专利名称：一种提取样品中原核微生物dna的方法及其专用试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种提取样品中原核微生物DNA的方法及其专用试剂。
背景技术：
聚合酶链反应(PCR)是一种体外核酸扩增技术，在分子生物学和医学领域得到广泛应用。PCR检测技术的第一步是模板DNA的制备，即样本中DNA的提取，直接影响PCR反应的结果。随着PCR技术的发展，已经有许多提取基因组DNA的方法。但是要从现场的环境标本如土壤、灰尘和污水中，快速检测致病微生物，由于模板量少，并且含有大量PCR抑制剂，往往使实验的敏感性大大降低。长期以来，样本中DNA的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程。为提高PCR实验的敏感性，许多实验室开始研究提取纯化DNA的实验方法，近年来常以二氧化硅作固相吸附剂提取DNA，如玻璃奶法，硅胶树脂型离心柱法等。利用二氧化硅在高离子强度、低pH值条件下吸附DNA，用洗涤液洗掉吸附在二氧化硅表面的其它杂质，再用低离子强度、高pH值缓冲液洗脱吸附在二氧化硅表面上的DNA分子，用于分子生物学实验。这些方法避免使用酚-氯仿抽提，但仍需乙醇沉淀、蛋白酶处理，步骤比较烦琐，不适合现场环境标本应用。1997年英国科学家研究了抗-DNA单克隆抗体与免疫磁珠结合的方法提取DNA，收到较好的效果(Adrian R.Gelsthorpe，Keith Gelsthorpe and Robert J Sokol.Extractionof DNA Using Monoclonal Anti-DNA and Magnetic Beads.BioTechniques，1997，221080-1082)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种提取样品中原核微生物DNA的方法及其专用试剂，该方法及其专用试剂尤其适合于提取环境样品，如土壤、灰尘和污水中的原核微生物DNA。
本发明所提供的提取样品中原核微生物DNA的专用试剂，是胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体；所述抗-DNA单克隆抗体是以原核微生物基因组DNA与沙门氏菌(密尼苏达株)的偶联物作为抗原免疫小鼠得到的。
所述小鼠可为BALB/C小鼠。
所述原核微生物包括细菌、放线菌和蓝细菌。所述原核微生物基因组DNA优选为细菌基因组DNA，尤其优选为大肠杆菌基因组DNA。
所述胶体金可按常规方法如柠檬酸盐还原法制备，其颗粒大小可为20-35nm，优选为25-30nm。
所述胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体可按如下方法制备在30ml pH8.2的所述胶体金溶液中加入650ul 1mg/ml的所述抗-DNA单克隆抗体溶液，搅拌30min，然后加入10％BSA(牛血清白蛋白)3ml搅拌30min，再加入10％PEG(聚乙二醇)0.6ml搅拌30min，于3000rpm 4℃离心10min，将得到的上清液于10000rpm 4℃离心25min，在得到的沉淀中加保存液(四硼酸钠0.4g/ml，BSA 1g/ml，NaN30.1g/ml，用HCl调PH值为7.4)30ml，混匀，9500rpm 4℃离心25min，在得到的沉淀中加保存液重溶至3ml，即得到胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体(免疫胶体金)。
本发明所提供的提取样品中原核微生物DNA的方法，包括以下步骤1)裂解样品中的原核微生物细胞，得到含有原核微生物DNA的裂解液；2)利用胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体吸附步骤1)中得到的裂解液中原核微生物DNA。
可通过常规方法裂解环境样品中的原核微生物细胞，如用NaI裂解细胞。
该方法中还包括纯化DNA的步骤用含3％FCS(小牛血清)的生理盐水及无菌纯水清洗所述胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体吸附的DNA，可以有效去除PCR抑制剂。
