专利名称：一种测定人血浆中霉酚酸及其代谢物的方法
技术领域：
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中霉酚酸及其代谢物的方法。
背景技术：
霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil，MMF，RS61443；商品名Cellcept，骁悉)是一种新型的抗代谢类免疫抑制剂，临床上广泛用于器官移植后的抗排异治疗。该药物是霉酚酸(Mycophenolic Acid，MPA)的2-乙基酯前体药物，可显著提高MPA的体内生物利用度。MMF口服后吸收迅速且完全，在体内迅速被水解脱酯转化为活性代谢产物MPA，后者继而与葡萄糖醛酸结合，转化为没有活性的代谢产物葡糖苷酸化物(Mycophenolic acid glucuronide，MPAG)，其主要代谢途径如图1所示。MPAG在体内的浓度比MPA高得多，且能通过肝肠循环再次水解为MPA，重新进入体内而发挥作用，而且会竞争性地与MPA蛋白结合为电结合，因此，MPAG能够影响MPA的体内药动学。同时，MPA的平均血浆蛋白结合率达97.5％，故同时测定总的和游离的MPA和MPAG的药物浓度有着重要的临床意义。
目前，国外多采用免疫法或高效液相法测定血浆中的总浓度，高效液相质谱联用技术(HPLC/MS)或改进的免疫法测定游离的药物浓度。同时对MPA和MPAG进行测定，文献报道的实验条件往往采用两套色谱系统或者采用梯度洗脱，离子对试剂等。上述的方法存在种种弊端如效率低，测定周期长，所需的仪器设备或试剂价格昂贵，维护费用高，分析成本高，不适合于广泛开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、灵敏的测定人血浆中霉酚酸及其代谢物的方法。本方法无需昂贵的设备和试剂，能同时测定总的和游离的MPA和MPAG。本发明的样品取样少，前处理简单、快速，分析周期短，成本低，适合于临床常规检测。
本发明方法对待测样品经过预处理后，利用MPA在碱性条件下有强的荧光吸收的特征，在分析色谱柱分离后衍生化，然后用荧光检测器进行检测。该法可使MPA的检出灵敏度提高两个数量级，可对游离的浓度进行测定。
本方法采用附加一个高压泵和一个三通连接柱后衍生化试剂，并用串联方式连接紫外检测器和荧光检测器，进行样品柱后衍生化，能使分离后的样品有荧光信号。
本方法可用于血浆、血清中总MPA和MPAG以及游离MPA和MPAG浓度的定量测定。其中，总MPA和MPAG的浓度测定定量分取血浆或者血清样品，加入定量的蛋白沉淀剂混匀，离心，取上清液进样，首先经紫外检测器检测MPAG，再用NaOH溶液进行衍生化后用荧光检测器检测MPA。上述测定方法中，加入的蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或二者混合物。
游离MPA和MPAG的浓度测定定量分取血浆或者血清样品，用超滤法分离出超滤液，经色谱柱进行分离，首先经紫外检测器检测MPAG，再用NaOH溶液进行衍生化后用荧光检测器检测MPA。
上述测定方法中，分别采用紫外检测器和荧光检测器检测MPAG和MPA的峰面积，用标准曲线方程换算成MPAG和MPA的浓度。
上述测定MPA和MPAG浓度的方法中，采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基或辛烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱。高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用等度洗脱。
本发明方法快速准确，灵敏可靠，分析成本低，适合于临床常规检测和药动学研究。具有如下优点本发明方法测定条件下，人体内源性物质以及常用合并用药均不干扰测定。总的MPA和MPAG的线性范围分别是0.1～40μg/ml，10～250μg/ml；游离的MPA和MPAG的线性范围分别是0.01～1μg/ml，2.5～100μg/ml，线性相关系数大于0.997，MPA和MPAG的最小检出量分别是10ng和50pg，方法回收率大于92％，RSD小于12％。
图1是霉酚酸酯的主要代谢途径，其中，mycophenolate mofetil霉酚酸酯；mycophenolic acid霉酚酸；MPAG葡糖醛酸化霉酚酸。
图2是色谱系统装置示意图。
图3是典型色谱图其中A，空白人血浆超滤液色谱图(a)紫外(b)荧光；实际肾移植患者服用MMF 750mg bid、强的松和环孢素A的色谱图(c)紫外(d)荧光；1MPAG；2内标；3MPA。
B，空白人血浆超滤液色谱图(a)紫外(b)荧光；实际肾移植患者服用MMF750mg bid、强的松和环孢素A的色谱图(c)紫外(d)荧光；1MPAG；2MPA。
具体实施例方式
实施例1总的MPA和MPAG测定色谱条件日本岛津公司LC-10A高效液相仪(系统包括LC-10AD泵，LC-10AT泵，SPD-10A紫外检测器，RF-10AXL荧光检测器，SIL-10A自动进样器，CBM-10A系统通讯器，柱温箱，Class-LC10 Version 1.63色谱工作站)；色谱柱采用KromasilC8(150mm×4.6mm i.d.，5μm)；柱温30℃；流动相甲醇-0.1％三氟乙酸水溶液(55∶45)；流速1.2ml/min；柱后添加0.2M NaOH 0.15ml/min。紫外检测波长295nm；荧光Ex＝325nm，Em＝435nm，灵敏度(sensitivity)设为中(medium)。
样品制备取100μl样品，加入含内标普罗帕酮150μg/ml的乙腈溶液300μl，涡旋混匀15秒后，于12000xg，10℃以下，离心10分钟，取上清液20μl进样。
线性试验取空白血浆，加入适量的MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MPA(0.1，0.5，10.0，20.0，30.0，40.0μg/ml)，MPAG(10，50，100，150，200，250μg/ml)的血浆标准品，按上节“样品制备”项下处理。以样品峰面积和内标峰面积之比对样品浓度进行线性回归，MPA和MPAG的线性方程分别为C＝0.000705 Ratio+0.001946(r＝0.9991)，C＝3.1434Ratio+0.2113(r＝0.9994)(n＝5)。
