蛋白masp作为结肠直肠癌标志的用途的制作方法

专利名称：蛋白masp作为结肠直肠癌标志的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及结肠直肠癌的诊断。它公开了MASP(乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)前体)蛋白在结肠直肠癌诊断中的用途。另外，它特别涉及从来自个体的液体样品诊断结肠直肠癌的方法，该方法通过测量所述样品中的MASP进行诊断。MASP的测量可以用于例如结肠直肠癌的早期检测或诊断。
尽管检测和治疗的进展，癌症仍然是主要的公共健康挑战。在多种类型的癌症中，结肠直肠癌(＝CRC)是西方世界最常见的癌症之一。
癌症能够越早得到检测/诊断，总生存率就越高。对于CRC，这一点尤其正确。晚期肿瘤的预后差。三分之一以上的患者将在诊断后五年内死于进行性疾病，相应为约40％的五年生存率。目前的治疗仅仅治愈一部分患者，而且对在疾病早期诊断的那些患者显然具有最佳作用。
关于作为公共健康问题的CRC，有必要发展对结肠直肠癌更有效的筛选和预防措施。
目前，关于结肠直肠癌现有的最早检测程序包括便血检验或内窥镜检查程序。然而，在检测便血之前一般必须存在显著的肿瘤大小。以愈创木脂为基础的大便潜血试验的灵敏性约为26％，意味着74％具有恶性病变的患者将仍然未检测到(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。癌变前和癌性病变的显像代表早期检测的最佳方法，但是结肠镜检查是昂贵、具有风险和并发症的侵入性方法(Silvis，S.E.等人，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，等人，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.等人，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
近年来，巨大量的所谓结肠特异的或甚至所谓结肠直肠癌特异的基因得到报导。相应研究论文或专利申请中的绝大多数，建立在通过RNA表达模式分析获得的数据的基础上，所述分析为结肠(癌)组织分别相对于不同组织或邻近的正常组织的RNA表达模式的分析。这些方法可以概括为示差mRNA展示技术。
作为可从mRNA展示技术得到的数据的实例，可以提及并讨论WO01/96390。该申请对超过两百个分离的多核苷酸和相应的等量多肽、及其在CRC检测中的用途进行了说明并请求保护。然而，不能由相应蛋白水平来反映mRNA水平的差异，这是常识。由稀有mRNA编码的蛋白可能具有非常高的量，但是由丰富mRNA编码的蛋白可能根本难以检测和发现。mRNA水平和蛋白水平之间相关性的缺乏归结于诸如mRNA稳定性、翻译效率、蛋白稳定性等原因。
也有最近研究不同组织之间或健康和疾病组织之间的蛋白模式差异的方法，以鉴定可能用于CRC诊断的候选标志分子。Brünagel，G.等人，Cancer Research 62(2002)2437-2442鉴定了7个核基质蛋白，与邻近的正常组织比较，它们在CRC组织中看来更为丰富。尚无从个体的液体样品得到的数据报导。
WO02/078636报告了约9个经表面增强激光解吸和电离(SELDI)发现的结肠直肠癌相关点。与从健康对照获得的血清相比，在从CRC患者获得的血清中更频繁地见到这些点。然而，这些点中包括的分子的特性(例如其序列)还未知。
尽管CRC领域中候选蛋白标志的名单巨大且不断增长，但到此为止，这些分子的临床/诊断效用尚且未知。为了具有临床效用，作为单独标志的新的诊断标志应当至少与本领域已知的最佳单独标志一样好。或者，如果单独或分别与一个或多个其他标志联合使用，一个新的诊断标志应当引起诊断灵敏性和/或特异性的提高。通过检验的承受操作特性(receiver-operating characterisitics)对其诊断灵敏性和/或特异性进行最佳评价，所述承受操作特性将在下面详细介绍。
目前，仅可利用建立在检测肿瘤相关糖蛋白癌胚抗原(CEA)基础上的诊断性血液检验来辅助CRC领域的诊断。从结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌和大部分乳腺癌、肺癌以及头部和颈部癌症患者得到的组织样品中，95％的样品中CEA升高(Goldenberg，D.M.等人，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。在非恶性疾病患者中也有过CEA水平升高的报导，而且许多结肠直肠癌患者具有正常的血清CEA水平，特别是在疾病的早期阶段(Carriquiry，L.A.，和Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.等人，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，等人，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。从血清或血浆测量CEA在检测复发中的效用据报导是有争议的，也未得到广泛应用(Martell，R.E.，等人，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.等人，JAMA 270(1993)943-947)。
根据现有数据，血清CEA测定既不具有灵敏性也不具有特异性来使其用于无症状人群中结肠直肠癌的筛选检验(Reynoso，G.等人，JAMA 220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。对允许可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期CRC肿瘤标志的鉴定，可以产生将大大帮助该疾病诊断和治疗的诊断性测定。因此，存在急迫的临床需求来改进CRC由血液的诊断。由于早期诊断的患者的存活机会大大高于在疾病进展后期得到诊断的患者，所以改进CRC的早期诊断尤其重要。