本发明根据抗-DNA单克隆抗体可以特异性的吸附双链DNA的特性，制备了可以特异性结合DNA的免疫胶体金试剂(胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体)，并提供了利用该免疫胶体金试剂提取纯化样品中细菌DNA的方法。实验表明免疫胶体金可与DNA牢固结合，通过离心可将其富集起来，用含3％FCS(小牛血清)的生理盐水及灭菌纯水清洗可以有效去除PCR抑制剂。应用该方法可以从每mL含几个菌的稀释菌液中获得高质量的扩增产物，并可以在每0.25g土壤中最低检测到50个菌，在每mL含10％牛奶的样本中最低检测到几个类鼻疽菌，大大提高了PCR的敏感性。与目前常用的商品化的玻璃奶和离心柱(硅胶树脂膜)法比较，效果基本一致。玻璃奶法在检测土壤和牛奶标本时，在模板量少的时候存在许多非特异扩增，影响结果的观察。离心柱法检测效果较好，但其步骤比较繁琐并需要蛋白酶K处理样本。本发明的方法简单，只需3步裂解→结合→清洗，40min就可获得PCR反应所需DNA，结合了DNA的免疫胶体金不需洗脱，可直接用于PCR反应。整个过提取过程不需使用有机溶剂，避免了环境污染。免疫胶体金溶液在4℃可以存放1-2个月，将其冻干后可于室温长期存放，因而为该方法广泛应用于核酸提取提供了条件。
本发明的方法及其专用试剂可用于不同原核微生物样品特别是细菌样品DNA的提取，可有效去除环境样品中PCR抑制剂，浓缩模板，提高PCR检测敏感度3-4个数量级；操作步骤简单，无需使用有机溶剂，避免了环境污染，吸附有DNA的免疫胶体金可直接用于PCR扩增；尤其是在样本含量少、存在大量PCR抑制剂时，更有效提高PCR技术在检测现场环境标本中的敏感性和实用性。
图1a为用胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体提取的系列稀释类鼻疽伯克霍尔德菌菌液的DNA进行PCR扩增得到的产物电泳图谱图1b为以系列稀释类鼻疽伯克霍尔德菌菌液直接进行PCR扩增得到的产物电泳图谱图2a为以用免疫胶体金法和玻璃奶法提取的系列稀释类鼻疽伯克霍尔德菌菌液DNA为模板进行PCR扩增得到的产物电泳图谱图2b为以用免疫胶体金法和玻璃奶法提取的土壤模拟标本DNA为模板进行PCR扩增得到的产物电泳图谱图2c为以用免疫胶体金法和玻璃奶法提取的牛奶模拟标本DNA为模板进行PCR扩增得到的产物电泳图谱图3a为以用免疫胶体金法和离心柱法提取的系列稀释类鼻疽伯克霍尔德菌菌液DNA为模板进行PCR扩增得到的产物电泳图谱图3b为以用免疫胶体金法和离心柱法提取的土壤模拟标本DNA为模板进行PCR扩增得到的产物电泳图谱图3c为以用免疫胶体金法和离心柱法提取的牛奶模拟标本DNA为模板进行PCR扩增得到的产物电泳图谱具体实施方式
实施例1、胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体的制备1、抗-DNA单克隆抗体的制备(1)抗原的合成用按常规方法提取的大肠杆菌DH5α染色体DNA按照如下方法与沙门氏菌(密尼苏达株)(中国人民解放军全军菌种保藏中心)37℃偶联30min，得到抗原。
(2)抗-DNA单克隆抗体的制备采用BALB/C小鼠作为免疫动物，以步骤(1)中合成的抗原为免疫原，剂量为50μg(0.1mL)加等体积完全福氏佐剂乳化，进行首次皮下多点注射免疫。一月后，取同样量免疫抗原加不完全福氏佐剂，乳化，进行加强免疫，再过一月后免疫抗原不加佐剂腹腔注射进行加强免疫，之后5天采血，测定抗体效价。取脾细胞按4∶1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释或软琼脂平板法筛选杂交瘤细胞，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1-5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5-106个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
以大肠杆菌DNA(75mg/ml)包被酶标板，以羊抗鼠IgG-HRP(1∶2000稀释)为二抗，进行间接酶联免疫试验(ELSIA)检测腹水，结果表明抗体可以与DNA发生强阳性反应，腹水效价为1∶10000。
