使用经子宫颈细胞的非侵入性产前遗传诊断的制作方法

专利名称：使用经子宫颈细胞的非侵入性产前遗传诊断的制作方法
技术领域：
和背景本发明涉及一种使用经子宫颈样品的滋养层细胞诊断遗传异常的方法，以及，更具体的，涉及用于测定胎儿性别和/或胎儿染色体异常的滋养层细胞的生物化学和遗传分析。
产前诊断涉及鉴定人类胎儿中存在的主要的或次要的胎儿畸形或者遗传疾病。超声扫描通常能检测结构畸形，如那些涉及神经管、心、肾、四肢等的畸形。另一方面，当前可使用绒毛膜绒毛取样(CVS)和/或羊膜腔穿刺术检测染色体畸变，如存在额外的染色体[例如，21三体性(唐氏综合征)；Klinefelter氏综合征(47，XXY)；13三体性(Patau综合征)；18三体性(Edwards综合征)；47，XYY；47，XXX]、染色体缺乏[例如，Turner氏综合征(45，X0)]、或者各种易位和缺失。
当前，向年龄超过35岁的妇女和/或向如平衡易位或微小缺失(例如，Angelman综合征)等遗传疾病的已知携带者的妇女提供产前诊断。因此，年龄超过35岁，生有患染色体畸变如唐氏综合征婴儿的妇女的百分率急剧减少。然而，在更年轻的妇女中产前试验的缺乏导致令人惊讶的统计学资料，即80％的唐氏综合征婴儿实际上是由年龄在35岁以下的妇女生的。
CVS通常是在妊娠的第9周至第14周进行的，其通过将导管经子宫颈插入或者将针插入腹部并且取一小部分胎盘样品(即，绒毛膜绒毛)。通常在CVS操作的1到2周内测定胎儿的核型。然而，由于CVS是一种侵入性的操作，其具有2-4％的与操作有关的流产风险并且可能与增加的胎儿畸形的风险有关，如有缺陷的四肢发育，大概是由于被吸出的胎盘组织的出血或栓塞(Miller D，等，1999.HumanReproduction 2521-531)。
另一方面，在妊娠的第16到第20周，通过将细针经腹插入到子宫中进行羊膜腔穿刺术。羊膜腔穿刺术操作具有0.5-1.0％的与操作有关的流产风险。吸出羊膜液后将胎儿的成纤维细胞进一步培养1-2周，之后对其进行细胞遗传学(例如，G显带技术)和/或FISH分析。因此，在采取细胞样品的2-3周内获得胎儿的核型分析。然而，在发现异常情况时，通常在妊娠的第18到第22周之间终止妊娠，其中包括Boero技术，一种在心理和临床方面更复杂的操作。
为了克服这些局限性，发展了几种使用非侵入性操作鉴定和分析胎儿细胞的方法。
一种方法基于在妊娠前三个月期间在母亲血液中发现了胎儿细胞如胎儿滋养层、白细胞和具核红细胞。然而，尽管从母亲血液中分离滋养层受到它们的多核形态和抗体可用性的限制，但是白细胞的分离受缺乏区分母亲和胎儿白细胞的独特细胞标记的限制。而且，由于白细胞可能在母亲血液中持续存在长达27年(Schroder J，等，1974.Transplantation，17346-360；Bianchi DW，等，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.93705-708)，因此在母亲血液中很可能存在来自先前的妊娠的残余细胞，从而使得基于这种细胞的产前诊断实际上变得不可能。
另一方面，具核红细胞(NRBCs)具有相对短的90天的半衰期，使得它们成为产前诊断的极好的候选物。然而，几个研究已经发现从母亲血液中分离的NRBCs中至少50％是母亲来源的(Slunga-TallbergA等，1995.Hum Genet.9653-7)。而且，由于在母亲血液中出现具核胎儿细胞的频率异常低(0.0035％)，所以NRBC细胞必须首先纯化(例如，使用Ficol-Paque或Percoll梯度密度离心)，然后进行富集，使用例如，磁性活化的细胞分选(MACS，Busch，J.等，1994，Prenat.Diagn.141129-1140)、铁磁流体悬浮(ferrofluid suspension)(Steele，C.D.等，1996，Clin.Obstet.Gynecol.39801-813)、电流分离(charge flow separation)(Wachtel，S.S.等，1996，Hum.Genet.98162-166)或者FACS(Wang，J.Y.等，2000，Cytometry 39224-230)。然而，这种纯化和富集步骤导致胎儿细胞的回收不一致并且限制诊断胎儿性别的灵敏度(综述见Bischoff，F.Z.等，2002.Hum.Repr.Update 8493-500)。因此，技术问题、高费用以及细胞来源的不确定已经妨碍了这种方法被临床上实际上接受。
另一种方法基于在子宫颈管中存在滋养层细胞(从胎盘上脱落的)[Shettles LB(1971).Nature London 23052-53；Rhine SA，等(1975).Am J Obstet Gynecol 122155-160；Holzgreve和Hahn，(2000)Clin Obstet and Gynaecol14709-722]。可使用(i)吸引术；(ii)细胞刷(cytobrush)或棉花拭子；(iii)子宫颈内灌洗；或者(iv)子宫内灌洗从子宫颈管回收滋养层细胞。
一旦获得，则可对滋养层细胞应用各种测定遗传疾病或染色体异常的方法。
Griffith-Jones等，[British J Obstet.and Gynaecol.(1992).99508-511]提出了基于PCR测定胎儿的性别，其中使用用棉花拭子或通过用盐水冲洗更低子宫腔回收的滋养层细胞。然而，这种方法受到由于子宫颈中残余精液造成的假阳性的限制。为了克服这些局限性，对通过粘液吸引或通过细胞刷获得的样品使用嵌套式PCR方法。这些分析导致胎儿性别预测的成功率更高(Falcinelli C.，等，1998.Prenat.Diagn.181109-1116)。然而，未纯化的经子宫颈细胞的直接PCR扩增很可能导致母亲细胞的污染。
一种使用PCR和FISH分析经子宫颈细胞的更新近的研究导致很差的胎儿性别检测率(Cioni R.，等，2003.Prenat.Diagn.23168-171)。
因此，为了在经子宫颈细胞样品中从占主导地位的母亲细胞群中区分滋养层细胞，使用了抗胎盘抗原的抗体。
Miller等(Human Reproduction，1999.14521-531)使用了各种滋养层特异性抗体(例如，FT1.41.1、NCL-PLAP、NDOG-1、NDOG-5和340)，以从用经子宫颈的吸引或冲洗回收的经子宫颈细胞中鉴定滋养层细胞。这些分析导致总的检测率为25％到79％，其中340抗体是最有效的抗体。
由Bulmer，J.N.等，(Prenat.Diagn.2003.2334-39)做的另一项研究在经子宫颈的细胞中使用FISH分析来测定胎儿性别。在这个研究中，发现所有从怀有男性胎儿的母亲中回收的样品含有一些具有Y特异性信号的细胞。平行地，对重复的经子宫颈的样品进行IHC，其中使用可识别绒毛外滋养层的所有群体的人白细胞抗原(HLA-G)抗体(G233)(Loke，Y.W.，等，1997.Tissue Antigen 50135-146；Loke和King，2000，Ballieres Best Pract Clin Obstet Gynaecol 14827-837)。在50％的样品中出现HLA-G阳性细胞(Bulmer，J.N.等，(2003)同上)。然而，由于在分开的载玻片上进行FISH分析和滋养层特异性IHC测定，所以使用这种方法诊断胎儿染色体异常是不实用的。
因此广泛公认需要一种无上述局限性的测定胎儿性别和/或鉴定胎儿染色体异常的方法，并且其将非常有利。
发明概述根据本发明的一个方面，提供一种测定胎儿性别和/或鉴定至少一种胎儿染色体异常的方法(a)免疫染色含有滋养层的细胞样品以便因此鉴定至少一种滋养层细胞，和(b)将至少一种滋养层细胞进行原位染色体和/或DNA分析以便因此测定胎儿性别和/或鉴定至少一种染色体异常。
根据下述本发明优选实施方案中的另外特征，从子宫颈和/或子宫获得含有滋养层的细胞样品。
根据所述优选实施方案中的另外特征，使用选自吸引术、细胞刷、棉花拭子、子宫颈内灌洗和子宫内灌洗的方法获得含有滋养层的细胞样品。
根据所述优选实施方案中的另外特征，从妊娠第6到第15周的怀孕妇女中获得滋养层细胞样品。
根据所述优选实施方案中的另外特征，使用抗滋养层特异性抗原的抗体实现免疫染色。
根据所述优选实施方案中的另外特征，滋养层特异性抗原选自HLA-G、PLAP、PAR-1、Glut 12、H315、FT1.41.1、I03、NDOG-1、NDOG-5、BC1、AB-340、AB-154和因子XIII。
根据所述优选实施方案中的另外特征，使用荧光原位杂交(FISH)和/或引物介导的原位标记(PRINS)实现原位染色体和/或DNA分析。
根据所述优选实施方案中的另外特征，至少一种染色体异常选自非整倍体性、易位、亚端粒(subtelomeric)重排、缺失、微小缺失、倒位和重复。
根据所述优选实施方案中的另外特征，染色体非整倍体性是完全和/或部分三体性。
根据所述优选实施方案中的另外特征，三体性选自21三体性、18三体性、13三体性、16三体性、XXY、XYY和XXX。
根据所述优选实施方案中的另外特征，染色体非整倍体性是完全和/或部分单体性。
根据所述优选实施方案中的另外特征，单体性选自X单体性、21单体性、22单体性、16单体性和15单体性。
