调节骨相关活性的新方法

专利名称：调节骨相关活性的新方法
技术领域：
本发明是在分子生物学领域中的。更具体地说，本发明涉及骨相关病症的诊断、预后、预防、治疗和疗法评估的方法和组合物。
背景技术：
骨相关病症(disorders)和疾病的课题在过去几年中得到相当多的注意。骨相关病症的特点在于由骨吸收和骨形成之间的不平衡引起的骨损失。整个生命过程中，存在着不断的骨骼改型。在这一改型过程中，在破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的随后恢复之间存在着微妙的平衡。涉及软骨内和膜内骨化的成骨细胞是骨组织中的特化细胞，它生成基质蛋白，导致新骨的形成。骨形成，即骨发生，是对骨骼中骨质量保持必不可少的。不象成骨细胞，破骨细胞是与骨吸收和除去有关的。在正常的骨中，成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡通过复杂的受调控的相作互用得到保持。
存在许多与骨骼系统有关的许多缺陷、疾病和病症。几个例子包括，但不限于，骨质疏松症、骨癌、关节炎、佝偻病、骨折、牙周病、骨部分缺陷、溶骨病、原发性和继发性甲状旁腺机能亢进、变形性骨炎(paget’s disease)、软骨病、骨肥厚和骨硬化病。鉴定涉及成骨分化和更新过程的机制对于理解骨生理学和骨骼病症，如骨质疏松症是关键性的。这些病症可能涉及由于推定的成骨祖细胞的有缺陷的成熟而导致的有缺陷的骨形成。
有必要发展治疗与骨生长有关的疾病或病症的方法，加速骨形成的方法，鉴定调节(增强或减弱)骨形成的制剂的方法，以及鉴定与骨相关病症相关的基因或其蛋白产物的方法。
鉴定骨形成和骨吸收涉及的机制对于理解骨生理学和骨骼病症，如骨质疏松症是关键性的。与骨相关病症有关的基因或其蛋白产物可以被用来阐明骨形成、骨吸收的分子机制，用于筛选筛选和发展新药，骨发育和骨损失病症的诊断、预后、预防和治疗，以及骨相关病症如骨质疏松症疗法的评估。
本发明不仅提供一种调节骨相关活性的方法，它还提供一种增进理解骨形成和骨吸收涉及的机制的方法。
发明概述本发明涉及一种包含编码Ror多肽或其同源物或衍生物或片段或变体或突变体的多聚核苷酸的表达盒，其中所述多聚核苷酸在骨细胞中可操作的启动子的控制下。
本发明涉及一种包含含有编码Ror多肽或其同源物或衍生物或片段或变体或突变体的多聚核苷酸的表达盒的宿主细胞，其中所述多聚核苷酸在真核细胞中可操作的启动子的控制下，所述启动子与所述多聚核苷酸异源。
本发明涉及一种调节骨-相关活性的组合物，包含有效量的Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变体或突变体。
本发明涉及一种筛选试剂的方法，所述方法包括(a)将试剂与Ror分子组合；和(b)检测所述试剂对Ror活性的效果，其中检测到的Ror活性的降低或提高是试剂为骨相关试剂的指征。
本发明涉及一种筛选试剂的方法，所述方法包括(a)将试剂与分离的细胞组合，所述细胞含有一种Ror启动子序列，其可操作地连接于报告基因上；和(b)检测所述试剂对报告基因活性的效果，其中如通过报告基因活性测量的Ror启动子活性的降低或提高是试剂为骨相关试剂的指征。
本发明涉及一种筛选调节Ror多肽对结合配偶体的结合的方法，包括(a)将Ror多肽与Ror结合配偶体在存在试剂时相接触；(b)将Ror多肽与Ror结合配偶体在存在对照或不存在所述试剂时相接触；和(c)通过对步骤(a)中所述Ror多肽与所述结合配偶体的结合和步骤(b)中所述Ror多肽与结合配偶体的结合进行比较来选择调节Ror多肽与Ror结合配偶体的结合的试剂。
本发明涉及一种在受试者中调节骨相关活性的方法，包括向受试者给药调节靶Ror分子表达或活性的试剂。
本发明涉及一种在受试者中调节Wnt-1和Wnt-3活性的方法，包括以有效调控Wnt-1和Wnt-3活性的量给药调节靶Ror2分子或活性的试剂。
本发明涉及一种在受试者中调节Wnt-3活性的方法，包括以有效调控Wnt-3活性的量给药调节靶Ror1多肽表达或活性的试剂。
本发明涉及一种鉴定调节骨相关活性的试剂的方法，包括(a)在细胞中表达Ror分子或利用内源性Ror表达；(b)将所述细胞与所述试剂接触；和(c)监测Ror分子的表达或活性，其中在存在所述试剂时Ror表达或活性的增减将所述试剂鉴定为调节骨相关活性的。
本发明涉及一种鉴定调节Wnt信号途径的试剂的方法，包括筛选一种或多种能够调节Ror分子表达或活性的试剂，其中所述能够调节Ror分子表达或活性的试剂是调节Wnt信号途径的试剂。
本发明涉及一种将生物活性分子连接到表达Wnt多肽的细胞上的方法，所述方法包括将所述细胞与结合所述生物活性分子的Ror2多肽相接触，并且允许所述Wnt多肽和所述Ror2多肽彼此结合，从而将所述生物活性分子连接到所述细胞上。
本发明涉及一种对受试者筛选骨相关病症的方法，包括下列步骤在受试者中测量Ror分子的表达并测定在受试者中所述Ror分子与其在正常受试者中相比的相对表达，或与其在进行过骨相关病症治疗后的同一受试者中的表达相比的相对表达。
本发明涉及一种对受试者筛选骨相关病症的方法，包括下列步骤在受试者中测量Ror多肽的活性并测定在受试者中所述Ror多肽与其在正常受试者中相比的相对活性，或与其在进行过骨相关病症治疗后的同一受试者中的活性相比的相对活性。
本发明涉及一种鉴定参与骨形成的基因的方法，包括a)在细胞中过表达Ror分子，b)监测基因表达模式的变化和c)测定哪个基因受Ror表达调控，藉此鉴定参与骨形成的基因。
本发明涉及一种鉴定调节Wnt信号途径的基因的方法，包括a)在细胞中过表达Ror分子，b)监测基因表达模式的变化和c)测定哪个基因受Ror表达调控，藉此鉴定调节wnt信号途径的基因。
本发明涉及一种利用Ror2作为标记鉴定正在增殖的人前成骨细胞的方法，包括在人成骨细胞中测定Ror2基因的表达，其中提高的Ror2表达将细胞鉴定为正在增殖的前成骨细胞。
本发明涉及一种利用Ror2作为标记鉴定处于基质成熟阶段的小鼠成骨细胞的方法，包括在小鼠成骨细胞中测定Ror2基因的表达，其中提高的Ror2表达将细胞鉴定为处于基质成熟阶段的成骨细胞。
本发明涉及一种测定Ror2激酶活性的方法，包括(a)获得Ror2多肽；(b)在存在32PγATP时标记Ror2多肽；(c)通过测量掺入的32P的量来测定Ror2激酶活性，其中32P的量表明Ror2激酶的活性。
附图简述和序列描述由下列详述和随附的形成本申请一部分的附图以及序列表可以更充分地理解本发明。


图1显示在人成骨细胞分化晚期Ror激酶的表达减少。通过在GlHuman1a芯片(圆形)上的基因芯片分析和通过实时RT-PCT(条形)评定细胞中Ror2(图1A)和Ror1(图1B)的表达，其代表了成骨细胞从前成骨细胞到成熟骨细胞的分化的不同阶段。对于两种方法来说，都将HOB-03-C5中的相对mRNA表达设定为1。利用列于实施例1中表1里的探针和引物进行实时RT-PCT。将mRNA的水平标准化为每种样品中18SrRNA的表达。每个细胞系三次RT-PCR反应的平均值±标准误差(SE)。在HOB-05-T1细胞中的Ror2表达通过RT-PCR是检测不到的。细胞系03-C5-HOB-03-C5，前成骨细胞，03-CE6-HOB-03-CE6，早期成骨细胞；02-C1-HOB-02-C1，成熟成骨细胞；01-C1-HOB-01-C1，前骨细胞；05-T1-HOB-05-T1，成熟骨细胞(在实施例1中参考图1)。
图2显示SFRP-1抑制Ror2表达。利用来自稳定过表达SFRP-1(01-09SFRP-1)的HOB-01-09骨细胞或空白载体(01-09载体)的或来自野生型或SFRP-1-/-小鼠的颅盖骨的多聚A(+)RNA在GlHumanla芯片上Ror2(闭合条形)以及Ror1(开放条形)表达的基因芯片分析的结果。在野生型以及SFRP1-/-小鼠中Ror1表达的水平在芯片探测范围之下。在所述01-09载体细胞以及在野生型小鼠中相对的mRNA表达设定于1(在实施例1中参考图2)。
图3显示Ror蛋白质的预测结构域结构。所述结构域是IG-免疫球蛋白；FRZ-卷曲的；kringle-最初在凝血酶原中发现的由三对二硫键连接的三环结构；M-跨膜；Tyr Kin-酪氨酸激酶。B.在卷曲的Ror1模块中二硫键的定位(Roszmusz，等，E.，2001，Journal of BiologicalChemistry.27618485-90)。数字是指所述卷曲的结构域中10个保守的半胱氨酸(在实施例1中参考图3)。
图4显示Ror2的表达，但不是Ror1，激酶在人成骨细胞分化早期直到小鼠成骨细胞分化晚期增多。A.将人MSC温育于人成骨培养基中(在生长培养基中的0.1mM地塞米松，0.05mM抗坏血酸以及10mM β-甘油磷酸酯)并于指定的时间收集总细胞RNA并通过RT-PCR分析Ror1和Ror2基因的表达。B.将鼠MC3T3-E1细胞温育于小鼠成骨培养基中(于生长培养基中的25ug/ml抗坏血酸和10mM β-甘油磷酸酯)并于指定的时间收集总细胞RNA并通过RT-PCR分析Ror1、Ror2、碱性磷酸酶(AP)、和骨钙素(OC)基因的表达(在实施例2中参考图3)。
图5显示Ror蛋白质在U2OS细胞中的表达。A.全长Ror1和Ror2激酶和Ror2突变体的图示。FLAG-flag表位标记；M-跨膜结构域；TyrKin-酪氨酸激酶结构域。B.来自U2OS细胞的全部细胞蛋白质提取物(50μg/泳道)的flag表位标记的蛋白质印迹，所述细胞用指定的Ror构建体进行转染。Ror1、Ror2和Ror2KD的位置通过箭头标记而Ror2ΔC-flag通过箭号标记。C.上部版块显示如在一般方法(GeneralMethods)下所述进行的体外自磷酸化试验结果的放射自显影照片，所述试验使用免疫沉淀于flag亲合性琼脂糖上的Ror2-flag或Ror2KD-flag进行。在下部版块中，通过SDS-PAGE分离百分之十的flag免疫沉淀的蛋白质并通过银染分析以评定在自磷酸化反应中的激酶水平(在实施例3，6和8中参考图5)。
图6显示Ror2激酶抑制Wnt-3，但是加强Wnt-l活性。用包含16个拷贝TCF结合位点的重组荧光素酶报告基因对U2OS培养物进行瞬间转染，所述TCF结合位点5’克隆于胸腺嘧啶核苷激酶启动子上。在A中，将启动子-报告基因与pcDNA3.1(+)(载体)，Ror2-flag(R2)，Wnt-3-HA(w3)，或Wnt-3-HA加上指定量的Ror2-flag(以ng/96孔板的孔表示)或SFRP-1(S)或二者一起进行共转染。在B中，将启动子-报告基因与pcDNA3.1(+)，Wnt-1-HA(w1)，或Wnt-1-HA加上指定量的Ror2-flag或SFRP-1或二者一起进行共转染。任意地给荧光素酶值一个值1，所述荧光素酶值在存在pcDNA3.1(+)时转染报告基因后测量。在A中，结果是至少两个独立实验的平均值±SE，n≥16，星号表明在单独用Wnt-3-HA获得的水平之下荧光素酶活性的显著降低(*p＜0.05，**-p＜0.0001)。在B中，结果是至少三个独立实验的平均值±SE，n≥24，星号表明在单独用Wnt-1-HA获得的水平之上荧光素酶活性的显著提高(*-p＜0.05，**-p＜0.0001)(在实施例4中参考图6)。
图7显示Ror1激酶抑制Wnt-3，但是对于Wnt-1活性没有影响。如在图6中一样，除了使用Ror1-flag(R1)代替Ror2-flag。平均值+SE，n≥8。在A中，星号表明在单独用Wnt-3-HA获得的水平之下荧光素酶活性的显著降低(*p＜0.01，**-p＜0.0001)(在实施例5中参考图7)。
图8显示Ror2的酪氨酸激酶活性是Wnt-1的增强和Wnt-3活性的大部分抑制所必需的。如在图6中一样，除了使用Ror2KD-flag(R2KD)代替Ror2-flag。在A和B中，结果是至少三个独立实验的平均值±SE，n≥24。星号表明在单独用Wnt-3-HA获得的水平之下荧光素酶活性的显著降低(**-p＜0.0001)(在实施例6中参考图8)。
图9显示Ror2的细胞质结构域是Wnt-1的增强和Wnt-3活性的部分抑制所心需的。如在图6中一样，除了使用Ror2ΔC-flag(R2d)代替Ror2-flag。在A中，结果是至少两个独立实验的平均值±SE，n≥16，星号表明在单独用Wnt-3-HA获得的水平之下荧光素酶活性的显著降低(*p＜0.05，**-p＜0.0001)。在B中，n≥8(在实施例6中参考图9)。
图10显示Ror2和Ror2KD结合Wnt-1和Wnt-3。用载体对照或指定的Ror2-flag和Wnts-HA组合瞬间转染COS7细胞。通过分别加入pcDNA3.1(+)或pUSEamp以代替Ror2或Wnts而将DNA的总量保持恒定。在第24小时，通过直接(上部)或在用抗flag抗体免疫沉淀之后(下部)进行SDS-PAGE对裂解物进行分析。用抗HA抗体进行免疫印迹(在实施例7中参考图10)。
图11显示Ror2在不同的Wnts之间进行区分。用指定的Wnts-HA和Ror2-Flag(+)或pcDNA3.1对COS7细胞进行瞬时转染。在第24小时，用抗flag抗体对裂解物进行免疫沉淀并通过抗HA抗体(上部)分析Wnts的存在。下部版块显示用抗HA抗体进行COS7提取物的蛋白质印迹分析，所述提取物包括指定的Wnts和Ror2-flag(在免疫沉淀反应中等量加样的对照)(在实施例7中参考图11)。
图12显示Wnt-1和Wnt-3的过表达对Ror2自磷酸化的程度没有影响。A.上部版块显示体外磷酸化分析的结果的放射自显影，所述磷酸化分析如在一般方法下所述利用免疫沉淀于flag亲和性琼脂糖上的Ror2-flag进行，其出自用Ror2-flag和指定的Wnts共转染的U2OS细胞。下部版块显示用抗flag抗体进行的相同膜的蛋白质免疫印迹。B.将放射自显影信号标准化为每个反应中免疫反应性Ror2蛋白的总量并将在缺失Wnts时获得的相对信号设定于一。三个独立实验的平均值±SE(在实施例8中参考图12)。
