处理利用软件进行数据处理，同时将分离数据转换成ASC码保存，用Excel格式作图，进行重叠比较与鉴定。
(3)标准图谱构建对选定品种和杂种品种及其亲本建立标准毛细管电泳图谱，每个标准品种重复电泳20-30次，计算峰迁移时间、峰高、峰面积的相对标准偏差(RSD)，获得各个醇溶蛋白组分的平均值和标准差，作为品种真实性和纯度鉴定或品种权保护的比较标准。
(4)品种鉴定如进行品种真实性和品种权保护鉴定，随机取样分析10粒种子，每个样品重复分离3次。品种纯度鉴定随机取50-100粒种子，重复分离3次，然后与标准图谱比较，计算品种纯度。
中国春等七种不同小麦品种醇溶蛋白毛细管电泳比较图谱如图2所示。实施例3利用本发明构建标准图谱及对小麦品种进行鉴定。
(1)取样与样品制备选取中品3号等四种小麦品种或亲本与杂交种鉴定，按实施例1中方法提取醇溶蛋白，4℃保存。
(2)毛细管电泳分离①仪器设备采用Bio-Rad公司生产的BioFocus 3000型高效毛细管电泳仪系统(配有软件用于系统操作和数据处理)进行CE分析。
②毛细管弹性石英毛细管柱，内径为50μm、长度为26cm(检测长度20cm)，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。
③电泳缓冲液120mm磷酸-甘氨酸缓冲液(pH2.80，添加有22％乙腈和0.06％羟脯氨酰甲基纤维素HPMC)。按实施例1中方法制备缓冲液，经0.45μm滤膜过滤，4℃保存。
④毛细管柱冲洗方法A.新毛细管预处理程序H2O6min0.1MNaOH12minH2O6min1MH3PO412minBuffer 70minB.进样前冲洗H2O10min0.1MNaOH8minH2O10min1MH3PO48minBuffer 30minC.样品间冲洗程序1MH3PO43minH2O3minBuffer 30minD.结束实验冲洗1MH3PO46minH2O6min0.1MNaOH4minH2O20minN211min⑤电泳参数运行电压 12kV
毛细管温度37℃样品槽温度12℃进样 10kV，10sec电极 由+向-⑥数据处理利用软件进行数据处理，同时将分离数据转换成ASC码保存，用Excel格式作图，进行重叠比较与鉴定。
(3)标准图谱构建对选定品种和杂种品种及其亲本建立标准毛细管电泳图谱，每个标准品种重复电泳20-30次，计算峰迁移时间、峰高、峰面积的相对标准偏差(RSD)，获得各个醇溶蛋白组分的平均值和标准差，作为品种真实性和纯度鉴定或品种权保护的比较标准。
(4)品种鉴定如进行品种真实性和品种权保护鉴定，随机取样分析10粒种子，每个样品重复分离3次。品种纯度鉴定随机取50-100粒种子，重复分离3次，然后与标准图谱比较，计算品种纯度。
中品3号等四种不同小麦品种醇溶蛋白毛细管电泳比较图谱如图3所示。
权利要求
1.一种快速鉴定小麦品种的毛细管电泳方法，包括取样及样品制备、毛细管电泳和数据处理分析，其特征是高效毛细管电泳时的电泳缓冲液为100-120mm磷酸-甘氨酸缓冲液，该缓冲液pH为2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为毛细管长度25-26cm毛细管内径25μm，50μm运行电压11-15kV毛细管温度35-40℃样品槽温度10-15℃进样8-10kV，5-10sec。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳方法，其特征是为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进行高效毛细管电泳时，对毛细管进行冲洗必须按冲洗程序操作，按照冲洗目的的不同，冲洗程序具体分为以下四种情况(1)对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下H2O 4-6min0.1M NaOH 9-12minH2O 4-6min1M H3PO48-12minBuffer 60-70min(2)进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下H2O 5-10min0.1M NaOH 6-8minH2O 5-10min1M H3PO46-8minBuffer 25-30min(3)当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗程序如下1M H3PO42-4minH2O 2-3minBuffer1.5-3min(4)检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下1M H3PO44-6minH2O 4-6min0.1M NaOH 2-4minH2O 10-20minN29-11min。
3.根据权利要求2所述的毛细管电泳方法，其特征在于通过本发明能够建立小麦醇溶蛋白的标准毛细管图谱，进而形成对小麦品种进行鉴定的一套完整的技术体系。
全文摘要
本发明涉及一种小麦品种的快速鉴定方法，特别是通过毛细管电泳手段快速鉴定小麦品种的方法。小麦种子贮藏蛋白中醇溶蛋白具有高度的异质性，醇溶蛋白组成由基因型决定，不受环境因素的影响，因此可作为鉴定品种的可靠遗传标记。本发明的提供快速鉴定小麦品种的毛细管电泳方法，主要通过小麦种子贮藏蛋白中醇溶蛋白的高效分离与鉴定实现对小麦种子的鉴定，相对于现有的鉴定技术方法，其具有快速、准确、成本低、可重复性好的特点。
文档编号G01N30/38GK1570622SQ20041003725
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月30日 优先权日2004年4月30日
发明者晏月明, 余建中, 胡英考, 蔡民华, 姜怡, 郑继刚, 安学丽 申请人:首都师范大学