本发明通过提供一种非侵入性、无风险的产前诊断的方法，成功地着手解决了目前已知构型的缺点。
除非有其它定义，这里所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管可在本发明的实践或试验中使用与这里所描述的那些相似或者等同的方法和材料，但下面描述了适当的方法和材料。如果发生冲突，以本专利说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，不打算用于限制。
附图的简要说明这里仅通过实例的方式，参考附图，描述本发明。现在详细具体参考附图，强调的是所显示的细节是通过实例的方式并且仅用于本发明优选实施方案的说明性讨论的目的，并且是为了提供相信是最有用的和最容易理解的本发明原理和概念方面的描述的目的而提供的。在这点上，不试图显示比基本理解本发明所必需的更详细的本发明的结构细节，采取带有附图的描述使得在实践中可以如何实现本发明的几种方式对于本领域技术人员来说变得显而易见。
在附图中

图1a-d是说明经子宫颈细胞的IHC(图1a、c)和FISH(图1b、d)分析的显微照片。使用HLA-G抗体(mAb 7759，Abcam)对从两个在妊娠第7周(图1a-b，表1中的第73号病例)和第9周(图1c-d，表1中的第80号病例)的怀孕妇女中获得的经子宫颈的细胞进行IHC，随后使用CEP X绿色和Y橙色(Abbott，Cat.5J10-51)探针进行FISH分析。显示HLA-G阳性的绒毛外滋养层细胞具有微红色的细胞质(图1a，用黑色箭标标记的细胞；图1c，两个用两个黑色箭标标记的细胞分裂前的细胞)。注意到在每个滋养层细胞中的单一橙色和绿色信号(图1b，和d，白色箭标)，其分别对应于Y和X染色体，表明在每个病例中存在正常男性胎儿。
图2a-b是说明经子宫颈细胞的IHC(图2a)和FISH(图2b)分析的显微照片。使用PLAP抗体(Zymed，Cat.No.18-0099)对从在妊娠第11周(图2a-b，表1中的第223号病例)的怀孕妇女中获得的经子宫颈的细胞进行IHC，随后使用CEP X绿色和Y橙色(Abbott，Cat.5J10-51)探针进行FISH分析。显示PLAP阳性的绒毛状细胞滋养层细胞具有微红色的细胞质(图2a，黑色箭标)。注意到在绒毛状细胞滋养层细胞中的单一橙色和绿色信号(图2b，白色箭标)，其分别对应于Y和X染色体，表明存在正常男性胎儿。
图3a-b是说明经子宫颈细胞的IHC(图3a)和FISH(图3b)分析的显微照片。使用HLA-G抗体(mAb 7759，Abcam)对从在妊娠第8周(表1中的第71号病例)的怀孕妇女中获得的经子宫颈的细胞进行IHC，随后使用LSI 21q22橙色和CEP Y绿色(Abbott，Cat.No.#5J10-24和5J13-02)探针进行FISH分析。注意到HLA-G抗体反应后滋养层细胞的微红色细胞质(图3a，白色箭标)，以及存在分别对应于第21和Y染色体的三个橙色和一个绿色信号(图3b，白色箭标)，表明在男性胎儿中存在21三体性。
图4a-b是说明经子宫颈细胞的IHC(图4a)和FISH(图4b)分析的显微照片。使用HLA-G抗体对从妊娠第6周(表1中的第76号病例)的怀孕妇女中获得的经子宫颈的细胞进行IHC，随后使用CEPX绿色和Y橙色(ABBOTT，Cat.#5J10-51)探针进行FISH分析。注意到HLA-G抗体反应后在滋养层细胞胞质中的微红色(图4a，黑色箭标)以及对应于单一X染色体的单一绿色信号(图4b，白色箭标)，表明存在具有Turner氏综合征的女性胎儿。
图5a-c是说明从妊娠第7周(表1中的第161号病例)的怀孕妇女中获得的经子宫颈(图5a-b)或胎盘(图5c)细胞的IHC(图5a)和FISH(图5b，c)分析的显微照片。图5a-b-使用HLA-G抗体(mAb7759，Abcam)对经子宫颈的细胞进行IHC以及使用CEP X绿色和Y橙色(Abbott，Cat.#5J10-51)探针进行FISH分析。注意到在两个滋养层细胞胞质中的微红色(图5a，Nos.1和2细胞)，以及在一个滋养层细胞中存在对应于两个X和单一Y染色体的两个绿色信号和单一橙色信号(图5b，No.1细胞)，以及在第二个滋养层细胞中存在对应于单一X和单一Y染色体的单一绿色和单一橙色信号(图5b，No.2细胞)，指示滋养层细胞中存在Klinefelter氏综合征的镶嵌性。图5c-使用CEP X绿色和Y橙色(Abbott，Cat.#5J10-51)探针对胎盘细胞进行FISH。注意到在一个胎盘细胞中存在对应于单一X和单一Y染色体的单一绿色和单一橙色信号(图5c，No.1细胞)，以及在第二个胎盘细胞中存在对应于两个X和单一Y染色体的两个绿色信号和单一橙色信号(图5c，No.2细胞)，指示胎盘细胞中存在Klinefelter氏综合征的镶嵌性。
优选实施方案的描述本发明是一种可在产前诊断中使用的测定胎儿性别和/或鉴定胎儿中至少一种染色体异常的方法。具体地，本发明提供一种非侵入性、无风险的产前诊断方法，其可用于测定遗传异常，如胎儿中的染色体非整倍体性、易位、倒位、缺失和微小缺失。
参考附图和附有的说明可更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案前，应当理解的是本发明在其应用中不限于在下列描述中所阐述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能实施其它实施方案或者能够以各种方式实践或完成。而且，应当理解的是这里所使用的措辞和术语是用于描述的目的，并且不应当被认为是限制的。
胎儿畸形的早期检测和遗传异常的产前诊断对于遗传疾病如，常见的易位(例如，罗伯逊易位)、染色体缺失和/或微小缺失(例如，Angelman综合征、DiGeorge综合征)的携带者以及对于各种染色体非整倍体性(例如，唐氏综合征)风险增加的高龄母亲(例如，超过35岁)的夫妇极重要。
当前产前诊断的方法包括在经羊膜腔穿刺术或绒毛膜绒毛取样(CVS)获得的胎儿细胞上进行的细胞遗传学和FISH分析。然而，尽管在预测染色体畸变中有效，但是羊膜腔穿刺术或CVS操作分别具有0.5-1％或2-4％与操作有关的流产风险。因为相对高的流产风险，所以对于年龄35岁以下的妇女不提供羊膜腔穿刺术或CVS。因此，由于没有检验，大多数(80％)唐氏综合征婴儿实际上是由年龄35岁以下妇女所生。因此，开发可向在任何母亲年龄的所有妇女提供的非侵入性、无风险的产前诊断方法很重要。
在妊娠早期的母亲血液中发现胎儿具核红细胞已经促使许多研究者开发分离这些细胞并对它们进行遗传分析的方法(例如，PCR、FISH)。然而，由于母亲血液中具核胎儿细胞的频率异常低(0.0035％)，所以NRBC细胞必需首先纯化(例如，使用Ficol-Paque或Percoll梯度密度离心)，然后富集，使用例如，磁性活化的细胞分选(MACS，Busch，J.等，1994，Prenat.Diagn.141129-1140)、铁磁流体悬浮(Steele，C.D.等，1996，Clin.Obstet.Gynecol.39801-813)、电流分离(Wachtel，S.S.等，1996，Hum.Genet.98162-166)或者FACS分析(Wang，J.Y.等，2000，Cytometry 39224-230)。尽管可使用这些方法实现胎儿NRBCs的回收，但是不一致的回收率结合有限的灵敏度妨碍了使用胎儿NRBCs的诊断技术的临床应用(Bischoff，F.Z.等，2002.Hum.Repr.Update 8493-500)。
另一种一直被鉴定为诊断的潜在靶的胎儿细胞类型是滋养层。先前的技术研究描述了使用各种抗体如HLA-G(Bulmer，J.N.等，2003.Prenat.Diagn.2334-39)、PLAP、FTl.41.1、NDOG-1、NDOG-5和340(Miller等，1999.Human Reproduction，14521-531)鉴定经子宫颈样品中的滋养层细胞。在这些研究中，抗体识别30-79％经子宫颈样品中的滋养层细胞。另外，FISH、PCR和/或定量荧光PCR(QF-PCR)分析，其在重复的经子宫颈的样品上进行，能够鉴定所有男性胎儿中的大约80-90％。然而，由于在分开的载玻片上进行DNA(例如，FISH和/或PCR)和免疫学(例如，IHC)分析，所以这些方法对于诊断胎儿染色体异常是不实用的。
当实施本发明和用提高胎儿遗传诊断的方法实验时，本发明人设计了一种非侵入性、无风险的测定胎儿性别和/或鉴定胎儿染色体异常的方法。
如在下文和在随后实施例部分的实施例1中所描述的，本发明人设计了一种顺序地用滋养层特异性抗体(例如，抗HLA-G或PLAP)对经子宫颈的细胞进行染色，随后对染色的细胞进行FISH分析的方法。如在表1和在随后实施例部分的实施例1中所示，使用本发明的方法在92.89％的从正在怀孕和/或妊娠终止前获得的含有滋养层的经子宫颈样品中获得了胎儿染色体FISH型的正确测定，因此，结论性地证明本发明的方法在诊断胎儿遗传异常中大大比现有技术的方法更准确。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种测定胎儿性别和/或鉴定至少一种胎儿染色体异常的方法。如这里所使用的术语“胎儿”指在胚胎的任何阶段未出生的人后代(即，胚胎和/或胎儿)。