图13显示Ror2抑制Wnt介导的细胞质β-连环蛋白的稳定化。用Ror2(R2)和Wnts(W)的指定组合对U2OS培养物进行瞬时转染。通过分别加入pcDNA3.1(+)或pUSEamp以代替Ror2或Wnts而将DNA的总量保持恒定。在第24小时，用抗β-连环蛋白抗体进行蛋白质免疫印迹来分析细胞质蛋白。在通过用抗β-肌动蛋白抗体染色而核实同等加样后，将β-连环蛋白的水平标准化为缺失Wnts时获得的信号。数字为三个独立实验的平均值(在实施例9中参考图13)。
图14显示一种设想的Ror2活性模式，由此Ror2结合两种Wnts，将它们从卷曲的受体(Frizzled receptor)中分离出来并抑制它们稳定β-连环蛋白的能力。此外，Wnt1结合Ror2受体引发一种未经确认的信号级联的激活，所述级联需要Ror2受体的酪氨酸激酶活性并导致Wnt反应性启动子活性的增强。Wnt3结合并不刺激相同的级联，但相反地激活其它的酪氨酸激酶依赖性事件，这导致Wnt反应性启动子的抑制。FZ-卷曲的受体，GSK-3β-肝糖合酶激酶β，β-cat-β-连环蛋白，Lef/Tcf-淋巴增强剂结合因子/T-细胞转录因子(在实施例10中参考图14)。
图15显示U2OS细胞中Ror2结合配偶体的鉴定。把用上面鉴定的构建体瞬时转染的U2OS细胞的全细胞提取物用抗flag抗体进行免疫沉淀并在4-12％(A)或7％(B)聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分析。在平行实验中，将4-12％凝胶转印至硝化纤维素膜上并用抗flag(C)或抗磷酸酪氨酸(D)抗体进行蛋白质免疫印迹。箭头指向看起来为Ror2依赖性的带。M-以kDa表示的分子量。在55和25kDa周围的显著带是从flag亲和性琼脂糖中分离的IgG亚基(在实施例11中参考图15)。
图16显示Ror2结合Notch2(Notch21C)的细胞内结构域。用载体对照或指定的Ror2-flag和Notch21C-V5-his组合对U2OS细胞进行瞬时转染。通过加入pcDNA3.1(+)而将DNA的总量保持恒定。在第24小时，用抗flag抗体进行蛋白质免疫印迹或直接(顶部)通过SDS-PAGE来分析裂解液。用抗V5(上部)或抗his(下部)抗体进行免疫印迹(在实施例12中参考图16)。
图17确认稳定过表达Ror2和Ror1的细胞系的制备。A.在过表达Ror2，Ror2-Flag，Ror1-Flag，或空白载体(pcDNA 3.1(+))的HOB-01-09细胞中相对的Ror2和Ror1 mRNA表达。将HOB-01-09-pcDNA细胞中的相对mRNA表达设定于一。利用实施例1的表1中所列的探针和引物进行实时RT-PCR。将mRNA的水平标准化为每个样品中18S rRNA的表达。B.用来自HOB-01-09细胞中的全细胞提取物的指定抗体进行的蛋白质免疫印迹(50μg/泳道)，所述细胞过表达Ror2，Ror2-Flag，Ror1-Flag，或空白载体(在实施例13中参考图17)。
表1显示用于人Ror mRNA的实时RT-PCR分析的引物和探针(在实施例1中参考表1)。
表2显示用于小鼠Ror mRNA的实时RT-PCR分析的引物和探针(在实施例2中参考表2)。
表3显示用于小鼠碱性磷酸酶和骨钙素(osteocalcin)mRNA的实时RT-PCR分析的引物和探针(在实施例2中参考表3)。
表4显示可能的Ror2相互作用蛋白质(在实施例9中参考表4)。
下列48个序列说明和附于本文的序列表遵循37C.F.R.§1.821-1.825所给出的专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列内容的规则。(“对包含核苷酸和/或氨基酸序列内容的专利申请的要求-序列规则”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO与PCT的序列表要求(细则5.2和4.95(a-bis)和208节和行政规程的附件C)。所述序列说明含有用于核苷酸序列符号的一个字母的代码以及用于氨基酸的三个字母的代码，如在Nucleic Acids Res.，13，3021-3030，(1985)和在Biochemical J.，219(2)，345-373，(1984)中所定义的那样，在此将所述文献以引用的方式并入本文。对于核苷酸和氨基酸序列数据所用的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中所示的规则。
SEQ ID NO1是包含最初在TCR-α增强子，the CD3-e增强子中鉴定的TCF DNA结合位点，和共同的TCF DNA结合位点的第一种核苷酸序列。
SEQ ID NO2是包含最初在TCR-α增强子，the CD3-e增强子中鉴定的TCF DNA结合位点，和共同的TCF DNA结合位点的第二种核苷酸序列。
SEQ ID NO3是编码Ror1蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO4是Ror1蛋白推定的氨基酸序列。
SEQ ID NO5是编码Ror2蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO6是Ror2蛋白推定的氨基酸序列。
SEQ ID NO7是编码Ror1-flag蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO8是Ror1-flag蛋白推定的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是编码Ror2-flag蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO10是Ror2-flag蛋白推定的氨基酸序列。
SEQ ID NO11是编码Ror2ΔC-flag蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO12是Ror2ΔC-flag蛋白推定的氨基酸序列。
SEQ ID NO13是用于构建Ror1-flag的上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO14是用于构建Ror1-flag的下链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO15是用于构建Ror2-flag的第一条上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO16是用于构建Ror2-flag的第一条下链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO17是用于构建Ror2-flag的第二条上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO18是用于构建Ror2-flag的第二条下链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO19是用于构建Ror2-flag的第三条上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO20是用于构建Ror2-flag的第三条下链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO21是用于构建Ror2KD-flag的上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO22是用于构建Ror2KD-flag的下链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO23是用于构建Ror2ΔC-flag的上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO24是用于构建Ror2ΔC-flag的下链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO25是鉴定人Ror1的正向引物的核苷酸序列(2993-3013)。
SEQ ID NO26是鉴定人Ror1的反向引物的核苷酸序列(3049-3074)。
SEQ ID NO27是鉴定人Ror1的探针的核苷酸序列(3018-3044)。
SEQ ID NO28是鉴定人Ror2的正向引物的核苷酸序列(1149-1169)。
SEQ ID NO29是鉴定人Ror2的反向引物的核苷酸序列(1239-1259)。
SEQ)D NO30是鉴定人Ror2的探针的核苷酸序列(1174-1198)。
SEQ ID NO31是鉴定小鼠Ror1的正向引物的核苷酸序列(2350-2370)。
SEQ ID NO32是鉴定小鼠Ror1的反向引物的核苷酸序列(2402-2421)。
SEQ ID NO33是鉴定小鼠Ror1的探针的核苷酸序列(2372-2395)。
SEQ ID NO34是鉴定小鼠Ror2的正向引物的核苷酸序列(364-386)。
SEQ ID NO35是鉴定小鼠Ror2的反向引物的核苷酸序列(429-448)。
SEQ ID NO36是鉴定小鼠Ror2的探针的核苷酸序列(400-424)。
SEQ ID NO37是鉴定小鼠碱性磷酸酶的正向引物的核苷酸序列(1354-1373)。
SEQ ID NO38是鉴定小鼠碱性磷酸酶的反向引物的核苷酸序列(1445-1464)。
SEQ ID NO39是鉴定小鼠碱性磷酸酶的探针的核苷酸序列(1416-1442)。
SEQ ID NO40是鉴定小鼠骨钙素的正向引物的核苷酸序列(78-96)。
SEQ ID NO41是鉴定小鼠骨钙素的反向引物的核苷酸序列(124-145)。
SEQ ID NO42是鉴定小鼠骨钙素的探针的核苷酸序列(98-121)。
SEQ ID NO43是人Ror1基因的5’非翻译区的核苷酸序列(-2000到+1)。
SEQ ID NO44是人Ror2基因的5’非翻译区的核苷酸序列(-2000到+1)。
SEQ ID NO45是用于构建Notch2IC的5’部分(1-782)的上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO46是用于构建Notch2IC的5’部分(1-782)的下链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO47是用于构建Notch2IC的3’部分(783-2307)的上链引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO48是用于构建Notch2IC的3’部分(783-2307)的下链引物的核苷酸序列。
发明详述申请人发现在人成骨细胞分化期间编码人受体酪氨酸激酶样孤儿受体(orphan receptor)1和2(Ror1和Ror2)的基因的表达显著下调。申请人还提供了Ror2表达与分泌型卷曲相关蛋白1(secretedfrizzled-related protein 1，SFRP-1)的表达反向相关的证据。已经报道SFRP-1是一种潜在的骨质疏松症靶目标，它在体外和体内刺激成骨细胞的凋亡(WO 01/19855)。
而且，申请人发现在成骨细胞中，Ror1和Ror2调节Wnt信号途径，所述途径调控骨形成性成骨细胞的存活。在一个实施方案中，Ror2激酶抑制Wnt-3但增强Wnt-1活性。另外，Ror2结合Wnt-1和Wnt-3蛋白二者。在另一个实施方案中，Ror2的胞质结构域对于Wnt-1的增强是心需的，但对于Wnt-3活性的抑制却并非必需的。在另一个实施方案中，Ror1激酶抑制Wnt-3但是对Wnt-1的活性没有影响。
还已经鉴定了几种Ror2结合配偶体。
本发明提供一种包含Ror多肽的表达盒，它在骨细胞中可操作启动子的控制之下。本发明进一步提供调节骨相关活性的组合物，其包含有效量的Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体。
本发明提供一种筛选试剂的方法，所述方法包括(a)将一种试剂与Ror分子组合；和(b)检测所述试剂对Ror活性的效果；其中检测到Ror活性的降低或提高是试剂为骨相关试剂的指征。
而且，本发明提供一种筛选调节Ror结合一种结合配偶体的试剂的方法，所述方法包括(a)将Ror在一种试剂存在的情况下与Ror结合配偶体相接触；(b)在对照存在或所述试剂缺失的情况下将Ror与一种Ror结合配偶体相接触；(c)通过将步骤(a)中所述Ror和结合配偶体的结合与步骤(b)中所述Ror和结合配偶体的结合相比较来选择调节Ror分子的试剂。
所述方法还可以包括一种筛选试剂的方法，所述方法包括(a)将一种试剂与包含Ror启动子序列的分离细胞相组合，所述启动子序列操作性地连接于一个报告基因上；和(b)检测所述试剂对Ror活性的影响；其中由报告基因测量的Ror活性的降低或提高是试剂为骨相关试剂的指征。
本发明提供一种以药物组合物的形式向受试者施用一种试剂以治疗骨相关病症的方法，所述试剂被鉴定为调节Ror表达或活性。而且，本发明提供向受试者施用一种被鉴定为调节Ror表达的试剂的方法，所述受试者被诊断患有与Wnt信号途径相关联的疾病或病症。本发明进一步提供有效量的试剂在制备组合物以便在骨相关病症的治疗中调节骨相关活性中的用途，所述试剂调节靶目标Ror分子的表达或活性。优选通过本文提供的筛选方法来鉴定所述试剂。
用于制备组合物的调节靶目标Ror分子的表达或活性的试剂可以选自抗体、小分子、肽、寡肽和多肽。
根据本发明所用的试剂优选包含一种对Ror基因特异性的反义核酸或siRNA分子，其中所述反义核酸或siRNA分子识别并结合编码一种或多种Ror多肽、其同源物、衍生物、片段、变异体或突变体的核酸。
在另一个实施方案中根据本发明用于调节Ror分子的表达或活性的试剂能够结合Ror结合配偶体。
