专利名称：一种可产生明场或宽场荧光光切片的方法
技术领域：
本发明涉及光切片技术，特别涉及一种可产生明场或宽场荧光光切片亦即对显微镜下微小样品在白光或宽场紫外光源照明下实现快速断层成像的方法。
背景技术：
在生物医学研究中，人们需要对细胞等微小样品进行断层成像检测，这种过程常形象地称之为光切片。因为无须对样品作实际的机械切片便可得到样品各层面清晰的图像，还可通过对其进行三维重构获得立体图像，所以很快成为对各种样品尤其是生物样品研究的有力手段。激光共焦显微镜是目前实现显微光切片的主要手段。激光共焦显微镜及其类似技术是利用激光在样品上激发荧光，通过有关共焦技术，使得仅在焦平面上的样品被激发荧光并被接收器所纪录成像，利用光束或载物台扫描技术，得到该平面上的像。再逐层扫描便可得到各断层图像。由于激光共焦显微镜需要先在X-Y平面上扫描才能成像，故大大影响了其成像速度，故一般不能实现对活细胞进行动态跟踪测定。此外，激光共焦显微镜只能对样品被激发荧光的部分成像，而且激光在激发荧光时会因荧光漂白作用而对生物样品产生毒性损伤。再加上用高度单色激光激发荧光使得可用的荧光探针有限，因此可检测的样品也受到较大的限制。
多光子吸收显微镜技术尽管相对于激光共焦显微镜可减少荧光漂白作用的毒性损伤，但仍然存在激光共焦显微镜的上述各种问题。
为此，生物医学研究迫切需要一种宽场光切片技术，以便可以使用白光为光源(检测其透射光)，实现对微小物体(如生物样品细胞等)在无毒、甚至无扰情况下的明场快速光切片，从而获得样品整体、全色真彩的清晰断层图像，并可实现对活细胞的动态跟踪监测。如采用扩展紫外光源，也可以实现宽场荧光光切片快速成像，实现动态跟踪监测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可利用显微镜本身的扩展光源，即白光或紫外光，而不是激光照射样品，实现明场或宽场荧光光切片，即断层成像的技术和方法。这种技术和方法可获得比普通光学显微镜更为清晰的断层图像，且无须在X-Y平面上作扫描，而可一次成像，能实现对样品(包括活细胞)的动态跟踪监测。基于此种方法在获得各断层图像基础上，还可实现对样品的三维图像重构及三维显示与分析测定。这种方法适用于对各种微小物体样品的成像，可以是透明或全反射样品，可应用于组织胚胎、血液、神经、微生物、细胞生物学、立体生物学以及各种有机、无机物的观察测定领域。
本发明的目的是通过下述方案实现的本发明所涉及的一种可产生明场或宽场荧光光切片的方法，其特点是在显微镜的照明光源与样品间的光路空间上设置一个一维光栅，使一维光栅图样投影于样品图像上，使显微镜的照明光成为结构光而获得叠加有光栅条纹的断层图像，再通过空间滤波滤除该断层图像上叠加的光栅条纹而得到清晰的样品光切片图像。
上述一维光栅为正弦光栅，设置在显微镜的照明光源与样品间的光路空间上。通过照明光的投影，其作用是使非零空间频率的图像信号在离焦面上衰减，而只使焦平面上的图像成像。
上述空间滤波是在断层图像的傅立叶频谱上通过带通滤波器或用数字图像空间滤波法滤去对应于光栅条纹的频谱部份来实现光栅条纹的去除。
上述带通滤波器设置在显微镜物镜后像方频谱空间中，其中心点与显微镜光路轴线一致。
上述数字图像空间滤波法是将叠加有光栅条纹的断层图像作傅里叶变换，获得其频谱后将对应于光栅条纹的频谱部分滤除，再进行反傅里叶变换获得滤除了光栅条纹后的样品光切片图像。