如这里所使用的“胎儿性别”指胎儿中是否存在或不存在X和/或Y染色体。
如这里所使用的“染色体异常”指染色体数目异常(例如21三体性、X单体性)或者指染色体的结构异常(例如，缺失、易位等)。
根据本发明的方法，通过首先免疫染色含有滋养层细胞的样品以便因此鉴定至少一种滋养层细胞，随后将鉴定的滋养层细胞进行原位染色体和/或DNA分析以便因此测定胎儿性别和/或鉴定至少一种染色体异常，实现胎儿性别和/或至少一种染色体异常的鉴定。
术语“滋养层”指从哺乳动物胚胎或胎儿的胎盘中获得的上皮细胞；滋养层一般接触子宫壁。在胎盘组织中有三种类型的滋养层细胞绒毛状细胞滋养层、合胞体滋养层和绒毛外滋养层，同样，这里所使用的术语“滋养层”包括这些细胞中的任何一种。绒毛状细胞滋养层细胞是特化的胎盘上皮细胞，其分化、增殖并侵入子宫壁形成绒毛。细胞滋养层，其存在于锚定绒毛中，可融合形成合胞体滋养层或者形成绒毛外滋养层柱(Cohen S.等，2003.J.Pathol.20047-52)。
含有滋养层的细胞样品可以是包括滋养层的任何生物样品，无论是活的还是死的。优选地，含有滋养层的细胞样品是血液样品或者是来自任何妊娠阶段的怀孕妇女的经子宫颈的和/或子宫内的样品。
目前优选的滋养层样品是来自怀孕妇女的子宫颈和/或子宫的那些样品(分别是经子宫颈的和子宫内的样品)。
可使用众多公知细胞收集技术中的任何一种获得本发明方法所利用的含有滋养层的细胞样品。
根据本发明的优选实施方案，使用粘液吸引(Sherlock，J.，等，1997.J.Med.Genet.34302-305；Miller，D.和Briggs，J.1996.EarlyHuman Development 47S99-S102)、细胞刷(Cioni，R.，等，2003.Prent.Diagn.23168-171；Fejgin，M.D.，等，2001.Prenat.Diagn.21619-621)、棉花拭子(Griffith-Jones，M.D.，等，1992.同上)、子宫颈内灌洗(Massari，A.，等，1996.Hum.Genet.97150-155；Griffith-Jones，M.D.，等，1992.同上；Schueler，P.A.等，2001.22688-701)和子宫内灌洗(Cioni，R.，等，2002.Prent.Diagn.2252-55；Ishai，D.，等，1995.Prenat.Diagn.15961-965；Chang，S-D.，等，1997.Prenat.Diagn.171019-1025；Sherlock，J.，等，1997，同上；Bussani，C.，等，2002.Prenat.Diagn.221098-1101)获得含有滋养层的细胞样品。各种方法的比较见Adinolfi，M.和Sherlock，J.(Human Reprod.Update 1997，3383-392和J.Hum.Genet.2001，4699-104)，Rodeck，C.，等(Prenat.Diagn.1995，15933-942)。细胞刷方法是目前获得本发明含有滋养层的细胞样品的优选方法。
在细胞刷方法中，将Pap涂抹细胞刷(例如，MedScand-AB，Malm，瑞典)通过外口插到最深2cm并且将其完全旋转(即，360°)后取出。为了取下在刷上捕获的经子宫颈的细胞，将刷子在含有2-3ml存在1％青霉素链霉素抗生素的组织培养基(例如，RPMI-1640培养基，购自Beth Haemek，以色列)的试管中振荡。为了在显微镜载玻片上浓缩经子宫颈的细胞，使用例如Cytofunel ChamberCytocentrifuge(Thermo-Shandon，英国)制备cytospin载玻片。将会意识到用于细胞离心(cytocentrifugation)的条件取决于经子宫颈样品中的模糊度(murkiness)；如果样品仅含有少量细胞，则首先将细胞离心5分钟然后用1ml新鲜培养基重悬。一旦制备，可将cytospin载玻片保藏在95％乙醇中直到进一步使用。
如在表1和在随后实施部分的实施例1中所示的，使用细胞刷方法，本发明人在收集的255份经子宫颈的样品中获得了230份含有滋养层的细胞样品。
由于滋养层细胞是从胎盘中脱落到子宫腔中的，所以只要子宫腔继续存在，就应该能够回收含有滋养层的细胞样品，直到约妊娠第13-15周(综述见Adinolfi，M.和Sherlock，J.2001，同上)。
因此，根据本发明的优选实施方案，从妊娠第6周到第15周的怀孕妇女中获得含有滋养层的细胞样品。优选地，从妊娠第6周到第13周的怀孕妇女中获得细胞，更优选地在妊娠第7周到第11周，最优选地，在妊娠的第7周到第8周。
将会意识到决定在怀孕期间妊娠的确切的哪一周进行取样是在妇科学和产科学领域普通技术人员的能力范围内的。
一旦获得，将含有滋养层的细胞样品(例如，其cytospin制剂)进行免疫染色。
根据本发明的优选实施方案，使用抗滋养层特异性抗原的抗体实现免疫学染色。
抗滋养层特异性抗原的抗体在现有技术中是已知的，并且包括例如，HLA-G抗体，其抗对绒毛外滋养层细胞特异的非经典I型主要组织相容性复合体(MHC)抗原的部分(Loke，Y.W.等，1997.TissueAntigens 50135-146)、对合胞体滋养层和/或细胞滋养层特异的抗人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)抗体(Leitner，K.等，2001.Placental alkalinephosphatase expression at the apical and basal plasma membrane interm villous trophoblasts.J.Histochemistry and Cytochemistry，491155-1164)、与存在于胎儿细胞表面上的人滋养层膜糖蛋白相互作用的H315抗体(Covone AE和Johnson PM，1986，Hum.Genet.72172-173)、对合胞体滋养层特异的FT1.41.1抗体和I03抗体(Rodeck，C.，等，1995.Prenat.Diag.15933-942)、对合胞体滋养层特异的NDOG-1抗体(Miller D.，等.Human Reproduction，1999，14521-531)、对绒毛外细胞滋养层特异的NDOG-5抗体(Miller D.，等.1999，同上)、BCl抗体(Bulmer，J.N.等，Prenat.Diagn.1995，151143-1153)、分别对合胞体和细胞滋养层或合胞体滋养层特异的AB-154或AB-340抗体(Durrant L等，1994，Prenat.Diagn.14131-140)、在妊娠的第7周和第10周对胎盘细胞特异的蛋白酶活化的受体(PAR)-1抗体(Cohen S.等，2003.J.Pathol.20047-52)、在妊娠的第10周和第12周对合胞体滋养层和绒毛外滋养层特异的葡萄糖转运蛋白(Glut)-12抗体(Gude NM等，2003.Placenta 24566-570)以及对细胞滋养层壳特异的抗因子XIII抗体(Asahina，T.，等，2000.Placenta，21388-393；Kappelmayer，J.，等，1994.Placenta，15613-623)。
免疫染色基于标记的抗体与细胞上存在的抗原的结合。免疫染色方法的实例包括但不限于，荧光标记的免疫组织化学(使用与抗体缀合的荧光染料)、放射性标记的免疫组织化学(使用放射性标记，例如，125I、抗体)和免疫细胞化学[使用酶(例如，辣根过氧化物酶)和显色底物]。优选地，本发明使用的免疫染色是免疫组织化学和/或免疫细胞化学。
免疫染色之后优选使用结合未染色的细胞区室的染料对细胞进行复染。例如，如果标记抗体结合细胞质上存在的抗原，那么核染料(例如，苏木精-伊红染料)是一种适当的复染剂。
对细胞进行免疫染色的方法是现有技术中已知的。简要地，为了检测经子宫颈样品中的滋养层细胞，将cytospin载玻片在70％乙醇溶液中洗涤，并在蒸馏水中浸5分钟。然后将载玻片转移到潮湿的室中，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤3次。为了在显微镜载玻片上显示经子宫颈细胞的位置，使用例如，Pap Pen(Zymed Laboratories Inc.，SanFrancisco，CA，美国)标记经子宫颈样品的边界。为了封闭内源性细胞过氧化物酶活性，向每个载玻片加入50μl 3％过氧化氢(Merck，德国)溶液，在室温下温育10分钟，随后将载玻片在PBS中洗涤3次。为了避免抗体的非特异性结合，向每个载玻片加入两滴封闭剂(例如，Zymed HISTOSTAIN-PLUS试剂盒，Cat No.858943)，在潮湿的室中温育10分钟。为了鉴定经子宫颈样品中的胎儿滋养层细胞，向载玻片加入滋养层特异性抗体[例如，抗HLA-G抗体(mAb 7759，Abcam Ltd.，Cambridge，英国)或抗人胎盘碱性磷酸酶抗体(PLAP，Cat.No.18-0099，Zymed)]的等分试样(例如，50μl)。然后将载玻片与抗体在潮湿的室中温育60分钟，随后将它们用PBS洗涤3次。为了检测结合的一抗，向每个载玻片加入两滴生物素化的二抗(例如，购自Zymed的山羊抗小鼠IgG抗体)，在潮湿的室中温育10分钟。二抗用PBS洗涤3次。为了显示生物素化的二抗，加入两滴辣根过氧化物酶(HRP)-链霉抗生物素缀合物(购自Zymed)，在潮湿的室中温育10分钟，随后在PBS中洗涤3次。最后，为了检测HRP缀合的链霉抗生物素，加入两滴氨乙基咔唑(AEC Single SolutionChromogen/Substrate，Zymed)HRP底物，在潮湿的室中温育6分钟，随后用PBS洗涤3次。通过将载玻片浸在2％的苏木精溶液(Sigma-Aldrich Corp.，St Louis，MO，美国，Cat.No.GHS-2-32)中25秒钟进行复染，随后将载玻片在自来水下洗涤并用盖玻片覆盖。
