专利名称：消旋酶的鉴别和鉴定、蛋白质特征的确定、及用于检测 d －氨基酸和筛选能抑制消旋酶 ...的制作方法
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背景技术：
本发明涉及消旋酶(racemase)的鉴别和鉴定及这些消旋酶的蛋白质特征的确定。更特别地，本发明涉及编码由所述蛋白质特征特有的基序组成的肽的核酸分子的鉴别，及涉及由这些基序组成的肽。本发明还涉及特异于所述肽的抗体及涉及这些抗体与肽的免疫复合物。另外，本发明涉及使用本发明的核酸分子检测消旋酶的方法和试剂盒，以及所述基序组成的肽及这些肽的抗体。
长久以来D-氨基酸被描述为存在于革兰氏阳性细菌、尤其是革兰氏阴性细菌的细胞壁中，在细胞壁中它们组成肽聚糖的必要基本元件及作为细胞壁磷壁酸的替代物(1)。另外，在由多种微生物通过非核糖体蛋白质合成而产生的许多小肽中发现了各种类型的D-氨基酸(2)，其主要作为抗生素制剂。然而，据认为这些实例是同手型(homochirality)规则及坚持除了来自由于陈化(aging)而自发外消旋的极低水平的D-氨基酸之外只有L-氨基酸对映异构体存在于真核细胞中的教导的例外(3)。
近年来，越来越多的研究报道了在众多的生物体包括哺乳动物中存在D-氨基酸(D-aa)，以蛋白质结合的形式(4)或游离形式(5)存在。游离D-aa的来源与蛋白质结合的D-aa的来源相比还不太清楚。例如，在哺乳动物中，游离D-aa也许源于外源(如(6)中所述)，但近来在真核细胞中氨基酸消旋酶的发现也已经揭示了D-aa的内源产生，需要了解其特异性功能。D-天冬氨酸的水平在大鼠胚胎中经发育调节(7)；D-丝氨酸与NMDA小鼠脑受体的结合促进了神经调节(8)、(9)，及D-天冬氨酸看起来参与内分泌组织中激素调节(10)。
所有氨基酸消旋酶均需要吡哆醛磷酸作为辅因子(cofactor)，除了辅因子非依赖性酶脯氨酸和羟脯氨酸消旋酶之外。例如，有两篇报告已经公布了来自革兰氏阳性菌斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)的脯氨酸消旋酶的生物化学和酶学特性(11，12)。一种反应机制提出，活性位点Cys256与有活性的同源二聚体酶中其它单体的相应半胱氨酸形成半反应位点(half-reaction site)。
尽管在细菌和真菌中论证了多种消旋酶和差向异构酶(epimerase)，但最近描述了分离自感染性后锥虫体形式的寄生的原生动物枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的第一种真核生物氨基酸(脯氨酸)消旋酶，枯氏锥虫是导致人体南美锥虫病(Chagas’disease)的因素(13)。这种寄生虫分泌的脯氨酸消旋酶(TcPRAC)被显示出是宿主B细胞的强力促分裂原，并且在枯氏锥虫通过多克隆淋巴细胞激活进行的免疫逃避和持续(persistence)中起重要作用(13)。这种蛋白质先前称为TcPA45，单体大小为45kDa，其仅通过寄生虫的感染性后锥虫体形式表达和释放(13)。
TcPRAC脯氨酸消旋酶基因的基因组组构和转录表明每个单倍型基因组存在两个同源的基因(TcPRACA和TcPRACB)。另外，使用45kDa-TcPRAC蛋白质的特异性抗体进行的定位研究表明一种单体大小为39kDa的胞内和/或膜结合的同工型(isoform)在非感染性短膜虫期形式的寄生虫中表达。
对TcPRACA基因序列的计算机辅助分析提示其通过可变反式剪接(alternative trans-splicing)机制可以产生寄生虫脯氨酸消旋酶的这两种同工型(45kDa和39kDa)，其中之一可含有信号肽(13)。另外，对推定的TcPRACB基因序列进行初步分析表明了一些不同，包括与TcPRACA相比的点突变，但也提示TcPRACB基因仅可以编码所述酶的胞内同工型，因为该基因缺乏输出信号序列。任何这些分子机制实质上确保了在枯氏锥虫的不同发育阶段产生的脯氨酸消旋酶的胞内和胞外同工型的不同表达。
通过使用L-氨基酸源生产D-氨基酸的方法包括使用特异于感兴趣的氨基酸的氨基酸消旋酶，所述消旋酶从含有具有编码所述酶的多核苷酸序列的一个载体的重组表达系统中产生。在原核生物宿主中，已知消旋酶参与D-氨基酸的合成和/或参与L-氨基酸的代谢。例如，肿瘤中及进行性自身免疫和退化疾病中游离D-氨基酸的存在提示真核生物氨基酸消旋酶的生物学重要性。含有D-氨基酸的蛋白质或肽对宿主酶的蛋白酶解抗性是所熟知的。另外，含有D-氨基酸，至少一个D-氨基酸残基的这种蛋白质可表现抗生素或免疫原性质。
人们对D-氨基酸在人体脑、肿瘤、抗微生物和神经肽中作为游离分子或在多肽链内的生物学作用越来越感兴趣，提示其具有广泛的生物学关联性。对活的生物体中D-氨基酸的研究受到其难以检测的限制。现有技术需要对消旋酶的鉴别及对其酶学性质和对其它化合物的特异性的鉴别。
尽管对南美锥虫病的预防特别是载体铲除已经有许多进展，但在全世界每天仍发生新增的感染和疾病发生情况。尽管过去在拉丁美洲地区感染主要限于载体传递，但是其在先天性和血液传递、移植和免疫抑制状态之后复发方面的影响在增加。在拉丁美洲南美锥虫病的流行也许达到人口的25％(如在玻利维亚)或者仍为1％(如在墨西哥)。在已经感染寄生虫枯氏锥虫的1.8-2千万的人中，60％以上生活在巴西，WHO估计在南美洲和中美洲有9千万人处于危险中。
例如，得自美国最近的人口普查的一些数字表明来自墨西哥的净移民数为大约1000人/天，其中有5-10人感染南美锥虫病。这种疾病可潜伏10-30年，并且作为许多其它进展性慢性病变的实例，其特征是“无症状的”。尽管在二十世纪九十年代，血库对西班牙裔的要求提高(50％的玻利维亚血液被污染)，食品及药物管理局(FDA)专门小组已经建议所有捐赠的血液均要进行南美锥虫病筛选。但现今，FDA尚未批准“精确的”血液测试以筛选供体血样。这种主张与地区性国家使用的超过30种的可用测试形成鲜明对照。另外，最近关于适合这种寄生虫的新的昆虫载体和在发达国家如美国被感染的家畜的报道及基于Genetic Algorithm for Rule-set Prediction模型的分布预测表明这些物种的潜在广泛分布，并提示在这些已经报道的区域之外的另外危险区域，强调了持续的世界范围的公众健康问题。
迄今为止，有两种药物特别用于治疗枯氏锥虫感染。硝呋替莫(Nifurtimox，3-甲基-4-5′-硝基亚糠基-氨基四氢-4H-1，4-噻嗪-1，1-二氧化物)是自1967年使用的第一种药物，这是由Bayer公司生产的一种硝基呋喃，称作Lampit。1973年以后，一种硝基咪唑(nitroimidazol)衍生物苄硝唑(Benznidazol)，称作Rochagan或Radanyl(N-苄基-2-硝基-1-咪唑乙酰胺)，由Hoffman-La-Roche生产，并且是一致同意选择的药物。这两种药物均是杀锥虫剂并对抗寄生虫的胞内或胞外形式。不利的副作用包括局部或一般化过敏性皮肤病变、周围敏感性多发神经病变(peripheral sensitive polyneuropathy)、白细胞减少、厌食、消化异常(digestive manifestations)及罕见的抽搐，这可通过中断治疗而逆转。最严重的并发症包括粒细胞缺乏症和血小板减少性紫癜。
毫无疑问地，治疗是有效的并且应该应用于感染的急性阶段、儿童、及在用免疫抑制剂治疗或器官移植程序后观测到寄生虫血症再激活的情况中。一些专家建议处于不确定阶段及慢性阶段的患者也应被治疗。然而，在发现了感染及其继发疾病之后的近百年来，研究人员对疾病慢性阶段的治疗始终保持分歧的观点。治愈的标准之一是基于血液中无寄生虫，这非常难以评价不确定阶段或慢性阶段的治疗效力。因为不确定形式是无症状的，因此不可能在临床评价治愈。进一步地，需要血清学及更灵敏和先进的分子技术组合并仍可能不确定。然后必须对患者随访几年以必然客观地确定治愈。
最近认为南美锥虫病是被忽视的一种疾病，DND-initiative(Drugfor Neglected Diseases Initiative，DNDi)希望支持发展针对锥虫病的有效、安全及买得起的新药物的药物开发项目。由于目前的治疗有争议，在一些情况中也许不适当，甚至是毒性的，以及也许效力有限，因此绝对需要能激发保护性免疫的新配制品的鉴定及寄生虫分子的揭示，并且必须被优先考虑。
发明概述本发明有助于满足本领域这些需要。已经揭示了枯氏锥虫中TcPRAC基因编码功能性胞内形式或分泌形式的酶，这些酶呈现出可能与其相对催化效率有关的独特的动力学性质。而所述酶的同工型的K0M是相似的数量级(29-75mM)，Vmax在2×10-4至5.3×10-5mol L-脯氨酸/秒/0.125μM同源二聚体重组蛋白质之间变化。使用酶特异性抑制剂进行的研究及通过定点诱变活性位点Cys330残基进行的酶活性消除研究支持了脯氨酸消旋酶作为开发抗南美锥虫病药物关键靶点的潜力。
本发明提供了一种纯化的核酸分子，其编码由选自SEQ ID NO1、2、3或4的基序组成的肽。
本发明还提供了一种纯化的核酸分子，其在中等严格条件下与包含这个核酸分子的变性的、双链DNA的任一链杂交。
另外，本发明提供了一种重组载体，其指导选自这些纯化的核酸分子的核酸分子的表达。
再者，本发明提供了一种纯化的多肽，其由选自编码如下多肽的纯化的核酸分子组成的一组的核酸分子编码(a)由基序I(SEQ ID NO1)组成的一种纯化的多肽；(b)由基序II(SEQ ID NO2)组成的一种纯化的多肽；(c)由基序III(SEQ ID NO3)组成的一种纯化的多肽；(d)由基序III*(SEQ ID NO4)组成的一种纯化的多肽。
本发明提供了与这些多肽结合的纯化的抗体。纯化的抗体可以是单克隆抗体。一种免疫复合物包含本发明的多肽及特异性识别此多肽的抗体。
本发明提供了用本发明的重组载体转染或转导的一种宿主细胞。
一种生产由SEQ ID NO1、2、3、或4组成的多肽的方法，包括在促进表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并从宿主细胞或培养基中回收多肽。所述宿主细胞可以是细菌细胞、寄生虫细胞，或真核细胞。
本发明的一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的方法，包括(a)将所述核苷酸序列与和本发明的核酸分子杂交的一种引物或探针接触；(b)使用所述引物或探针扩增所述核苷酸序列；(c)检测在引物或探针与核苷酸序列之间形成的杂交复合物。
本发明提供了一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的方法，包括(a)将所述消旋酶与本发明的抗体接触；(b)检测所得免疫复合物。
一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亚序列核苷酸序列编码的消旋酶的试剂盒，其包含(a)一种多核苷酸探针或引物，其与本发明的多核苷酸杂交；(b)进行核酸杂交反应的试剂。
本发明还提供了一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的试剂盒。该试剂盒包含(a)纯化的本发明抗体；(b)纯化形式的标准试剂；(c)检测试剂。
一种在体外筛选能抑制由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的活性分子的方法，包括(a)将所述活性分子与所述消旋酶接触；(b)测试在各种浓度的所述活性分子抑制所述消旋酶活性的能力；(c)选择对任何脯氨酸消旋酶的活性有至少80％抑制作用的活性分子。
在本发明的一个优选实施方案中，所述消旋酶是脯氨酸消旋酶。
本发明的一种免疫组合物含有能在体内诱导免疫应答的至少一种本发明的纯化的多肽，及一种药物载体。
附图简述参考附图以更好地理解本发明。
图1枯氏锥虫TcPRACA和TcPRACB脯氨酸消旋酶同工型的序列对比分析。
A.TcPRACA(Tc-A)和TcPRACB(Tc-B)核苷酸序列对比非编码序列以斜体字母表示；反式剪接信号以下划线表示，推定的剪接前导序列受体位点以双下划线表示；编码计算机预测的信号肽的区域以双向箭头表示；TcPRACA和TcPRACB的翻译起始以单向箭头表示；亮和暗灰色阴影中的核苷酸分别代表沉默突变或点突变；框是脯氨酸消旋酶活性位点；UUA三联体以粗下划线表示，位于双下划线的聚腺苷酸化位点的前面。
B.枯氏锥虫TcPRACA(Tc-A)、TcPRACB(Tc-B)脯氨酸消旋酶的氨基酸序列对比的图示。共同的数值是沿着线性排列的氨基酸残基位置，并分别代表TcPRACA和TcPRACB蛋白的初始密码子；V代表可变TcPRACA推定的起始密码子；氨基酸的差异在垂直线的上方和下方表示，其在序列中的位置在括号内显示。SP信号肽；TcPRACA的N末端结构域从第1位延伸至第69位；SPCGTTcPRACA和TcPRACB脯氨酸消旋酶的保守的活性位点；N末端和C末端均是指这两种蛋白质而言。
C.TcPRACA的疏水性图示。虚线表示通过Von Heijne的方法预测的切割位点(第31-32位氨基酸)。
D.枯氏锥虫CL Brener克隆的染色体条带在通过PFGE分离(泳道1)及与TcPRAC探针Southern印迹杂交后(泳道2)的溴化乙啶染色的凝胶。指出了染色体条带的大小(Mb)，以及用罗马数字表示区域染色体编号。
图2枯氏锥虫脯氨酸消旋酶同工型和底物特异性的生物化学鉴定。
A.纯化的rTcPRACA(泳道1)和rTcPRACB(泳道2)重组蛋白的SDS-PAGE分析。8％聚丙烯酰胺凝胶用考马斯蓝染色。右边缘是分子量标记。
B.与rTcPRACA(实心条形)相对比，rTcPRACB(空心条形)对L-脯氨酸、D-脯氨酸，L-羟基(OH)脯氨酸和D-羟基(OH)脯氨酸底物外消旋作用的百分比。消旋酶活性用pH6.0的乙酸钠缓冲液中的0.25μM脯氨酸消旋酶的每种同工型和40mM底物确定。
C.以pH消旋酶的函数表示的外消旋作用的百分比分析在含有0.2M Tris-HCl(正方形)、乙酸钠(三角形)和磷酸钠(圆形)，40mM L-脯氨酸和0.25μM纯化的rTcPRACA(实心符号)和rTcPRACB(空心符号)的缓冲液中进行。在37℃进行30分钟后，反应通过热灭活和冷冻而中止。
D.39kDa的胞内同工型分离自非感染性短膜虫期形式的寄生虫的可溶(Ese)提取物。将可溶悬浮液的系列稀释液的Western印迹与已知量的rTcPRACB蛋白对比，并用于使用Quantity One_软件进行的蛋白质定量。消旋酶分析在pH6的乙酸钠缓冲液中进行，使用40mM L-脯氨酸及包含于Ese提取物中相应于所描述量的39kDa(ng)。