本发明的任务是研究是否可以鉴定能够帮助CRC诊断的新的标志。
令人惊讶的是，已发现蛋白MASP的使用至少可以部分地克服从本领域技术水平已知的问题。
本发明因此涉及结肠直肠癌的诊断方法，该方法包括步骤a)提供从个体获得的液体样品，b)在适于MASP特异性结合试剂与MASP之间形成复合物的条件下，将所述样品与所述结合试剂接触，以及c)将(b)中形成的复合物的量与结肠直肠癌的诊断关联。优选的方法使用从个体获得的液体样品。。
本发明另一个优选的实施方案是诊断结肠直肠癌的方法，该方法包括步骤a)在适于MASP特异性结合试剂与MASP之间形成复合物的条件下，将从个体获得的液体样品与所述结合试剂接触，以及b)将(a)中形成的复合物的量与结肠直肠癌的诊断关联。
技术人员将认识到，任何这样的诊断都是在体外进行的。其后将患者的样品丢弃。患者的样品仅仅用于本发明的体外诊断方法，且不将患者样品材料转移回患者体内。一般地，所述样品是液体样品。
蛋白MASP(乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂前体；Swiss-PROTP36952)以SEQ ID NO1给出的序列为特征。克隆的人乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂cDNA编码42-kDa的蛋白，其与丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂超家族共有同源性。免疫染色研究证实乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂发现于细胞外基中和质膜上(Zou，Z.等人，Science 263(1994)526-529)。
人MASP基因(PI5的SERPINB5)最初在其mRNA水平表达的基础上通过扣除杂交分离自正常哺乳动物上皮(Zou等人，同上)。乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂在正常哺乳动物上皮细胞中表达，但不在大多数哺乳动物癌细胞系中表达。Zou等人(同上)显示其表达降低了转化的细胞诱导肿瘤形成和转移的能力，提示所述乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因编码肿瘤抑制剂。
Bass，R.等人(J.Biol.Chem.277(2002)46845-46848)表征了真核的乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂，并发现它对任何测试的蛋白水解系统都没有蛋白酶抑制作用。但是，它的确抑制肿瘤和血管平滑肌细胞的迁移。
Song，S.Y.等人(Digestive Diseases and Sciences 47(2002)1831-1835)通过对来自腺瘤、腺癌和转移性腺癌的组织切片进行免疫组织化学染色，研究了乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂在结肠癌中的表达。由Song等人(同上)发现的乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫反应性是细胞质的，同时在核中有一些染色。超过90％的腺瘤、75％的腺癌和47％的转移性癌组织切片对乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂染色呈阳性。该研究具有没有使用定量测定系统例如蛋白印迹分析的局限性。没有估计与邻近的正常结肠组织相比的表达水平。
对技术人员显而易见的是，本发明不应该解释为局限于SEQ IDNO1的全长蛋白MASP。MASP的生理或人工片段、MASP的二级修饰以及MASP的等位基因变体也包括在本发明中。人工片段优选包括合成或由重组技术产生的肽，该肽至少包括一个诊断性目的的表位，该表位由至少6个邻接的氨基酸组成，这6个氨基酸衍生自SEQID NO1公开的序列。这样的片段可以有利地用于抗体的产生，或者作为免疫测定的标准物。人工片段更优选包括至少两个适于建立夹心免疫测定的目的表位。
在优选的实施方案中，新标志MASP可以用于监控和筛选目的。
用于患者监控时，根据本发明的诊断方法有助于在患者随访中评价肿瘤负荷、治疗功效和肿瘤复发。MASP水平的升高与肿瘤负担直接相关。短期(数小时至14天)化学治疗后，MASP的增加可以作为肿瘤细胞死亡的指示物。在患者的随访中(3个月至10年)，MASP的升高可以用作肿瘤复发的指示物。
在优选的实施方案中，根据本发明的诊断方法用于筛选目的。即，该方法通过测量MASP水平、并将测量的水平与是否存在CRC关联，用于评价没有先前CRC诊断的受试者。
结肠直肠癌最常由腺瘤(息肉)进展为恶性癌症。通常根据Dukes′氏病期A至D来分类CRC的不同病期。
癌症的分期是疾病关于程度、进展和严重性的分类。它将癌症患者分组从而可以对预后和选择治疗作出概括。
TNM系统是当前最广泛使用的癌症解剖学程度的分类。该系统代表国际接受的统一分期系统。它有三个基本变量T(原发肿瘤的程度)，N(局部淋巴结状态)以及M(是否出现远处转移)。TNM标准由UICC(International Union Against Cancer)出版(Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(编)，TNM Classification of MalignantTumours，第五版，1997)。