2、胶体金的制备参照文献(严杰，罗海波，陆德源主编.现代微生物学实验技术及其应用，人民卫生出版社，1997)，采用柠檬酸盐还原法，具体操作方法如下将HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到约25-30nm大小的胶体金颗粒溶液。
3、胶体金的标记参照文献(严杰，罗海波，陆德源主编.现代微生物学实验技术及其应用，人民卫生出版社，1997)，将步骤2中得到的胶体金溶液的pH调至8.2，将步骤1中得到的单抗溶至1mg/ml，取650ul加入到30ml的胶体金溶液中，不断搅拌30min，然后加入10％BSA(牛血清白蛋白)3ml搅拌30min，再加入10％PEG(聚乙二醇)0.6ml搅拌30min，于3000rpm 4℃离心10min，收集上清，将上清于10000rpm 4℃离心25min，用枪头吸弃上清，在沉淀中加保存液(四硼酸钠0.4g/ml，BSA 1g/ml，NaN30.1g/ml，用HCl调PH值为7.4)30ml，混匀，9500rpm 4℃离心25min，用枪头吸弃上清，加保存液重溶至3ml，即为制备好的免疫胶体金，4℃保存备用。
实施例2、检测样品中的类鼻疽伯克霍尔德菌材料1.氯金酸(HAuCl4) 购自上海试剂厂。
2.玻璃奶 购自博大泰克公司。
3.离心柱 购自天为时代公司基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。
4.实验菌株 类鼻疽伯克霍尔德菌350102株(中国医学细菌保藏管理中心，350102)。
5.引物设计与合成 根据Burkholderia pseudomallei ferricuptake regulatorgene设计引物(宋亚军，王津，张敏丽等.类鼻疽伯克霍尔德菌UDPE检测方法的建立和应用，中国人兽共患病杂志，2001，17(2)35)，只取其巢式PCR的一对内引物Fup2和Fdown2，扩增长度为409bp，由华美公司合成。
6.PCR反应体系 天为时代公司2×Taq PCR MasterMix。
一、提取DNA1、系列稀释菌液和模拟标本的制备系列稀释菌液以类鼻疽伯克霍尔德菌为检测样本，比浊法测定其浓度为5.4×1010菌/mL。按常规方法将菌液以水进行10倍梯度稀释，各取1ml备用。
模拟土壤污染标本取0.25g土壤，加各浓度梯度菌液100ul，生理盐水400ul，混匀，加6M NaI 500ul，共1ml。
模拟牛奶污染标本市售纯牛奶(伊利)100ul，加菌液100ul，生理盐水300ul，混匀，加6M NaI 500ul，共1ml。
2、提取原核微生物DNA(1)免疫胶体金法提取DNA取步骤1中的系列稀释菌液或模拟标本1ml，100℃水浴10min。然后12000rpm离心5min，收集上清液。在上清中加入实施例1中制备的胶体金标记的单抗10ul，混匀，于室温下至微量振动器上振动15min。9500rpm离心10min或12000rpm离心5min，吸弃上清，用含3％FCS(小牛血清)的生理盐水1mL及灭菌纯水各洗一次，保留沉淀。将沉淀加入PCR反应液中，直接进行扩增。
(2)玻璃奶法提取DNA实验按试剂盒说明操作取步骤1中的系列稀释菌液或模拟标本1ml，100℃水浴10min。然后12000rpm离心5min，收集上清液。取200ul上清液，加入3倍体积溶胶液和10ul玻璃奶，混匀，室温下放置10min，用250ul漂洗液清洗两次，离心吸干漂洗液，然后于37℃温箱干燥至沉淀成白色，约15-20min，加20ul洗脱缓冲液混匀，60℃水浴5min，12000rpm离心1min，回收上清备用。