如在图1-5和随后实施例部分的实施例1中的表1所示的，使用抗HLA-G抗体(MEM-G/1，Abcam，Cat.No.ab7759，Cambridge，英国)和/或抗PLAP抗体(Zymed，Cat.No.18-0099，San Francisco，CA，美国)在230/255份经子宫颈的样品中检测到滋养层细胞。
将会意识到免疫染色后，在荧光或光学显微镜下(视染色方法而定)观察免疫学阳性细胞(即，滋养层)，且优选地使用例如，CCD照相机进行照相。为了将相同样品的相同滋养层细胞进一步进行染色体和/或DNA分析，将在载玻片上的这些细胞的位置(即，坐标位置)储存在与其相连的显微镜或计算机中以用于后来的参考。能鉴定和储存细胞坐标的显微镜系统的实例包括Bio View DuetTM(Bio ViewLtD，Rehovot，以色列)，以及Applied Imaging System(Newcastle英国)，基本上如在Merchant，F.A.和Castleman K.R.(Hum.Repr.Update，2002，8509-521)中所描述的。
如以前所提到的，一旦在含有滋养层的细胞样品内鉴定了滋养层细胞，则对其进行原位染色体和/或DNA分析。
如这里所使用的，“原位染色体和/或DNA分析”指分析细胞内的染色体和/或DNA，其中使用荧光原位杂交(FISH)和/或引物介导的原位标记(PRINS)。
根据本发明的方法，在相同含有滋养层的细胞样品中顺序地进行免疫染色和原位染色体和/或DNA分析。
将会意识到需要特殊的处理来制备可改进以用于第二种染色方法(例如，FISH)的已经免疫染色的细胞。这种处理包括，例如，洗掉结合的抗体(使用例如，水和逐级的乙醇系列)、暴露细胞核(使用例如，甲醇-乙酸固定剂)以及消化蛋白(使用例如，胃蛋白酶)，基本上如在随后实施例部分的实施例1中的“材料和实验方法”和在Strehl S，Ambros PF(Cytogenet.Cell Genet.1993，6324-8)中所描述的。
使用FISH分析分裂间期染色体的方法在现有技术中是已知的。简要地，将直接标记的探针[例如，CEP X绿色和Y橙色(Abbott catno.5J10-51)]与杂交缓冲液(例如，LSI/WCP，Abbott)和载体DNA(例如，人Cot1 DNA，购自Abbott)混合。将探针溶液应用到含有例如，经子宫颈的cytospin样品的显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖载玻片。将含有探针的载玻片在70℃变性3分钟，并使用杂交装置(例如，HYBrite，Abbott Cat.No.2J11-04)在37℃进一步温育48小时。杂交后，将载玻片在72℃溶于60mM NaCl和6mM柠檬酸钠(0.4XSSC)的0.3％NP-40(Abbott)溶液中洗涤2分钟。然后将载玻片在室温下在溶于2XSSC的0.1％NP-40溶液中浸1分钟，随后将载玻片在黑暗中干燥。使用，例如DAPI II复染剂(Abbott)进行复染。
在基因缺失的检测(Tharapel SA和Kadandale JS，2002.Am.J.Med.Genet.107123-126)、测定胎儿性别(Orsetti，B.，等，1998.Prenat.Diagn.181014-1022)和在染色体非整倍体性鉴定(Mennicke，K.等，2003.Fetal Diagn.Ther.18114-121)中已经使用PRINS分析。
进行PRINS分析的方法在现有技术中是已知的，并且包括例如，在Coullin，P.等(Am.J.Med.Genet.2002，107127-135)；Findlay，I.，等(J.Assist.Reprod.Genet.1998，15258-265)；Musio，A.，等(Genome 1998，41739-741)；Mennicke，K.，等(Fetal Diagn.Ther.2003，18114-121)；Orsetti，B.，等(Prenat.Diagn.1998，181014-1022)中所描述的那些方法。简要地，将含有分裂间期染色体的载玻片在溶于2 X SSC(pH7.2)的70％甲酰胺的溶液中，在71℃变性2分钟，在乙醇系列(70、80、90和100％)中脱水并且置于可编程的温度循环仪(如购自MJ Research，Waltham，Massachusetts，美国的适合玻璃载玻片的PTC-200热循环仪)平坦的平板块上。通常在存在未标记的引物以及dNTPs与标记的dUTP(例如，分别用于直接或间接检测的荧光素-12-dUTP或洋地黄毒苷-11-dUTP)的混合物时进行PRINS反应。可选择地，或者另外，可使用例如，1-3荧光素或花菁3(Cy3)分子在5’端标记序列特异性引物。因此，一般的PRINS反应混合物包括序列特异性引物(50μl反应体积中50-200pmol)、未标记的dNTPs(0.1mM的dATP、dCTP、dGTP以及0.002mM的dTTP)、标记的dUTP(0.025mM)和带有适当反应缓冲液的Taq DNA聚合酶(2单位)。一旦载玻片达到所需的退火温度，则将反应混合物应用到载玻片上并且使用盖玻片覆盖载玻片。使序列特异性引物退火15分钟，随后将引发的链在72℃延伸另外15分钟。延伸后，在室温下将载玻片在4XSSC/0.5％Tween-20溶液中洗涤3次(每次4分钟)，随后在PBS中洗涤4分钟。然后使用DAPI或碘化丙锭对载玻片进行核复染。可使用荧光显微镜和适当的滤色片组合(例如，DAPI、FITC、TRITC、FITC-罗丹明)观察荧光染色的载玻片。
将会意识到可在使用不同5’缀合物的相同PRINS运行中使用几种对几种靶特异的引物。因此，PRINS分析可用作测定是否存在，和/或定位几种基因或染色体基因座的多色试验。
另外，如在Coullin等，(2002，同上)所描述的，可在与FISH分析相同的载玻片上进行PRINS分析，优选地，先于FISH分析。
总的说来，如在随后的表1和在实施例部分的实施例1中进一步显示的，通过使用胎盘活组织检查、羊膜腔穿刺术或CVS的胎儿细胞所获得的核型结果证实，在92.89％的含有滋养层的经子宫颈的样品中获得了成功的FISH结果。
由于在使用滋养层特异性抗体免疫染色的相同细胞上进行染色体和/或DNA分析，所以可使用本发明的方法测定胎儿性别和/或在胎儿中鉴定至少一种染色体异常。
根据本发明的优选实施方案，染色体异常可以是染色体非整倍体性(即，完全和/或部分三体性和/或单体性)、易位、亚端粒重排、缺失、微小缺失、倒位和/或重复(即，完全和/或部分染色体重复)。
根据本发明的优选实施方案，通过本发明所检测的三体性可以是21三体性[使用例如，LSI 21q22橙色标记的探针(Abbott cat no.5J13-02)]、18三体性[使用例如，CEP 18绿色标记的探针(Abbott CatNo.5J10-18)；CEP18(D18Z1，α随体)Spectrum OrangeTM探针(Abbott Cat No.5J08-18)]、16三体性[使用例如，CEP 16探针(AbbottCat.No.6J37-17)]、13三体性[使用例如，LSI13SpectrumGreenTM探针(Abbott Cat.No.5J14-18)]，以及可使用例如，CEP X绿色和Y橙色探针(Abbott cat no.5J10-51)；和/或CEPXSpectrumGreenTM/CEPY(μ随体)SpectrumOrangeTM探针(AbbottCat.No.5J10-51)检测的XXY、XYY或XXX三体性。
将会意识到根据本发明的教导，可使用各种染色体特异性FISH探针或PRINS引物在胎儿细胞中检测各种其它三体性和部分三体性。这些包括，但不限于，部分1q32-44三体性(Kimya Y等，Prenat Diagn.2002，22957-61)、具有10p三体性的9p三体性(Hengstschlager M等，Fetal Diagn Ther.2002，17243-6)、4三体性镶嵌现象(Zaslav AL等，Am J Med Genet.2000，95381-4)、17p三体性(De Pater JM等，Genet Couns.2000，11241-7)、部分4q26-qter三体性(Petek E等，Prenat Diagn.2000，20349-52)、9三体性(Van den Berg C等，Prenat.Diagn.1997，17933-40)、部分2p三体性(Siffroi JP等，Prenat Diagn.1994，141097-9)、部分1q三体性(DuPont BR等，Am J Med Genet.1994，5021-7)以及部分6p三体性/6q单体性(Wauters JG等，ClinGenet.1993，44262-9)。