特别重要的是，CRC的早期诊断能转化为好很多的预后。结肠直肠的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即腺瘤。因此，在腺瘤病期诊断的患者具有最好的预后。在已经出现远处转移时诊断的患者仅有10％的五年生存率，与此相比，如果处理得当，在早至Tis、N0、M0或T1-3；N0；M0病期诊断的患者，在诊断后具有90％以上的五年生存机会。
从本发明的理解，CRC的早期诊断指在癌前状态(腺瘤)或在完全没有转移(既非邻近的也非远处的)的肿瘤病期，即腺瘤、Tis、N0、M0或T1-4；N0；M0存在的病期进行的诊断。Tis表示原位癌。
在优选的实施方案中，使用MASP在早至腺瘤病期诊断CRC。
更优选在CRC尚未完全生长穿过肠壁时进行诊断，这样既没有脏体腔膜穿孔也没有其他器官或结构受侵，即，在Tis；N0；M0至T3；N0；M0(＝Tis-3；N0；M0)的任一个病期中作出诊断。
根据本发明的诊断方法建立在得自个体的液体样品的基础上。与本领域已知的方法不同，使用特异性结合试剂从该液体样品特异性地测量MASP。
特异性结合试剂为，例如，MASP受体、结合MASP的凝集素或MASP抗体。特异性结合试剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性结合试剂优选对其靶分子具有108l/mol的亲和力，或甚至更优选109l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语“特异性的”表示样品中存在的其他生物分子不与MASP的特异性结合试剂发生显著的结合。优选地，与靶分子之外的生物分子结合的水平导致与靶分子亲和力的仅仅10％，更优选仅仅5％或更低。最优选的特异性结合试剂将同时满足上述亲和力和特异性的最小标准。
特异性结合试剂优选是与MASP反应的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、这类抗体的片段、以及包括抗体结合结构域的遗传构建体。
术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、这类抗体的片段、以及包括抗体结合结构域的遗传构建体。可以使用任何保留了特异性结合试剂的上述标准的抗体。使用现有技术方法产生抗体，例如Tijssen(Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays 11(1990)全书，尤其43-78页；Elsevier，Amsterdam)中所说明的。另外，熟练的技术人员充分认识到以免疫吸附剂为基础的方法可以用于抗体的特异性分离。使用这些方法，可以加强多克隆抗体的质量以及其在免疫测定中的性能(Tijssen，P.，见上，108-115页)。
为达到在本发明中公开的成绩，使用在兔中产生的多克隆抗体。然而，显然也可以使用来自不同物种，例如大鼠或豚鼠的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于具有恒定特征的单克隆抗体能够以任何需要量产生，所以它们代表了临床常规测定开发中的理想工具。在根据本发明的方法中，MASP的单克隆抗体的产生和使用是另一个优选的技术人员现在将理解，MASP已鉴定为用于CRC诊断的标志，可以使用可选的途径达到能够与本发明成绩相比的结果。例如，可以使用可选的策略产生抗体。这些策略其中包括使用合成肽，该肽为免疫呈递MASP表位。作为选择，可以使用DNA免疫，也称为DNA疫苗。
为了测量，在适于形成结合试剂MASP-复合物的条件下，将从个体获得的液体样品与MASP特异性结合试剂温育。由于不具有任何创造性努力的技术人员可以轻易地确定这类适宜的温育条件，所以这样的条件无需说明。
根据本发明公开的方法，作为最后步骤，测量复合物的量，并将其与CRC的诊断关联。技术人员将理解，测量特异性结合试剂MASP-复合物量的大量方法都在有关教科书中得到详细说明(参阅，例如Tijssen P.，见上，或Diamandis等人编(1996)Immunoassay，AcademicPress，Boston)。
优选以夹心型测定形式检测MASP。在这类测定中，使用第一个特异性结合试剂将MASP捕获于一侧，在另一侧使用第二个特异性结合试剂，该试剂经过标记，可以直接或间接检测。
如上所述，令人惊讶地发现可以在从个体样品获得的液体样品中测量MASP。在CRC诊断中，不需要组织和活组织检查样品来应用标志MASP。
在优选的实施方案中，以血清为液体样品材料，实施根据本发明的方法。
在另一个优选的实施方案中，以血浆为液体样品材料，实施根据本发明的方法。
在另一个优选的实施方案中，以全血为液体样品材料，实施根据本发明的方法。
另外，也可以使用技术人员已知的多种方法处理粪便产生液体样品。这些由粪便产生的液体样品也代表了根据本发明的优选实施方案。
尽管常规蛋白组学(proteomics)方法在组织样品的应用导致许多所选组织的潜在标志候选物的鉴定，但本发明的发明者可以令人惊讶地在体液样品中检测到蛋白MASP。更惊讶的是，他们能够证实，从个体获得的液体样品中MASP的存在可以与结肠直肠癌诊断关联。
具有巨大优点的MASP抗体可以用于已经确定的程序中，例如，在原位、活组织检查或免疫组织程序中检测结肠直肠癌细胞。
MASP抗体优选用于定性(有无MASP存在)或定量(确定MASP量)免疫测定中。
已证明测量蛋白MASP水平在CRC领域中非常有利。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及在获得自个体的液体样品的结肠直肠癌诊断中，使用蛋白MASP作为标志分子。
术语标志分子用于指示，从个体体液测量的提高的分析物MASP水平标志着CRC的存在。
特别优选在结肠直肠癌的早期诊断中使用新标志MASP。