(3)离心柱法提取DNA取步骤1中的系列稀释菌液或模拟标本1ml，100℃水浴10min。然后12000rpm离心5min，收集上清液。取200ul上清液，加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液混匀，加220ul缓冲液GB，充分混匀，70℃放置10min，再加入220ul无水乙醇，充分混匀，将其全部加入一个吸附柱CB中(吸附柱放入废液收集管中)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。加入500ul去蛋白液GD，12000rpm离心30s，弃掉废液，分别加入漂洗液GW 700ul，12000rpm离心30s，弃掉废液，500ul，12000rpm离心30s，弃掉废液，再12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱转入一个干净的离心管中，加入20ul 60℃水浴预热的洗脱缓冲液，混匀，室温放置2-5min，12000rpm离心30s，离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min。
二、PCR反应PCR反应(2×TaqPCR MasterMix)按试剂盒说明操作。每管反应体系为20ul2×TaqPCR反应液10ul，引物各0.2ul(25uM)，灭菌纯水5.6ul，模板4ul。循环参数为94℃×3min；94℃×40s→58℃×40s→72℃×40s 35个循环；72℃×7min。其中，模板为系列稀释菌液或免疫胶体金法提取的DNA或玻璃奶法提取的DNA或离心柱法提取的DNA。用琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察结果。
以免疫胶体金法提取的系列稀释菌液DNA为模板和以系列稀释菌液为模板进行PCR扩增，得到的产物的电泳结果分别如图1a和图1b所示，表明使用免疫胶体金法可以获得高质量的扩增产物(可以检测到5.4个菌/mL)，比直接扩增(最低可检测浓度为5.4×104个菌/mL)敏感性提高10000倍。图1a中，左起第一孔为Maker(DL2000)，第二孔到第八孔含菌量依次为5.4×104，5.4×103，5.4×102，5.4×101，5.4，0.54，0个菌/mL；图1b中，左起第一孔为Maker(DL2000)，第二孔到第五孔含菌量依次为5.4×104，5.4×103，5.4×102，5.4×101个菌/mL。
以免疫胶体金法或玻璃奶法提取的稀释菌液，土壤和牛奶模拟标本DNA为模板进行PCR扩增，得到的产物的电泳结果如图2a、图2b和图2c所示，表明在分别对系列稀释菌液和土壤、牛奶模拟标本的检测中，应用胶体金法可以达到这两种商品化试剂盒的检测效果，免疫胶体金法最低可检测浓度分别为100菌/mL、101菌/mL、100菌/mL，玻璃奶法最低检测浓度分别为101菌/mL、101菌/mL、100菌/mL；免疫胶体金法在0.25g/mL的土壤溶液中可以检测到约50个菌，每mL10％的牛奶标本中可以检测到几个菌。图2a、图2b和图2c中，上排为免疫胶体金法，下排为玻璃奶法检测结果；M为Maker(DL2000)；105，104，103，102，101，100和10-1分别表示5.4×105，5.4×104，5.4×103，5.4×102，5.4×101，5.4，0.54和0个菌/mL；阴表示以水作为阴性对照。
以免疫胶体金法或离心柱法提取的稀释菌液，土壤和牛奶模拟标本DNA为模板进行PCR扩增，得到的产物的电泳结果如图3a、图3b和图3c所示，表明免疫胶体金法最低检测浓度分别为100菌/mL、101菌/mL、100菌/mL，离心柱法最低检测浓度分别为100菌/mL、101菌/mL、100菌/mL。图3a、图3b和图3c中，上排为免疫胶体金法，下排为离心柱法检测结果；M为Maker(DL2000)；106，105，104，103，102，101，100和10-1分别表示5.4×106，5.4×105，5.4×104，5.4×103，5.4×102，5.4×101，5.4，0.54和0个菌/mL。
实施例3、检测土拉弗朗西斯菌具体方法同实施例2，其中，土拉弗朗西斯菌410062株(中国医学细菌保藏管理中心，410062)依次稀释至3×106，3×105，3×104，3×103，3×102，3×101，3个菌/mL，以免疫胶体金法提取的系列稀释菌液DNA为模板和以系列稀释菌液为模板进行PCR扩增(扩增引物FT393和FT642根据Francisella tularensis 17kDa majormembrane protein(TUL4)gene设计(Anders sjostedt，Gunnar sandstrom etc，1990.Nucleotide sequence and T cell epitopes of a membrance protein of Francisellatularensia.J.Immunol.145311-317))，扩增长度为250bp。结果表明使用免疫胶体金法可以获得高质量的扩增产物(可以检测到3×103个菌/mL)，比直接扩增(最低可检测浓度为3×106个菌/mL)敏感性提高1000倍。