也可使用本发明的方法检测几种染色体单体性如，22、16、21和15单体性，已知其涉及妊娠流产(Munne，S.等，2004.Reprod BiomedOnline.881-90)]。
根据本发明的优选实施方案，通过本发明的方法所检测的单体性可以是X单体性、21单体性、22单体性[使用例如，LSI 22(BCR)探针(Abbott，Cat.No.5J17-24)]、16单体性(使用例如，CEP 16(D16Z3)Abbott，Cat.No.6J36-17)以及15单体性[使用例如，CEP15(D15Z4)探针(Abbott，Cat.No.6J36-15)]。
将会意识到在携带者的亲代中几种易位和微小缺失可以是无症状的，然而在后代中可导致严重的遗传疾病。例如，携带15q11-q13微小缺失的健康母亲可生出具有Angelman综合征的孩子，所述综合征是一种严重的神经变性障碍。因此，使用例如对这种缺失特异的FISH探针，本发明可用于鉴定胎儿中的这种缺失(Erdel M等，Hum Genet.1996，97784-93)。
因此，如果父母中的一方是这种异常的已知携带者，那么本发明也可用于检测任何染色体异常。这些包括，但不限于，少量超数标记染色体(SMC)的镶嵌性(Giardino D等，Am J Med Genet.2002，111319-23)；t(11；14)(p15；p13)易位(Benzacken B等，PrenatDiagn.2001，2196-8)；未平衡的易位t(8；11)(p23.2；p15.5)(Fert-Ferrer S等，Prenat Diagn.2000，20511-5)；11q23微小缺失(Matsubara K，Yura K.Rinsho Ketsueki.2004，4561-5)；Smith-Magenis综合征17p11.2缺失(Potocki L等，Genet Med.2003，5430-4)；22q13.3缺失(Chen CP等，Prenat Diagn.2003，23504-8)；Xp22.3微小缺失(Enright F等，Pediatr Dermatol.2003，20153-7)；10p14缺失(Bartsch O，等，Am J Med Genet.2003，117A1-5)；20p微小缺失(Laufer-Cahana A，Am J Med Genet.2002，112190-3.)、DiGeorge综合征[del(22)(q11.2q11.23)]、Williams综合征[7q11.23和7q36缺失，Wouters CH，等，Am J Med Genet.2001，102261-5.]；1p36缺失(Zenker M，等，Clin Dysmorphol.2002，1143-8)；2p微小缺失(Dee SL等，J Med Genet.2001，38E32)；1型神经纤维瘤(17q11.2微小缺失，Jenne DE，等，Am J Hum Genet.2001，69516-27)；Yq缺失(Toth A，等，Prenaat Diagn.2001，21253-5)；Wolf-Hirschhorn综合征(WHS，4p16.3微小缺失，Rauch A等，Am J Med Genet.2001，99338-42)；1p36.2微小缺失(Finelli P，Am J Med Genet.2001，99308-13)；11q14缺失(Coupry I等，J MedGenet.2001，3835-8)；19q13.2微小缺失(Tentler D等，J Med Genet.2000，37128-31)；Rubinstein-Taybi(16p13.3微小缺失，Blough RI，等，Am J Med Genet.2000，9029-34)；7p21微小缺失(Johnson D等，Am J Hum Genet.1998，631282-93)；Miiler-Dieker综合征(17p13.3)、17p11.2缺失(Juyal RC等，Am J Hum Genet.1996，58998-1007)；2q37微小缺失(Wilson LC等，Am J Hum Genet.1995，56400-7)。
可使用本发明检测倒位[例如，倒位的X染色体Lepretre，F.等，Cytogenet.Genome Res.2003.101124-129；Xu，W.等，Am.J.Med.Genet.2003.120A434-436)、倒位的10号染色体(Helszer，Z.，等，2003.J.Appl.Genet.44225-229)]、隐蔽的亚端粒染色体重排(Engels，H.，等，2003.Eur.J.Hum.Genet.11643-651；Bocian，E.，等，2004.Med.Sci.Monit.10CR143-CR151)和/或重复(Soler，A.，等，Prenat.Diagn.2003.23319-322)。
因此，可使用本发明的教导鉴定胎儿中的染色体畸变，而不对母亲进行侵入性的和有风险的操作。
例如，根据本发明的教导，为了测定胎儿性别和/或是否存在唐氏综合征胎儿(即，21三体性)，使用Pap涂抹细胞刷从妊娠第7周到第11周的怀孕妇女中获得经子宫颈的细胞。将细胞在存在1％青霉素链霉素抗生素的RPMI-1640组织培养基(Beth Haemek，以色列)中重悬，并且根据生产商的使用说明使用Cytofunel ChamberCytocentrifuge(Thermo-Shandon，英国)制备cytospin载玻片。将cytospin载玻片在95％的乙醇中脱水直到进行免疫组织化学分析。
在免疫组织化学分析前，将cytospin载玻片在70％乙醇和水中水合、用PBS洗涤、用3％过氧化氢处理，随后在PBS中洗涤三次并与封闭剂(来自Zymed HISTOSTAIN-PLUS试剂盒，Cat No.858943)温育。根据生产商的使用说明，在载玻片上应用HLA-G抗体(mAb 7759，Abcam Ltd.，Cambridge，英国)，温育60分钟，随后在PBS中洗涤3次。向载玻片上添加生物素化的山羊抗小鼠IgG二抗(Zymed HISTOSTAIN-PLUS试剂盒，Cat No.858943)，温育10分钟，随后在PBS中洗涤3次。然后根据生产商的使用说明，使用HRP-链霉抗生物素缀合物(Zymed HISTOSTAIN-PLUS试剂盒，Cat No.858943)和氨乙基咔唑(AEC Single SolutionChromogen/Substrate，Zymed)HRP底物回收二抗。使用苏木精溶液(Sigma-Aldrich Corp.，St Louis，MO，美国，Cat.No.GHS-2-32)进行复染。使用光学显微镜(AX-70Provis，Olympus，日本)和与其连接的CCD照相机(Applied Imaging，Newcastle，英国)观察免疫染色的经子宫颈的样品并照相，并使用显微镜坐标标记HLA-G阳性滋养层细胞的位置。
然后在水中洗涤含有HLA-G阳性细胞的载玻片，在70％和100％的乙醇中脱水，并且在甲醇-乙酸(以3∶1比率)固定剂溶液中固定10分钟。然后将载玻片在2 X SSC的温溶液(在37℃)中洗涤，在溶于PBS的0.9％的甲醛中固定并在PBS中洗涤。在FISH分析前，将载玻片用胃蛋白酶溶液(溶于0.01N HCl中，0.15％)消化，在乙醇系列中脱水并干燥。
对于测定胎儿性别，将7μl LSI/WCP杂交缓冲液(Abbott)与1μl含有着丝点区Xp11.1-q11.1(DXZ1)和Yp11.1-q11.1(DYZ3)的直接标记的CEP X绿色和Y橙色探针(Abbott cat no.5J10-51)、1μl人Cot1 DNA(1μg/μl，Abbott，Cat No.06J31-001)以及2μl纯化的双蒸水混合。将探针-杂交溶液离心1-3秒并且在每个载玻片上应用11μl探针-杂交溶液，随后立即使用盖玻片覆盖载玻片。然后将载玻片在70℃变性3分钟并在HYBrite装置(Abbott Cat.No.2J11-04)中在37℃进一步温育48小时。杂交后，将载玻片在溶于0.4 X SSC的0.3％NP-40中洗涤，随后在溶于2 X SSC的0.1％NP-40中洗涤，并且使其在黑暗中干燥。使用DAPI II(Abbott)进行复染。然后根据以前标记的HLA-G阳性细胞的位置，使用荧光显微镜(AX-70Provis，Olympus，日本)观察载玻片并照相。
为了测定是否存在或缺乏唐氏综合征胎儿，第一组FISH分析后将载玻片在1 X SSC中洗涤(20分钟，室温下)，随后将它们在71℃纯化的双蒸水中浸10秒种。然后将载玻片在乙醇系列中脱水并干燥。使用含有21q22.13到21q22.2区内的D21S259、D21S341和D21S342基因座的LSI 21q22橙色标记的探针(Abbott cat no.5J13-02)以及如第一组FISH探针所使用的相同杂交和洗涤条件实现杂交。使用荧光显微镜和HLA-G阳性滋养层细胞的相同坐标观察第二组FISH探针杂交后所获得的FISH信号。