蛋白MASP的使用本身代表了充满挑战的CRC诊断领域的重大进展。将MASP与其他已知的标志例如CEA、或其他有待发现的CRC标志的测量联合，引起了更深远的进步。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及从获得自个体的液体样品的结肠直肠癌诊断中，与一种或多种结肠直肠癌标志分子联合来使用MASP作为结肠直肠癌标志分子。在这一点上，表述“一种或多种”指1-10，优选1-5，更优选3。可以与MASP的测量联合的其他优选CRC标志为CEA、CA 19-9、CA 72-4和/或CA 242。因而，本发明非常优选的实施方案是从获得自个体的液体样品的结肠直肠癌诊断中，与一种或多种结肠直肠癌标志分子联合来使用蛋白MASP作为结肠直肠癌标志分子，其中至少一种其他标志分子选自CEA、CA 19-9、CA 72-4和CA 242。
在诸如免疫测定的特异性结合测定领域中，诊断试剂通常最好以试剂盒形式提供，试剂盒包括特异性结合试剂和实施该测定需要的辅助试剂。本发明因此也涉及免疫学试剂盒，其包括至少一种MASP特异性结合试剂以及MASP测量的辅助试剂。
测试的精确性最好由其承受操作特性(ROC)说明(特别见Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲线图是在整个观察数据范围内连续变化决定阈值(decisionthresh-hold)产生的所有灵敏性/特异性对的图。
实验室检验的临床性能依赖于其诊断精确性、或将受试者正确分类为临床相关亚群的能力。诊断精确性衡量了检验将研究的受试者的两种不同状况正确区分的能力。这类状况为例如健康和疾病或良性对恶性疾病。
在每个病例中，ROC图通过在决定阈值的全部范围将灵敏性对1-特异性作图，描述了两种分布之间的重叠。在y轴上是灵敏性或真阳性分数[定义为(真阳性试验结果数)/(真阳性数+假阴性试验结果数)]。它也指疾病或状况存在的确定性。它从受影响的亚群单独计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性数+假阳性结果数)]。它是特异性的指标，并完全从未受影响的亚群计算。因为使用两个不同亚群的检验结果，完全独立地计算真和假阳性分数，所以ROC图不依赖于样品中疾病的流行率。ROC上的每点代表对应于特定决定阈值的灵敏性/特异性对。具有最佳辨别力的检验(在结果的两个分布中没有重叠)具有经过左上角的ROC图，在左上角，真阳性分数为1.0，或者100％(理想的灵敏性)，且假阳性分数为0(理想的特异性)。没有辨别力的检验的理论图(两组结果的同样分布)为从左下角至右上角的45°对角线。大多图介于这两个极端之间。(如果ROC图完全落在45°对角线之下，则容易通过将“确定性”标准从“高于”反转为“低于”来矫正这种情况，反之亦然。)从定性上，图越接近左上角，检验的总精确度就越高。
定量实验室检验诊断精确度的一个方便的目标是通过单独的数字表达其性能。最普通的全面测量是ROC图下的面积。按照惯例，该面积总是≥0.5(如果不是，可以反转决定规则使其≥0.5)。值在1.0(两组检验值的理想分离)和0.5(在两组检验值之间没有明显的分布差异)之间变化。该面积不仅依赖于该图的特定部分，例如最接近对角线的点或在90％特异性的灵敏性，也依赖于全图。这是对ROC图有多么接近理想ROC图(面积＝1.0)的定量的说明性表达。
使用承受操作曲线分析(ROC；Zweig，M.H.，以及Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)，与确定的标志CEA比较并与其联合，评价新标志MASP的临床效用。该分析以由50个样品组成的明确患者群组为基础，其中各个样品分别来自T1-3；N0；M0、进展更晚期的肿瘤即T4和/或不同严重性的转移(N+和/或M+)的患者，以及健康对照。
经曲线下面积证明，建立在单独测量MASP基础上的诊断方法具有的诊断精确度(灵敏性/特异性特征)，至少与确定的单独标志CEA相比一样好。
提供下列实施例、参考文献、序列表和附图以帮助对本发明的理解，其真实范围于附加的权利要求中提出。应当理解，可以在不偏离本发明精神的情况下，在提出的方法中进行修饰。


图1图1显示以肿瘤样品上样的2D-凝胶(左侧)、以匹配的获得自邻近的健康粘膜层的对照样品上样的凝胶(右侧)的典型实例。MASP的表观分子量和等电点分别相应为理论值约46kDA和5.98。这些凝胶放大部分的圆形指示蛋白MASP的位置。在健康粘膜层中，以同样的方法不能检测到该蛋白。
图2图2显示蛋白印迹的典型实例。凝胶以来自结肠直肠肿瘤组织和邻近的健康对照组织的组织裂解物上样，所述组织来自4个患者(受试者36直肠癌，Dukes B；受试者37直肠癌，Dukes A；受试者39结肠癌，Dukes A；以及受试者40结肠癌，Dukes B)。使用多克隆兔抗-MASP血清检测样品中MASP的存在。以“T”指示含有肿瘤裂解物的泳道，以“N”指示含有正常对照组织的泳道。以“Ma”指示含有分子量蛋白标准物的标志泳道。以“300”、“1000”和“3000”指示含有不同浓度所重组MASP的泳道。箭标指示MASP条带在凝胶中的位置。所有肿瘤样品在MASP位置给以强信号，而来自邻近的正常对照组织的裂解物中只能检测到弱信号。在13个检验的受试者中，13个显示结肠直肠癌患者肿瘤组织中MASP的强烈超表达。
缩写ABTS 2，2’-叠氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐BSA牛血清清蛋白cDNA 互补DNACHAPS (3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐)DMSO 二甲亚砜DTT二硫苏糖醇EDTA 乙二胺四乙酸ELISA 酶联免疫吸附测定HRP辣根过氧化物酶IAA碘乙酰胺IgG免疫球蛋白G