图3通过rTcPRACA和rTcPRACB脯氨酸消旋酶同工型催化的L-脯氨酸外消旋作用的动力学参数。外消旋反应的行进如先前所述经旋光测量而监测(13)。
A.曲线的线性部分的确定在37℃在含有0.2M乙酸钠(pH 6.0)，0.25μM纯化的酶和40mM L-脯氨酸的培养基中进行。rTcPRACA反应由黑方块表示，rTcPRACB反应由白方块表示。
B.消旋酶活性的初始速率在37℃在含有0.2M乙酸钠(pH 6.0)，0.125μM的rTcPRACA(实心方块)或rTcPRACB(空心方块)的纯化的酶和不同浓度的L-脯氨酸的培养基中进行。使用Lineweaver-Burk双倒数作图法(double reciprocal plots)确定KM和Vmax数值，其中1/V以1/[S]的函数作图，曲线的斜率代表KM/Vmax。获得的数值通过使用 程序和米氏方程(Michaelis-Menten equation)而证实。数值用不同的酶制品的6次实验代表。
C.0.125μM rTcPRACA脯氨酸消旋酶同工型在有(空心方块)或无(实心方块)6.7μM PAC竞争抑制剂的情况中的双倒数作图动力学，以L-脯氨酸浓度的函数表示。为进行对比，斯氏梭菌的脯氨酸消旋酶报道的KM为2.3mM；使用得自可溶的短膜虫期级分的天然蛋白质的动力学分析揭示了10.7mM的KM和1.15μM的Ki。
图4使用Superdex 75柱进行的rTcPRACA蛋白的大小排阻层析。级分通过HPLC在pH6.0洗脱，B2和B4峰分别相应于rTcPRACA二聚体和单体。将B1和B5洗脱的级分使用相同的条件再加样于该柱中(粗体，见插入)并与先前洗脱图对比(非粗体)。
图5TcPRACA脯氨酸消旋酶的定点诱变。TcPRACA基因的脯氨酸消旋酶的活性位点诱变的示意图。
图6使用基序I、II和III通过筛选SWISS-PROT和TrEMBL数据库获得的蛋白质(Clustal X)的序列对比。MI，MII和M1II中包含的氨基酸以暗灰色和浅灰色图案阴影显示，第13-14位非特异性氨基酸包含在MII中。序列的SWISS-PROT登记号(accession number)在表4中显示。
图7通过T-coffee对比放射树(T-coffee alignment radial tree)获得的蛋白质序列进化树。SWISS-PROT蛋白质登记号在表4中示出。
图8显示与使用旋光测量的常规监测方法(Pol/L-)对比，使用D-AAO(D-AAO/L-)微量测试测定的不同浓度(10-40mM)的L-脯氨酸的外消旋抑制百分比。
图9显示单独使用D-脯氨酸或者D-和L-脯氨酸等摩尔混合物作标准的D-AAO/HRP反应的对比。
图10显示在如下条件下在490nm处光密度与D-脯氨酸浓度的函数关系。
图11是用D-脯氨酸的系列稀释液获得的曲线图，作为阳性反应对照。注阴性孔(well(-))OD是得自空白孔的OD的平均值。
图12显示在残基Cys160或残基Cys330诱变后，脯氨酸消旋酶的酶活性的丧失。
发明详述脯氨酸消旋酶催化L-和D-脯氨酸对映体的互变，迄今为止仅在两个物种中被描述。最初是在细菌斯氏梭菌中发现，其在活性位点含有半胱氨酸，并且不需要辅因子或其它已知辅酶。第一种真核生物氨基酸(脯氨酸)消旋酶在从病原性人体寄生虫枯氏锥虫的基因中分离和克隆后已经被描述。这个酶在胞内位于复制的非感染性形式的枯氏锥虫中，膜结合形式和分泌形式的酶基于寄生虫分化为非分裂的感染形式而存在。脯氨酸消旋酶的分泌的同工型是强力的宿主B细胞促分裂原，支持寄生虫的特异性免疫应答的逃避。
首先必须阐明TcPRACB基因是否编码功能性脯氨酸消旋酶。为回答这个问题，将TcPRACA和TcPRACB共生同源基因在大肠杆菌中表达并对重组蛋白的生物化学和酶学特点进行详细研究。本发明论证了TcPRACB确实编码功能性脯氨酸消旋酶，该酶当与TcPRACA酶对比时呈现略微不同的动力学参数和生物化学特征。代表性的重组蛋白的酶活性显示由TcPRACB构建体产生的39kDa脯氨酸消旋酶的胞内同工型与TcPRACA产生的45kDa同工型对比更稳定，并且具有较高的D/L-脯氨酸互变速率。另外，用脯氨酸消旋酶的特异性抑制剂吡咯-2-羧酸获得的酶抑制剂复合物的解离常数(Kj)低于重组TcPRACB酶。
另外，本发明论证了Cys330和Cys160是脯氨酸消旋酶活性位点的关键氨基酸，因为该酶的活性通过这些残基的定点诱变而完全消除。再者，脯氨酸消旋酶氨基酸序列的多重排列可以阐明可用于鉴别在其它微生物中推定的脯氨酸消旋酶的蛋白质特征。本发明讨论了脯氨酸消旋酶在真核细胞，特别是在枯氏锥虫中存在的意义，以及这种酶活性在生物学和寄生虫的感染性中的因果关系。
本发明提供了氨基酸基序，其用作脯氨酸消旋酶的特征。这些氨基酸基序如下基序I[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XG[SEQ IDNO1]基序II[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY][SEQ ID NO2]基序IIIDRSPXGXGXXAXXA[SEQ ID NO3]基序III*DRSPCGXGXXAXXA[SEQ ID NO4]其中X在这些序列的每一个中均是一个氨基酸。
本发明还提供了编码氨基酸基序的多核苷酸，其在本文也称作“本发明的多核苷酸”和“本发明的多肽”。
使用TcPRACA的这些多核苷酸或多肽序列筛选数据库。搜索基序I-III。基序I相应于[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG，基序II相应于[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY]，基序III相应于DRSPXGXGXXAXXA及基序III*相应于DRSPCGXGXXAXXA。序列在附件中显示，其中活性位点的两个半胱氨酸残基的保守区域以方块表示，在表5中以相应的登记号用粗体表示。所述两个半胱氨酸残基是Cys330及其同源物Cys160，其中通过定点诱变使残基Cys160突变为丝氨酸也诱导酶活性的急剧丧失，对于残基Cys330也如此。
脯氨酸消旋酶，这是先前仅在原生细菌斯氏梭菌(Clostridiumsticklandii)中描述的一种酶(11)，其被显示还由真核细胞枯氏锥虫编码，枯氏锥虫是一种高致病原性的原生动物寄生虫(13)。先前称为TcPA45的枯氏锥虫脯氨酸消旋酶(TcPRAC)是一种有效的宿主B细胞促分裂原，并且是由后锥虫体形式的寄生虫感染而分泌，有助于其通过非特异性多克隆淋巴细胞激活的免疫逃避和持续(13)。先前的结果提示TcPRAC由每个单倍体基因组两个共生同源基因编码。蛋白质定位研究也表明枯氏锥虫在细胞周期和分化期间可不同地表达胞内形式和分泌形式TcPRAC，因为发现该蛋白质在非感染性复制(短膜虫期)形式的寄生虫细胞质中，并与膜结合或者在感染性非复制的(后锥虫体锥虫成虫期)寄生虫中分泌(13)。
本发明鉴定了两种TcPRAC共生同源基因，并论证了TcPRACA和TcPRACB均引起辅因子非依赖性脯氨酸消旋酶的功能性同工型产生，其表现不同的生物化学性质，这些性质在各自的酶活性的效率中具有重要作用。如先前对于细菌脯氨酸消旋酶进行的生物化学和理论研究所提示(11，17，18)，TcPRAC活性依赖于两种单体酶亚基，它们通过双碱性机制反应(two base mechanism reaction)进行L-和/或D-脯氨酸对映体的互变，其中所述酶从底物中除去一个α-氢原子并为α碳原子的对侧提供一个质子。已经推测同源二聚体的每个亚基提供巯基基团之一(18)。
本发明论证了TcPRAC酶活性确实是依赖于活性位点的残基Cys330，因为位点特异性330Cys突变为Ser完全地消除了L-和D-脯氨酸外消旋作用，与先前论证的TcPRAC酶活性通过与碘乙酸或碘乙酰胺烷化而消除一致(13)，这也与梭菌脯氨酸消旋酶相似，其中显示与反应位点的两个半胱氨酸特异性发生羧甲基化导致酶失活(12)。本发明还论证了残基Cys160也是活性位点的一个关键残基，TcPRAC在其同源二聚体内具有两个活性位点。这些观察使得可以利用基于天然和突变的序列的分析搜索抑制剂。
基因序列分析推测通过可变剪接的机制，TcPRACA可以产生胞内和分泌形式的寄生虫脯氨酸消旋酶，本发明论证了TcPRACB基因序列本身编码一种蛋白质，其缺少参与肽信号形成的氨基酸和TcPRACA蛋白质中存在的一个额外N末端结构域，与CsPR更为相似。因此，TcPRACB仅可以产生一种胞内形式的TcPRAC脯氨酸消旋酶。这个揭示使得可以实现搜索一种应穿透细胞的胞内酶的推定的抑制剂。
令人感兴趣地，枯氏锥虫基因组中TcPRAC基因的两个同源拷贝(编码两个相似的多肽但具有独特的特异性生物化学性质)的存在，可以反映出一种基因复制的进化机制及一种寄生虫策略，以保证更好的环境适应性。这个假想通过TcPRACA基因通过可变剪接产生两种相关的蛋白质同工型的潜力而证实，可变剪接是特别适于必须对环境刺激迅速应答的细胞的一种机制。最初，反式剪接表现为确实是一种古老的方法，其对高等生物体中的断裂基因可组成一种选择性优势(19)，可变反式剪接仅仅在最近才证实在枯氏锥虫中发生(20)。作为另一种启动子选择，通过TcPRACA基因的可变反式剪接，枯氏锥虫中脯氨酸消旋酶的胞内和/或分泌的同工型的经调节的产生使得恒定的蛋白质结构域可以严格保守和/或可能获得额外的分泌区结构域。事实上，近来使用基于RT-PCR的策略及与5’剪接前导寡核苷酸组合的TcPRACA和TcPRACB序列共有的3’探针，随后克隆并测序所得片段的研究确实证实了TcPRAC的胞内形式也可源自TcPRACA基因，确证了这个假说。
在枯氏锥虫中基因复制是相对普通的事件，其增加了对寄生虫基因组研究的复杂性。另外，TcPRAC染色体作图揭示了两个染色体条带，每一个均具有3个以上的染色体，并且可以表明脯氨酸消旋酶基因被图谱定位于大小多态性的同源染色体中，这是对脯氨酸消旋酶基因家族鉴定的一个重要发现。初步的结果已经表明例如枯氏锥虫DM28c I型菌株将脯氨酸消旋酶基因图谱定位于与本发明使用的枯氏锥虫CL II型菌株鉴别的相同的染色体印迹(chromoblot)区。
本领域技术人员熟知脯氨酸组成了一些生物体如一些血鞭毛虫(21)，(22)，(23)及昆虫中飞行肌(24)的重要能量来源。另外，提示锥虫中有脯氨酸氧化酶系统(25)，并且报道了脯氨酸在锥猎蝽亚科动物(triatominae)肠中富集的研究(26)提示脯氨酸在枯氏锥虫寄生虫中的代谢途径以及其在昆虫载体的消化道中的区别(27)。因此，非常肯定枯氏锥虫可使用L-脯氨酸作为碳的主要来源(25)。
另外，使用在指定培养基中培养的寄生虫的初步结果表明在载体中发现的短膜虫期和感染性后锥虫体锥鞭毛体形式(metacyclictrypomastigote form)均可有效地代谢L-或D-脯氨酸作为唯一的碳源。某些报道指出脯氨酸的生物合成在锥虫中发生(即通过谷氨酸碳链的还原反应或转氨基作用)，脯氨酸的一个额外和直接的生理调节可存在于寄生虫中以控制氨基酸氧化及其随后的降解或者脯氨酸利用。事实上，近来的报道显示枯氏锥虫中的两种活性的脯氨酸转运系统(28)。枯氏锥虫脯氨酸消旋酶可能在胞内脯氨酸代谢途径的调节中因此而起作用，或者，其可参与D-氨基酸翻译后添加至多肽链的机制。
一方面，这些假说可以允许一种获得能量的方式，另一方面，其使得寄生虫逃避宿主应答。在这个方面，据报道在蛋白质的N末端添加一个D-氨基酸足以产生对包含宿主蛋白酶解酶在内的裂解反应的一般抗性(29)。含有D-氨基酸的蛋白质在寄生虫膜中的表达除了有助于起始多克隆激活之外，还有助于寄生虫进入宿主细胞溶酶体中，如已经对由D-对映体组成的聚合物描述的那样(30)，(31)。尽管枯氏锥虫蛋白质中包含D-氨基酸对寄生虫有益，但这个假说仍需加以证实并且直接的证据在技术上难以获得。
值得注意的是短膜虫期在后循环期发育成为感染性后锥虫体形式包括寄生虫形态的改变，包括动基体(kinetoplast)(与寄生虫鞭毛物理性连接的一个结构)的迁移，及组合起来赋予寄生虫感染性/毒性的许多其它显著的代谢改变(13，32)。脯氨酸消旋酶显示在发育后期发生之后优先位于感染性寄生虫形式的鞭毛袋(flagellar pocket)内(13)，与分泌的并参与早期感染的许多已知的蛋白质一样(33)。
也可能的是寄生虫脯氨酸消旋酶可通过内在环境的游离脯氨酸的胞内修饰而发挥枯氏锥虫分化的早期中介物的作用，这在前面已经提示并已经在一些细菌系统中观测到。例如，已经描述了外源丙氨酸在细菌转录调节中起重要作用，此调节通过控制编码丙氨酸消旋酶的基因形成的操纵子及细菌脱氢酶的一个较小的亚基而进行(34)。
在细菌中，膜丙氨酸受体与丙氨酸和脯氨酸进入细菌细胞相关(35)。然后可以假设在昆虫消化道环境中并与通过寄生虫膜内特异性受体进行的环境感受机制相关的脯氨酸的可用性支持寄生虫脯氨酸吸收及其进一步的胞内外消旋作用。脯氨酸消旋酶然后在寄生虫生长和分化的调节中起基本作用，此作用通过如上述其参与能量代谢途径和含有D-氨基酸的蛋白质的表达而因此赋予寄生虫感染性及其逃避宿主特异性应答的能力实现。
迄今为止并与在枯氏锥虫的短膜虫期形式中发现的TcPRAC胞内同工型相反，后锥虫体和血流形式的寄生虫表达和分泌脯氨酸消旋酶的能力可进一步参与宿主/寄生虫相互作用。事实上，寄生虫分泌的脯氨酸消旋酶同工型主动参与基于宿主感染的非特异性多克隆B细胞应答的诱导(13)并促成寄生虫逃避，因此保证其在宿主中的持续。
如针对其它促分裂原和寄生虫抗原所述(36)、(37)、(38)，及除了其促分裂原性质之外，TcPRAC也可以参与宿主细胞靶位的修饰，使得寄生虫能更好地的附着于宿主细胞膜，从而保证感染性改善。因为有L-脯氨酸的富集与肌肉功能失调(39)及肌肉收缩抑制(40)相关的一些报道，因此胞内寄生虫对脯氨酸消旋酶的释放可另外有助于通过调节宿主细胞内L-脯氨酸浓度而保持感染，因为脯氨酸是肌细胞靶位的完整性所必需的。因此，近来论证了超表达TcPRACA或TcPRACB基因而非功能性剔除的转基因寄生虫对宿主靶细胞的感染性是5-10倍，指出了脯氨酸消旋酶在正在进行的感染过程中的关键作用。同样，先前的报道表明单核细胞增生李斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)丙氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶基因的遗传失活消除了细菌的致病原性，因为D-丙氨酸的存在是保护所有细菌免于外部环境影响的细胞壁的粘肽成分的合成所必需的(41)。