当靶目标Ror分子为Ror2时用于制备根据本发明的组合物的试剂可以选自ADP/ATP载体蛋白，UDP-葡萄糖酰基鞘氨醇葡糖转移酶样1，14-3-3蛋白β/α，14-3-3蛋白γ，核糖体结合糖蛋白1，精氨酸N-甲基转移酶1，细胞凋亡易感蛋白，NOTCH2蛋白和人骨骼肌LIM-蛋白3。
本发明进一步提供一种制备调节骨相关活性的组合物的方法，其中所述方法包括(i)通过将一种试剂与Ror分子相组合并检测所述试剂对于Ror活性的影响来鉴定骨相关试剂，(ii)将有效量的在步骤(i)中鉴定的骨相关试剂与可药用的载体相组合以形成所述组合物。
本发明还提供Ror分子的其它用途，如鉴定调节骨形成和/或Wnt信号(signaling)的试剂，鉴定参与骨形成和/或Wnt信号的基因或蛋白质，诊断性用途，用作药物的药靶，评估药物的效力，和产生宿主细胞和转基因动物。
本发明提供一种利用Ror2作为标记鉴定增殖性人前成骨细胞的方法，包括在人成骨细胞中检测Ror2基因的表达，其中提高的Ror2表达将细胞鉴定为增殖性前成骨细胞。
本发明提供一种利用Ror2作为标记鉴定小鼠成骨细胞处于基质(matrix)成熟期的方法，包括在小鼠成骨细胞中测定Ror2基因的表达，其中提高的Ror2表达将细胞鉴定为处于基质成熟期的成骨细胞。
此外，本发明提供一种测定Ror2激酶活性的方法，包括(a)获得Ror2多肽；(b)在32PγATP存在时标记Ror2多肽；(c)通过测定掺入32P的量测定Ror2激酶活性，其中32P的量指示Ror2激酶活性。
缩写和术语的定义为了充分理解用于本说明书中的术语和缩写，提供下列定义。
如本文和所附权利要求中所用的，单数形式″a″，″an″，和″the″包括复数的意思，除非上下文有清楚的不同说明。因而，例如，″a hostcell″的写法包括多种这样的宿主细胞，而″an antibody″的写法指一种或多种抗体以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
说明书中的缩写如下对应于测量单位、技术、性能或化合物″g″意指克(s)，″mg″意指毫克(s)，″ng″意指纳克(s)，″kDa″意指千道尔顿(s)，″℃″意指摄氏度(s)，″cm″意指厘米(s)，″s″意指秒(s)，″min″意指分钟(s)，″h″意指小时(s)，″l″意指升(s)，″ml″意指亳升(s)，″μl″意指微升(s)，″pl″意指皮升(s)，″M″意指摩尔浓度，″mM″意指毫摩尔浓度，″mmole″意指毫摩尔(s)，″kb″意指千碱基(s)，″bp″意指碱基对(s)，而″RT″意指室温。
″Dulbecco′s-modified Eagle培养基″缩写为DMEM。
″高效液相色谱″缩写为HPLC。
″高通量筛选″缩写为HTS。
″开放阅读框″缩写为ORF。
″质谱分析″缩写为MS。
″串联质谱分析″缩写为MS/MS。
″聚丙烯酰胺凝胶电泳″缩写为PAGE。
″聚合酶链式反应″缩写为PCR。
″反转录酶聚合酶链式反应″缩写为RT-PCR。
″十二烷基磺酸钠″缩写为SDS。
″十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳″缩写为SDS-PAGE。
″人骨骼肌LIM-蛋白3″缩写为(SLIM 3)。
″腺嘌呤核苷酸移位因子2″缩写为ADP/ATP载体蛋白。
″骨矿物质密度″缩写为BMD。
″核糖体RNA″缩写为rRNA″。
“非翻译区”缩写为UTR。
″T细胞因子″缩写为TCF。
″二硫苏糖醇″缩写为DTT.
在本说明书中的上下文中，将采用多种术语。如本文所用的，术语Ror指受体酪氨酸激酶样孤儿受体(orphan receptors)的家族。″Ror分子″指Ror多肽，Ror肽，其片段、变异体和突变体，以及编码Ror多肽、Ror肽及其片段或变异体或突变体的核酸。″Ror分子″还指Ror多核苷酸，基因及其变异体和突变体。″Ror分子″和″Ror″指Ror1和Ror2分子二者。
″靶Ror分子″指其活性受本发明的试剂调节的Ror分子。所述靶目标Ror分子可以是Ror多肽，其同源物、衍生物或片段或变异体或突变体。目标Ror分子还可以是核酸(RNA或DNA的寡核苷酸或多核苷酸)。例如，如果基因的转录物是实验的目标，则靶Ror分子将是转录物。应当理解术语靶Ror分子指全长分子及其片段、变异体和突变体，如蛋白的表位。靶Ror分子既可以是Ror1分子也可以是Ror2分子或二者。
术语″Wnt″指一个涉及早期胚胎发育重要方面的保守的、富含半胱氨酸的、分泌型的糖蛋白家族。Wnt基因还涉及癌症。如本文所用的″Wnt″具体包括全部人和非人动物物种的Wnt基因，包括但不限于哺乳动物，如人、小鼠、大鼠和其它啮齿动物等。术语″Wnt″包括天然的人Wnt基因和编码的多肽，包括人Wnt-1(以往称为int-1)(vanOoyen等，EMBO J，4，2905-9，(1985))，Wnt-3(Roelink等，Genomics，17，790-792，(1993)；Huguet等，Cancer Res.，54，2615-2521，(1994))，及其变异体，特别是氨基酸序列变异体。
″Wnt信号途径″指任何由诸如Wnt-1，Wnt-2，Wnt-3等Wnt蛋白调节的途径。
″标准的Wnt信号途径″指由Disheveled蛋白的Wnt蛋白进行的激活，其接着抑制来自磷酸化β-连环蛋白的糖原合成酶激酶-3。泛素化后磷酸化β-连环蛋白迅速被降解。不过，未磷酸化的β-连环蛋白积聚并移位到核中，在那里它作为T细胞因子转录激活剂复合物的辅助因子起作用。
术语″分泌型卷曲相关蛋白″或″SFRP″涉及Wnt信号途径的分泌型受体。
术语“核酸分子”核糖核苷酸(RNA分子)或脱氧核糖核苷酸(DNA分子)的磷酸酯形式，或任何以单链形式或双链螺旋存在的磷酸二酯类似物。双链DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，指分子的一级和二级结构，并且不将它限于任何特定三级形式。因而，这个术语包括双链DNA，特别是在线性(例如，限制性片段)或环状DNA分子、质粒和染色体等中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构中，可以根据正常惯例只给出沿着DNA非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)5’-3’方向上的序列来描述序列。
“重组核酸分子”是已经进行过分子生物学处理的核酸分子，即，非天然发生的核酸分子。另外，术语“重组DNA分子”指一种核酸序列，它并非天然发生的，或者可以通过两条本来分离的序列片段的人工组合而制得，即，通过将正常情况下非连续性的DNA片段连接在一起。“重组生产”意指通常由化学合成方法，或由分离核酸片段的人工处理而实现的人工组合，例如，通过利用限制性酶、连接酶的遗传工程技术和类似的重组技术，例如，由Sambrook等，MolecularCloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.；(1989)，或Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols(1989)，和DNA CloningA Practical Approach，卷I和11(D.N.Glover编辑)IREL Press，Oxford，(1985)所介绍的技术。
通常用编码相同或保守氨基酸的冗余密码子替代一种密码子，同时一般引入或去除一个序列识别位点。或者，可以将所需功能的核酸片段连接在一起以产生单一的遗传实体，其包含在普通自然形式中没有发现的功能的所需组合。限制性酶识别位点通常是这类人工处理的靶目标，但其它位点特异性靶目标，例如，启动子、DNA复制位点、调控序列、控制序列或其它有用的特征可以通过设计而并入。重组核酸分子的例子包括重组载体，如包含编码phl基因蛋白的DNA序列的克隆或表达载体，该DNA序列处于5′-3′(有义)方向或处于3′-5′(反义)方向。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“寡核苷酸”指DNA和RNA中一系列的核苷酸碱基(也称“核苷酸”)，并意指任何两个或多个核苷酸的链。所述多核苷酸可以是单链或双链的嵌合性混合物或其衍生物或修饰体。可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上对寡核苷酸进行修饰，以便例如提高分子的稳定性、其杂交参数等。反义寡核苷酸可以包含修饰的碱基部分，其选自包括如下成员的组5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘代尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、beta-D-半乳糖基queosine、次黄嘌呤核苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基n6-异戊烯基腺嘌呤、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，和2，6-二氨基嘌呤。核苷酸序列一般携带遗传信息，包括由细胞机制利用以制造蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链-或单链基因组和cDNA，RNA，任何合成的和遗传操作的多核苷酸，以及有义和反义多核苷酸。这包括单链和双链分子，即，DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂交物，以及通过将碱基共轭至氨基酸骨架上形成的“蛋白质核酸”(PNA)。这也包括包含修饰碱基的核酸，例如，硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤以及氟尿嘧啶，或包含糖类或脂类的核酸。
本发明的多核苷酸可以通过本领域已知的标准方法合成，例如，通过使用自动DNA合成仪(如可从Biosearch，Applied Biosystems，等商购的那些)。作为例子，硫代磷酸寡核苷酸可以通过Stein等，Nucl.Acids Res.，16，3209，(1988)的方法合成，甲基磷酸酯寡核苷酸可以利用受控的微孔玻璃聚合物支持物制备(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，7448-7451，(1988)等。已经发展了多种方法将反义DNA或RNA递送至细胞中，例如，可以将反义分子直接注射入组织位点中，或可以系统性地施用设计来靶向期望细胞的改进的反义分子(连接于肽或抗体上的反义分子，所述肽或抗体特异性地结合在靶细胞表面上表达的受体或抗原)。或者，可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录来制备RNA分子。可以将这些DNA序列整合入广泛的载体中，所述载体整合了合适的RNA聚合酶启动子，如T7或SP6聚合酶启动子。或者，依赖于所用的启动子，组成性或可诱导性合成反义RNA的反义cDNA构建体可以被稳定地导入细胞系中。不过，通常难以获得足以抑制内源性mRNAs翻译的反义分子细胞内浓度。所以优选的方法利用一种重组的DNA构建体，其中将反义寡核苷酸置于强启动子的控制之下。使用这种构建体转染受试者中的靶细胞将导致足量单链RNAs的转录，其将形成与内源性靶基因转录物互补的碱基对并由此阻止靶基因mRNA的翻译。例如，可以将一种载体导入体内从而使它被细胞所吸收并指导反义RNA的转录。这种载体可以保持游离或被染色体整合，只要它能够进行转录以产生所需的反义RNA。这种载体可以通过本领域标准的重组DNA技术进行构建。载体可以是本领域已知的质粒、病毒或其它，用于在哺乳细胞中复制和表达。编码反义RNA的序列的表达可以通过本领域已知的在哺乳类，优选人细胞中作用的任何启动子进行。这些启动子可以是可诱导的或组成性的。这些启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，Nature，290，304-310，(1981)，包含在劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中的启动子，Yamamoto等，Cell，22，787-797，(1980)，疱疹胸腺嘧啶核苷激酶启动子，Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，1441-1445，(1981)，金属硫蛋白基因的调控序列等，Brinster等，Nature 296，39-42，(1982)。任何类型的质粒、粘粒、酵母人工染色体或病毒载体都可以用于制备能够直接引入组织位点上的重组DNA构建体。或者，可以使用选择性感染期望组织的病毒载体，其中通过另一种途径完成给药(例如，全身性地)。
核酶是具有以与DNA限制性内切酶相似的方式特异性剪切其它单链RNA的能力的RNA分子。通过修饰编码这些RNAs的核苷酸序列，有可能构建在RNA分子中识别特异性核苷酸序列并剪切它的分子，Cech，J.Amer.Med.Assn.，260，3030，(1988)。这种方法的主要益处是只灭活具有特定序列的mRNAs，因为它们是序列特异性的。