IEF等电聚焦IPG固定pH梯度LDS十二烷基硫酸锂MALDI-TOF 基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间质谱MES基，2，4，6-三甲苯基OD 光密度PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS磷酸缓冲盐水PI 等电点RTS快速翻译体系SDS十二烷基硫酸钠实施例1MASP作为可能的结肠直肠癌标志的鉴定组织来源为了鉴定作为可能的结肠直肠癌诊断标志的肿瘤特异性蛋白，使用蛋白质组学方法进行三种不同种类组织的分析。
总共分析来自10个患有结肠直肠癌的患者的组织样品。以治疗性切除术从各个患者收集三种不同的组织类型肿瘤组织(＞80％肿瘤)(T)、邻近的健康组织(N)和由邻近的健康粘膜层剥除的粘膜层(M)。后两种组织类型作为匹配的健康对照样品。组织在切除后立即冰冻，并在处理前保存于-80℃。肿瘤经组织病理学标准诊断。
组织制备将0.8-1.2g冰冻组织置于研钵并以液氮完全冰冻。将组织在研钵中粉碎，于10倍体积(w/v)的裂解缓冲液(40mM柠檬酸钠，5mMMgCl2，1％Genapol X-080，0.02％叠氮化钠，CompleteEDTA-free[Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，Cat.No.1 873580])中溶解，随后在Wheaton玻璃匀浆器中匀浆(20x松配合，20x紧配合)。将3ml匀浆物以4500×g进行蔗糖密度离心(10-60％蔗糖)1小时。离心步骤后获得三个级分。梯度顶端的级分含有可溶性蛋白，用于进一步分析。
等电聚焦(IEF)及SDS-PAGE
对于IEF，将3ml悬液与12ml样品缓冲液(7M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，0.4％IPG缓冲液pH4-7，0.5％DTT)混合，温育1小时。在AmiconUltra-15装置(Millipore GmbH，Schwalbach，德国)中浓缩样品，使用Bio-Rad蛋白测定(Cat.No.500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH，München，德国)按照厂商手册说明测定蛋白浓度。对于相当于1.5mg的蛋白的体积，添加样品缓冲液至350μl终体积。使用该溶液将IPG条pH4-7(AmershamBiosciences，Freiburg，德国)再水化过夜。使用下列梯度方案进行IEF1.)1分钟至500V；2.)2小时至3500V；3.)22小时恒定于3500V，使发生82kVh。IEF后，将条保存于-80℃，或直接用于SDS-PAGE。
SDS-PAGE之前，条在平衡缓冲液(6M尿素，50mM Tris/HCl，pH8.8，30％甘油，2％SDS)中温育，添加DDT(15分钟，+50mgDTT/10ml)以还原，添加IAA(15分钟，+235mg碘乙酰胺/10ml)以烷基化。将条置于12.5％聚丙烯酰胺凝胶上，以1W/凝胶电泳1小时，其后以17W/凝胶进行电泳。随后，将凝胶固定(50％甲醇，10％醋酸盐)并以NovexTMColloidal Blue Staining Kit(Invitrogen，Karlsruhe，德国，Cat No.LC6025，45-7101)染色过夜。
MASP作为可能的结肠直肠癌标志的检测使用ProteomeWeaver软件(Definiens AG，德国，München)通过影像分析分别分析各个患者。另外，使用采集自动机械切割凝胶上所有的点，使用MALDI-TOF质谱(UltraflexTMTof/Tof，BrukerDaltonik GmbH，Bremen，德国)鉴定点中存在的蛋白。对于每个患者，将肿瘤样品的4块凝胶与邻近的正常和剥除的粘膜层组织的4块凝胶比较，分析相应于差异表达蛋白的不同点。使用这种方法，发现蛋白MASP在肿瘤组织中特异地表达或强烈超表达，在健康对照组织中不可检测或强度较低地表达。因此，在其他许多蛋白中，MASP取得用于结肠直肠癌诊断的候选标志的资格。
实施例2结肠直肠癌标志蛋白MASP抗体的产生产生结肠直肠癌标志蛋白MASP的多克隆抗体用于抗体在进一步测量MASP的血清和血浆和全血水平中的用途，测量使用免疫检测测定，例如蛋白印迹和ELISA。
大肠杆菌(E.coli)中的重组蛋白表达为了产生MASP抗体，进行该蛋白的重组表达以获得免疫原。结合使用RTS 100表达系统和大肠杆菌进行表达。第一步，分析DNA序列，并使用“ProteoExpert RTS E.coli HY”系统获得高产量cDNA沉默突变变体推荐和各自的PCR引物序列。该系统是以网络为基础的商业服务(www.proteoexpert.com)。使用推荐的引物对，利用“RTS 100E.coli Linear Template Generation Set，His-tag”(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国，Cat.No.3186237)系统，从cDNA产生线性PCR模板，并用于编码MASP蛋白的核苷酸序列的体外转录和表达。对于蛋白印迹检测和随后的纯化，表达的蛋白含有His-标志。鉴定最佳的表达变体。根据厂商说明执行从PCR到表达和检测的所有步骤。根据厂商说明，将各自的PCR产物克隆到pBADTOPO载体(Invitrogen，Karlsruhe，德国，Cat.No.K 4300/01)中，PCR产物含有所有必需的T7调节区域(启动子、核糖体结合位点和T7终止子)。对于使用T7调节序列的表达，将构建体转化到大肠杆菌BL 21(DE 3)中(Studier，F.W.等人，Methods Enzymol.185(1990)60-89)，分批培养转化的细菌以表达蛋白，每批1L。