使用TcPRAC和斯氏梭菌脯氨酸消旋酶基因中经鉴别的关键的保守残基及筛选SWISS-PROT和TrEMBL数据库的分析揭示了脯氨酸消旋酶的最小特征DRSPXGX[GA]XXAXXA，并证实了推定的蛋白质在至少10种独特的生物体中的存在。对未完成的基因组序列的筛选显示在另外8种生物体中高度同源的脯氨酸消旋酶候选基因，其中有真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)及细菌炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)和肉毒梭菌(Clostridium botulinum)。这是最令人感兴趣的，因为是消旋酶而不是脯氨酸消旋酶在细菌中普遍存在，并只是在最近才在更复杂的生物体如枯氏锥虫中进行了描述(42，43)。这些发现可能反映了细胞对胞外刺激的适应性应答并揭示了在真核细胞中通过D-氨基酸对基因表达的调节的更普遍的机制。在人和小鼠基因组数据库中使用脯氨酸消旋酶的较低严格的特征发现相似的基因是令人惊奇的。然而，在那些推测的蛋白质的推定的活性位点中没有关键的氨基酸半胱氨酸提示与脯氨酸消旋酶不同的功能性。
本发明显示TcPRAC同工型是高度稳定的，并具有在大范围pH进行其活性的能力。另外，吡咯羧酸(一种特异性脯氨酸消旋酶的抑制剂)对TcPRAC酶比对CsPR的亲和性高。
本发明还提供了与本文揭示的特异性序列基本相似的氨基酸或核酸序列。
术语“基本相似”当就氨基酸或核酸序列而言时，是指特定的目标序列例如突变的序列与参考序列由于一或多个取代、缺失或添加而不同，但其净效应保持活性。或者，如果在如下情况下，则核酸亚单位和类似物与本文揭示的特异DNA序列是“基本相似的”(a)所述DNA序列衍生自本发明的一个区域；(b)所述DNA序列能与(a)的DNA序列杂交和/或其编码活性分子；或者所述DNA序列为(a)或(b)的DNA序列的遗传密码简并序列和/或其编码活性分子。
为了保持活性，缺失和取代优选产生同源或保守取代的序列，意味着给定的残基由一个生物学相似的残基置换。保守取代例如包括脂肪族残基彼此取代，如Ile，Val，Leu或Ala彼此取代，或者极性残基彼此取代，如Lys与Arg、Glu与Asp或者Gln与Asn之间彼此取代。本领域熟知其它这种保守取代例如具有相似疏水性特征的完整区域的取代。当所述活性是脯氨酸消旋酶活性时，Cys330和Cys160必须存在。
本发明的多核苷酸可用作探针或者用于选择扩增反应的核苷酸引物。PCR在Cetus Corp的美国专利No.4,683,202中有描述。扩增的片段可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者通过毛细管电泳，或者通过层析技术(凝胶过滤、疏水性层析，或者离子交换层析)而鉴别。扩增的特异性可以通过分子杂交而保证，使用本发明的多核苷酸、与这些多核苷酸互补的寡核苷酸或者其扩增产物自身作为核酸探针。
扩增的核苷酸片段在杂交反应中用作探针以在如生物学样品中检测本发明的多核苷酸的存在或者检测编码消旋酶活性的基因的存在。本发明还提供了上述扩增的核酸片段(扩增子)。这些探针和扩增子可以使用例如酶或荧光化合物而放射性或非放射性标记。
也可以使用除了PCR技术之外的其它核酸扩增技术。链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)技术(Walker et al.，1992)是一种等温扩增技术，其基于限制酶在识别位点(其在半硫代磷酸形式下)切割一条链的能力，及基于DNA聚合酶在限制酶产生的3′OH末端起始新链合成的性质，及基于这个DNA聚合酶置换位于下游的先前合成的链的性质而进行。
SDA扩增技术比PCR(需要一种自动调温水浴装置)更易于进行，而且比其它扩增方法更快速。因此，本发明还包含在DNA或RNA扩增方法如SDA技术中使用本发明的核酸片段(引物)。
本发明的多核苷酸，尤其是本发明的引物，在进行不同的靶核酸扩增方法中是有用的技术手段，所述方法如-Kwoh等在1989年所述的TAS(基于转录的扩增系统(Transcription-based Amplification System))；-Guatelli等在1990年所述的SR(自主序列复制(Self-SustainedSequence Replication))；-Kievitis等在1991年所述的NASBA(基于核酸序列的扩增(Nucleic acid Sequence Based Amplification))；及-TMA(转录介导的扩增(Transcription Mediated Amplification))。
本发明的多核苷酸，尤其是本发明的引物，也可作为技术手段在进行核酸扩增或修饰的方法中用作探针，所述方法如-LCR(连接酶链反应(Ligase Chain Reaction))，由Landegren等在1988年描述并由Barany等在1991年改进，Barany采用一种热稳定连接酶；-RCR(修复链反应(Repair Chain Reaction))，由Segev等在1992年描述；-CPR(循环探针反应(Cycling Probe Reaction))，由Duck等在1990年描述；及-Q-β复制酶反应，由Miele等在1983年描述并由Chu等在1986年、Lizardi等在1988年及由Burg等和Stone等在1996年改进。
当被检测的靶多核苷酸是RNA例如mRNA时，可以在扩增反应之前使用逆转录酶以从生物学样品中含有的RNA中获得cDNA。产生的cDNA随后可用作本发明的扩增方法或检测方法中使用的引物或探针的核酸靶。
本发明的寡核苷酸探针在严格条件下与包含本发明的所有或部分多核苷酸的DNA或RNA分子特异性杂交。在一个举例性的实施方案中，为了特异性检测本发明的多核苷酸而使用的严格杂交条件如下如下进行预杂交和杂交以增加异源杂交的可能性预杂交和杂交在50℃在含有5×SSC和1×Denhardt′s溶液的溶液中进行。
洗涤如下进行在60℃用2×SSC洗涤3次，每次20分钟。
本发明的未标记的多核苷酸可直接用作探针。然而，多核苷酸通常可用放射性元素(32P、35S、3H、125I)标记或者用非同位素分子例如生物素、乙酰氨基芴、洋地黄毒苷、5-溴脱氧尿苷、荧光素)标记，以产生用于多种应用的探针。核酸片段的非放射性标记的实例在法国专利No.FR 78 10975或由Urdea等或由Sanchez-Pescador等在1988年描述。
也可以使用其它标记技术，如法国专利2 422 956和2 518 755所述那些。可以不同方式进行杂交步骤。一般的方法包括将已经从生物学样品中提取出的核酸固定在底物(硝化纤维、尼龙、聚苯乙烯)上，然后在指定条件下温育所述靶核酸和探针。在杂交步骤后，弃去过量的特异性探针，并通过适当的方法(放射性、荧光或酶活性测定方法)检测形成的杂交分子。
优选地，本发明的探针可具有结构特征，由此允许信号扩增，这种结构特征例如是由Urdea等在1991年或者欧洲专利No.0 225 807(Chiron)所述的那些分支的DNA探针。
在本发明的另一个有利的实施方案中，本文所述的探针可用作“捕捉探针”，并为此而固定在底物上以捕捉生物学样品中含有的靶核酸。捕捉的靶核酸随后用第二种探针检测，所述第二种探针识别与捕捉探针识别的序列不同的靶核酸序列。
本发明的寡核苷酸探针也可用于包含固定在基质上的探针矩阵文库(matrix library)的检测装置中，给定长度的每个探针的序列彼此移位一或多个碱基，矩阵文库的每个探针因此与靶核酸的独特序列互补。任选地，矩阵的基质可以是能作为电子供体的材料，发生杂交的矩阵位置的检测随后通过电子装置确定。这种探针矩阵文库及靶核酸的特异性检测的方法在欧洲专利申请No.0 713 016，或者PCT申请No.WO 95 33846，或者PCT申请No.WO 95 11995(AffymaxTechnologies)，PCT申请No.WO 97 02357(Affymetrix Inc.)，及美国专利No.5,202,231(Drmanac)中有描述，所述专利和专利申请在此并入参考。
本发明还涉及含有至少一种本发明核酸的重组质粒。在细菌中、尤其在大肠杆菌中表达的合适载体是pET-28(Novagen)，其使得含有6xHis亲和性标记的重组蛋白质产生。所述6xHis标记置于重组多肽的C末端或N末端。
本发明的多肽也可以通过常规的化学合成方法在均质的溶液或在固相中制备。这种多肽的化学合成技术的一个示范性实例是Houbenweyl在1974年所述的均质溶液技术(homogenous solutiontechnique)。
本发明的多肽用于制备识别多肽(SEQ ID NO1、2、3和4)或其片段的多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein在1975年描述的技术从杂交瘤中制备。多克隆抗体可以通过用本发明的多肽组合一种佐剂免疫哺乳动物尤其是小鼠或兔，然后在预先固定有用作抗原的多肽的亲和层析柱上纯化免疫动物血清中含有的特异性抗体而制备。
本发明提供了检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的方法。
因此，本发明还提供了特异性检测生物学样品中本发明的多肽存在与否的方法。所述方法包括a)将生物学样品与本发明的抗体接触；b)检测形成的抗原-抗体复合物。
本发明还提供了一种诊断试剂盒，以在体外检测生物学样品中本发明多肽的存在与否。所述试剂盒包含上述多克隆或单克隆抗体，任选是标记的；及检测形成的抗原-抗体复合物的试剂，其中所述试剂任选携带一个标记，或者能通过一个标记的试剂而自身识别，更特别地在上述单克隆或多克隆抗体不是通过自身标记的情况中。
本发明还涉及使用多肽的完整序列(SEQ ID NO1、2、3、或4)在数据库中进行生物信息搜索。在这种情况中，所述方法检测编码选自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的至少一个亚序列的存在与否，其中所述至少一个亚序列是消旋酶的指征。
本发明还涉及
具有至少10个氨基酸的一种纯化的多肽或肽片段，其是由本发明的多核苷酸或肽序列的抗体识别。
由本发明的多核苷酸序列编码的多肽或肽片段的一种单克隆或多克隆抗体。
一种检测生物学样品中消旋酶的方法，包括a)将生物学样品的DNA或RNA与本发明的多核苷酸的引物或探针接触，所述引物或探针与核苷酸序列杂交；b)使用所述引物或探针扩增核苷酸序列；c)检测在引物或探针与DNA或RNA之间形成的杂交复合物。
一种检测生物学样品中消旋酶存在与否的试剂盒，其包含a)本发明的多核苷酸引物或探针；b)进行核酸杂交反应必需的试剂。
一种在体外筛选能抑制由含有本发明的多核苷酸的核酸编码的消旋酶的活性分子的方法，其中测试所述分子对至少所述消旋酶的抑制活性，包括a)提供含有本发明的多肽的消旋酶；b)将所述活性分子与所述消旋酶接触；c)测试各种浓度的活性分子抑制消旋酶活性的能力；d)选择对所述消旋酶的活性有至少80％抑制作用的活性分子。
本文所用术语“重组”是指本发明中应用的蛋白质或多肽衍生自重组(例如微生物或哺乳动物)表达系统。“微生物”是指在细菌或真菌(例如酵母)表达系统中产生的重组蛋白质或多肽。作为产物，“重组微生物”是指在微生物表达系统中产生的蛋白质或多肽，其基本上没有天然的内源物质。在大多数细菌培养物例如大肠杆菌中表达的蛋白质或多肽没有聚糖。在酵母中表达的蛋白质或多肽可具有与在哺乳动物细胞中表达的蛋白质或多肽不同的糖基化模式。
本发明的多肽或多核苷酸可以是分离或纯化形式的。在本说明书中针对蛋白质或多肽组合物的纯度而所用的术语“分离的”或“纯化的”是指蛋白质或多肽组合物基本上没有天然或内源的其它蛋白质，并含有低于大约1％质量的生产过程中的蛋白质污染物。然而，这种组合物可含有作为稳定剂、赋形剂或共治疗剂(co-therapeutics)而加入的其它蛋白质。这些性质相似地用于本发明的多核苷酸。
本发明的平台涉及进行筛选D-氨基酸测试方法的试剂、系统和装置。
适当的载体、稀释剂和佐剂可以与本文所述的多肽和多核苷酸组合以制备本发明的组合物。本发明的组合物含有所述多肽或多核苷酸以及固体或液体的可接受的非毒性载体。这种载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成的油脂。合适的液体是花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。水是优选的载体。生理溶液也可以用作液体载体。
现在参考如下实施例对本发明加以描述。
实施例1克隆和自动测序λ噬菌体和质粒DNA使用标准技术制备，直接测序使用Big dyeTerminator试剂盒(Perkin Elmer，Montigny-le Bretonneux，France)根据厂商指导而完成。扩展产物在ABI 377自动测序仪中运行7小时。简而言之，为获得全长的TcPRAC基因，32P标记的239bp PCR产物用作探针以筛选枯氏锥虫克隆CL-Brener lamba Fix II基因组文库(详见(13)所述)。有4种分离的独立的阳性噬菌体。限制分析和Southern印迹杂交显示两种类型的基因组片段，每种均由2个噬菌体代表。确定每种模式的代表性噬菌体的完整序列和侧翼区域。代表第一种噬菌体类型的TcPRACA基因的完全鉴定如先前所述(13)。然后进行鉴定代表第二种噬菌体类型的推定的TcPRACB基因的全部序列，并使用该序列内在的引物进行测序，如前所述(13)。