所述多核苷酸的两侧可以分布天然调控(表达控制)序列，或可以与异源序列相关联，包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、反应元件、抑制子、信号序列、多腺苷酸序列、内含子、5′-和3′-非编码区等等。还可以通过本领域已知的多种方法对核酸进行修饰。这种修饰的非限制性例子包括甲基化、″帽″、用类似物取代一个或多个天然发生的核苷酸，和核苷酸间的修饰如，例如，具有不带电荷连接的修饰(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接的修饰(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可以包含一个或多个额外的共价连接部分，如，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等等)，螯合剂(例如，金属、放射性金属、铁、氧化性金属等等)，和烷基化剂。可以通过甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯连接的形成对多核苷酸进行衍生化。另外，还可以用一种能够直接或间接提供可检测信号的标记对本文的多核苷酸进行修饰。例示性的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
″RNA转录物″指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录形成的产物。当RNA转录物是DNA序列的互补拷贝时，它称为原始转录物，或者它可以是源自原始转录物转录后加工的RNA序列并称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子并能够被细胞翻译成多肽的RNA。″cRNA″指由重组cDNA模板转录的互补性RNA。″cDNA″指与mRNA模板互补并源自mRNA模板的DNA。cDNA可以是单链的或可以利用，例如，DNA聚合酶I的Klenow片段转变为双链形式。
与RNA的一部分“互补”的序列，指具有充分的互补性从而能够与RNA杂交，形成稳定的双螺旋的序列；对于双链反义核酸而言，双链DNA的单链因而可以进行测试，或可以分析三联体形成。杂交能力依赖于互补性的程度以及反义核酸的长度。通常，杂交的核酸越长，它就可以包含越多的与RNA错配的碱基并依然形成稳定的双螺旋(或三联体，视情况而定)。通过利用标准方法测定杂交复合物的熔解点，本领域技术人员可以确定错配的容许度。
特定多核苷酸的“反义”拷贝指能够与多核苷酸形成氢键并因此能够调节多核苷酸的表达的互补性序列。这些是DNA，RNA或其类似物，包括如上所述具有变化骨架的类似物。反义拷贝结合的多核苷酸可以是单链形式的也可以是双链形式的。以“反义方向”连接于启动子的DNA序列可以连接于该启动子上，从而产生与靶基因的编码mRNA互补的RNA分子。
反义多核苷酸可以包含至少一种修饰的糖部分，其选自阿拉伯糖、2-氟-阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在一个实施方案中，反义寡核苷酸可以包含至少一种修饰的磷酸酯骨架，其选自硫代磷酯、二硫代磷酸酯、磷酸氨基二硫酯、氨基磷酸酯、phosphordiamidate、甲基磷酸酯、烷基磷酸酯，及甲乙缩醛(formacetal)或类似物。
术语“有义”指与编码性mRNA核酸序列同一方向的核酸序列。以“有义方向”连接于启动子的DNA序列被连接，从而转录一种RNA分子，该RNA分子包含与mRNA相同的序列。不过，产生的RNA分子不需要转录成功能性的蛋白质。
当用于同一语境时“有义”链和“反义”链指相互之间互补的单链多核苷酸。它们可以是双链多核苷酸的相对链，或一个链可以根据公认的碱基配对法则由另一个预测。除非另外指定或暗示，指定一条或另一条链为“有义”或“反义”是任意的。
术语“核酸”、“核酸序列”、“核酸分子”、“核酸片段”或“多核苷酸”可以与“基因”、“由基因编码的mRNA”和“cDNA”相互交换使用。
术语“编码多肽的多核苷酸”包含只包括编码序列的多核苷酸，以及可以包括额外编码或非编码序列的多核苷酸。
当核酸的单链形式能够在合适的温度和溶液离子强度的条件下退火到其它核酸分子上时，所述核酸分子“可杂交”到另一种核酸分子上，如cDNA，基因组DNA或RNA，Sambrook，J.等编辑，MolecularCloningA Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，NY.Vols.1-3(ISBN 0-87969-309-6)。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格度”。对于同源性核酸的初步筛选，可以使用对应于55℃Tm的低严格度杂交条件，例如，5x SSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，无甲酰胺；或30％甲酰胺，5x SSC，0.5％SDS。中等严格度杂交条件对应于更高的Tm，例如，40％甲酰胺，5x或6x SSC。高严格度杂交条件对应于最高的Tm，例如，50％甲酰胺，5x或6x SSC。杂交要求两个核酸包含互补序列，尽管根据杂交的严格度，碱基之间的错配是可能的。对于杂交核酸适合的严格度依赖于核酸的长度和互补的程度，其变化是本领域公知的。在两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，则具有这些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于更高的Tm)以下列顺序降低RNARNA，DNARNA，DNADNA。对于长度大于100核苷酸的杂交体，已经导出计算Tm的方程式，Sambrook等编辑，Molecular CloningALaboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，9.50-9.51)。对于较短核酸，即，寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更加重要，而寡核苷酸的长度决定其特异性，Sambrook等编辑，Molecular CloningALaboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6，11.7-11.8)。
术语“互补的”用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤互补于胸腺嘧啶而胞嘧啶互补于鸟嘌呤。
如本领域已知的，“同一性”或“相似性”是如通过比较序列所确定的，两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，视情况而定，如通过这些序列链之间的匹配所确定的，同一性还意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度。同一性和相似性都可以通过已知的方法轻易地进行计算，如在ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，NewYork，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；and Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.and Devereux，J.编辑，M Stockton Press，NewYork，1991中所介绍的方法。普遍用于测定序列之间同一性或相似性的方法包括但不限于在.Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J AppliedMath.，481073(1988)中所公开的方法。测定同一性和相似性的方法被编于公众可获得的计算机程序中。优选的用于确定两序列间的同一性和相似性的计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包，Devereux，J.，等，Nucleic Acids Research，12(1)，387(1984))，BLASTP，BLASTN，和FASTA Atschul，S.F.等，J Molec.Biol.，215，403(1990))。
“同源的”指两种聚合物(即，多肽分子或核酸分子)之间序列相似性的程度。本文所提及的同源性百分比数字反映了两种聚合物之间最大可能的同源性，即，当两种聚合物以某种方式进行比对从而具有最大数目的匹配(同源的)位置时的百分比同源性。
术语“百分比同源性”指多肽之间氨基酸序列同一性的程度。任何两个多肽之间的同源性是在两个序列中给定的位置上匹配氨基酸的总数的直接函数，例如，如果在两个序列中氨基酸总数的一半是相同的则这两个序列显示50％的同源性。
当对于本发明的多肽(例如SEQ ID NOs4，6，8，10和12)时，术语“片段”、“类似物”和“衍生物”指可以基本上保留与这种多肽相同的生物学功能或活性的多肽。因而，类似物包括前体蛋白，它能够通过剪切前体蛋白的部分而得到激活以产生有活性的成熟多肽。本发明多肽(例如SEQ ID NOs4，6，8，10和12)的片段、类似物或衍生物可以是这样一种分子，其中一个或多个氨基酸用保守的或非保守的氨基酸残基取代并且这种氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码子编码的残基，或者其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或者其中多肽与诸如聚乙二醇的化合物融合以提高多肽的半寿期，或者其中将额外的氨基酸融合于诸如信号肽的多肽或诸如多组氨酸标记的序列上，所述多组氨酸标记用于纯化多肽或前体蛋白质。这些片段、类似物或衍生物在本发明的范围之内。
多核苷酸序列的“保守的”残基是在被比较的两个或多个相关序列的相同位置不变出现的那些残基。相对保守的残基是在比序列中其它处出现的残基更相关的序列中保守的残基。
相关多核苷酸是共享显著比例的相同残基的多核苷酸。
如要一个多核苷酸最终源自另一个的话则不同的多核苷酸彼此“对应”。例如，信使RNA对应于其所转录自的基因。cDNA对应其所产自的RNA，如通过反转录反应，或通过基于RNA序列的知识而进行的DNA的化学合成。cDNA还对应编码RNA的基因。如果它们行使类似的功能，多核苷酸也彼此“对应”，如在被比较的不同物种、株或变异体中编码相关的多肽。
DNA、RNA或多核苷酸的“类似物”指在形式和/或功能(例如进行序列特异性氢键接合于互补多核苷酸序列上的碱基对的能力)上与天然发生的多核苷酸相似的分子，但它例如具有异常或非天然碱基或变化的骨架，在这方面有别于DNA或RNA。参见，例如，Uhlmann etal.，Chemical Reviews 90，543-584，(1990)。
“编码序列”或“编码”表达产物，如RNA、多肽、蛋白质或酶的序列是在表达时产生所述RNA、多肽、蛋白质或酶的核苷酸序列，即，编码所述多肽、蛋白质或酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
″密码子简并性″指遗传密码的差异，其允许多核苷酸序列的变化而不会影响编码多肽的氨基酸序列。本领域技术人员充分认识特定宿主细胞所表现出来的“密码子偏好性”，其利用核苷酸密码子指定给定的氨基酸。所以，当在一种宿主细胞中合成一种基因以提高表达时，希望设计所述基因，从而使其密码子使用频率接近宿主细胞的优选密码子使用的频率。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分(substantial portion)”是包含足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列的部分，以便推定地性鉴定该多肽或基因，既可以通过本领域技术人员的人工序列评估，也可以通过利用算法如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215，403-410，(1993)；还见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行的计算机自动序列比较和鉴定。
因此，核苷酸序列的“基本部分”包含足够的序列以便特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。拥有本文报道序列的益处的技术人员现在可以利用公开序列的全部或基本部分实现本领域技术人员已知的目的。
“合成性基因”可以由寡核苷酸构建块(building blocks)组合起来，所述寡核苷酸构建块是利用本领域技术人员已知的方法进行化学合成的。将这些构建块连接并退火以形成基因片段，随后将其酶学组合以构建完整基因。关于DNA的序列，“化学合成的”意即将组成核苷酸在体外进行装配。可以利用公知的方法进行DNA的手工化学合成，或者可以利用多种可商购机器的其中之一进行自动的化学合成。因此，基于核苷酸序列的优化，基因可以适应于最优的基因表达以反映宿主细胞的密码子偏好性。如果编码子应用偏向于宿主喜好的那些密码子，熟练的技术人员会理解成功基因表达的可能性。确定优选的密码子可以基于对源自宿主细胞的基因的研究，其中这些基因的序列信息是可以得到的。
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”指在自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”或“嵌合构建体”指不是天然基因的任何基因或构建体，包含并非在自然界中一同发现的调控和编码序列。因此，嵌合基因或嵌合构建体可以包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自相同来源但以与自然界中所发现的排列方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”指在一种生物基因组中天然位置上的天然基因。“外源”基因指不是在宿主生物中正常发现的基因，但通过基因转移将其导入宿主生物中。外源基因可以包含插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组的基因。