按照标准程序在Ni螯合柱上进行His-MASP融合蛋白的纯化。简要地说，通过离心将1L含有His-MASP融合蛋白表达载体的细菌培养物沉淀。在裂解缓冲液中将细胞沉淀重悬，随后使用Ultra-Turrax匀浆，所述裂解缓冲液中含有磷酸盐，pH8.0，7M氯化胍，咪唑和硫甘油。通过高速离心使不溶材料沉淀，将上清液应用于Ni螯合层析柱。使用数个柱床体积的裂解缓冲液洗涤柱子，随后使用含有磷酸盐，pH8.0和尿素的缓冲液洗涤。最后，在酸性条件下，使用含有SDS的磷酸盐缓冲液洗脱结合的抗原。
抗MASP单克隆抗体的生产a)小鼠的免疫使用100μgMASP腹膜内初次免疫12周龄A/J小鼠。初次免疫六周后继之以另外两次腹膜内免疫，这两次免疫间隔一个月。在此过程中，向每只小鼠施用吸附至氢氧化铝的100μgMASP、以及109个百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。随后，在融合前第三和第二天，每只小鼠使用100μgMASP的PBS缓冲液溶液静脉内进行最后两次免疫。
b)融合与克隆将根据a)免疫的小鼠脾细胞与根据Galfre，G.和Milstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46的骨髓瘤细胞融合。在此过程中，将约1×108个免疫小鼠脾细胞与2×107个骨髓瘤细胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合并离心(10分钟，300g，4℃)。以不含胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基将细胞洗涤一次，在50ml锥形管中于400g再次离心。弃上清液，轻敲以温和地松散细胞沉淀，经吸液添加并混合1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)。于37℃水浴1分钟后，于室温在4-5分钟时间段内滴加5ml不含FCS的RPMI 1640。然后在大约1分钟内滴加5ml含有10％FCS的RPMI 1640，充分混合，以培养基(RPMI 1640+10％FCS)填充至50ml，随后于4℃以400×g离心10分钟。将沉淀的细胞置于含10％FCS的RPMI 1640培养基中，接种于次黄嘌呤-重氮丝氨酸选择培养基(100mmol/l次黄嘌呤，1μg/ml重氮丝氨酸于RPMI 1640+10％FCS中)。白细胞介素6作为生长因子以100U/ml添加于培养基中。
约10天后，将原代培养物对特异性抗体进行检验。使用荧光激活细胞分选仪将MASP阳性原代培养物克隆到96孔细胞培养板中。在此过程中，白细胞介素6再次作为生长添加剂以100U/ml添加于培养基中。
c)从细胞培养上清液中分离免疫球蛋白获得的杂交瘤细胞以每毫升含有10％FCS的RPMI 1640培养基中1×105个细胞的密度接种，并于发酵罐中增殖7天(ThermoduxCo.，Wertheim/Main，Model MCS-104XL，Order No.144-050)。在培养物上清液中获得平均浓度为每毫升100μg的单克隆抗体。使用蛋白化学中的常规方法(例如根据Bruck，C.等人，Methods inEnzymology 121(1986)587-695)进行该抗体从培养物上清液中的纯化。
多克隆抗体的产生
a)免疫为了免疫，以1∶1比例制备蛋白溶液(100μg/ml蛋白MASP)和完全弗氏佐剂的新鲜乳剂。在1、7、14和30、60和90天以1ml乳剂免疫各兔。吸出血液，将产生的抗MASP血清用于实施例3和4中说明的进一步实验。
b)使用辛酸和硫酸铵依次沉淀(sequential precipitation)从兔血清纯化IgG(免疫球蛋白G)以4体积醋酸盐缓冲液(60mM，pH4.0)稀释1体积兔血清。以2M Tris碱调节pH至4.5。在剧烈搅动下滴加辛酸(25μl/ml稀释样品)。30分钟后，将样品离心(13000×g，30分钟，4℃)，弃沉淀，收集上清液。通过添加2M Tris碱将上清液pH调节至7.5并过滤(0.2μm)。
通过在剧烈搅动下滴加4M硫酸铵至2M的终浓度，将上清液中的免疫球蛋白沉淀。通过离心收集沉淀的免疫球蛋白(8000×g，15分钟，4℃)。
弃上清液。以10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl溶解沉淀并彻底透析。将透析液离心(13000×g，15分钟，4℃)并过滤(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化在10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中制备10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg/ml于DMSO中)。于室温30分钟后，将样品在Superdex 200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上层析。收集含有生物素化IgG的级分。根据相同程序将单克隆抗体生物素化。
多克隆兔IgG的洋地黄毒苷化(Digoxygenylation)在10mM NaH2PO4/NaOH，30mM NaCl，pH7.5中制备10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，德国，Cat.No.1 333 054)(3.8mg/ml于DMSO中)。于室温30分钟后，将样品在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上层析。收集含有洋地黄毒苷化的IgG的级分。根据相同程序将单克隆抗体以洋地黄毒苷标记。