实施例2染色体印迹(Chromoblots)将短膜虫期的枯氏锥虫(克隆CL Brener)通过在LIT培养基中每周一次传代而保持。将含有1×107个培养的寄生虫的琼脂糖(0.7％)块用0.5M EDTA/10mM Tris/1％十二烷基肌氨酸钠pH8.0裂解，由蛋白酶K消化并在10mM Tris/1mM EDTA，pH8.0中洗涤。在18℃使用Gene Navigator装置(Pharmacia，Upsala，Sweden)在0.5×TBE中进行脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)。电泳如(14)所述进行。然后将凝胶用溴化乙啶染色、拍照、暴露于紫外线下(265nm)5分钟，并在碱性条件下进一步印迹于尼龙滤膜上(HybondN+，Amersham Life ScienceInc.，Cleveland，USA)。将使用Hi-45(5′CTCTCC CAT GGG GCA GGA AAA GCT TCT G 3′)[SEQ ID NO5]和Bg-45(5′CTG AGC TCG ACC AGA T(CA)T ACT GC 3′)[SEQ IDNO6]寡核苷酸通过PCR扩增TcPRACA基因获得的DNA探针(如(13)所述)使用Megaprime DNA标记系统(Amersham)用αdATP32标记。将染色体印迹在55℃在2×Denhart′s/5×SSPE/1.5％SDS中杂交过夜，并在60℃在2×SSPE/0.1％SDS及随后在1×SSPE中洗涤。使用Phosphorimager cassette(Molecular Dynamics，UK)，通过将染色体印迹过夜曝光获得放射自显影图实施例3质粒构建和蛋白质纯化在密码子30起始的TcPRACA基因片段通过使用Hi-和Bg-45引物PCR获得，并克隆进pET28b(+)表达载体(Novagen-Tebu，Le Perrayen Yvelines，France)中并符合C末端6-组氨酸标记的读框。编码TcPRACB的片段由通过相似PCR获得的TcPRACB基因片段的HindIII消化产物组成，并克隆进pET28b(+)表达载体中并符合C末端6-组氨酸标记的读框。相应的重组蛋白TcPRACA和TcPRACB在大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen，Cergy Pontoise，France)中产生，并在镍柱(Novagen-Tebu，Le Parrayen Yvelines，France)上根据厂商指导使用固定金属亲和层析(Immobilized Metal Affinity Chromatography)纯化。
实施例4大小排阻层析rTcPRACA和rTcPRACB蛋白质如上所述纯化，并在透析池(Slide-A-lyzer 7K Pierce)中在4℃对PBS pH7.4或0.2M NaOAc pH6.0洗脱缓冲液透析过夜。将最终的蛋白质浓度调节为2mg/ml，并将0.5ml该溶液加样于预先用中等范围的蛋白质校准试剂盒(Pharmacia)校准的Pharmacia Superdex 75柱(HR10×30)中。大小排阻层析(SEC)使用FPLC系统(AKTA Purifier，Pharmacia)进行。洗脱在恒定的0.5ml/分钟流速进行，收集0.5ml蛋白质级分并在280nm监测吸光度。将每个级分如下所述在外消旋分析中检测。将级分B1和B5再次加样于Superdex 75柱中并进行进一步的SEC以核实所述级分的纯度。
实施例5外消旋作用分析如(13)所述，计算不同浓度的L-脯氨酸、D-脯氨酸，L-羟基(OH)-脯氨酸，D-羟基(OH)-脯氨酸的外消旋作用百分比，通过将0.25μM二聚体蛋白质和40mM底物于0.2M乙酸钠pH 6.0中的500μl混合物在37℃温育30分钟或1小时而进行。反应通过在80℃温育10分钟并冷冻而终止。然后加入水(1ml)，并在旋光计241MC(Perkin Elmer，Montigny le Bretonneux，France)中测定路径长度10cm的细胞中旋光度，波长为365nm，精确度为0.001度。使用0.2M乙酸钠、磷酸钾和Tris-HCl缓冲液确定作为pH函数的40mM L-脯氨酸外消旋作用的百分比，如上述将反应在37℃温育30分钟。所有试剂均购自Sigma。
实施例6动力学分析L-和D-脯氨酸的浓度从溶液的旋光度中经旋光计在热稳定在37℃，路径长度10cm的细胞中确定，波长365nm。使用终体积为1.5ml的于0.2M乙酸钠(pH6)中的40mM L-脯氨酸进行初步分析。在10分钟期间每5秒测定一次旋光度，及每5分钟测定一次旋光度至1小时。在曲线的线性部分确定之后，在10分钟期间内每30秒测定一次在5-160mM底物中的速度以确定KM和Vmax。使用 程序进行计算。抑制分析通过如上述温育0.125μM二聚体蛋白质、6,7μM-6mM吡咯-2-羧酸(PAC)、20-160mM L-脯氨酸而进行。图式和曲线线性回归可以确定Ki为[PAC]/[(具有PAC的斜率/无PAC的斜率)-1]。所有试剂均购自Sigma。
实施例7C330STcPRACA的定点诱变定点诱变通过PCR，调整Higuchi等(15)的方法进行。简而言之，使用基于如下两种重叠(overlapping)的致突变引物的定点诱变通过两个连续的聚合酶链反应产生脯氨酸消旋酶活性位点的Cys330突变(act-1)5′GCG GAT CGC TCT CCAAGCGGG ACA GGC ACC 3′[SEQID NO7]和(act-2)5′GGT GCC TGT CCCGCTTGG AGA GCG ATCCGC 3′[SEQ ID NO8]，设计为在活性位点通过用丝氨酸(AGC)置换第330位的半胱氨酸(TGT)而导入一个密码子突变。第一步的标准PCR扩增通过使用TcPRACA DNA作模板及act-1引物和反向C-末端引物(Bg-45)5′CTG AGC TCG ACC AGA T(CA)T ACT GC 3′(密码子423)的混合物，或者act-2引物和正向N-末端引物(Hi-45)5′CTC TCCCAT GGG GCA GGA AAA GCT TCT G 3′(密码子-53)的混合物(见图5)进行。将获得的分别为316bp和918bp的扩增片段通过Qiagen PCR提取试剂盒(Qiagen，Courtaboeuf，France)根据厂商指导进行纯化，并进一步通过T4连接酶连接以产生由全长的潜在突变的TcPRACA*编码序列组成的模板用于第二步PCR。这个模板的扩增使用正向Hi-45和反向Bg-45引物进行，将编码成熟的脯氨酸消旋酶的所得TcPRACA*片段纯化并克隆进pCR_2.1-TOPO_载体(Invitrogen)中。TOP10感受态大肠杆菌用pCR_2.1-TOPO_-TcPRACA*构建体和分离自为DNA测序而制备的各个克隆的质粒DNA转化。然后将阳性突变体亚克隆进pET28b(+)表达载体(Novagen-Tebu，Le ParrayenYvelines，France)的NcoI/SacI位点并符合C末端6-组氨酸标记的读框。对在大肠杆菌(DH5α)中产生的pET28b(+)-TcPRACA*的亚克隆再次测序以证实突变的存在。可溶的重组C330STcPRACA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中产生，使用镍柱(Novagen-Tebu)根据厂商指导进行纯化。
实施例8诱变为核实脯氨酸消旋酶的反应机制中涉及残基Cys160，进行位点特异性诱变以用丝氨酸置换残基Cys160，与针对Cys330残基所述突变相似(见实施例7)。简而言之，使用如下引物通过PCR进行位点特异性诱变Ser160-正向5′GGCTATTTAAATATGTCTGGACATAACTCAATTGCAGCG3′Ser160-反向5′CGCTGCAATTGAGTTATGTCCAGACATATTTAAATAGC3′半胱氨酸-丝氨酸突变的存在通过测序含有所述PCR产物的相应质粒而核实，如下所示。质粒pET-C160S用于转化大肠杆菌BL21(DE3)并用于产生相应的重组的突变蛋白。
139M D T C G Y L N MCG H N G I A A145pET-TcPRAC 499ATCGATACCGCTGGCTATTTAAATATGTGTGGACATAACTCAATTGCAGCG550Ser160-F/RGGCTATTTAAATATGTCTGGACATAACTCAATTGCAGCG550pET-C160S 499ATGGATACCGGTGGCTATTTAAATATGTCTGGACATAACTCAATTGCAGCG550pET-C330S 499ATGGATACCGGTGGCTATTTAAATATGTGTGGACATAACTCAATTGCAGCG550139M D T C G Y L N MSG H N G I A A145318V I F G N R Q A D R S PCG T C T334pET-TcPRAC 999GTGATATTTGGCAATCGCCAGGCGGATCGCTCTCCATGTGGGACAGGCACC1050Ser330-F/RGCGGATCGCTCTCCAAGCGGGACAGGCACC1050pET-C160S 999GTCATATTTGGCAATCGCCAGGCGGATCGCTCTCCATGTGGGACAGGCACC1050pET-C330S 999GTGATATTTGGCAATCGCCAGGCGGATCGCTCTCCAAGCGGGACAGGCACC1050318V I F G N R Q A D R S PSG T C T334下划线处是用于位点特异性诱变的引物序列。Cys160和Cys330残基的Cys→Ser突变用黑体字和下划线表示。
实施例9脯氨酸消旋酶的功能性胞内同工型的表达先前鉴定的是来自枯氏锥虫的TcPRAC基因，在体内和体外论证了其编码脯氨酸消旋酶(13)。TcPRAC基因的基因组组构和转录分析表明每个单倍体基因组中存在两个同种异型基因拷贝，称为TcPRACA1和TcPRACB2。TcPRACA显示编码一种功能上不依赖于辅因子的脯氨酸消旋酶，与斯氏梭菌脯氨酸消旋酶(CsPR)非常相似(11)。对全长TcPRACB进行测序，从图1A中可以观察到TcPRACA和TcPRACB基因在基因间区域均具有特征性锥虫多嘧啶富集基序，当其位于用作受体位点的(AG)-二核苷酸的上游时是关键的反式剪接信号。在其它枯氏锥虫基因中，发现UUA三联体在聚腺苷酸化位点之前的3’未翻译区的末端。这两个序列之间的对比表明14个点突变(导致96％相同性)产生7个氨基酸差异。当表达时，预测TcPRACB产生较短的蛋白质(39kDa)，其翻译在位于(AG)-剪接的前导受体位点(在第175位)下游的第274位ATG密码子开始。对比之下，TcPRACA具有编码具有45kDa表观分子量的肽的开放读框。图1B中所示的两种蛋白质TcPRACA和TcPRACB的蛋白质序列对比图式表明TcPRACB脯氨酸消旋酶缺少相应于在TcPRACA蛋白质中观测到的信号肽氨基酸序列(图中阴影框所示；见图1C中推测的切割位点)。因此，TcPRACB产生39kDa的胞内和非分泌的蛋白质同工型。与CsPR(11)和TcPRACA(13和图1B)一样，脯氨酸消旋酶的活性位点在TcPRACB序列中是保守的。另外，虽然仅有7个氨基酸不同，但TcPRACA和TcPRACB序列与CsPR具有大约50％同源性(13)。与枯氏锥虫中其它蛋白质编码基因一致，TcPRAC基因位于两个不同的染色体条带上，一个条带含有三或多个相似大小的染色体，见图1D所示。因此，含有通过脉冲场凝胶电泳分离的枯氏锥虫CL Brener染色体条带的印迹的杂交表明由与TcPRACA和TcPRACB均同源的探针识别的序列图谱定位于分别相应于区域VII和V的大约0.9Mb和0.8Mb的邻近迁移条带中，根据Cano等的编号系统进行(14)。
为了核实TcPRACB基因是否可编码功能性脯氨酸消旋酶，将两种枯氏锥虫同种异型基因均在大肠杆菌中表达以产生C-末端His6-标记的重组蛋白质。在镍-次氮基三乙酸琼脂糖柱上通过亲和层析纯化后，重组蛋白质通过SDS凝胶电泳分离，揭示了对于rTcPRACA和rTcPRACB的分别具有45.8和40.1kDa预期大小的单一条带(图2A)。为确定rTcPRACB是否显示脯氨酸消旋酶活性，如述应用生物化学分析以测定L-和D-脯氨酸底物的旋光变化(13)。从图2B中可以看出，rTcPRACB对L-和D-脯氨酸均具有外消旋作用，但对L-羟基-脯氨酸无外消旋作用，rTcPRACA也如此。相似地，如对于CsPR(11)和rTcPRACA(13)脯氨酸消旋酶所述，rTcPRACB是一种辅因子非依赖性脯氨酸消旋酶。使用这两种重组酶在各种pH值测定L-脯氨酸转化为D-脯氨酸的速率。如图2C所示，rTcPRACA活性明显显示出pH依赖性，在pH 5.5-7.0活性最佳。相反，rTcPRACB的最佳活性可以在pH 4.5-8.5的pH大范围内观测到。这些结果表明这两种TcPRAC基因拷贝的开放读框的翻译产生功能性脯氨酸消旋酶同工型。如前所述，使用对抗45kDa分泌的脯氨酸消旋酶而产生的抗体对非感染性短膜虫期寄生虫提取物进行的Western印迹分析已经表明39kDa蛋白质主要在可溶的细胞级分中，仅少量在不可溶的细胞级分中，培养基中不存在(13)。为表明蛋白质的胞内39kDa同工型在体内的功能相同，从5×108个短膜虫期非感染性寄生虫中获得可溶的细胞提取物，39kDa可溶的蛋白质的水平通过Western印迹量化，与已知量的rTcPRACB酶对比。从图2D中可以看出，该蛋白质的胞内同工型在体内确实是功能性的，因为显示了脯氨酸消旋酶活性并且外消旋作用的水平依赖于蛋白质浓度。这个发现对到达胞内区室的特异性抑制剂是有益的。
实施例10重组枯氏锥虫脯氨酸消旋酶的功能分析和动力学性质由于TcPRAC基因拷贝编码具有独特的pH依赖性活性的分泌的和非分泌的脯氨酸消旋酶同工型，因此我们进行了研究以确定rTcPRACA与rTcPRACB蛋白质之间的其它生物化学性质是否不同。这种差异可反映寄生虫分化期间蛋白质的细胞定位及在宿主内的存活力。rTcPRACA和rTcPRACB酶活性均在37℃为最大，并可以通过在80℃加热5分钟而消除。然而，当在不同的贮存条件下分析时，这两种重组酶的稳定性显著不同。因此，如表1所示，纯化的rTcPRACB是高度稳定的，因为其活性在室温在0.5M咪唑缓冲液pH8.0中保持至少10天，对比之下，rTcPRACA在这种条件下丧失84％的活性。相反，在4℃rTcPRACA的大部分酶活性得以保持(65％)，相比之下rTcPRACB酶活性较低(34％)。这两种酶均可以在50％甘油中在-20℃保存，或者在乙酸钠缓冲液pH6.0中稀释，但在这些贮存条件下，rTcPRACA活性被削弱。然而，当将蛋白质作为硫酸铵沉淀保持在-20℃时无疑获得对这两种重组脯氨酸消旋酶的最佳保存方法。保存对试剂盒而言是重要的。
表1重组TcPRACA和TcPRACB脯氨酸消旋酶在不同贮存条件下的稳定性