“调控序列”指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、中间或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，它影响转录、RNA加工或稳定，或相关编码序列的翻译。调控序列可以包括启动子、翻译引导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“基因控制序列”指起始基因转录所需的DNA序列加上调控起始发生速率所需的序列。因而基因控制序列可以由启动子(此处一般转录因子和聚合酶发生装配)，加上所有调控序列所组成，基因调控蛋白结合到所述调控序列上以控制启动子上这些装配过程的速率。例如，适于原核生物的控制序列可以包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。真核细胞可以利用启动子、增强子，和/或多聚腺苷酸化信号。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’。启动子序列由近端或更远端的上游元件组成，在后的元件通常称为增强子。因此，“增强子”是能够刺激启动子活性的核苷酸序列并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体源自天然基因，或由源自自然界发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成性的核苷酸片段。本领域技术人员应当理解不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞型，或处于不同发育状态，或相应于不同环境条件下的表达。
“3’非编码序列”指位于编码序列下游的核苷酸序列，包括多腺苷酸化识别序列和其它编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。多腺苷酸化信号的特征通常是影响多腺苷酸片段(tracts)向mRNA前体的3’末端的添加。
“翻译引导序列”指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译引导序列存在于翻译起始序列上游的充分加工过的mRNA。翻译引导序列可以影响原始转录物加工为mRNA，mRNA的稳定性或翻译效率。
术语“操作性连接的”指两个或多个核酸片段联接于单个核酸片段上从而使一个片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时它就是与该编码序列操作性连接的(即，该编码序列在该启动子的转录控制之下)。编码序列可以在有义或反义方向上操作性连接于调控序列上。“在骨细胞中可操作的启动子”指被该骨细胞的RNA聚合酶识别的启动子。
“RNA转录物”指由一种DNA序列的RNA聚合酶催化的转录形成的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补拷贝时，它称为原始转录物(primary transcript)或者它可以是源自原始转录物转录后加工的RNA序列并称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子并能够翻译成多肽的RNA。cDNA”指互补于和源自mRNA的双链DNA。“有义”RNA指包括mRNA并因此可以被细胞翻译成多肽的RNA转录物。“反义RNA”指与靶原始转录物或mRNA的全部或部分互补并阻抑靶基因表达的RNA转录物(见美国专利号5,107,065，在此并入作为参考)。反义RNA的互补性可以是与特定核苷酸序列的任何部分互补，即，在5′非编码区序列，3′非编码区序列，内含子，或编码序列。“功能性RNA”指有义RNA，反义RNA，核酶RNA，或其它可能不翻译但对细胞过程具有效应的RNA。
术语″siRNA″或″RNAi″指小的干扰RNA，它能够引起干扰并能够引起特定基因在细胞，例如哺乳动物细胞(包括人细胞)中和躯体，例如哺乳动物躯体(包括人)中的转录后沉默。RNA干扰的现象在Bass，Nature，411，428-29，(2001)；Elbahir等，Nature，411，494-98，(2001)；和Fire等，Nature，391，806-11，(1998)中进行了介绍和讨论，其中也讨论了制备干涉RNA的方法。通过本领域已知的方法可以制备基于本文公开序列的siRNAs，包括使用互补的DNA链或合成方法。例示性的siRNAs可以具有高达29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或任何相近或中间的整数。
术语“表达”指源自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还可以指mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的产生。
“过表达”指在生物中超出正常或未转化生物中的产生水平的基因产物的产生。“抑制”指抑制外源或内源基因或RNA转录物的表达。
“变化的水平”指在生物中基因产物的产生在量或比例上有别于正常或未转化生物的基因产物产生。通过首先构建一种嵌合基因或嵌合构建体可以实现本发明多肽的过表达，在所述嵌合基因或嵌合构建体中编码区操作性地连接于启动子上，所述启动子能够在期望的组织中于期望的发育阶段指导基因或构建体的表达。为了方便，嵌合基因或嵌合构建体可以包含源自相同基因的启动子序列和翻译引导序列。还可以提供编码转录终止信号的3’非编码序列。本发明的嵌合基因或嵌合构建体还可以包含一个或多个内含子从而促进基因表达。随后可以构建包含本发明嵌合基因或嵌合构建体的质粒载体。质粒载体的选择依赖于用于转化宿主细胞的方法。熟练的技术人员充分了解必须存在于质粒载体上以便成功转化，选择和增殖包含嵌合基因或嵌合构建体的宿主细胞的遗传元件。熟练的技术人员还将认识到不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式，Jones等，EMBO J.，4，2411-2418，(1985)；De Almeida等，Mol.Gen.Genetics，218，78-86，(1989)，因而必须对多个事件进行筛选以便获得呈现所需表达水平和模式的系(lines)。这种筛选可以通过DNA的核酸印迹分析，mRNA表达的RNA印迹分析，蛋白质表达的蛋白质印迹或免疫细胞化学分析，或表型分析来完成。
“表达盒”指编码表达产物的DNA编码序列或DNA的片段，它能够于确定的限制性位点插入到载体中。对盒限制性位点进行设计以确保所述盒插入正确的阅读框中。通常，外源DNA在载体DNA的一个或多个限制性位点上插入，随后与可传递的载体DNA一起被载体携带入宿主细胞中。具有插入或添加的DNA的DNA片段或序列，如表达载体，还可以叫作“DNA构建体”。
术语“多肽”指氨基酸的聚合物，而不论聚合物的长度如何，因而，“肽”、“寡肽”和“蛋白质”包括于多肽的定义中并在本文可以相互交换使用。这一术语也不特指或排除本发明多肽的化学或表达后修饰，尽管这些多肽的化学或表达后修饰可以包括或排除为特定实施方案。所以，例如，对多肽的修饰为术语多肽所特别包含，所述修饰包括糖基、乙酰基、磷酸基、脂基等的共价连接。另外，具有这些修饰的多肽可以指定为个别由本发明包括或排除的种类。天然或其它的化学修饰，如上面例子中所列的那些可以发生于多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羰基末端。应当理解相同类型的修饰可在给定多肽的几个位点上以相同或不同的程度存在。另外，一种给定的多肽可含有许多种类型的修饰。多肽可因遍在蛋白化的结果而分枝，并且它们可以在具有或没有分枝的情况下为环状。修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环形化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖苷化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、pegylation、蛋白裂解加工、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、硒化、硫酸化、由转移RNA介导的往蛋白上添加氨基酸如精氨酰基化和遍在蛋白化。(参见，例如，proteins--structure andmolecular properties，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York(1993)；posttranslational covalent modificationof proteins，b.c.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1-12页，1983；Seifter等，Meth Enzymol 182626-646，1990；Rattan等，AnnNY Acad Sci 66348-62，1992)。在所述定义中还包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然发生的氨基酸，仅天然发生于不相关生物系统中的氨基酸，来自哺乳动物系统的修饰氨基酸等)，具有取代键以及本领域已知的其它修饰的多肽，包括天然发生或非天然发生的。术语“多肽”还可以与术语“蛋白质”或“肽”相互交换使用。
术语“肽”指两个或多个氨基酸的任何聚合物，其中每个氨基酸都通过在相邻氨基酸的NH2和COOH基团之间形成的肽键(-CONH-)连接到一个或两个其它的氨基酸上。优选地，氨基酸是天然发生的氨基酸，特别是L-镜像形式的α氨基酸。不过，其它氨基酸，镜像形式和氨基酸衍生物可以包括于肽中。肽包括“多肽”，它在水解后产生两个以上的氨基酸。多肽可以包括蛋白质，它一般包含50或更多的氨基酸。
术语“变异体”指Ror分子的核酸或氨基酸序列的变种。术语“变异体”中包括Ror分子的核苷酸和氨基酸取代、添加或删除。另外，术语“变异体”中还包括化学修饰的天然和合成的Ror分子。例如，变异体可以指与参照多肽不同的多肽。一般地，在氨基酸序列上与参照多肽不同的多肽与参照多肽之间的差异是有限的，从而使参照和变异体的氨基酸序列整体上是近似的，并且在某些区域是相同的。变异体和参照多肽的氨基酸序列可以差异一个或多个取代、删除、添加、融合和截短，其可以是保守性的或非保守性的并且可以任何组合存在。例如，变异体可以是以任何组合插入、取代或删除了几个，例如50-30，30-20，20-10，10-5，5-3，3-2，2-1或1个氨基酸的变异体。此外，变异体可以是本发明多肽的片段，它比参照序列短，如由于末端或中间删除而有别于参照多肽序列。本发明多肽的变异体还包括基本保留了与这种多肽相同生物学功能或活性的多肽，例如，能够通过剪切前体部分而活化以产生活性成熟多肽的前体蛋白。这些变异体可以是等位变异，其特征在于编码蛋白质的结构基因核苷酸序列的差异，或可以包括差异剪切或翻译后修饰。变异体还包括基本具有相同生物学活性但获自不同物种的相关蛋白。熟练的可以产生具有单个或多个氨基酸取代、删除、添加或替换的变异体。这些变异体可以包括，特别是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)取代的变异体，这种被取代的氨基酸残基可以或可以不是被遗传密码编码的残基，或(ii)其中一个或多个氨基酸被从多肽或蛋白质中删除的变异体，或(iii)其中一个或多个氨基酸被添加到多肽或蛋白质中的变异体，或(iv)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团的变异体，或(v)其中成熟多肽与另一种化合物融合的变异体，所述化合物如提高多肽半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(vi)其中额外的氨基酸融合到成熟多肽上的变异体，如引导或分泌序列或用于纯化成熟多肽或前体蛋白质序列的序列。多肽的变异体还可以是天然发生的变异体，如天然发生的等位变异体，或者它可以是未知天然发生的变异体。所有上面定义的这些变异体都被视为在本领域教示的范围之内。
本发明的多肽或多核苷酸优选以分离的形式提供，并且可以纯化至同质。
术语“分离的”意指物质从其原始的或天然的环境中移除(例如，自然环境，如果它是天然发生的话)。所以，存在于生活的动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是通过人类干涉从自然系统中某些或全部共存材料中隔离出来的相同多核苷酸或多肽是分离的。例如，“分离的核酸片段”是单链或双链RNA或DNA的聚合物，其任选地包含合成性、非天然或变化的核苷酸碱基。以DNA的聚合物形式存在的分离的核酸片段可以包含一种或多种cDNA、基因组DNA或合成生DNA的片段并且结合以糖、脂类、蛋白质或其它物质。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物并不是其在自然界中被发现的环境的一部分。类似地，术语“基本上纯化的”指一种物质，它已经通过人类干涉而从自然界中其所发生的直接化学环境中分离或者移除。通过多种本领域公知的技术和方法可以获得或产生基本上纯化的多肽或核酸。
术语“纯化”指在样品中提高特定多肽的比活性或浓度。在一个实施方案中，比活性表示为样品中靶多肽的活性和全部多肽浓度之间的比率。在另一个实施方案中，比活性表示为样品中靶多肽的浓度和全部多肽浓度之间的比率。纯化方法包括但不限于本领域技术人员所公知的透析、离心和柱层析技术。见，例如，Young等，1997，″Productionof biopharmaceutical proteins in the milk of transgenic dairy animals，″BioPharm 10(6)34-38。