本发明的作用原理是通过在显微镜的照明光路中设置一个一维光栅，可使显微镜的普通光成为结构光，亦即其频谱中的零频分量与其它高频分量分离的结构光谱。由于只有零空间频率的图像信号在离焦面上不衰减，而非零空间频率的图像信号在离焦面上均有衰减。故当照明光投影某一非零频空间频率的光栅图样于样品图像中，显微镜只能对在焦点处的那一层面有效成像。通过只摄录出该焦平面的图像，再用空间滤波的方法处理消除掉图像上的光栅条纹，便可得到该断层样品清晰的光切片图像。通过选择物镜放大倍数和光栅的密度，可获得的光切片厚度最小为0.2-0.3微米。
空间滤波方法的原理是，在图像的频谱空间上设置一带通滤波器，将对应于光栅条纹的频谱滤除，便可获得仅有样品信息的清晰的光切片图像。或利用数字图像处理的方法，先用计算机把带有光栅条纹的样品像作傅里叶变换，转换成频谱后在计算机上将对应于光栅条纹的频谱去除，然后再进行傅里叶反变换，便可得到清晰的光切片图像。
与现有技术相比，本发明的优点是(1)只需一个光栅与一个带通滤波器(如采用数字图像处理空间滤波法，则仅需一个光栅)，无论是器件还是设置都十分简单，方便易行，在各种显微镜(正立、倒置、立体显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜等)上采用不同倍率的物镜都可应用，应用前景较广。
(2)使用显微镜白光或宽场紫外光光源，无须用激光作光源，由于白光照明对生物或其它样品无损伤，不会产生荧光漂白作用损伤生物样品；(3)无须在X-Y平面上作扫描，而可一次成像，大大增加了其成像速度，还能对活细胞进行动态跟踪监测成像，还可实现对样品的三维图像重构及三维显示与分析测定；(4)不仅对样品可发荧光部分结构成像，还可得到整个样品的全色真彩图像；(5)因采用宽场光源，故有大量荧光探针可用，甚至无须荧光探针成像(用白光)，切层厚度达到0.2-0.3微米。
图1是对角膜组织玻片实现的显微光切片。其中，a为没用光栅投影法获得的图像，b为用光栅投影法获得的迭加了光栅条纹的图像，c为经过空间滤波后获得的图像；图2是利用本发明在一荧光显微镜下以其宽场紫外光作光源所成的花粉孢子的断层宽场光切片图像(共30断层)，及将其作三维重构后获得的三维立体图像；图3是利用本发明在一偏光显微镜上实现对指纹的断层明场光切片成像。其中，(a)为带光栅条纹的指纹样品图像；(b)为经数字图像处理空间滤波去除光栅条纹后的指纹样品图像；(c)为对应于(a)图的频谱；(d)为用数字图像处理去除对应光栅条纹的频谱。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1以本可产生宽场光切片的技术在一倒置显微镜上实现对角膜切片的观察与明场光切片成像。所使用的物镜为40×平场消色差物镜，具体方法为在显微镜卤钨灯(宽场白光光源)前设置一25/mm的正弦光栅，在显微镜物镜后的像方傅里叶频谱平面上设置一带通滤波器。卤钨灯将光栅投影于角膜切片的像上，而获得厚度为0.7微米的光切片图像。调节显微镜物镜的焦距，获得各断层的光切片图像。带通滤波器滤除光栅条纹使之成清晰的光切片图像。具体图像如图1所示，由图1可见，所成的角膜切片图像不但边界清楚，且细节更为丰富，可清楚辨别血管中的红细胞及角膜胶原纤维的纹理。对比之下，没用本技术的同一显微镜所成的同一视场下的角膜切片图像，由于叠加了焦点前后的离焦模糊图像，故图像清晰度差，细节也看不清楚。