精密度和回收率试验取空白血浆，加入适量的MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MPA(0.25，15.0，35.0μg/ml)，MPAG(25，125，225μg/ml)的血浆质控品，按上节“样品制备”项下处理。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差(RSD)表示，(C实测/C理论)x100％即为回收率。
实施例2游离MPA和MPAG测定色谱条件同实施例1中总的MPA和MPAG测定部分，荧光检测器灵敏度(sensitivity)设为高(high)。
样品制备取500μl血浆，置于超滤管(Amicon，Danvers，MA，USA)中，超滤管滤膜的截流分子量为10 000 Da。于25℃，12000xg，离心40分钟，可获取近200μl超滤血浆，进样20μl。
线性试验取空白超滤后的空白血浆，加入适量的MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MPA，MPAG的标准品，按上节“样品制备”项下处理。以样品峰面积对样品浓度进行线性回归，MPA和MPAG的线性方程分别为C＝0.00006187Area-4.31441(r＝0.9997)，C＝0.0002478Area-0.331591(r＝0.9997)(n＝5)。
精密度和回收率试验取空白血浆，加入适量的MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MPA(20，400，800ng/ml)，MPAG(5，40，80μg/ml)的血浆质控品，按上节“样品制备”项下处理。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差(RSD)表示，(C实测/C理论)x100％即为回收率。
表1是血浆中总MPA的日内、日间精密度和方法回收率。
表2是血浆中总MPAG的日内、日间精密度和方法回收率。
表3是血浆中游离MPA的日内、日间精密度和方法回收率。
表4血浆中游离MPAG的日内、日间精密度和方法回收率。
表1日内精密度(n＝6) 日间精密度(n＝6)理论浓度实测值RSD 实测值 RSD 方法回收率％μg·mL-1μg·mL-1％ μg·mL-1％0.25 0.2497 5.89 0.2435 6.3497.4％1515.822.60 14.853.1899.0％3029.911.71 28.781.3295.9％表2日内精密度(n＝6) 日间精密度(n＝6)理论浓度实测值RSD实测值 RSD 方法回收率％μg·mL-1μg·mL-1％μg·mL-1％25 23.39 5.75 24.07 6.3496.3％125 123.983.19 136.673.18109.3％225 212.673.23 236.111.32104.9％
表3日内精密度(n＝6)日间精密度(n＝6)理论浓度实测值RSD 实测值 RSD 方法回收率％ng·mL-1μg·mL-1％ μg·mL-1％2019.315.9518.79 6.2294.0％400 399.02 5.64429.833.80107.5％800 738.61 3.20773.142.7796.6％表4日内精密度(n＝6)日间精密度(n＝6)理论浓度实测值RSD 实测值 RSD 方法回收率％μg·mL-1μg·mL-1％ μg·mL-1％5 4.96 1.504.87 2.2997.4％4038.001.2537.15 0.6492.9％8078.131.0975.81 0.6894.8％
权利要求
1.一种测定人血浆中霉酚酸及其代谢物的方法，其特征是待测样品经预处理后，在分析色谱柱分离后衍生化，用荧光检测器检测，包括以下步骤(1)样品预处理测定总浓度取待测样品，加入甲醇、乙腈或两者混合液，进行蛋白沉淀，测定游离浓度取待测样品，25℃，12000xg，用超滤法进行；(2)样品分离和分析采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基或辛烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用等度洗脱，分别采用紫外检测器和荧光检测器检测MPAG和MPA的峰面积，用标准曲线方程换算成MPAG和MPA的浓度；(3)样品柱后衍生化采用附加一个高压泵和一个三通连接柱后衍生化试剂，并用串联方式连接紫外检测器和荧光检测器，使分离后的样品有荧光信号。
2.根据权利要求1所述的测定人血浆中霉酚酸及其代谢物的方法，其特征是所述的步骤(1)的待测样品为人血浆或血清。
3.根据权利要求1所述的测定人血浆中霉酚酸及其代谢物的方法，其特征是所述的步骤(2)的色谱条件其中色谱柱采用Kromasil C8(150mm×4.6mm i.d.，5μm)；柱温为30℃；流动相是甲醇-0.1％三氟乙酸水溶液(55∶45)；流速为1.2ml/min；柱后添加0.2M NaOH 0.15ml/min。
全文摘要
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中霉酚酸及其代谢物的方法。本发明方法对待测样品经过预处理后，利用MPA在碱性条件下有强的荧光吸收的特征，在分析色谱柱分离后衍生化，然后用荧光检测器进行检测。该法可使MPA的检出灵敏度提高两个数量级，可对游离的浓度进行测定。本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，能同时测定总的和游离的MPA和MPAG。分析周期短，成本低，适合于临床常规检测。
文档编号G01N30/74GK1619304SQ200410066519
公开日2005年5月25日 申请日期2004年9月20日 优先权日2004年9月20日
发明者郁韵秋, 焦正 申请人:复旦大学, 复旦大学附属华山医院