术语“基本上纯的”和“分离的”并不排除多核苷酸或多肽与在自然界中和所述多核苷酸或多肽不相关联的物质的混合物。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以相互交换使用。所有这些术语还包括它们的后代，其是任何或全部随后的世代。应当理解由于有意或无意的突变所有后代不一定相同。在表达异源核酸的上下文中，“宿主细胞”指原核或真核细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，可以位于体外或体内。例如，宿主可以包括任何能够复制细胞的可转化生物，细胞可以位于转基因动物中。宿主细胞可以用作载体的受体和/或表达由载体编码的异源核酸。
例如，Etchevcrry，″Expression of Engineered Proteins inMammalian Cell Culture，″in Protein EngineeringPrinciples andPractice，Cleland等(编辑)，163页(Wiley-Liss，Inc.1996)提供了表达和回收外源蛋白质的一般性方法，所述蛋白由哺乳动物细胞系统产生。例如，Grisshammer等″Purification of over-produced proteinsfrom E.coli cells，″in DNA Cloning 2Expression Systems，2ndEdition，Glover等(编辑)，59-92页(Oxford University Press 1995)提供了回收由细菌系统产生的蛋白质的标准技术。Guarino等，US5162222和WIPO公开号W094/06463公开了昆虫细胞的转化和外源多肽在其中的生产。Richardson(编辑)，″Baculovirus ExpressionProtocols″(The Humana Press，Inc.1995)也介绍了从杆状病毒中分离重组蛋白的方法。在一个实施方案中，本发明的多肽可以利用杆状病毒表达系统表达(见，Luckow等，Bio/Technology，1988，6，47，″Baculovirus Expression Vectorsa Laboratory Manual″，O′Rielly等(编辑)，W.H.Freeman and Company，New York，1992，US4,879,236，将每一篇的全部内容都并入本文作为参考)。此外，MAXBAC.TM.完全杆状病毒表达系统(Invitrogen)可以，例如用于昆虫细胞中的生产。
本发明的多肽还可以通过利用特定性质来进行分离。例如，可以利用固定金属离子吸附(IMAC)层析来纯化富含组氨酸的蛋白质，包括含有多聚组氨酸标记的蛋白质。简言之，首先用二价金属离子对凝胶加电(charged)以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.31(1985))。根据所用的金属离子，富含组氨酸的蛋白质将以不同的亲和性吸附到此基质上，并由竞争性洗脱液通过降低pH或使用强螯合剂洗脱。其它纯化方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析的糖基化蛋白的纯化(M.Deutscher，(编辑)，Meth.Enzymol.182529(1990))。在本发明其它的实施方案中，可以构建目标多肽和亲和标记(例如，麦芽糖结合蛋白，免疫球蛋白结构域)的融合物以促进纯化。
本发明的宿主细胞可以用于Ror多肽的大规模生产方法中，其中将细胞生长于合适的培养基中并通过本领域已知的纯化方法从细胞中，或从细胞生长的培养基中分离所需的多肽产物，所述方法例如传统的层析方法，包括免疫亲和层析、受体亲和层析、疏水作用层析、凝集素亲和层析、大小排阻过滤、阳离子或阴离子交换层析、高压液相色谱(HPLC)、反相HPLC等。纯化的其它方法包括所需蛋白被表达并纯化为具有特异性标签、标记或螯合部分的融合蛋白的方法，所述螯合部分由特异性结合配偶体或试剂所识别。可以剪切纯化的蛋白质以产生所需的蛋白质，或保持为完整的融合蛋白。融合组分的剪切可以产生所需蛋白质的形式，其具有额外的氨基酸残基作为剪切处理的结果。
术语“原位”指并且包括术语“体内”、“离体”和“体外”，这些术语通常被本领域普通技术人员所识别和理解。而且，本文以其最宽泛的间接和直接的含义使用短语“原位”以在发现时或原位鉴定一种实体、细胞或组织，而不受其来源或起源、在该地点或位置上其条件或状态或其延续时间或寿命的影响。
术语“体外”指一种人工环境或指发生于人工环境中的反应或过程。体外环境包括但不限于，试管和细胞培养物。术语“体内”指天然环境(例如，动物或细胞)并指发生于天然环境中的过程或反应。
本发明的方法可以在体外利用细胞(培养的细胞)和细胞裂解物，包括核提取物来实施。考虑用来鉴定调节骨形成的试剂的细胞的例子包括但不限于颅盖细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞，以及多能前体细胞，比如多能性骨髓基质细胞。成骨细胞以及成骨前体细胞系的具体例子包括在来自ATCC(WO 01/19855)的目录中提供的MC3T3-E1，C2C12，MG-63细胞，U2OS细胞，UMR106细胞，ROS17/2.8细胞，SaOS-2细胞等，以及在Bodine PV，Vernon S K，Komm BS.，Endocrinology，137，4592-4604，(1996)，Bodine PVN，TrailSmith M，Komm BS.，J Bone Min Res，11，806-819，(1996)，Bodine PV，Green J，Harris HA，Bhat RA，Stein GS，Lian JB，Komm BS.，J CellBiochem，65，368-387，(1997)，Bodine PV，Komm BS.，Bone，25，535-43(1999)，Bodine PVN，Harris HA，Komm BS.，Endocrinology，140，2439-2451，(1999)，Prince M，Banerjee C，Javed A，Green J，Lian JB，Stein GS，Bodine PV，Komm BS，JCell Biochem，80，424-40，(2001).中描述的HOB细胞系。
本发明的方法还可以利用无细胞系统来实施。
术语“表达系统”指在合适条件下的宿主细胞和相容的载体，例如，进行由载体携带并导入宿主细胞中的外源DNA编码的蛋白质的表达。常用的表达系统包括大肠杆菌(E.Coli)宿主细胞和质粒载体，昆虫宿主细胞和杆状病毒(Baculovirus)载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。
“转化”指核酸片段转移入宿主生物的基因组中，导致遗传上稳定的继承(inheritance)。包含转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。
“克隆”指通过有丝分裂由单细胞或共同祖先衍生的细胞群。“细胞系”指一个原代细胞的克隆，它能够在体外稳定生长几代。
术语“分化”指由组织或细胞的初始类型而具有的不同特性或功能。因而，“分化”是分化的过程或行为。
术语“成骨细胞分化”指细胞在成熟为成骨细胞的过程中发育出特化功能的过程。成骨细胞分化可以包括前成骨细胞、早期和成熟成骨细胞、前骨细胞和成熟骨细胞阶段(Bodine等，Vitamins andHormones 65，101-151(2002)，Stein等.Endocrine Reviews 14，424-442(1993)，and Lian等Vitamins and Hormones 55，443-509(1999))。
术语″增殖″指类似细胞的生长和生产。
术语″表型″指细胞或生物的可观察到的特征。这种可观察到的特征可以包括物理外观以及存在于细胞或生物中特定生理组分的水平。成骨细胞表型包括几种标记蛋白质，如骨特异性转录因子Cbfa1；I型胶原蛋白；碱性磷酸酶，骨钙素；和骨唾液蛋白的表达。
术语″基因可诱导性系统″指配体调控基因表达的应用。已经发展了几种利用小分子诱导基因表达的调控系统(在Clackson T.，CurrOpin Chem Biol，1，210-218，(1997)；Lewandoski M.，Nat Rev Genet.，2，743-755，(2001)进行综述)。基因可诱导性系统是一种分子工具，它在系统未被激活时允许靶基因的低的至不可检测的基本表达，并在激活时提高靶基因的表达水平。
″成熟″蛋白指经过翻译后加工的多肽，即已经去除了任何存在于原始翻译产物中的前肽或原肽的一种形式。″前体″蛋白指mRNA翻译的原始产物，即，前肽和原肽依然存在。前肽和原肽包括但不限于细胞内定位信号。
如本文所用的，术语″结合配偶体(binding partner)″或″相互作用蛋白″指能够特异性结合另一种分子的分子，例如，抗原和抗原特异性抗体或酶及其抑制剂。结合配偶体可以包括，例如，生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素、IgG和蛋白A、受体-配体结合物、蛋白质-蛋白质相互作用和互补的多核苷酸链。术语″结合配偶体″还可以指在细胞中结合激酶的多肽、脂类、小分子或核酸。在激酶和结合配偶体之间相互作用的变化可以使其自身显示为提高或降低的相互作用形成的可能性，或提高或降低的激酶-结合配偶体复合物浓度。例如，Ror1或Ror2蛋白二者都可以与另一种蛋白质或多肽结合并形成一种可以导致调节Ror1或Ror2活性的复合物。
术语″信号转导途径″指将细胞外信号通过细胞膜传递成为细胞内信号的分子。所述信号可以随后刺激细胞反应。参与信号转导过程的多肽分子可以是受体和非受体蛋白酪氨酸激酶。
″受体″指细胞内或细胞表面上的分子结构，它的特征通常为选择性地结合特定物质。例示性的受体包括肽激素的细胞表面受体、神经递质、抗原、互补片段和免疫球蛋白以及固醇类激素的细胞质受体。
术语″调节″指功能的抑制、增强或诱导。例如，基因表达的“调节”或“调控”指基因活性的变化。表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因抑制。“调节”或“调控”也指提高或降低蛋白质、酶、抑制剂、信号转导剂、受体、转录激活剂、辅因子等的生物学活性的方法、条件或试剂。这种活性的变化可以是mRNA翻译、DNA转录和/或mRNA或蛋白质降解的提高或降低，其接下来对应于生物学活性的提高或降低。这种增强或抑制可能是随着特定事件，如信号转导途径的激活的发生而有条件地发生的，和/或只在特定细胞类型中表现。
“受调节的活性”指由蛋白质的生物学活性形式调节的任何活性、状况、疾病或表型。可以通过影响生物学活性蛋白的浓度来影响调节，例如，通过调控表达或降解，或通过直接的激动或拮抗效应，如通过底物的抑制、激活、结合或释放，化学或结构上的修饰，或通过可以涉及其它因子的直接或间接的相互作用。
“调节剂”指改变特定活性表达的任何试剂，如骨形成或Ror分子表达。例如，调节骨形成的试剂变化或改变(提高或降低)骨形成。调节剂意在包括任何化合物，例如，抗体、小分子、肽、寡肽、多肽或蛋白质。
术语“小分子”指合成性的或天然发生的化学化合物，例如肽或寡核苷酸，其可以任选地是衍生的、天然产物或任何其它天然或合成来源的低分子量(一般小于大约5kD)的有机、生物有机或无机化合物。这种小分子可以是治疗上可递送的物质或者可以被进一步衍生以促进递送。
如本文所用的，术语“诱导剂”指诱导、增强、促进或提高特定活性，如骨形成或Ror分子表达的任何试剂。
如本文所用的术语“抑制剂”或“阻抑剂”指抑制、压制、阻抑或降低特定活性，如骨形成或Ror分子表达的任何试剂。
如本文所用的，术语“试剂(agent)”或“测试剂”指待测试的任何化合物或分子。
本发明的试剂的例子包括但不限于肽、小分子和抗体。试剂可以随机地进行选择或理性地选择或设计。如本文所用的，当随机地选择所述试剂而不考虑该试剂与靶化合物或位点之间的特异性相互作用时就说该试剂是被“随机选择的”。如本文所用的，当在非随机的基础上选择所述试剂时就说该试剂是被“理性地选择或设计的”，所述非随机的基础考虑该试剂与靶化合物或位点之间的特异性相互作用和/或与该试剂的作用有关的构象。
如本文所用的，术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)，Fv和F(ab′)片段，其可以通过用诸如胃蛋白酶的酶剪切抗体来制成。
如本文所用的，术语“治疗”(名词)、“治疗”(动词)和“疗法”指治疗性处理和预防性操作，或刺激骨细胞分化或骨形成、延缓骨病症状的发展和/或降低骨病症的严重性和/或将或预期由骨病症发展出来的这些症状的操作。这些术语进一步包括改善现有的骨病症状，预防其它症状，改善或预防症状的潜在代谢起因，预防或逆转症状的潜在代谢起因，或预防或促进骨形成。因而，这些术语表示已经赋予患有骨病症，或具有发展成这种病症的可能性的受试者的有益的结果。而且，术语“治疗”被定义为试剂(例如，治疗剂或治疗性组合物)或来自受试者的分离组织或细胞系应用或给药于受试者，所述受试者患有疾病、具有疾病的症状或疾病的易感性，以便治疗、治愈、减轻、减缓、改变、补救、改善、改进或影响所述疾病、疾病的症状或疾病的易感性。如本文所用的，“治疗剂”指有助于治疗疾病，例如，调节骨形成活性或诱导新的骨形成的任何物质或物质的组合。因此，治疗剂包括但不限于，小分子、肽、抗体、核酶和反义寡核苷酸。
治疗剂或治疗性组合物还可以包括预防和/或减少特定疾病症状的可药用形式的化合物。例如治疗性组合物可以是预防和/或减少骨相关疾病症状的药物组合物。欲以任何适合的形式提供本发明的治疗性组合物。治疗性组合物的形式依赖于多种因素，包括给药的方式。治疗性组合物可以包含稀释剂、佐剂和赋形剂等成分。