在镍-次氮基三乙酸琼脂糖柱上纯化后，将重组蛋白质在镍柱缓冲液(20mM Tris/500mM NaCl/500mM咪唑，pH8.0)中在室温(RT)或+4℃保持10天，或者在50％甘油中稀释在-20℃保持(Gly/-20℃)，或者在4℃在最佳pH缓冲液(NaOAc，pH6.0)中保持。将重组酶在(NH4)2SO4中沉淀并在溶液中在4℃保持或将沉淀干燥在-20℃保持。在37℃进行30分钟消旋酶分析。活性保存百分比使用0.25μM纯化的rTcPRACA或rTcPRACB酶和40mM的L-脯氨酸经旋光计测定，与用新纯化的蛋白质(CTRL)获得的结果相对比。这些结果是至少两个独立实验的代表。
这两种重组酶均呈现Michaelis-Menten动力学(图3A)，rTcPRACB比rTcPRACA具有较高的活性。事实上从图3B可以看出，通过恒定量每种酶催化的L-脯氨酸的系列稀释液的L至D的转化分析显示rTcPRACB酶(KM为75mM，Vmax为2×10-4mol/秒)与rTcPRACA(KM为29mM，Vmax为5.3×10-5mol/秒)相比具有较高速度。为了确定吡咯-2-羧酸(PAC)的Ki值，对这两种重组蛋白质进行分析，吡咯-2-羧酸是CsPR的特异性抑制剂(16)。这些分析表明PAC是比较有效的rTcPRACA(图3C)和rTcPRACB抑制剂，获得的Ki值分别为5.7μM和3.6μM。Ki值的差异几乎完全地反映了对这两种酶所报道的KM值的差异，其与天然蛋白质的值相似。这些Ki值表明PAC抑制剂对rTcPRACA和rTcPRACB的亲和性高于对CsPR(Ki为18μM)的亲和性。KM和Ki值对抑制剂而言是重要的。
实施例11脯氨酸消旋酶活性对二聚体结构的需求当对rTcPRACA在Superdex 75柱上在pH6.0进行大小排阻层析时，洗脱了分别为大约80kDa(B2级分)和43kDa(B4级分)的两个蛋白质峰，推测其相应于酶的二聚体和单体形式(图4)。使用非变性的PAGE对完整的枯氏锥虫短膜虫期提取物进行Western印迹分析已经表明天然蛋白质的80kDa分子量条带，通过SDS-PAGE获得45kDa条带(13)。为了消除交叉污染，将在预测的二聚体(B2)或单体(B4)峰的起点和终点分别洗脱的B1和B5级分再加样于该柱上，获得的图式(见图4插入图)证实级分的纯度。酶活性位于80kDa峰，但未在43kDa峰(表2)。这些结果确证了蛋白质的这两个亚基是消旋酶活性所必需的。在中性pH(7.4或之上)，rTcPRACA产生高分子量的聚合体，其在rTcPRACB的情况中未观测到，这与其更广泛的最佳pH范围一致。例如对于试剂盒缓冲液而言，所述酶应在最佳pH条件下。
表2在大小排阻层析后重组TcPRACA级分的消旋酶活性
在从Superdex 75柱洗脱后，将相应于1μg蛋白质的20μl每个峰(A15至B7，见图4)在37℃与于0.2M NaOAc，pH6.0中的40mM L-脯氨酸温育1小时。如实施例5所述测定旋光度及确定外消旋作用百分比。
实施例11通过催化位点的Cys330及或者Cys160突变对脯氨酸消旋酶活性的消除斯氏梭菌脯氨酸消旋酶被描述为具有38kDa亚基及每两个亚基有一个脯氨酸结合位点的同源二聚体酶，其中在第256位的两个半胱氨酸也许在催化中通过转移质子至结合的底物而发挥关键作用(12)。先前已经显示枯氏锥虫脯氨酸消旋酶的促分裂原性质依赖于酶活性位点的完整性，因为B细胞增殖的抑制是通过底物竞争及通过与底物脯氨酸在过渡状态中的假定的结构相似的类似物(PAC)的特异性应用而获得的(16)。为核实枯氏锥虫脯氨酸消旋酶的活性位点的半胱氨酸残基的潜在作用，将Cys330或者Cys160通过TcPRACA的位点特异性突变而用丝氨酸残基置换。选择丝氨酸作为取代氨基酸以避免对蛋白质三维结构的进一步的较大干扰(见上图5中的策略)。在通过对构建体测序而证实单一密码子突变之后，将C330S或C160SrTcPRACA突变体脯氨酸消旋酶在大肠杆菌中表达并以与野生型rTcPRACA相同的方式纯化。然后在外消旋作用分析中使用C330S或C160SrTcPRACA以核实突变对蛋白质酶活性的作用。从表3(及图12)中可以看出，与野生型酶相对比观测到脯氨酸消旋酶活性全部丧失，确定在脯氨酸外消旋作用期间质子转移特异性依赖于活性位点中半胱氨酸残基的存在。
表3在定点C330SrTcPRACA中消旋酶活性的丧失
在纯化后，将5μg rTcPRACA或者C330SrTcPRACA在37℃与在NaOAc缓冲液pH6.0中的40mM L-脯氨酸温育。在不同时间测定旋光度及如实施例5所述测定外消旋作用百分比。
实施例12序列数据库中脯氨酸消旋酶蛋白质特征和推定的脯氨酸消旋酶寄生虫和细菌脯氨酸消旋酶之间关键残基的保守促使对TcPRAC与SWISS-PROT和TrEMBL数据库中其它蛋白质序列之间的相似性进行研究。来自11种生物体的21个蛋白质序列产生显著同源，所述生物体如α亚门的几种α-蛋白菌(proteobacteria)(农杆菌(Agrobacterium)、布鲁氏菌(Brucella)、根瘤菌(Rhizobium))和γ亚门的一些蛋白菌(黄单胞菌(Xanthomonas)和假单胞菌(Pseudomonas))，以及硬壁菌(fermicutes)(链霉菌(Streptomyces)和梭菌(Clostridium))。在真核生物中，除了枯氏锥虫之外，在人和小鼠基因组中检测到同源基因，其中预测的蛋白质显示与脯氨酸消旋酶的全面相似性。除了斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)和野油菜黄单胞菌(Xantomonas campestri)之外，每个其它生物体均编码2个同种异型，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有3个基因。多重排列对比还可以阐明脯氨酸消旋酶的3个特征，其在此以PROSITE形式描述。从表4中可以看出，当使用位于第79位起始密码子之后的脯氨酸消旋酶蛋白的最小基序(M I)，即[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG时，本发明人获得了9个标的(hit)。在第218位起始的由[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY]组成的第二个基序(M II)提供14个标的；然而，本基序的前一半或后一半不足以严格限制推定的脯氨酸消旋酶，但提供不同的蛋白质家族标的。从第326-339位的第三个基序(M III)称为DRSPXGX[GA]XXAXXA，被认为是最小的模式。注意在第330位，活性位点的半胱氨酸被X置换。如表4所示，这个最小模式产生所有21个标的。令人好奇地，在人体以及在小鼠中的基因均编码基序III中第X位的苏氨酸而不是半胱氨酸，而在布鲁氏菌、根瘤菌和农杆菌属的菌种中均编码在这个位置具有C的一个蛋白质和具有T的一个蛋白质。人们不能假定这种取代与这些推定的蛋白质功能的关系。如果在第330位的残基在基序III中保持是半胱氨酸，则因此从9种生物体种获得的生物体标的数降低至12，其可正确地认为是真实的脯氨酸消旋酶。21个蛋白质序列的对比和衍生的进化树分别示于图6和图7，三个框相应于上述基序I、II和III。本发明因此显示DRSPCGXGXXAXXA是脯氨酸消旋酶的最小特征。目前针对未完成的基因组的Blast研究从8种生物体中获得了额外13个推测的蛋白质序列，与脯氨酸消旋酶具有高度相似性，均含有基序III。生物体是艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(C.botulinum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.mallei)和真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。这些结果表明脯氨酸消旋酶可以是非常广泛分布的。
表4使用PROSITE基序的SWISS-PROT和TrEMBL数据库筛选
使用基序I-III(M I、M II和M III)筛选SWISS-PROT和TrEMBL数据库。M I相应于[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG，M II相应于[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY]，M III相应于DRSPXGXGXXAXXA，MIII*相应于DRSPCGXGXXAXXA。Access.Nb序列的SWISS-PROT登记号；seq根据图6的序列号；+和-使用相应的基序分别存存或不存在标的。
最后，表5概括了其中已经鉴别了脯氨酸消旋酶特征及存在包括催化位点的关键的残基Cys330和Cys160的序列的基因。
表5用TcPRACA的核苷酸或肽序列筛选的结果基序 一般序列
使用TcPRACA的核苷酸或肽序列筛选数据库。搜索基序I-III(M I，M II和M III)。M I相应于[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG，M II相应于[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGS[FWY]，M III相应于DRSPXGXGXXAXXA，M III*相应于DRSPCGXGXXAXXA。Access．NbsTIGR，EMBL或SANGER序列登记号；+和-分别存在或不存在相应的基序。其它的是所述基序之外的极度保守区域，包括含有活性位点半胱氨酸之一的NMCGH。序列示于附页中，其十活性位点的2个半胱氨酸残基的保守区域以方块表示，在表中与相应登记号以黑体字表示。
在天然发生的条件下在不同的哺乳动物组织中可以发现多种游离的D-氨基酸。一些实例包括D-丝氨酸存在于哺乳动物脑、外周和生理体液中，或者D-asp也可以在内分泌腺、睾丸、肾上腺和垂体中检测到。D-pro和D-leu水平在一些脑部区域、松果体和垂体中也非常高。一些报道认为D-氨基酸具有神经调节剂的关键作用(受体介导的神经传递)，在D-ser的情况中也如此，或者具有激素分泌、致癌和分化调节剂作用(即D-asp)。确信在哺乳动物组织和体液中天然发生的D-氨基酸的最可能的来源是通过原位存在的游离L-对映体的直接外消旋作用而合成。然而，除了丝氨酸消旋酶基因从大鼠脑和人中克隆之外，至今在人体内还未鉴别其它的氨基酸消旋酶。一些其它报道认为哺乳动物组织中存在的D-氨基酸衍生自营养和细菌。
关于D-氨基酸的存在与病理过程相关的报道数目越来越多表明生物学样品中D-氨基酸水平的改变具有一些诊断价值，例如患有阿尔茨海默病(Alzheimer)个体的脑中D-asp和D-Ala游离水平改变的鉴别。D-asp的数量在患有神经病变的脑区域中似乎降低，并且相应地D-ala增加。总而言之，与正常脑相比在阿尔茨海默病存在记忆力下降的患者脑中D-氨基酸总量增加，这提供了关于揭示新的简便D-氨基酸检测方法的新观点。同样，在帕金森病和精神分裂症患者脑中D-ser浓度改变，但其它的发现明显显示患者血浆中D-氨基酸的显著较高浓度与肾病相关或者老年人的血浆中D-氨基酸浓度较高。
先前的结果表明寄生虫促分裂原对多克隆B细胞激活有助于导致寄生虫逃避并在哺乳动物宿主中持续存在的机制。还已经表明TcPRAC是由感染形式的寄生虫释放的一种强力的B细胞促分裂原。吡咯羧酸对TcPRAC的抑制诱导TcPRAC的B细胞促分裂原能力全部丧失。
也已经显示突变体寄生虫对TcPRACA和TcPRACB基因的过表达能赋予这些突变体在体外对宿主细胞较好的入侵能力。这与如果这些基因通过遗传操纵而失活则寄生虫不能存活形成鲜明对照。另外，用亚促分裂原剂量的TcPRAC或者用适当的TcPRAC-DNA载体疫苗制剂对小鼠进行免疫，显示引发对TcPRAC的高水平特异性抗体应答及对活枯氏锥虫的感染性攻击的高水平的免疫保护作用。
总而言之，这些数据提示TcPRAC酶同工型是寄生虫存活和命运所必需的因子，并还支持寄生虫脯氨酸消旋酶对免疫接种和化疗均是一个良好靶位。事实上，将TcPRAC中和剂量吡咯羧酸加入到非感染的猴细胞培养物中不干扰细胞生长。此外，推测在人体中利用脯氨酸消旋酶抑制剂是可能的，因为在显示与TcPRAC有一些肽同源性的一个序列中已经观测到不存在PRAC酶活性关键的两个活性位点半胱氨酸残基(Cys330和Cys160)，这通过用TcPRAC基因序列blasting搜索人基因组可利用的数据而鉴别。
通过使用TcPRAC基因序列的数据进行资料探勘(data mining)观察到，可以在医学和农业学感兴趣的其它微生物中鉴别推定的脯氨酸消旋酶。从图8中可以看出，M I、M II和最特别地M III严格基序(脯氨酸消旋酶的特征)的存在表明那些蛋白质是功能性的脯氨酸消旋酶的可能性。一方面，可以观测到所述酶活性必需的关键残基在那些序列中展现，另一方面，该开放读框(ORF)与寄生虫PRAC的ORF高度同源。
为了搜索可用作TcPRAC或其它脯氨酸消旋酶抑制剂的推定的分子，必须研制能特异性表明脯氨酸外消旋作用被TcPRAC抑制及因此妨碍给定的脯氨酸立体异构体产生的一种微量测试。例如，这可以通过分析任何潜在的抑制分子在L-脯氨酸受到TcPRAC酶活性作用的反应中阻碍D-脯氨酸产生的能力而进行。
目前，检测D-(或L-)氨基酸的可利用的分析是非常有挑战性的，并且区分L-立体异构体与D-立体异构体的方法是耗时的，即气相层析、使用手性平板(chiral plate)的薄层层析、高效毛细管电泳方法、HPLC、及一些酶学方法。这些技术中有一些还需要使用柱和/或重装置，如旋光计或荧光检测仪。
针对用于快速筛选推定的TcPRAC抑制剂的简便测试的研制，使用可以产生大量重组活性酶的TcPRAC构建体及已知的脯氨酸消旋酶特异性抑制剂(吡咯羧酸，PAC)以产生一种中等/高流量的微量培养板(microplate)测试，其可用于简便地筛选大量的抑制剂候选物(即100-1000个)。这种测试基于比色反应，与旋光测定及其它耗时的测试相比确实是一种较简便的方法。通过旋光计评价L-或D-脯氨酸对映体的偏光度以量化脯氨酸外消旋作用的抑制以测试这种分子数目增加是不可行的，敏感性较低，及与微量培养板测试相比需要更多量的试剂，因而另外微量培养板测试的价格将是可以负担的。
因此，本发明的基础是在存在或不存在已知浓度的PAC抑制剂分别作为外消旋作用的阳性和阴性对照的情况下检测通过TcPRAC对L-脯氨酸的外消旋作用而产生的D-脯氨酸。为此，本发明利用另一种酶D-氨基酸氧化酶(D-AAO)，其在存在电子供体/受体的情况下具有特异性氧化D-氨基酸的能力并产生过氧化氢。这个策略的优势是过氧化氢可以在例如包含正-苯二胺的非常灵敏的反应中通过过氧化物酶而传统量化，最后提供通过在490nm比色而观测的显色反应。