发现使用分裂间期染色体13、18、21、X和Y的FISH探针将临床上显著畸形的剩余风险从分裂间期FISH测定前的0.9-10.1％降低到正常分裂间期FISH型后的0.6-1.5％[Homer J，等，2003.Residualrisk for cytogenetic abnormalities after prenatal diagnosis byinterphase fluorescence in situ hybridization(FISH).Prenat Diagn.23566-71]。因此，可使用本发明的教导，通过提供一种有效的产前诊断方法显著降低临床上异常婴儿的风险。
当前在从CVS和/或羊膜腔穿刺术细胞样品中获得的DNA样品上使用基于PCR的或RFLP分析进行产前亲子关系试验(Strom CM，等，Am J Obstet Gynecol.1996，1741849-53；Yamada Y，等，2001.J Forensic Odontostomatol.，191-4)。
将会意识到也可使用激光捕获显微解剖在经子宫颈的和/或子宫内样品中存在的滋养层细胞上进行产前亲子关系试验。
使用细胞的激光捕获显微解剖从载玻片上含有的异种细胞群中选择性地分离特异性细胞类型。使用激光捕获显微解剖的方法在现有技术中是已知的(见，例如Fein，Howard等的美国专利申请No.20030227611；Micke P，等，2004.J.Pathol.，202130-8；Evans EA，等，2003.Reprod.Biol.Endocrinol.154；Bauer M，等2002.Paternitytesting after pregnancy termination using laser microdissection ofchorionic villi.Int.J.Legal Med.11639-42；Fend，F.和Raffeld，M.2000，J.Clin.Pathol.53666-72)。
例如，将含有滋养层的细胞样品(例如，经子宫颈细胞的cytospin载玻片)与激光活化后能附着到特异性细胞上的选择性活化的表面(例如，热塑性的膜)接触。基本上如在随后实施例部分的实施例1中所描述的对细胞样品进行免疫染色(使用例如，HLA-G或PLAP抗体)。免疫染色后，使用显微镜观察细胞样品以鉴定免疫染色的滋养层细胞(即，分别是HLA-G或PLAP阳性细胞)。一旦鉴定，则经光学纤维发送的激光束[例如，使用PALM Microbeam系统(PALM MicrolaserTechnologies AG，Bernreid，德国)]激活附着到所选滋养层细胞上导致其显微解剖和分离的表面。
一旦分离，可使用例如，对短串连重复(STRs)和/或D1S80基因座特异的PCR引物，和/或对多基因座(Myo)和单基因座(pYNH24)特异的RFLP探针，基本上如在Strom CM，等，(同上)和YamadaY，等，(同上)中所描述的，对滋养层细胞进行PCR和/或RFLP分析。
预计在本专利的保护期限期间将会开发许多相关的染色方法，并且术语染色的范围意在包括所有这些由此演绎的新技术。
如这里所使用的术语“约”指±10％。
在研究下列实施例后，本发明的另外目的、优点以及新的特征对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的，其不意在用于限制。另外，在上文所描绘的和在下面权利要求部分中所要求的本发明的各种实施方案和方面中的每一种都能在下列实施例中得到实验的支持。
实施例现在参考下列实施例，与上面描述一起，以非限制方式举例说明本发明。
通常，这里所使用的术语和在本发明中利用的实验室方法包括分子的、生物化学的、微生物学的以及重组DNA技术。在现有技术中完全解释了这些技术。见，例如，“Molecular CloningA laboratoryManual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”I-III卷Ausubel，R.M.，编(1994)；Ausubel等，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(编)“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如在美国专利Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐述的方法学；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，I-III卷Cellis，J.E.，编(1994)；Freshney，Wiley-Liss编“Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique”，N.Y.(1994)，第三版；“CurrentProtocols in Immunology”I-III卷Coligan J.E.，编(1994)；Stites等(编)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton &Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，“SelectedMethods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；在专利和科学文献中广泛描述了可利用的免疫测定，见，例如，美国专利Nos.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，编(1984)；“Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1985)；“Transcription and Trahslation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，编(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A PracticalGuide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods inEnzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCR ProtocolsA GuideTo Methods And APPlications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；“In Situ Hybridization Protocols”，Choo，K.H.A.，编HumanaPress，Totowa，New Jersey(1994)；所有这些都引入作为参考，如同这里完全阐述的一样。整个这篇文件提供其它一般的参考文献。这里的方法据信在现有技术中是公知的并且为了读者的方便提供。将这里所包含的所有信息引入作为参考。
实施例1从经子宫颈样品中获得的绒毛外滋养层细胞测定胎儿FISH型如下所述，使用免疫组织化学染色分析从妊娠第6周至第15周怀孕的妇女中获得的经子宫颈细胞，随后进行FISH分析。
材料和实验方法研究受试者-在妊娠的第6周至第15周的怀孕妇女，其被安排进行妊娠终止或者被邀请进行常规妊娠检查，在获得她们的书面同意后被编入研究中。
经子宫颈细胞的取样-将Pap涂抹细胞刷(MedScand-AB，Malm，瑞典)通过外口插到最深2cm(刷的长度)，将其完全旋转(即，360°)后取出。为了取下刷上捕获的经子宫颈的细胞，将刷子在含有2-3ml存在1％青霉素链霉素抗生素的RPMI-1640培养基(Beth Haemek，以色列)的试管中振荡。然后通过将1-3滴含有经子宫颈细胞的RPMI-1640培养基滴到Cytofunel ChamberCytocentrifuge(Thermo-Shandon，英国)中制备cytospin载玻片(每个经子宫颈的样品6个载玻片)。用于细胞离心的条件取决于经子宫颈样品的细胞的模糊度；如果样品仅含有少量细胞，则首先将细胞离心5分钟，然后用1ml新鲜RPMI-1640培养基重悬。将cytospin载玻片保藏在95％乙醇中。