实施例3利用实施例2中产生的多克隆抗体检测人结肠直肠癌组织中MASP的蛋白印迹如实施例1中“组织制备”所说明的，制备肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解物。
使用Invitrogen，Karlsruhe，德国的试剂和设备进行SDS-PAGE和蛋白印迹。对于每个检验的组织样品，在还原NuPAGE(Invitrogen)SDS样品缓冲液中稀释10μg组织裂解物，并于95℃加热10分钟。在MES运行缓冲系统中的4-12％NuPAGE凝胶(Tris-Glycine)上运行样品。使用Invitrogen XCell IITMBlot Module(Invitrogen)和NuPAGE转移缓冲系统将凝胶分离的蛋白混合物印迹于硝化纤维素膜上。于PBS/0.05％Tween-20中将膜洗涤3次，并以Roti-Block封闭缓冲液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，德国)封闭2小时。将第一抗体多克隆兔抗MASP血清(根据实施例2中说明产生)以1∶10 000稀释于Roti-Block封闭缓冲液中，并与膜温育1小时。在PBS/0.05％Tween-20中将膜洗涤6次。使用POD缀合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体标记特异性结合的兔第一抗体，POD缀合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体以0.5×Roti-Block封闭缓冲液稀释至10mU/ml。温育1小时后，在PBS/0.05％Tween-20中将膜洗涤6次。为了检测结合的POD缀合的抗兔抗体，将膜与Lumi-LightPLUSWestern Blotting Substrate(Order-No.2015196，Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德国)温育，并暴光于放射自显影胶片。
实施例4测量人血清和血浆样品中MASP的ELISA为了检测人血清或血浆中的MASP，开发了夹心法ELISA。为了捕获和检测抗原，分别使用生物素和洋地黄毒苷缀合等分试样的抗MASP多克隆抗体(见实施例2)。
将链霉抗生素蛋白包被的96孔微孔滴定板与100μl生物素化的抗MASP多克隆抗体温育60分钟，生物素化的抗MASP多克隆抗体以10μg/ml溶于10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。温育后，以0.9％NaCl，0.1％Tween 20将板洗涤3次。然后，将孔与作为标准抗原的重组蛋白(见实施例2)的连续稀释液或稀释的患者血浆样品温育2小时。MASP结合后，使用0.9％NaCl，0.1％Tween-20将板洗涤3次。为了结合的MASP的特异性检测，将孔与100μl洋地黄毒苷化抗MASP多克隆抗体温育60分钟，洋地黄毒苷化抗MASP多克隆抗体以10μg/ml溶于10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。此后，将板洗涤3次以去除未结合的抗体。在下一步中，将孔与20mU/ml抗洋地黄毒苷-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，Catalog No.1633716)温育60分钟，抗洋地黄毒苷-POD缀合物溶于10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。随后使用相同缓冲液将板洗涤3次。为了检测抗原-抗体复合物，将孔与100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，Catalog No.11685767)温育，并于30-60分钟后使用ELISA读出器(ELISA reader)在405nm测量OD。
实施例5根据诊断精确度评价临床效用的ROC分析通过分析从充分表征的患者群组获得的个体液体样品评价精确度，即，分别为50个经历结肠镜检查并发现没有腺瘤或CRC的患者；50个诊断并分期为CRC Tis-3、N0、M0的患者；以及50个诊断为进展后期CRC的患者，其具有肿瘤浸润于至少一个邻近淋巴结、或更严重形式的转移。使用商业供应的测定(Roche Diagnostics，CEA-assay(Cat.No.1 173 1629用于ElecsysSystems免疫测定分析仪)测量的CEA，以及如上说明测量的MASP，在从这些个体的每一个中获得的血清中得到定量。根据Zweig，M.H.，和Campbell，如上，进行ROC分析。经曲线下面积测量发现，对于MASP，将Tis-3、N0、M0组的患者与健康个体区分分辨力至少与确定的标志CEA相比一样好。
初步数据显示，MASP也可能用于外科手术后患者的随访。
参考文献表Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55Anderson，W.F.，et al.，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133Bass，R.，et al.，J.Biol.Chem.277(2002)46845-46848Bruck，C.，et al.，Methods Enzymol.121(1986)587-695Brünagel，G.，et al.，Cancer Research 62(2002)2437-2442Carriquiry，L.A.，and Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929Diamandis，et al.，eds.(1996)Immunoassay，Academic Press，Boston.