由于D-氨基酸氧化酶与任何“D-氨基酸”均不加选择地反应，而与其L-立体异构体不反应，因此这种测试不仅有助于鉴别脯氨酸消旋酶抑制剂，而且如果稍加修改还可用于检测各种体液中游离D-氨基酸水平的任何改变，以诊断一些病理过程。
ID-氨基酸定量测试的基础如下本发明的方法可以检测和量化D-氨基酸。第一个反应包括D-氨基-氧化酶。根据酶的起源，这个酶与辅基黄素-腺苷-二核苷酸(Flavin-Adenin-Dinucleotide，FAD)或黄素-单核苷酸(Flavin-Mononucleotide，FMN)，一起特异性催化D-氨基酸的氧化脱氨作用(注如果酶来自猪肾则是FAD)。
一般反应如下进行
在(1)中，D-氨基酸被脱氨及氧化，释放氨和还原的辅基。如果氨基基团不是初级基团，则氨基基团保持不变并且无氨释放。
在(2)中，还原的辅基使氧还原并产生过氧化氢。
过氧化氢酶或过氧化物酶均可分解过氧化氢。
过氧化氢酶活性写作
氧而过氧化物酶活性是
其中R′是任何碳链。
因此，过氧化氢的检测可以使用过氧化氢酶和对氧灵敏的试剂进行，如通过用氧使还原的亚甲蓝脱色或者使用过氧化物酶使试剂的颜色改变，如下所示
II评价枯氏锥虫消旋酶活性和这种消旋酶抑制的这种测试的应用II-1消旋酶活性的测试枯氏锥虫消旋酶活性将L-Pro可逆地转变D-Pro。由于这两种形式可诱导偏振光偏离，因此这种转变可通过光学偏振光偏离而测定。但是D-形式的存在也可以使用D-氨基酸氧化酶以确定消旋酶动力学中D-脯氨酸的量。在这个测试中包含如下反应1)脯氨酸消旋酶活性
2)D-氨基酸氧化酶
(注在脯氨酸的情况中无形成的氨，因为脯氨酸的氮参与仲胺中)。
3)用过氧化物酶对过氧化氢进行检测
(无色) (显色)生色试剂可例如是正苯二胺(orthophenylenediamine，OPD)，或者3，3′，5，5′四甲基联苯胺(3，3′，5，5′tetramethyl benzidine，TMB)，或者5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid，ASA)。
这些反应可以使用如下举例且优选的材料和方法进行。
II-1-1材料
II-1-2方法II-1-2.1微量培养板中的外消旋作用(1)体积是指一个孔而言，但强制一式两份进行。为在进一步的步骤中使用的标准和对照孔，剩余足够的空的显微培养板孔。每个孔反应分配如下体积a)无抑制剂(Vol＝QS 81μl)
b)有抑制剂(Vol＝QS 81μl)对于抑制剂，浓度范围可以计划在5mM-1mM之间。其应在0.2M pH 6.0乙酸钠缓冲液中稀释。因此，抑制剂的体积从加入的缓冲液的体积中减去以达到终体积为81μl。例如，当使用36.5μl PAC+44.5μl缓冲液时，10mM L-脯氨酸的外消旋作用的50％抑制是用45μM吡咯羧酸(PAC，脯氨酸消旋酶的特异性抑制剂)获得(见图8中结果)。
表6是10mM L-脯氨酸作为底物的结果。
表6
(2)用粘性盖子覆盖所述微量培养板并在37℃放置30分钟。
(3)在外消旋作用结束时，向微量培养板的每个反应孔中加入5.5μl 0.235M Pop以将pH从pH6.0改变至pH8.3。
II-1-2.1-2形成的D-脯氨酸的量化标准和对照(1)制备标准和对照标准L-和D-脯氨酸的等摩尔混合物用作标准，范围是0.05mM-50mM(分析中的终浓度)。其用于确定在外消旋作用后形成的D-脯氨酸的量。如下在微量试管中产生标准范围。
在试管1中，根据所述比例混和脯氨酸和缓冲液。然后在下一个试管中将500μl获得的混合物加入500μl缓冲液中，等等。
阴性对照如下所述在另一个微量试管中制备。
L-脯氨酸(1M) 200μl缓冲液*800μl终浓度40ml空白＝缓冲液*(2)在微量培养板的空孔中分配(见步骤II-1-2.1)缓冲液*67μl标准稀释液或阴性对照 20μl
注对空白仅分配87μl缓冲液*(3)如下制备含有酶(D-AAO/HRP混合物)的混合物给定的量是针对一个孔的，终体积是具有所述消旋酶产物或底物的100μl总体积13μl缓冲液*6.5μlD-AAO 50U/ml 1.7μlOPD(20mg/ml) 2.5μlHRP 5000U/ml 0.75μlFAD 10-3M(4.5μl 10-1M+446μl缓冲液) 1.5μl将这个混合物在冰上保持直至使用。
(4)当将13μl D-AAO/HRP混合物加入反应孔中时开始量化反应。
(5)将微量培养板用粘性盖子覆盖并将其在37℃置于黑暗中30分钟-2小时。反应可以随时通过目测检测，只要颜色梯度符合标准稀释的D-氨基酸浓度。
(6)使用490nm滤片用微量培养板分光光度计读数该微量培养板。
实施例13D-AOO微量培养板测试与通过旋光计检测D-氨基酸相比更灵敏为了对比通过旋光计和通过D-氨基-氧化酶/HRP对D-脯氨酸的量化，使用不同浓度的L-脯氨酸和不同浓度的PAC(脯氨酸消旋酶的特异性抑制剂)在这两个测试之间进行对比。图8显示使用D-AAO(D-AAO/L-)微量测试与常规旋光计检测(Pol/L-)相对比，不同浓度(10-40mM)的L-脯氨酸的外消旋作用的抑制百分比使用旋光计，似乎三种浓度的L-脯氨酸对TcPRAC的PAC抑制无差异。因此，使用1mM PAC获得50％抑制，无论使用10mM还是40mM L-脯氨酸。相反，当使用D-AAO/HRP测试时可以看出PAC抑制在低浓度(例如10mM)比在高浓度(20mM或40mM)L-脯氨酸情况下略微更高。因此，50％抑制在如下情况中获得-当使用10mM L-脯氨酸时用50μM PAC，-当使用20mM L-脯氨酸时用170μM PAC，-当使用40mM L-脯氨酸时用220μM PAC。
总而言之，D-AAO/HRP评估是更灵敏的，因为其可以在比旋光计评估更低的浓度区别PAC抑制。另外，在逻辑上抑制与L-脯氨酸浓度成反比，这可以用D-AAO/HRP方法确定，而不是用旋光计测定方法确定。这种测试用于在中等/高流量测试中筛选新的TcPRAC抑制剂。
进行上述测试及选择适当的抑制剂的一种优选的技术平台含有至少如下产品L-脯氨酸，D-脯氨酸，脯氨酸消旋酶过氧化物酶，过氧化物酶的底物D-氨基酸氧化酶及任选地，一组潜在的抑制分子实施例14L-脯氨酸抑制D-氨基-氧化酶活性图9显示单独使用D-脯氨酸或者使用D-和L-脯氨酸的等摩尔混合物作为标准，D-AAO/HRP反应的对比。可以看出当使用L-和D-脯氨酸的混合物与单独使用D-脯氨酸进行对比时，获得给定光密度需要的D-脯氨酸量较高。因为当L-和D-脯氨酸等量时，脯氨酸消旋酶活性终止，这对使用脯氨酸的两种对映体的等摩尔混合物作为D-脯氨酸检测的标准也是适当的。
实施例15PAC不干扰DAAO/HRP活性图10显示在如下条件下作为D-脯氨酸浓度的函数的490nm光密度。
在μl孔中的条件[D-脯氨酸]0.1mM-40mM[D-AAO] 0.89U/ml[HRP] 37.5U/ml[OPD] 0.5U/ml[FAD] 1.5×10-5M缓冲液*PAC的存在不影响DAAO/HRP反应。
实施例16使用D-AAO微量培养板测试的中/高流量测试表VII显示了使用D-AAO微量培养板测试的中等/高流量测试的实例。
蓝色D-脯氨酸标准(第1列)绿色使用avec 10mM底物的外消旋作用阳性对照(第2列，A和B行)橙色使用10mM底物通过PAC对外消旋反应的抑制对照(第2列，C和D行)空白1含有消旋酶的混和物(第2列，E行)空白2不含消旋酶的混和物(第2列，F行)黄色特异性阴性对照(无消旋酶+40mM L-脯氨酸)(第2列，G和H行)其它孔具有抑制剂(T1，T2，T3，…T40)一式两份。
表VII1
实施例17这种测试在通常检测样品中D-氨基酸中的应用基于D-氨基酸氧化酶与过氧化物酶如辣根过氧化物酶的微量培养板测试可以用于检测并量化任何生物学或化学样品中的任何D-氨基酸。例如，由于D-氨基酸参与一些病理过程或神经系统疾病如阿尔茨海默病、帕金森病或肾病，因此对其的检测可以是这些病变的诊断及预后的重要标记或参数。这个技术也可以扩展为检测和量化真核生物体如植物或真菌及在细菌中的D-氨基酸。
上述D-AAO/HRP测试略加修改也可以用于此目的。为此，应跳过消旋酶反应步骤，微量培养板测试应直接在上述II-1-2.1-2步骤开始，备注如下1)标准其不应是D-和L-氨基酸的等摩尔混合物，而是D-氨基酸的系列稀释液。根据研究中的感兴趣的D-氨基酸选择氨基酸。孔中终体积应为87μl。
2)阴性对照其是用研究的D-氨基酸的L-对映体制成。终体积应为87μl。
3)空白其用87μl缓冲液*制成(见段落II.1.1材料)。
4)样品测试的样品应用缓冲液*调节为pH8.3，其终体积应为87μl/孔。
注标准、阴性对照、测试样品和空白应制成一式两份。将它们分配至微量培养板的孔中。
5)然后，如上述进行步骤3)-6)。
一些D-氨基酸及其L-对映体已经使用上述微量培养板测试。表VIII和表IX显示了酪氨酸、缬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸和色氨酸的D-形式确实是D-AAO/HRP的底物并通过如对于D-脯氨酸所述同样测试检测。结果还显示通过这种方法学未检测到L-氨基酸。
表VIII
在D-AAO反应后获得的490nm处的光密度(原始OD数据)表IX
微量培养板的模板，其中制成D-脯氨酸(mM)的系列稀释液作为D-AAO反应的阳性对照。显示了含有缓冲液*的空白孔。测试了不同的L-和D-氨基酸，即酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)和色氨酸(Try)。为突出D-AAO微量测试的灵敏性，在反应中使用与用于D-对映体的浓度(6.25mM)相比较高浓度的L-对映体(12.5mM)。
图11是用D-脯氨酸的系列稀释液作为阳性反应对照获得的图表。注孔(-)的OD得自空白孔的平均OD。
一种搜索并量化样品中D-氨基酸存在的优选平台，其含有至少如下的产品D-氨基酸，过氧化物酶和过氧化物酶底物D-氨基酸氧化酶及任选地L-氨基酸对映体作为对照。
最后，本发明涉及一种筛选可调节消旋酶活性的分子的方法，其中所述方法包括(A)在存在L-氨基酸和D-氨基酸的等摩尔混合物及待被调节的消旋酶的情况下，利用被测试的分子调节消旋酶活性；(B)利用辅基中的D-氨基酸氧化酶对在步骤(A)中产生的D-氨基酸进行氧化脱氨；(C)检测通过氧化脱氨产生的过氧化氢；其中过氧化氢的调节表示测试的分子调节消旋酶活性的能力。优选地，所述分子抑制消旋酶活性，更优选地，所述消旋酶是脯氨酸消旋酶，例如枯氏锥虫脯氨酸消旋酶。通过这种方法鉴别的分子也是本发明的一部分。
另外，本发明涉及进行本发明方法必需的技术平台及所有试剂和装置。所述技术平台包含a)L-氨基酸、D-氨基酸和消旋酶；
b)过氧化物酶和过氧化物酶底物，或者过氧化氢酶和一种对氧敏感的试剂；c)D-氨基酸氧化酶；及d)任选地，就抑制所述消旋酶的活性而被筛选的一或多种分子。
优选地，所述消旋酶是脯氨酸消旋酶，L-氨基酸和D-氨基酸分别是L-脯氨酸和D-脯氨酸。
一种分子抑制脯氨酸消旋酶，其含有选自SEQ ID NO1、2、3或4的亚序列。
实施例18脯氨酸消旋酶的特征DRSPCGXGXXAXXA在此定义为基序III*的脯氨酸消旋酶的特征DRSPCGXGXXAXXA含有在上述序列中也观测到的残基Cys330。不同的序列和重叠群也含有NMCGH基序，相应于TcPRAC的残基Cys160周围的序列，已表明其对酶活性是重要的。下面描述了一些实例。与脯氨酸消旋酶活性的关键Cys残基相关的序列框在方块内。
方框显示的是NMCGH(Cys160)残基和DRSPCGTGTSAKMA(基序III，含有Cys330的特征)残基1-Bacillus anthracis＞gnl|TIGR_1392|banth_4742 Bacillus anthracis unfinished fragment of complete genomeLength＝11981Score＝14l bits(302)，Expect(3)＝4e-69Identities＝60/146(41％)，Positives＝91/146(62％)Frame＝+1/-3Query763 GEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHIN 942G V DIA+GGNF+AI+ A+ +G+++ ++ S + ++R IN ++ HP+ ISbjct8379 GTVEADIAYGGNFYAIIDAKSVGLELVPEHASTIIDKAIHIRNIINERFEIIHPEYSFIR 8200
Query1123 SILGSLFQGRVLGEERIPGVKVPVTK 1200SI+GSLF+G V++ ++ VTKSbjct8019 SIVGSLFKGCVINTTNVANMEAVVTK 7942Score＝137 bits (294)，Expect(3)＝4e-69Identities＝54/117(46％)，Positives＝79/117(67％)Frame＝+1/-3Querv262 MRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHD 44lMR +K FT ID HT G R + SGLP + G MAEK ++++ D++R+ +M EPRGHDSbjct8859 MRTQKVFTTIDTHTGGNPTRTLISGLPKLLGETMAEKMLHMKKEYDWIRKLLMNEPRGHD 8680 ＞gnl|TIGR_1392|banth_4799 Bacillus anthracis unfinished fragment of complete genomeLength＝22506Score＝125 bits(267)，Expect(4)＝4e-68Identities＝56/145(38％)，Positives＝86/145(59％)Frame＝+1/-3Query766 EVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINT 945E +VDIAFGG F+A+V +++ G+ + ++LS +Q+ G ++ I ++V+HP+Sbjct5188 EFQVDIAFGGAFYAVVDSKEFGLKVDFKDLSAIQQWGGKIKHYIESKMEVKHPLEEGLKG 5009