经子宫颈细胞的免疫组织化学(IHC)染色-将含有经子宫颈细胞的cytospin载玻片在70％乙醇溶液中洗涤并在蒸馏水中浸5分钟。在PBS中进行所有洗涤，所述PBS包括封闭剂，同时轻轻振荡载玻片。然后将载玻片转移到潮湿的室中，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤3次。为了显示显微镜载玻片上细胞的位置，使用Pap Pen(ZymedLaboratories Inc.，San Francisco，CA，美国)标记经子宫颈样品的边界。向每个载玻片加入50微升3％过氧化氢(Merck，德国)，室温下温育10分钟，随后将载玻片在PBS中洗涤3次。为了避免抗体的非特异性结合，向每个载玻片上加入两滴封闭剂(ZymedHISTOSTAIN-PLUS试剂盒，Cat No.858943)，在潮湿的室中温育10分钟。为了鉴定经子宫颈样品中的胎儿滋养层细胞，向载玻片加入50μl在抗体稀释液(Zymed)中1200稀释的对绒毛外滋养层细胞特异的非经典I型主要组织相容性复合体(MHC)抗原的HLA-G抗体(mAb 7759，Abcam Ltd.，Cambridge，英国)部分(Loke，Y.W.等，1997.Tissue Antigens 50135-146)，或者50μl在抗体稀释液中1∶200稀释的对合胞体滋养层和/或细胞滋养层特异的抗人胎盘碱性磷酸酶抗体(PLAP Cat.No.18-0099，Zymed)(Leitner，K.等，2001.Placentalalkaline phosphatase expression at the apical and basal plasmamembrane in term villous trophoblasts.J.Histochemistry andCytochemistry，491155-1164)。将载玻片与抗体在潮湿的室中温育60分钟，随后将它们用PBS洗涤3次。为了检测结合的HLA-G特异性一抗，向每个载玻片加入两滴生物素化的山羊抗小鼠IgG二抗(Zymed HISTOSTAIN-PLUS试剂盒，Cat No.858943)，在潮湿的室中温育10分钟。二抗用PBS洗涤3次。为了显示生物素化的二抗，加入两滴辣根过氧化物酶(HRP)-链霉抗生物素缀合物(ZymedHISTOSTAIN-PLUS试剂盒，Cat No.858943)，在潮湿的室中温育10分钟，随后在PBS中洗涤3次。最后，为了检测HRP缀合的链霉抗生物素，加入两滴氨乙基咔唑(AEC Single SolutionChromogen/Substrate，Zymed)HRP底物，在潮湿的室中温育6分钟，随后用PBS洗涤3次。通过将载玻片在2％苏木精溶液(Sigma-Aldrich Corp.，St Louis，MO，美国，Cat.No.GHS-2-32)中浸25秒进行复染，随后将载玻片在自来水下洗涤并用盖玻片覆盖。
免疫组织化学染色的显微镜分析-使用光学显微镜(AX-70，Provis，Olympus，日本)扫描含有经子宫颈细胞的免疫染色的载玻片，并用显微镜中的坐标数标记染色的细胞(滋养层)的位置。
FISH分析前免疫组织化学染色的载玻片的预处理-免疫组织化学染色后，将载玻片在双蒸水中浸5分钟，在70％和100％乙醇中脱水，每种5分钟，并在甲醇-乙酸(以3∶1比率，Merck)固定剂溶液中固定10分钟。然后将载玻片在pH7.0-7.5，300mM NaCl，30mM柠檬酸钠(2 X SSC)的温溶液(在37℃)中浸20分钟。温育后，排干过量的2 X SSC溶液并且在室温下将载玻片在溶于PBS的0.9％甲醛溶液中固定15分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤10分钟并将细胞在37℃在溶于0.01N HCl的0.15％胃蛋白酶溶液(Sigma)中消化15分钟。胃蛋白酶消化后，将载玻片在PBS中洗涤10分钟并使其干燥。为了确保完全脱水，将载玻片浸在70％、85％和100％乙醇系列中(每种1分钟)，并在培养箱中45-50℃干燥。
FISH探针-使用双色技术和随后的直接标记的探针(Abbott，Illinois，美国)进行FISH分析性染色体CEP X绿色和Y橙色(Abbott cat no.5J10-51)；CEPXSpectrumGreenTM/CEPY(μ，随体)SpectrumOrangeTM(Abbott Cat.No.5J10-51)；CEP X/Y由用SpectrumGreenTM直接标记的、并与SpectrumOrangeTM直接标记的探针混合的对着丝点区Xp11.1-q11.1(DXZ1)特异的μ随体DNA组成，其中所述探针对包含在着丝点区Yp11.1-q11.1(DYZ3)内的μ随体DNA序列是特异的。
21号染色体橙色标记的LSI 21q22(Abbott cat no.5J13-02)。LSI 21q22探针含有与21号染色体长臂上21q22.13到21q22.2区内的D21S259、D21S341和D21S342基因座互补的独特的DNA序列。
13号染色体LSI13SpectrumGreenTM探针(Abbott Cat.No.5J14-18)，其包括成视网膜细胞瘤基因座(RB-113)和对13号染色体13q14区特异的序列。
18号染色体绿色标记的CEP 18(Abbott Cat No.5J10-18)；CEP18(D18Z1，α随体)Spectrum OrangeTM(ABBOTT Cat No.5J08-18)。CEP 18探针由对包含在18号染色体着丝点区(18p11.1-q11.1)内的α随体DNA(D18Z1)特异的DNA序列组成。
16号染色体CEP16(Abbott Cat.No.6J37-17)探针与16号染色体(16q11.2)的着丝点区(随体II，D16Z3)杂交。用spectrum绿色荧光团直接标记CEP16探针。
AneuVysion探针用于18号染色体(Aqua)、X染色体(绿色)、Y染色体(橙色)的CEP探针以及用于13号染色体的绿色和21号染色体的橙色LSI探针。这种FDA批准的试剂盒(Abbott cat.#5J37-01)包括阳性和阴性对照载玻片、20 X SSC、NP-40、DAPI II复染剂和详细的包装插页。
免疫组织化学染色的载玻片上的FISH分析-杂交前，将7μlLSI/WCP杂交缓冲液(Abbott)与1μl直接标记的探针(见上文)、1μl人Cot 1DNA(1μg/μl)(Abbott，Cat No.06J31-001)和2μl纯化的双蒸水混合。将探针-杂交溶液离心1-3秒钟并在每个载玻片上应用11μl探针-杂交溶液，随后，使用盖玻片立即覆盖载玻片。
通过将解链温度设置到70℃以及将解链时间设置为3分钟，在HYBrite装置(Abbott Cat.No.2J11-04)中进行原位杂交。在37℃杂交48小时。
杂交后，将载玻片在72℃在溶于60mM NaCl和6mM柠檬酸钠(0.4 X SSC)的0.3％NP-40(Abbott)溶液中洗涤2分钟。然后将载玻片在室温下在溶于2 X SSC的0.1％NP-40溶液中浸1分钟，随后使载玻片在黑暗中干燥。使用10μl DAPI II复染剂(Abbott)进行复染，随后使用盖玻片覆盖载玻片。
将载玻片进行重复的FISH分析-对于几个载玻片，使用不同组探针重复FISH分析。与第一组FISH探针杂交后，将载玻片在150mMNaCl和15mM柠檬酸钠(1X SSC)中洗涤20分钟，随后将载玻片在71℃的纯化的双蒸水中浸10秒钟。然后将载玻片在70％、85％和100％乙醇系列中脱水，每种2分钟，并在培养箱中于45-50℃进行干燥。根据如上文所描述的方法进行杂交和杂交后洗涤。
FISH结果的显微镜评估-FISH分析后，使用免疫组织化学染色后获得的标记的坐标鉴定滋养层细胞(即，HLA-G阳性细胞)，并且使用荧光显微镜(AX-70Provis，Olympus，日本)观察这些细胞中的FISH信号。
胎盘组织的取样和处理-妊娠终止后获得一块大约0.25cm2的活组织检查胎盘组织。使用解剖刀将胎盘组织压碎成小块，在含有1∶1比率的KCl(43mM)和柠檬酸钠(20mM)的溶液中洗涤3次，并在室温下温育13分钟。然后通过添加3滴甲醇-乙酸(以3∶1比率)固定剂溶液温育3分钟来固定胎盘组织，随后将溶液用新鲜的3ml固定剂溶液替换，在室温下温育45分钟。为了将胎盘组织分离成细胞悬浮液，用1-2ml 60％乙酸替换固定剂溶液，振荡温育10秒钟。然后将胎盘细胞悬浮液置于载玻片上风干。
在正在进行的妊娠中进一步证实染色体的FISH分析-使用羊膜腔穿刺术和绒毛膜绒毛取样(CVS)测定染色体核型并使用超声扫描(US)测定正在妊娠中的胎儿性别。
实验结果在母亲的经子宫颈的细胞中鉴定绒毛外滋养层细胞-为了鉴定绒毛外滋养层，从怀孕的妇女(妊娠第6-15周)中制备经子宫颈的样品并使用HLA-G抗体对经子宫颈的细胞进行免疫组织化学染色。如在下文表1中所示的，使用HLA-G和/或PLAP抗体的IHC染色能在255份经子宫颈样品中的230份中鉴定出绒毛外的、合胞体滋养层或细胞滋养层细胞。在25份经子宫颈的样品中(所有病例的10％)，经子宫颈的细胞不包括滋养层细胞。在几个病例中，邀请患者重复进行经子宫颈取样并进一步证实存在滋养层(没有显示)。正如可从下文表1中所计算的，HLA-G阳性细胞的平均数是每个经子宫颈样品6.67个(包括所有6个cytospin载玻片)。
对绒毛外滋养层细胞进行FISH分析-IHC染色后，对含有HLA-G或PLAP阳性细胞的载玻片进行甲醛和胃蛋白酶处理，随后使用直接标记的FISH探针进行FISH分析。正如可从下文表1中的数据所计算的，使用FISH探针标记的细胞的平均数是3.44。在大多数病例中，将FISH结果与从胎盘组织(在妊娠终止的病例中)或CVS和/或羊膜腔穿刺术(在正在怀孕的病例中)的细胞核型分析中获得的结果进行比较。在一些病例中，使用超声扫描进一步证实胎儿性别。
表1测定经子宫颈样品的滋养层中的FISH型
表1与IHC和FISH阳性细胞的数目以及使用胎盘活组织检查、CVS或羊膜腔穿刺术测定性别和/或染色体畸变一起显示胎儿FISH型测定的成功(+)或失败(-)。Gest.＝怀孕的妊娠；“错误”＝HLA-G或PLAP抗体对母亲细胞的非特异性结合和/或FISH分析后残余的抗体来源的信号；*＝由于细胞数少导致镶嵌性鉴定的失败。