权利要求
1.提取样品中原核微生物DNA的专用试剂，是胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体；所述抗-DNA单克隆抗体是以原核微生物基因组DNA与沙门氏菌密尼苏达株的偶联物作为抗原免疫小鼠得到的。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于所述原核微生物基因组DNA为细菌基因组DNA。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于所述细菌基因组DNA为大肠杆菌基因组DNA。
4.根据权利要求1、2或3所述的试剂，其特征在于所述胶体金的颗粒大小为20-35nm。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于所述胶体金的颗粒大小为25-30nm。
6.根据权利要求1、2或3所述的试剂，其特征在于所述胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体可按如下方法制备在30ml pH 8.2的所述胶体金溶液中加入650ul 1mg/ml的所述抗-DNA单克隆抗体溶液，搅拌30min，然后加入10％ BSA 3ml搅拌30min，再加入10％PEG 0.6ml搅拌30min，于3000rpm 4℃离心10min，将得到的上清液于10000rpm 4℃离心25min，在得到的沉淀中加保存液30ml，混匀，9500rpm 4℃离心25min，在得到的沉淀中加保存液重溶至3ml，即得到胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体。
7.一种提取样品中原核微生物DNA的方法，包括以下步骤1)裂解样品中的原核微生物细胞，得到含有原核微生物DNA的裂解液；2)利用胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体吸附步骤1)中得到的裂解液中原核微生物DNA；所述抗-DNA单克隆抗体是以原核微生物基因组DNA与沙门氏菌密尼苏达株的偶联物作为抗原免疫小鼠得到的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中还包括用含3％FCS的生理盐水及无菌水清洗所述胶体金标记的抗-DNA单克隆抗体吸附的DNA的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述原核微生物基因组DNA为细菌基因组DNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述细菌基因组DNA为大肠杆菌基因组DNA。
全文摘要
本发明公开了一种提取样品中原核微生物DNA的方法及其专用试剂。本发明所提供的提取样品中原核微生物DNA的专用试剂，是胶体金标记的抗－DNA单克隆抗体；所述抗－DNA单克隆抗体是以原核微生物基因组DNA与沙门氏菌(密尼苏达株)的偶联物作为抗原免疫小鼠得到的。利用该试剂提取样品中原核微生物DNA的方法，包括以下步骤1)裂解样品中的原核微生物细胞，得到含有原核微生物DNA的裂解液；2)利用上述胶体金标记的抗－DNA单克隆抗体吸附步骤1)中得到的裂解液中原核微生物DNA。该方法得到的吸附有DNA的免疫胶体金可直接用于PCR扩增。
文档编号G01N33/53GK1632581SQ20041005007
公开日2005年6月29日 申请日期2004年7月2日 优先权日2004年7月2日
发明者端青, 裴杰萍, 何君, 檀华, 朱虹 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所