Query1126 ILGSLFQGRVLGEERIPGVKVPVTK 1200IF+G VL+ + V KSbjet4828 ITDGEFEGEVLSVTAVHTYEAVVPK 4754Score＝124 bits(266)，Expect(4)＝4e-68Identities＝48/113(42％)，Positives＝65/113(57％)Frame＝+1/-3Query262 MRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHD 441M+ K +T ID H GE RI+T G+P I GE++ Y E++DYLR +M EPRGHSbjct5662 MKVSKVYTTIDAHVAGEPLRIITGGVPEIKGETQLERRWYCMEHLDYLREVLMYEPRGHH 5483 M+G + PAD G++FM G+ MCGH IA +T +ETG+ KSbjct5482 GMYGCIITPPASAHADFGVLFMHNEGWSTMCGHGIIAVITVGIETGMFETKQK 53242-Clostridium botulinum＞gnl|SANGER_36826|cbotul_Contig173 clostridium botulinum A unfinished fragment of completegenomeLength＝97750Score＝178 bits(383)，Expect(4)＝3e-98Identities＝70/138(50％)，Positives＝102/138(73％)Frame＝+1/-2Query760 YGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHI 939YG++ +DI+FGG+FFA+V AE++GIDIS N +L + G + +N V+++HP L HISbjct70443 YGKLTLDISFGGSFFAMVDAEKVGIDISPANSQKLNDLGMKIVHAVNEQVEIKHPVLEHI 70264 Query1120 ESILGSLFQGRVLGEERI 1173ESI+ + F+G++L E ++Sbjct70083 ESIICTKFKGKILEETKV 70030Score＝166 bits(357)，Expect(4)＝3e-98Identities＝70/118(59％)，Positives＝81/118(68％)Frame＝+1/-2
Query259 IMRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGH 438IMR K+ I+ HT GE RIV GLP +PG MAEK YL+EN D LR +M EPRGHSbjct70926 IMRAIKTIQTIESHTMGEPTRIVIGGLPKVPGKTMAEKMEYLEENNDSLRTMLMSEPRGH 70747 ＞SANGER Cbot12g05.q1cScore＝584(210.6bits)，Expect＝7.7e-57，P＝7.7e-57Identities＝115/224(51％)，Positives＝156/224(69％)，Frame＝-2 Query135 QSGTESEVSNASIINVPSFLYQQDVVIVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEHLGIDIS 194+ G E S I+NVP+FLY++DV I +P YG++ +DI+FGG+FFA+V AE +GIDISSbjct480 EDGKAKETS---IVNVPAFLYKKDVEIDVPD-YGKLTLDISFGGSFFAMVDAEKVGIDIS 313Query195 VQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINTVDCVEIYGNATNPEAKYKNVVIFGNR 254N +L + G + +N V+++HP L HI TVD E YG A + +A +NVV+FGSbjct312 PANSQKLNDLGMKIVHAVNEQVEIKHPVLEHIKTVDLCEFYGPAKSEDADVQNVVVFGQG 133 3-Aspergillus fumigatus＞gnl|TIGR_5085|afumi_1044 Aspergillus fumigatus unfinished fragment of complete genomeLength＝7621Score＝46.0bits(94)，Expect(4)＝3e-16Identities＝21/72(29％)，Positives＝34/72(47％)Frame＝+1/+2 Query1153 VLGEERIPGVKV 1188E + V +
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＞LM16_BIN_Contig2054 L.major Friedlin contig not yet assigned to chromosomefrom LM16bin，unfinished whole chromosome shotgun data sequencedby the Wellcome Trust Sanger Institute，Contig number Contig2054，length 873bpLength＝873Score＝242(90.2bits)，Expect＝2.5e-31，Sum P(3)＝2.5e-31Identities＝61/180(33％)，Positives＝91/180(50％)，Frame＝+2[HSP Sequence]Query93 SGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGIVFMD 152+G P + G +A+K L+ D RR +LEPRG+D + GAP+ A G++F +Sbjct2 TGFPELAGETIADKLDNLRTQHDQWRRACLLEPRGNDVLVGALYCAPVSADATCGVIFFN 181 Query213 NASIINVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQE 272++ NVP++ Y+Q V V +P +G V DIA+GGN+F +V G + + N+ L +Sbjct329 --TLRNVPAYRYRQQVPVDVPG-HGRVYGDIAWGGNWFFLVSDH--GQALQMDNVEALTD 493Score＝91(37.1bits)，Expect＝2.5e-31，Sum P(3)＝2.5e-31Identities＝24/69(34％)，Positives＝34/69(49％)，Frame＝+3[HSP Seauence] Query367 VLGE-ERIP 374E +R+PSbjct759 YQWECKRVP 785Score＝48(22.0bits)，Expect＝2.5e-31，Sum P(3)＝2.5e-31Identities＝11/28(39％)，Positives＝16/28(57％)，Frame＝+3[HSP Seauence]Query391 VTAEITGKAFIMGFNTMLFDPTDPFKNG 418V IT +A++ +T+L D DPF GSbjct780 VPPSITRRAYMTADSTLLID*QDPFAWG 863
＞LM16W5b02.qlcScore＝245(91.3bits)，Expect＝2.3e-19，P＝2.3e-19Identities＝62/182(34％)，Positives＝92/182(50％)，Frame＝+1[HSP Seouence]Query91 VTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGIVF 150V +G P + G +A+K L+ D RR +LEPRG+D + GAP+ A G++FSbjct1 VMTGFPELAGETIADKLDNLRTQHDQWRRACLLEPRGNDVLVGALYCAPVSADATCGVIF 180 Query211 VSNASIINVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRL 270++ NVP++ Y+Q V V +P +G V DIA+GGN+F +V G + + N+ LSbjct334 ----TLRNVPAYRYRQQVPVDVPG-HGRVYGDIAWGGNWFFLVSDH--GQALQMDNVEAL 492Query271 QE 272+Sbjct493 TD 49811.Trypanosoma bruceiSANGER＞tryp_IXb-28b06.qlcScore＝305(112.4bits)，Expect＝5.4e-27，P＝5.4e-27Identities＝61/142(42％)，Positives＝84/142(59％)，Frame＝-2[HSP Sequence]Query20 RIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGI 79RI+T G+P I GE++AY E++DYLR +M EPRGH M+G + PAD G+Sbjct421 RIITGGVPEIKGETQLERRAYCMEHLDYLREILMYEPRGHHGMYGCIITPPASAHADFGV 242 Query140 SEVSNASIINVPSFLYQQDVVI 161SEV + S NVPSF+Y++DV ISbjct76 SEVESVSFENVPSFVYKKDVPI 11＞tryp_IXb-28b06.plc[Full Sequence]Score＝296(109.3bits)，Expect＝4.8e-26，P＝4.8e-26
Identities＝59/140(42％)，Positives＝82/140(58％)，Frame＝+1[HSP Sequence]Query22 VTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGIVF 81+T G+P I GE++AY E++DYLR +M EPRGH M+G + PAD G++FSbjct10 ITGGVPEIKGETQLERRAYCMEHLDYLREILMYEPRGHHGMYGCIITPPASAHADFGVLF 189 Query142 VSNASIINVPSFLYQQDVVI 161V + S NVPSF+Y++DV ISbjct355 VESVSFENVPSFVYKKDVPI 41412.Trypanosoma congolenseSANGER＞congo208e06.plkw[Full Sequence]Length＝478Plus Strand HSPsScore＝104(41.7bits)，Expect＝0.00070，P＝0.00070Identities＝31/103(30％)，Positives＝56/103(54％)，Frame＝+3[HSP Sequence]Query187 FGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINTVDCVEIY 246+GGN+F +V G ++ + N+ L + + +N +++ Q + +D +E++Sbjct54 WGGNWFFLVSDH--GHELQMDNVEALTDYTWAM---LN-ALEAQGIRGADGALIDHIELF 215 SANGER＞congo208e06.plk[Full Sequence]Lenghh＝164Plus Strand HSPsScore＝78(32.5bits)，Expect＝0.085，P＝0.082Identities＝19/55(34％)，Positives＝34/55(61％)，Frame＝+3[HSP Sequence]Query160 NVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQE 214
+VP++ Y++ V V +P +G V DIA+GGN+F +V G ++ + N+ L +Sbjct3 HVPAYRYRKQVPVEVPG-HGVVLGDIAWGGNWFFLVSDH--GHELQMDNVEALTD 15813.Trypanosoma vivaxSANGER＞Tviv655d02.plk 4405bp，11 reads，51.90 AT[Full Sequence]Length＝4405Plus Strand HSPsScore＝403(146.9bits)，Expect＝4.3e-37，P＝4.3e-37Identities＝77/117(65％)，Positives＝91/117(77％)，Frame＝+1[HSP Sequence]Query174 LPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQ 233LP PYG+ V I+FGG+FFA++ A QL + + +LS LQ G LLR +NR+V VQHPQSbjct34 LPHPYGKYAV-ISFGGSFFALIDAAQLQLTVDKGHLSTLQHVGGLLRDTLNRNVSVQHPQ 210 SANGER＞Tviv380d6.plkScore＝156bits(395)，Expect＝1e-36Identities＝70/106(66％)，Positives＝88/106(82％)IQuery67 REIMRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPR 126R +M+F + TCIDMHT GE ARIVTSG P+IPG+++ EK+ +LQ +MD++RR +MLEPRSbjct41 RVVMQFTGTMTCIDMHTAGEPARIVTSGFPNIPGASLVEKRDHLQRHMDHIRRRVMLEPR 100 14.Vibrio parahaemolyticus＞EM_PROAP005077 AP005077.1 Vibrio parahaemolyticus DNA，chromosome 1，completesequence，5/11.