在经子宫颈样品中存在的绒毛外滋养层中鉴定正常男性胎儿-对含有在妊娠第7周和第9周的两个不同的怀孕妇女(在上文的表1中分别是73和80号病例)中获得的经子宫颈细胞的载玻片进行HLA-GIHC染色。如在图1a和1c中所示的，两个经子宫颈的样品都包括HLA-G阳性细胞(即，绒毛外滋养层)。为了测定胎儿的性别，IHC染色后，使用CEP X和Y探针对载玻片进行FISH分析。如在图1b和1d中所示的，在每个病例中检测对应于男性胎儿的正常FISH型。这些结果证明经子宫颈的样品在测定胎儿细胞FISH型中的用途。
使用PLAP抗体可在经子宫颈样品中存在的细胞滋养层细胞中成功地测定FISH型-使用能鉴定合胞体滋养层和绒毛状细胞滋养层细胞的抗人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)抗体对从妊娠第11周的怀孕妇女中获得的经子宫颈的细胞进行IHC染色(Miller等，1999Hum.Reprod.14521-531)。如在图2a中所示的，PLAP抗体能鉴定经子宫颈样品中的绒毛状细胞滋养层细胞。使用CEP X和Y探针的FISH分析后，在绒毛状细胞滋养层细胞上存在单一橙色和单一绿色信号(图2b，白色箭标)证实存在正常男性胎儿。
使用经子宫颈样品中的绒毛外滋养层诊断唐氏综合征(21三体性)-将从妊娠第8周的怀孕妇女(上文表1中的第71号病例)中获得的经子宫颈细胞进行HLA-G IHC染色，随后使用对Y和21号染色体特异的探针进行FISH分析。如在图3a-b中所示的，HLA-G阳性细胞(图3a，用白色箭标标记的细胞)含有3个橙色信号和单一绿色信号(图3b)，表明在男性胎儿的绒毛外滋养层中存在21三体性(即，唐氏综合征)。这些结果暗示在经子宫颈样品制剂中鉴定具有唐氏综合征胎儿的用途。
使用经子宫颈细胞诊断Turner氏综合征(XO)-对从妊娠第6周的怀孕妇女中获得的经子宫颈的细胞(上文表1中第76号病例)进行HLA-G IHC，随后使用对X和Y染色体特异的探针进行FISH分析。如在图4a-b中所示，FISH分析(图4b)后HLA-G-阳性绒毛外滋养层细胞中存在单一绿色信号，表明女性胎儿中存在Turner氏综合征(即，XO)。这些结果提示在经子宫颈样品制剂中鉴定具有Turner氏综合征胎儿的用途。
使用经子宫颈细胞诊断Klinefelter氏镶嵌性-从妊娠第7周被安排进行妊娠终止的怀孕妇女(上文表1中的第161号病例)中制备经子宫颈样品的cytospin载玻片。如在图5a-b中所示的，虽然一个绒毛外滋养层细胞(图5b，1号细胞)显示正常FISH型(即，单一X和单一Y染色体)，但第二个滋养层细胞(图5b，2号细胞)显示具有两个X染色体和单一Y染色体的异常FISH型。这些结果提示在男性胎儿中存在Klinefelter氏镶嵌性。为了证实该结果，将来源于妊娠终止后获得的胎盘组织的细胞进行相同的FISH分析。如在图5c中所示的，在胎盘细胞中进一步证实了Klinefelter氏镶嵌性。因此，可在经子宫颈的样品中检测染色体的镶嵌性。然而，将会意识到这种鉴定可能取决于在经子宫颈的样品中存在的滋养层细胞(即，IHC阳性细胞)的总数以及取决于滋养层细胞内的镶嵌细胞的百分率。
在从正在怀孕和妊娠终止前获得的含有滋养层的经子宫颈样品中，本发明的联合检测方法在92.89％的样品中成功地测定了胎儿的FISH型-上文表1，总结了妊娠终止前(1-165号病例，表1)或在常规检查期间(166-255号病例，表1，正在妊娠)，在从妊娠第6周到第15周的怀孕妇女中制备的255份经子宫颈样品上进行的IHC和FISH分析的结果。本发明的联合检测方法(即，IHC和FISH分析)在经子宫颈的样品中测定胎儿FISH型的总成功率是76.86％。在25/255病例中，由于没有足够的IHC阳性细胞而没有进行FISH分析，在19/255病例中，由于FISH测定的失败而没有测定FISH型(表1，用“-”标记的病例)。在剩余的211份病例中，通过使用胎盘活组织检查、羊膜腔穿刺术或CVS的胎儿细胞所获得的核型结果进一步证实，在92.89％的病例中成功地在含有滋养层的经子宫颈样品中测定了胎儿的FISH型(表1，用“+”标记的病例)。在15/211病例中(即，7.11％)，在与HLA-G或PLAP抗体非特异性相互作用的细胞上进行了FISH分析，因此，导致在母亲细胞上的FISH杂交(表1，标记为“错误”病例)。将会意识到通过改善抗体制备或IHC测定条件，预计将降低与滋养层特异性抗体(例如，HLA-G或PLAP)非特异性相互作用细胞的百分率。
本发明的联合检测方法在87.34％来源于正在妊娠的含有滋养层的经子宫颈样品中成功地测定了胎儿的FISH型-如可从上文表1中所计算的，使用正在妊娠的经子宫颈样品测定胎儿细胞中FISH型的总成功率是76.67％。在常规检查期间从怀孕妇女(即，正在怀孕)中获得的总计90份经子宫颈的样品中(第166-255号病例，表1)，11份经子宫颈的样品(12.2％)包含了IHC阴性细胞。在剩余的79份经子宫颈的样品中，在8份IHC阳性样品中抗体与母亲细胞非特异性相互作用，结果在母亲染色体的FISH分析中(标记为“错误”的病例，表1)，一个经子宫颈的样品(第247号病例，表1)由于样品中滋养层细胞数目少而不能鉴定XY/XXY镶嵌性，然而，能鉴定XY细胞，且一个经子宫颈的样品(第174号病例，表1)由于FISH测定的技术问题而不能鉴定。总的来说，在79份IHC阳性(即，含有滋养层)的经子宫颈样品中的69份(87.34％)中成功地测定了FISH型。
总而言之，这些结果证明经子宫颈的细胞用于测定胎儿滋养层的FISH型的用途。此外，从正在怀孕妇女的经子宫颈样品所获得的结果提示，为了测定胎儿性别和常见的染色体畸变(例如，三体性、单体性等)，经子宫颈的细胞在常规产前诊断中的用途。更具体地，可将本发明的联合检测方法用于能使用FISH分析检测的与染色体畸变相关疾病的产前诊断，尤其是，在父母一方是这类疾病，例如，罗伯逊易位t(14；21)、平衡相互易位t(1；19)、小微小缺失综合征(例如，DiGeorge、Miller-Dieker)、已知倒位(例如，染色体7、10)等疾病携带者的情况时。
应当意识到也可能在单独的实施方案中以组合方式提供为了清楚起见描述在单独实施方案上下文中的本发明的某些特征。相反地，也可单独地或以任何适当的亚组合方式提供为了清楚起见描述在单独实施方案上下文中的本发明的各种特征。
尽管结合其具体实施方案已经描述了本发明，但是很显然许多备选方案、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，意欲包括落在所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些备选方案、修改和变化。这里将在本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请的全部内容结合到本说明书中作为参考，其程度与具体地和单独地指出在这里结合参考每个单独的出版物、专利或专利申请的相同的程度。另外，本说明书中任何参考文献的引用或鉴定不应当被解释为承认这些参考文献作为本发明的现有技术。
权利要求
1.一种测定胎儿性别和/或鉴定至少一种胎儿染色体异常的方法(a)免疫染色含有滋养层的细胞样品以便鉴定至少一种滋养层细胞，和；(b)对所述至少一种滋养层细胞进行原位染色体和/或DNA分析以便测定胎儿性别和/或鉴定至少一种染色体异常。
2.权利要求1的方法，其中从子宫颈和/或子宫获得所述含有滋养层的细胞样品。
3.权利要求1的方法，其中使用选自吸引术、细胞刷、棉花拭子、子宫颈内灌洗和子宫内灌洗的方法获得所述含有滋养层的细胞样品。
4.权利要求1的方法，其中从妊娠第6周到第15周的怀孕妇女中获得所述滋养层细胞样品。
5.权利要求1的方法，其中使用抗滋养层特异性抗原的抗体实现所述免疫染色。
6.权利要求5的方法，其中所述滋养层特异性抗原选自HLA-G、PLAP、PAR-1、Glut12、H315、FT1.41.1、I03、NDOG-1、NDOG-5、BC1、AB-340、AB-154和因子XIII。
7.权利要求1的方法，其中使用荧光原位杂交(FISH)和/或引物介导的原位标记(PRINS)实现所述原位染色体和/或DNA分析。
8.权利要求1的方法，其中所述至少一种染色体异常选自非整倍体性、易位、亚端粒重排、缺失、微小缺失、倒位和重复。
9.权利要求8的方法，其中所述染色体非整倍体性是完全和/或部分三体性。
10.权利要求9的方法，其中所述三体性选自21三体性、18三体性、13三体性、16三体性、XXY、XYY和XXX。
11.权利要求8的方法，其中所述染色体非整倍体性是完全和/或部分单体性。
12.权利要求11的方法，其中所述单体性是X单体性、21单体性、22单体性、16单体性和15单体性。
全文摘要
提供一种非侵入性、无风险的产前诊断方法。根据本发明的方法，为了测定胎儿性别和/或鉴定胎儿染色体的异常，对经子宫颈的样品进行滋养层特异性免疫染色，随后进行FISH和/或PRINS分析。
文档编号G01N33/68GK1798853SQ200480015391
公开日2006年7月5日 申请日期2004年4月1日 优先权日2003年4月3日
发明者A·艾米尔, M·D·费金 申请人:蒙娜丽莎医疗有限公司