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序列表<110>Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG<120>蛋白MASP作为结肠直肠癌标志的用途<130>21767<150>EP 03011158.7<151>2003-05-26<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>375<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂前体；Swiss-PROTP36952<400>1Met Asp Ala Leu Gln Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ala Val Asp Leu Phe1 5 10 15Lys Gln Leu Cys Glu Lys Glu Pro Leu Gly Asn Val Leu Phe Ser Pro20 25 30Ile Cys Leu Ser Thr Ser Leu Ser Leu Ala Gln Val Gly Ala Lys Gly35 40 45Asp Thr Ala Asn Glu Ile Gly Gln Val Leu His Phe Glu Asn Val Lys50 55 60
Asp Ile Pro Phe Gly Phe Gln Thr Val Thr Ser Asp ValAsn Lys Leu65 70 75 80Ser Ser Phe Tyr Ser Leu Lys Leu Ile Lys Arg Leu Tyr Val Asp Lys85 90 95Ser Leu Asn Leu Ser Thr Glu Phe Ile Ser Ser Thr Lys Arg Pro Tyr100 105 110Ala Lys Glu Leu Glu Thr Val Asp Phe Lys Asp Lys Leu Glu Glu Thr115 120 125Lys Gly Gln Ile Asn Asn Ser Ile Lys Asp Leu Thr Asp Gly His Phe130 135 140Glu Asn Ile Leu Ala Asp Asn Ser Val Asn Asp Gln Thr Lys Ile Leu145 150 155 160Val Val Asn Ala Ala Tyr Phe Val Gly Lys Trp Met Lys Lys Phe Pro165 170 175Glu Ser Glu Thr Lys Glu Cys Pro Phe Arg Leu Asn Lys Thr Asp Thr180 185 190Lys Pro Val Gln Met Met Asn Met Glu Ala Thr Phe Cys Met Gly Asn195 200 205Ile Asp Ser Ile Asn Cys Lys Ile Ile Glu Leu Pro Phe Gln Asn Lys210 215 220His Leu Ser Met Phe Ile Leu Leu Pro Lys Asp Val Glu Asp Glu Ser225 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Lys Ile Glu Lys Gln Leu Asn Ser Glu Ser Leu Ser245 250 255Gln Trp Thr Asn Pro Ser Thr Met Ala Asn Ala Lys Val Lys Leu Ser260 265 270Ile Pro Lys Phe Lys Val Glu Lys Met Ile Asp Pro Lys Ala Cys Leu275 280 285Glu Asn Leu Gly Leu Lys His Ile Phe Ser Glu Asp Thr Ser Asp Phe290 295 300Ser Gly Met Ser Glu Thr Lys Gly Val Ala Leu Ser Asn Val Ile His305 310 315 320Lys Val Cys Leu Glu Ile Thr Glu Asp Gly Gly Asp Ser Ile Glu Val325 330 335Pro Gly Ala Arg Ile Leu Gln His Lys Asp Glu Leu Asn Ala Asp His340 345 350Pro Phe Ile Tyr Ile Ile Arg His Asn Lys Thr Arg Asn Ile Ile Phe355 360 365Phe Gly Lys Phe Cys Ser Pro370 37权利要求
1.诊断结肠直肠癌的方法，包括下列步骤a)提供从个体获得的液体样品，b.在适于乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂前体(MASP)特异性结合试剂与MASP之间形成复合物的条件下，将所述样品与所述结合试剂接触，以及c.将(b)中形成的复合物的量与结肠直肠癌的诊断关联。
2.根据权利要求1的方法，其进一步的特征在于所述样品为血清。
3.根据权利要求1的方法，其进一步的特征在于所述样品为血浆。
4.根据权利要求1的方法，其进一步的特征在于所述样品为全血。
5.蛋白MASP作为标志分子在从个体获得的液体样品进行结肠直肠癌的诊断中的用途。
6.蛋白MASP作为标志分子在从个体获得的液体样品进行结肠直肠癌的早期诊断中的用途。
7.根据权利要求6的用途，其中所述早期诊断使用得自腺瘤病期CRC患者的样品进行。
8.根据权利要求6的用途，其中所述早期诊断使用得自Tis-3；N0；M0病期CRC患者的样品进行。
9.蛋白MASP作为结肠直肠癌的标志分子，与另一个结肠直肠癌的标志分子联合在从个体获得的液体样品进行结肠直肠癌诊断中的用途。
10.免疫学试剂盒，其包括至少一种MASP的特异性结合试剂和用于MASP测量的辅助试剂。
全文摘要
本发明涉及结肠直肠癌的诊断。它公开了蛋白MASP在结肠直肠癌诊断中的用途。它涉及从来自个体的液体样品诊断结肠直肠癌的方法，该方法通过测量所述样品中的MASP进行诊断。MASP的测量可以用于例如结肠直肠癌的早期检测或诊断。
文档编号G01N33/536GK1795385SQ200480014319
公开日2006年6月28日 申请日期2004年5月25日 优先权日2003年5月26日
发明者P·伯恩德特, M·-L·哈格曼, H·朗根, S·帕尔姆, M·勒斯勒, W·罗林格尔, M·塔克, W·措尔格, J·卡尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司