实施例2以本可产生三维立体图像的光学空间滤波方法在一荧光显微镜上实现对花粉孢子的断层光宽场光切片成像。所使用的物镜为60×平场消色差物镜。具体方法为在显微镜汞灯(宽场紫外光源)前设置一100/mm的正弦光栅。汞灯将光栅投影至样品上成像，带通滤波器滤除光栅条纹使之成清晰的光切片图像。调节显微镜物镜的焦距获得30个断层的光切片图像，每层厚度为0.3微米。具体图像如图2所示，各光切片图像清晰，各层图像逐渐过渡。图2还同时给出了以我们的三维图像重构技术，对此30层的光切片图像作三维重构后获得的三维立体图像。可见图像逼真，立体感强，可任意角度显示。利用本三维图像重构与分析技术，还可进一步获得该样品的各种定量分析的数据与信息。
实施例3以本可产生三维立体图像的光学空间滤波方法在一偏光显微镜上实现对指纹的断层宽场光切片成像。所使用的物镜为20×物镜。具体方法为在显微镜卤钨灯(宽场白光光源)前设置一150/mm的正弦光栅，卤钨灯将光栅投影在带指纹的样品玻片上成像，所成的像随後以数字图像处理的方式进行空间滤波。具体图像如图3所示，图3a为迭加有光栅条纹的图像，该图像经数字图像处理作傅里叶变换后的频谱如图3c所见。图3d为以数字图像处理的方式去除对应于光栅条纹的频谱部分，图3b则为再经傅里叶反变换后获得的已滤除光栅条纹后的指纹的断层光切片图像。可见图像清晰，指纹的纹理清楚。
由上述实施例可见，利用本宽场光切片方法可产生图像清晰，细节丰富的全色真彩明场光切片或宽场荧光光切片图像，所成的像衬度高、边界清楚、细微结构表现丰富。三维重构后的立体图像立体感强、可任意角度显示，并可获得样品定量化信息，效果非常明显。
权利要求
1.一种可产生明场或宽场荧光光切片的方法，其特征在于在显微镜的照明光源与样品间的光路空间上设置一个一维光栅，使一维光栅图样投影于样品图像上，使显微镜获得叠加有光栅条纹的断层图像，再通过空间滤波滤除该断层图像上叠加的光栅条纹而得到清晰的样品光切片图像。
2.根据权利要求1所述的可产生明场或宽场荧光光切片的方法，其特征在于所述一维光栅为正弦光栅。
3.根据权利要求1所述的可产生明场或宽场荧光光切片的方法，其特征在于所述空间滤波是在断层图像的傅立叶频谱上通过带通滤波器或用数字图像空间滤波法滤去对应于光栅条纹的频谱部分。
4.根据权利要求3所述的可产生明场或宽场荧光光切片的方法，其特征在于所述带通滤波器设置在显微镜物镜后像方频谱空间中。
5.根据权利要求3所述的可产生明场或宽场荧光光切片的方法，其特征在于所述数字图像空间滤波法是将叠加有光栅条纹的断层图像作傅里叶变换，获得其频谱后将对应于光栅条纹的频谱部分滤除，再进行反傅里叶变换获得滤除了光栅条纹后的样品光切片图像。
全文摘要
本发明提供一种可产生明场或宽场荧光光切片的方法，即断层成像的技术和方法。该方法可通过普通光学显微镜的白光或宽场紫外光作光源，获得显微样品清晰的断层图像，所得到的断层图像可以是全色真彩图像，也可以是荧光图像，且无须在X－Y平面上作扫描，而可一次成像，能实现对样品(包括活细胞)的动态跟踪监测。基于此种方法在获得各断层图像基础上，还可实现对样品的三维图像重构及三维显示与分析测定。这种方法适用于对各种微小物体样品的成像，可以是透明或全反射样品，可应用于组织胚胎、血液、神经、微生物、细胞生物学、立体生物学以及各种有机、无机物的观察测定领域。
文档编号G01N21/64GK1786688SQ200410077228
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者黄耀雄, 李金 申请人:暨南大学