骨强度由骨密度(矿物质克数/体积的cm3)和骨质量(矿化、骨结构、骨更新、微裂缝)所决定。通常使用骨矿物质密度(Bone MineralDensity，BMD)作为骨强度的测量。例如，如果骨的BMD超过年轻白种成年妇女的平均BMD之下的2.5标准偏差，则称它为骨质疏松的(世界卫生组织，1994，Assessment of Fracture Risk and it′s Applicationto Screening for Postmenopausal Osteoporosis.Technical Report Series843.日内瓦世界卫生组织)。
“骨组织”指钙化的组织(例如，颅骨、胫骨、股骨、椎骨、牙齿)、骨小梁、骨髓腔，其为骨小梁之外的腔体、覆盖骨小梁外周和骨髓腔的皮质骨等。骨组织还指通常位于矿化胶原蛋白基质内的骨细胞；为骨细胞提供营养的血管；骨髓抽吸物；关节液；源自骨组织的骨细胞；并且可以包括脂肪性骨髓。骨组织包括诸如全骨、全骨的部分、骨片、骨粉、骨组织活检样品、胶原蛋白制品或其混合物的骨产品。为了本发明的目的，术语“骨组织”用来包括全部前述骨组织和产品，不论是人或动物，除非另外声明。
如本文所用的，“骨相关活性”包括骨形成活性和骨吸收活性。
骨形成活性可以通过增强成骨活性、由骨祖细胞进行的成骨分化，和成骨增殖，通过减少成骨细胞凋亡和通过其任意组合来进行诱导。此外，骨吸收活性可以通过降低破骨细胞活性、破骨细胞分化和增殖，通过提高破骨细胞凋亡和通过其任意组合来进行抑制。可以在各种骨组织或细胞中诱导骨形成活性。
如本文所用的，短语“调节骨形成”指骨形成的提高或降低。“提高的骨形成”意为成骨细胞或成骨细胞前体募集(recruitment)到骨位点，这导致细胞inot成熟成骨细胞的分化和它们胶原基质的分泌，这在该位点上矿化了内部的(int)骨物质并提高了骨质量(mass)。该术语还包括成熟成骨细胞胶原基质的增强的生产和分泌。增强的骨形成能够通过骨折率的降低、区域性骨密度的增加、容积性矿物质骨密度的提高、小梁连接性的提高、小梁密度的提高、皮质密度或厚度的提高、骨直径的增加和无机骨成分的增加中的一种或多种来进行确定。提高的骨形成可以缘自骨细胞，例如成骨细胞增强的附着、增殖、存活和/或分化以及随后的骨矿质化。
“骨相关病症”包括骨形成和骨吸收的病症。这些疾病和状况包括但不限于佝偻病、骨软化、骨质减少、骨硬化、肾病性骨营养不良、骨质疏松症(包括老年性和绝经后骨质疏松症)、变形性骨炎、骨转移、高钙血症、甲状旁腺机能亢进、骨硬化病、牙周炎和骨代谢的异常变化，其可能伴随着类风湿性关节炎和骨关节炎。某些这类疾病的特征为骨形成不足或骨流失，而其它的包括骨组织异常增厚或硬化。将从骨异常增厚的抑制中受益的疾病的例子包括但不限于骨硬化病(osteopetrosis)和骨硬化(osteosclerosis)。
“骨相关试剂”指影响骨形成或骨吸收的试剂。“骨相关试剂”可以诱导合成代谢或分解代谢效应，可以抑制骨吸收并且导致骨矿物质密度提高，可以增强骨形成，或者可以维持骨形成和骨吸收之间的平衡。
术语“化合物”或“试剂”在本文可以相互交换使用来指一种化合物或多种化合物或物质的组分，在施用给受试者(人或动物)时通过局部和/或全身性作用诱导所需的药理或生理作用。
术语“受试者”指任何哺乳动物，包括人或非人受试者。非人受试者可以包括实验性、试验性、农业性、娱乐性或伴侣动物。
术语“生物样品”是宽泛定义的，包括任何细胞、组织、生物液、器官、多细胞生物等。生物样品可以在源自例如细胞或体外组织培养物。或者，生物样品可以源自活体生物或源自单细胞生物的种群。生物样品可以是活体组织，如活体骨骼。术语“生物样品”还意在包括诸如分离自受试者的细胞、组织或生物液的样品，以及存在于受试者体内的样品。即，本发明的检测方法可以用于在体外以及在体内检测生物样品中的Ror mRNA、蛋白质、基因组DNA或活性。例如，检测Ror mRNA的体外技术包括TaqMan分析、RNA杂交和原位杂交。检测Ror蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附分析(ELISAs)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。检测Ror基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。
“试验样品”指来自目标受试者的生物样品。
“体液”指任何体液，包括而不限于血清、血浆、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊膜水、奶、全血、汗、尿、脑脊液、唾液、痰、泪、汗、粘液、组织培养基、组织提取液和细胞提取液。它还可以应用于体液的级分和稀释液。体液的来源可以是人体、动物体、实验动物、植物或其它生物。
本发明具体实施方案的介绍利用调节Ror分子的表达或活性的试剂作为骨相关活性调节剂的方法调节Ror分子的表达或活性的试剂可用于调节骨相关活性有许多疾病和状况，其特征是需要调节骨相关活性，例如增强骨形成。最显而易见的是骨折的情况，其中需要刺激骨生长并促进和完成骨修复。例如，增强骨形成的试剂可能会对面部重构过程有用。其它的骨缺陷状况包括但不限于，骨节段性缺陷、牙周病、转移性骨疾病、溶骨性骨疾病和结缔组织修复将会有益的状况，如软骨缺陷或损伤的治愈或再生。具有很大意义的还有骨质疏松症的慢性状况，包括年龄相关性骨质疏松症和与绝经后激素状况相关联的骨质疏松症。其它的特征为需要骨生长的状况包括原发性和继发性甲状旁腺功能亢进症、糖尿病相关的骨质疏松症、废用性骨质疏松症和糖皮质激素相关性骨质疏松症。
可以将用于本发明方法的试剂掺入适于给药的药物组合物中。如本文所用的，术语“试剂”包括但不限于，Ror核酸分子、Ror多肽片段和抗Ror抗体，以及鉴定过的调节Ror分子表达、合成和/或活性的化合物(例如小的口服活性的有机分子)。这些组合物一般包含所述化合物、核酸分子、蛋白质、抗体以及表达这种核酸分子的载体和宿主细胞，和可药物的载体。本发明的组合物可以包含一种或多种结合以一种或多种已知调节骨相关活性的试剂的试剂。例如，诱导Ror表达的试剂可以结合抑制骨吸收的试剂，像雌激素、二磷酸盐或组织选择性雌激素(即，选择性雌激素受体调节剂或SERMs)。
以治疗有效的剂量使用一种或多种试剂。治疗有效剂量指足以显示益处(例如，与正在治疗的病症、疾病或状况相关联的症状的减轻)的试剂的量。当应用于单独给药的个别成分时，所述术语单指该成分。当应用于组合时，所述术语指产生益处的成分的组合量，所述成份既可以组合给药，按顺序给药或同时给药。例如，对于治疗用途的有效量是包含试剂的组合物的量，所述试剂提供在骨折修复的治愈率上的临床显著的提高；骨流失的逆转和骨质疏松症中骨折的预防；软骨缺陷或病症的逆转；骨质疏松症发病的预防或延缓；在骨折非联合和牵拉骨生成中骨形成的刺激和/或抑制；骨生长入假肢装置的增强和/或减弱；牙齿缺陷的修复等。这种有效量将用常规优化技术进行确定并依赖于待治疗的特定状况、患者的病况、给药途径、配剂以及医生的判断和其它对于本领域技术人员显而易见的因素。本发明化合物所需要的剂量(例如，在骨质疏松症中，其中需要增强骨形成)是保证在治疗和对照组之间骨质量的统计学上显著差异的剂量。这种骨质量的差异可以视为，例如，在治疗组中骨质量5-20％或更多的提高。在治疗中临床显著提高的其它测量可以包括，例如，对断裂强度和张力、断裂强度和扭力、4点弯曲、骨活组织检查中增强的连接性的试验和其它本领域技术人员公知的生物力学试验。治疗方案的一般性指导可以从在目标疾病动物模型中进行的实验中获得。
试剂的毒性和治疗效力可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学方法来测定，例如，测定LD50(对群体50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效力之间的剂量比率是治疗指数，它可以表示为比率LD50/ED50。优选展示大的治疗指数的试剂或化合物。从细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可以用于配制一定范围的剂量用于人类。这种试剂或化合的的剂量可以在包括ED50而只有稍许或没有毒性的循环浓度范围之内。根据采用的剂型和利用的给药途径，剂量可以在此范围之内变化。
对于任何在本发明的方法中使用的试剂，治疗有效剂量都可以最初由细胞培养物分析进行评估。例如，可以在动物模型中配制一种剂量以获得循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养物中测定的ED50(即，获得蛋白质复合物的半数最大破坏，或复合物组分的细胞水平和/或活性的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可以用于更准确地确定在人类中的有用剂量。血浆中的水平可以例如，通过HPLC进行测量。各个医生根据患者的情况可以选择剂量。主治医生会知道如何以及何时终止、中断或调节给药。反过来，如果临床反应不足的话，主治医生也会知道将治疗调节到较高的水平(预先排除毒性)。在目标病症的控制中给试剂量的数量将随着待治疗病况的严重性而变化。病况的严重性可以，例如，通过标准的预后评估方法部分地进行评估。另外，剂量，也许还有剂量频率也将根据各个患者的年龄、体重和反应而变化。与上面所讨论的程序相当的程序可以用于兽医。
对于特定情形的适当剂量的测定是本领域的公知技术。通常，以小于化合物最佳剂量的较小剂量起始治疗。随后，可以小量增强剂量直至达到所述情况下的最佳效果。例如，如果需要，可以将总的每日剂量分开并在当天一份份地给药。
根据待治疗的特定病况，可以配制试剂并全身性或局部性地加以给药。将本发明的药物组合物配制成与其预期给药途径相适合。配剂和给药的技术可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990)里发现。合适的途径可以包括口、直肠、阴道、经皮、经粘膜或肠给药；肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射；以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射等。可以使用的一些递送方法包括但不限于包装于脂质体中、通过反转录病毒载体的转导、利用发现于大多数核蛋白上的核靶向性位点定位于核区、离体转染细胞随后重移植或给予转染的细胞，以及DNA传输系统。
当在药学上使用所述组合物时，它们与“可药用的载体”结合用于诊断和治疗。这些组合物的配剂是本领域技术人员所公知的。本发明的药物组合物可以包含一种或多种额外的试剂，并且优选包括可药用的载体。
合适的可药用的载体和/或稀释剂包括任何和全部传统溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。术语“可药用的载体”指不在其被给予的患者体内引发变应性反应或其它不当效应的载体。合适的可药用载体包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或多种，以及其组合。可药用载体可以进一步包含少量的辅助物质，如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲液，它提高所述组合物的一种或多种试剂的保存期或效力。这种介质和试剂用作药物是本领域公知的。
用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下列组分无菌稀释液如注射用水、盐水、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成性溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液和张力调节剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠外制品可以包装于安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。适于注射的药物组合物包括无菌水溶液(其中水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液的无菌粉末或分散体。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL_(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐溶液。所述载体可以是包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散剂介质。例如，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散体通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过各种抗菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等可以实现预防微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖或多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射组合物的延长吸收。