Length＝299，130Minus Strand HSPs
Score＝616(221.9bits)，Expect＝6.2e-57，P＝6.2e-57Identities＝134/357(37％)，Positives＝207/357(57％)，Frame＝-2IQuery66 KREIMRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEP 125K MR + +F CID HT G R+V G+P + G+ M+EK+ Y E+ D++R+ +M EPSbjct210923 KERKMR-QGTFFCIDAHTCGNPVRLVAGGVPPLEGNTMSEKRQYFLEHYDWIRQALMFEP 210747 Query186VPVVLDTPAGLVRGTAHLQSGTESEVSNASIINVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAF 245+ +LD PAG +H Q+ + +V++ I NVP++L QDV V + + GE+ VD+A+Sbjct210569 L--ILDVPAGQIE--VHYQTKGD-KVTSVKIFNVPAYLAHQDVTVEI-EGLGEITVDVAY 210408Query246GGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINTVDCVEIYG 305GGN++ IV +++ + + +RT ++++V+ HP P + V V GSbjct210407 GGNYYVIVDPQENYAGLEHYSPDEILMLSPKVRTAVSKAVECIHPNDPTVCGVSHVLWTG 210228 Query366RyLGEERIPGVKVPVTKDAEEGMLVVTAEITGKAFIMGFNTMLFDPTDPFKNGFTLK 422R+ G +T+G + I G A + G NT+ D DP+ GF +KSbjct210047 RIEG----------ITE--VNGQTAILPSIEGWAQVYGHNTIWVDDEDPYAYGFEVK 209913
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4The proline racemase/B-cell mitogen of Trypanosomacruzi is avirulence factor whose mRNA is differentially regulated throughdevelopment by alternative splicing.N.Chamond，N.Coatnoan，J.C.Barale，A.Cosson，A.Berneman，W.Degrave and P.Minoprio.手稿撰写中。
根据本发明使用D-氨基酸氧化酶的微量测试相关的参考书1.Reina-San-Martin B.，Degrave W.，Rougeot C.，Cosson A.，Chamond N.，Cordeiro-da-Silva A.，Arala-Chaves M.& Minoprio P.(2000)AB-cell mitogen from a pathogenic trypanosome is a eukaryoticproline racemase.Nature Medicine，6，890.
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权利要求
1.一种纯化的核酸分子，其编码由选自SEQ ID NO1、2、3、或4的基序组成的肽。
2.一种纯化的核酸分子，其在中等严格条件下与包含权利要求1的核酸分子的变性双链DNA的任一链杂交。
3.一种重组载体，其指导选自由权利要求1或2的纯化的核酸分子组成的一组的一种核酸分子的表达。
4.一种纯化的多肽，其由选自由权利要求1或2的纯化的核酸分子组成一组的一种核酸分子编码。
5.一种由基序I(SEQ ID NO1)组成的纯化的多肽。
6.一种由基序II(SEQ ID NO2)组成的纯化的多肽。
7.一种由基序III(SEQ ID NO3)组成的纯化的多肽。
8.一种由基序III*(SEQ ID NO4)组成的纯化的多肽。
9.与权利要求4的多肽结合的纯化的抗体。
10.权利要求9的纯化的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
11.与权利要求5的多肽结合的纯化的抗体。
12.权利要求11的纯化的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
13.与权利要求6的多肽结合的纯化的抗体。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.与权利要求7的多肽结合的纯化的抗体。
16.权利要求15的纯化的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
17.与权利要求8的多肽结合的纯化的抗体。
18.权利要求17的纯化的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
19.由权利要求3的重组载体转染或转导的宿主细胞。
20.一种生产由SEQ ID NO1、2、3或4组成的多肽的方法，包括在促进表达的条件下培养权利要求17的宿主细胞，并从宿主细胞或培养基中回收所述多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、寄生虫细胞及真核细胞。
22.一种免疫复合物，其包含权利要求4的多肽和特异性识别所述多肽的抗体。
23.一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的方法，所述方法包括(a)将所述核苷酸序列与一种与权利要求1的核酸分子杂交的引物或探针接触；(b)使用所述引物或所述探针扩增所述核苷酸序列；(c)检测在所述引物或探针与所述核苷酸序列之间形成的杂交复合物。
24.一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的方法，所述方法包括(a)将由所述核苷酸序列编码的产物消旋酶与权利要求9-18任一项的抗体接触；(b)检测所得免疫复合物。
25.一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的试剂盒，所述试剂盒包含(a)一种多核苷酸引物或探针，其与权利要求1的多核苷酸序列杂交；(b)进行核酸杂交反应的试剂。
26.一种检测由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的试剂盒，所述试剂盒包含(a)权利要求9或10任一项的纯化的抗体；(b)纯化形式的标准试剂；(c)检测试剂。
27.一种筛选能抑制由含有编码选自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亚序列的核苷酸序列编码的消旋酶的活性分子的体外方法，所述方法包括(a)将所述活性分子与所述消旋酶接触；(b)测试各种浓度的所述活性分子抑制消旋酶活性的能力；(c)选择对消旋酶的活性有至少80％抑制作用的所述活性分子。
28.一种免疫组合物，其含有能在体内诱导免疫应答的权利要求4的至少一种纯化的多肽，及一种药物学载体。
29.一种检测D-氨基酸的方法，其中所述方法包括(A)提供含有D-氨基酸的反应介质；(B)将该D-氨基酸与具有辅基的D-氨基氧化酶反应以通过对具有伯胺的D-氨基酸的氧化脱氨或者对具有仲胺的D-氨基酸的氧化而形成还原的辅基；(C)将还原的辅基与氧反应形成过氧化氢；(D)检测由此形成的过氧化氢。
30.权利要求29的方法，其中所述辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或者黄素单核苷酸(FMN)。
31.权利要求30的方法，其中所述过氧化氢通过与过氧化氢酶反应而被检测。
32.权利要求29的方法，其中D-氨基酸是D-脯氨酸、D-酪氨酸、D-缬氨酸、D-苏氨酸、D-谷氨酸、D-赖氨酸或D-色氨酸。
33.权利要求30的方法，其中所述过氧化氢通过与过氧化物酶反应而被检测。
34.权利要求29-33任一项的方法，包括在过氧化氢形成后确定反应介质中的D-氨基酸的量。
35.权利要求29的方法，其中所述反应介质包含来自患有阿尔茨海默病、帕金森病、肾病或精神分裂症患者的生物学样品。
36.权利要求34的方法，其中所述生物学样品包含患者的体液或组织样品。
37.权利要求34的方法，其中所述生物学样品包含患者的细胞。
38.一种检测反应介质中的消旋酶活性的方法，其中所述方法包括(A)提供含有特异于所检测的消旋酶的D-氨基酸的反应介质；(B)将D-氨基酸与具有辅基的D-氨基氧化酶反应以通过D-氨基酸的氧化而形成还原的辅基；(C)将还原的辅基与氧反应以形成过氧化氢；和(D)检测由此形成的过氧化氢，其中检测到过氧化氢表示反应介质中有消旋酶活性。
39.权利要求38的方法，其中过氧化氢通过与过氧化氢酶反应而被检测。
40.权利要求38的方法，其中所述过氧化氢用生色试剂检测。
41.权利要求39的方法，其中所述生色试剂是正苯丙氨酸二胺(OPD)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)或者5-氨基水杨酸(ASA)。
42.一种筛选TcPRAC抑制剂的试剂盒，其中该试剂盒包含(A)L-脯氨酸、D-脯氨酸和脯氨酸消旋酶；(B)一种过氧化物酶和过氧化物酶的底物，或者一种过氧化氢酶和一种对氧敏感的试剂；(C)一种D-氨基酸氧化酶；和(D)任选地，针对TcPRAC抑制活性而待筛选的一或多种分子。
43.一种检测样品中D-氨基酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含(A)一种D-氨基酸；(B)一种过氧化物酶和过氧化物酶的底物；(C)一种D-氨基酸氧化酶；和(D)任选地，作为对照的L-氨基酸对映异构体。
44.一种检测样品中D-氨基酸的方法，其中所述方法包括(A)通过与辅基中的D-氨基酸氧化酶反应而使D-氨基酸氧化脱氨；(B)检测通过氧化脱氨而产生的过氧化氢，其中过氧化氢的存在表示样品中存在D-氨基酸。
45.权利要求43的方法，其中D-氨基酸是D-脯氨酸、D-酪氨酸、D-缬氨酸、D-苏氨酸、D-谷氨酸、D-赖氨酸或D-色氨酸。
46.一种筛选可调节消旋酶活性的分子的方法，其中所述方法包括(A)在存在L-氨基酸和D-氨基酸的等摩尔混合物及待调节的消旋酶的情况下，利用被测试的分子调节消旋酶活性；(B)利用辅基中的D-氨基氧化酶对在步骤(A)中产生的D-氨基酸进行氧化脱氨；(C)检测通过氧化脱氨产生的过氧化氢，其中过氧化氢的调节代表测试的分子调节消旋酶活性的能力。
47.权利要求46的方法，其中所述分子抑制所述消旋酶活性。
48.权利要求46的方法，其中所述消旋酶是脯氨酸消旋酶。
49.权利要求47的方法，其中所述脯氨酸消旋酶是枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)脯氨酸消旋酶。
50.一种通过权利要求45-48的方法鉴别的分子。
51.进行权利要求29-41及44-49的方法所需的技术平台及所有试剂和装置。
52.权利要求51的技术平台，包含a)L-氨基酸、D-氨基酸和一种消旋酶；b)一种过氧化物酶和过氧化物酶的底物，或者一种过氧化氢酶和一种对氧敏感的试剂；c)D-氨基酸氧化酶；和d)任选地，针对抑制所述消旋酶的活性而待筛选的一或多种分子。
53.权利要求51的技术平台，其中所述消旋酶是脯氨酸消旋酶，所述L-氨基酸和D-氨基酸分别是L-脯氨酸和D-脯氨酸。
54.一种抑制脯氨酸消旋酶的分子，其含有选自SEQ ID NO1、2、3或4的亚序列。
全文摘要
本发明涉及消旋酶的鉴别和鉴定，以及这些消旋酶的蛋白质特征的确定。更特别地，本发明涉及编码由蛋白质特征特有的基序组成的肽的核酸分子的鉴别，还涉及由这些基序特别是SEQ ID NO1－4组成的肽。本发明还涉及特异于所述肽的抗体及这些抗体与所述肽的免疫复合物。另外，本发明涉及使用本发明的核酸分子检测消旋酶的方法和试剂盒，以及由所述基序组成的肽和这些肽的抗体。
文档编号G01N33/68GK1820070SQ200480009743
公开日2006年8月16日 申请日期2004年2月11日 优先权日2003年2月11日
发明者保拉·米诺普里奥, 纳塔莉·沙芒特, 维姆·德格拉夫, 阿尔芒·贝尔内曼 申请人:巴斯德研究院, 国立科学研究中心