另外，本发明鉴定的治疗疾病和状况的试剂还可以与其它治疗剂共给药，所述其它治疗剂是因为它们对抗正在治疗状况的特别用处而被选用的。例如，所述试剂可以与雌激素或雌激素相关化合物或其它骨吸收抑制剂相组合。雌激素化合物包括但不限于共轭雌激素、雌二醇及其类似物。其它的骨相关治疗性化合物包括但不限于，二磷酸盐和相关化合物(如在美国专利号5,312,814中给出的那些)，钙补充物(Prince，R.L.等，N.Engl.J.Med.325，1189，(1991)，维生素D补充物(Chapuy M.C.等，N.Engl.J.Med.327，1637，(1992)，氟化钠(Riggs，B.L.等，N.Engl.J.Med.，327，620，(1992)，男性激素(Nagent de Deuxchaisnes，C.，in Osteoporosis，a Multi-DisciplinaryProblem，Royal Society of Medicine International Congress andSymposium Series No.55，Academic Press，London，p.291，(1983)，和降血钙素(Christiansen，C.，Bone 13(Suppl.1)S35，(1992)。
Ror分子作为药学药靶本发明通过体外和体内方法证实Ror分子为骨质疏松的药靶。例如，可以产生特异性破坏哺乳细胞内Ror表达的siRNA分子。这些siRNAs可以在具有相对高水平的Ror mRNA的早期成骨细胞中过表达并且可以监测Ror对于细胞分化和/或存活的破坏效应。还可以进行基因芯片分析以鉴定Ror依赖性基因(US5795716，US5974164)。基于Ror2表达模式及其与SFRP-1和Wnt信号(signaling)的关系，Ror2下调可以加速成骨细胞分化并且还能够促进凋亡。一种互补性方法包括Ror在前骨细胞中的过表达并监测这些细胞的分化状态，所述前骨细胞没有可检测水平的Ror2mRNA和具有低水平的Ror1 mRNA。体外确认之后，可以通过生成以组织和/或时间依赖性方式有条件地过表达Ror的转基因小鼠来体内确认Ror为骨质疏松症靶目标。还可以生成具有Ror表达的小鼠，所述表达在发育过程中于不同的时间被条件性地破坏。
鉴定调节骨相关活性和/或Wnt信号途径的试剂的方法本发明提供一种鉴定调节骨相关活性和/或wnt信号的试剂的方法，包括给药试验试剂并监测Ror分子的表达或活性以确定所述试剂是否调节骨相关活性，其中Ror分子的表达或活性的提高或降低表示所述试剂调节骨相关活性和/或Wnt信号。
确定一种试剂是否改变Ror分子的表达或活性的方法包括进行本领域技术人员公知的分析和测试。例子包括但不限于组化分析、RNA印迹分析、TaqMan分析、蛋白质印迹分析、ELISA，和功能性分析，包括例如，Ror磷酸化程度的测量(磷酸化的更高状态反映更高活性)。本发明所考虑的鉴定调节Ror表达和活性的待测试剂的其它方法包括PCR分析和报告基因系统。所述报告基因可以编码荧光素酶并且可以在，例如，由Wnt-3信号激活的启动子的控制之下。由于Ror1和Ror2抑制Wnt-3活性，报告基因的表达反映Ror分子的表达和/或活性的变化。
可以任何已有的格式改进或实施本发明的方法，包括高通量测试。高通量分析可用于在给定的时期内筛选大量的化合物。在一个实施方案中，可以进行利用核酸的分析，其中核酸置于DNA芯片上。在另一个实施方案中，进行利用基于细胞的筛选的分析。美国专利号6,103,479公开了进行基于细胞的筛选的小规模细胞阵列法和装置。已经介绍过为其它应用制备细胞均一微模式阵列的方法，例如光化学耐受照相平版术(Mrksich and Whitesides，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，25，55-78，(1996))。美国专利号6,096，509提供了一种在流动的细胞悬浮液上实时测量对试验化合物的细胞反应的装置和方法，其中将一系列细胞类型中的每个成员的均匀悬浮液结合以特定浓度的试验化合物，定向通过检测区，并且当试验混合物中的细胞流经检测区时实时测量活细胞的细胞反应。该专利公开了所述装置用于自动筛选化合物文库。可以对美国专利中公开的方法进行修饰以便利用诸如成骨细胞(HOB，U2OS，SaOS-2和其它)或非成骨细胞(COS-7和其它)的细胞来确定试验试剂是否调节Ror分子的表达或活性。
鉴定调节骨相关活性和/或Wnt信号途径的基因或蛋白质的方法本发明还考虑了鉴定可以受Ror表达调控并因而可以参与骨相关活性的基因或蛋白质的方法。例如，可以通过过表达Ror分子和监测基因表达模式的变化来鉴定这种基因或蛋白质。此外，可以研究Ror下调(通过反义RNA或siRNA的方法)对基因表达模式的影响。而且，受Ror表达调控的基因或蛋白质可以对Wnt信号途径具有影响。
在高等生物中，细胞中某些基因的表达决定了由细胞所进行的生命过程，例如发育和分化、内环境稳定、对各种试剂的反应、细胞周期调控、老化、凋亡等。基因表达变化改变了正常细胞发育的过程。所以，分析基因表达的方法对于基础分子生物学研究是十分重要的。鉴定差异表达的基因可以对于动物，包括人类中多种疾病或病情状态的诊断、预后和治疗提供线索。此外，这些方法可以用于鉴定差异表达的序列，因为基因表达水平的变化与疾病或状况的易感性相关联，例如，与骨相关活性相关联。
例如，差异基因表达分析可以在特定细胞中进行并且可以比较不同细胞中基因的表达并鉴定表达中的任何差异，其中差异的存在表明被比较的细胞中表达的基因类别的不同。
如本文所用的，“差异基因表达”指基因的时间和/或组织表达模式的量的以及质的差异。因而，在正常的对异常的骨形成状态或异常的体重状态下，或在对照对实验条件下，差异表达的基因可以在质上使其表达受到激活或完全灭活。这种在质上受到调控的基因在对照受试者或患病受试者的其中之一，但不都是，将是可检测的。或者，这种在质上受到调控的基因在对照或实验性受试者的其中之一，但不都是，将是可检测的。术语“可检测的”指，例如，可以通过差异显示，RT-PCR和/或RNA印迹分析的标准技术检测的RNA表达模式，所述技术是本领域技术人员所公知的。
多种正常和异常动物的模型或细胞系可以被用于鉴定受Ror调节或调控的差异表达的基因。例如，源自正常个体和患病个体的细胞系被用于研究与Ror表达相关联的差异基因表达，所述疾病包括，但不限于，骨质疏松症、佝偻病、骨软化、骨质减少、骨质硬化、甲状旁腺机能亢进、骨硬化病、牙周炎、肾病性骨营养不良、变形性骨炎、骨转移、高钙血症、肥胖、厌食、恶病质，以及非颤抖性和颤抖性生热作用。
为了鉴定差异表达的基因，可以将RNA，可以是总RNA或mRNA，从动物的组织或上述细胞中分离出来。RNA样品可以获自试验受试者的组织和来自对照受试者的相应组织。可以利用任何不会背离mRNA的分离进行选择的RNA分离技术以便纯化这种RNA样品(例如，Ausubel，F.M.等编辑，(1987-1993)，Current Protocols in MolecularBiology，JohnWiley & Sons，Inc.New York)。此外，利用本领域技术人员公知的技术可以轻易地处理大量组织样品(例如美国专利号4,843,155)。
通过本领域公知的方法可以鉴定所收集的RNA样品中代表由差异表达基因产生的RNA的转录物。例如，基因芯片分析(US5795716，US5974164)，cDNA微阵列分析，见，例如，Ono K，Tanaka T，TsunodaT，KitaharaO，Kihara C，Okamoto A，Ochiaia K，Takagi T，NakamuraY.，Cancer Res 60，5007-5011，(2000)，递减杂交法(Hedrick等，Nature 308，149-153，(1984)；Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，2825，(1984)，或差异显示(Liang等，Science 257，967-971(1992)，美国专利号5,262,311)可以被用于鉴定源自差异表达基因的核酸。
一旦通过上述技术鉴定了可能差异表达的基因序列，可以利用本领域公知的方法如TaqMan分析、RNA印迹分析或定量RT-PCR对这些推定的差异表达基因的差异表达作进一步特征鉴定。
制备宿主细胞通过本领域已知的技术，可以在不同的细胞系中过表达Ror核苷酸序列以鉴定它们在不同细胞功能中的作用。例如，可以在成骨细胞系中过表达Ror并且随后可以通过标准技术监测其在分化中的作用。而且，Ror可以用于瞬时转染分析的基因可诱导系统中以确定一种试剂是否对骨形成具有影响。
可以用包含Ror核苷酸序列的载体对宿主细胞进行工程化。宿主生物(重组宿主细胞)可以是任何真核或原核细胞，或多细胞生物。它们可以源自哺乳动物、酵母、真菌或病毒。合适的宿主细胞可以包括但不限于哺乳动物细胞，例如非成骨细胞(猴肾COS-7，人肾293，人卵巢CHO，人肝HepG2，人子宫颈HeLa，或小鼠成纤维细胞NIH3T3)或成骨细胞(原代成骨细胞(primary osteoblasts)，人成骨细胞如TE-85、U2OS、SaOS-2或HOB，大鼠成骨细胞如UMR 106或ROS 17/2.8，或小鼠成骨细胞如MC3T3。而且，大肠杆菌的多种菌株(例如，DH5α，BL21，DH10B)、酵母细胞(例如，Schizasaccharomyces，酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisice)，PichiaPastoris，Pichia Methanolica)和昆虫细胞(SF9，SF21，草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda)，S2 Schneider细胞，来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵的High Five Cells)可以用作分子生物学操作的宿主细胞。
载体可以是克隆载体或表达载体，如以质粒、粘粒或噬菌体或任何其它在宿主细胞中可复制和存活的载体的形式存在。工程化的宿主细胞可以在传统的营养性培养基中进行培养，所述培养基为了激活启动子、选择转化子或扩增本发明的多核苷酸进行了改进。培养条件如pH、温度等是本领域普通技术人员已知的适用于所选择的宿主细胞表达多核苷酸的条件。
根据本领域技术人员所熟悉的标准命名惯例，本文中将质粒表示为小写“p”前跟和/或后跟大写字母和/或数字。本文的质粒既可以是可商购的、在不加限制的基础上公众可获得的，也可以是通过常规应用公知的、发表过的方法由可获得的质粒构建的。此外，许多可以根据本发明使用的质粒和其它克隆和表达载体是公知的和本领域技术人员可以轻易获得的。而且，本领域技术人员可以轻易地构建任何数目的适用于本发明的其它质粒。对于本领域技术人员来说，根据本说明书，在本发明中这些质粒以及其它载体的性质、构建和使用将是显而易见的。
可以通过多种本领域已知的方法将合适的DNA序列插入到载体中。
可以将表达载体中的DNA序列操作性地连接于适合的表达控制元件上以指导mRNA合成。所述表达控制元件是本领域公知的并且包括但不限于，可诱导的启动子、组成性启动子、分泌信号和其它调控元件。优选地，所述可诱导的启动子容易进行控制，如对宿主细胞的培养基中的营养成分是反应性的。合适的非固有的(non-native)哺乳动物启动子可以包括巨细胞病毒(CMV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、来自猿病毒40的早期和晚期启动子(SV40，Fiers等，Nature，273，113，(1978))或来自Moloney鼠白血病病毒、小鼠肿瘤病毒、鸟肉瘤病毒、腺病毒II、牛剌瘤病毒或多瘤的启动子。优选的骨相关启动子包括CMVβ肌动蛋白或I型胶原蛋白启动子。除了启动子，还可以将基因置于核糖体结合位点(对于细菌表达)、适合的基因控制序列或调控序列的控制下，从而将编码所述蛋白质的DNA序列在宿主细胞中转录成RNA，所述宿主细胞由包含这种表达构建体的载体所转化。在某些情况下需要添加引起多肽由宿主细胞分泌的序列，随后剪切掉分泌信号。表达载体还可以包括进行翻译起始的核糖体结合位点、转录终止子和扩增表达的适当序列。表达载体还可以包括一种或多种可选择的标记基因以提供特定的表型进行转化的宿主细胞的筛选，如真核细胞的新霉素抗性或大肠杆菌的氨苄青霉素抗性。此外，构建体可以连接到一个可扩增的基因上(例如，DHFR)，从而可以制得多拷贝的基因。关于合适的增强子和其它表达控制序列，还见Enhaneers andEukaryotic Gene Expression(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，(1983))。
适用于酵母表达的载体和启动子在EP 73,675A中进行了介绍。适于哺乳动物表达的载体的例子包括但不限于pCMV SPORT6、pCDNA3.1DN5-His-TOPO和pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO。
抑制Ror表达的方法本发明提供抑制Ror表达和/或活性的方法，其包括但不限于，使用反义核酸、siRNAs和核酶以及抗体、肽和小分子。反义RNA和DNA分子通过杂交到靶向的mRNA上并阻止蛋白质翻译来直接阻抑mRNA的翻译。反义法包括设计与靶基因mRNA互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸将结合互补的靶基因mRNA转录物并阻止翻译。
鉴定Ror相互作用蛋白的方法可以通过本领域技术人员已知的方法鉴定Ror相互作用蛋白。例如，免疫沉淀之后进行质谱分析(Hill等，J.Biol.Chem.277，40735-40741(2002))以及哺乳动物和酵母双杂交系统可以用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。见，例如，
US 6,251,602，Chien etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 88，9578-82(1991)；Fields et al.，Trends Genetics 10，286-92(1994)；Harper et al.，Cell 75，805-16(1993)；Vojtek et al.，Cell 74，205-14(1993)；Luban et al.，Cell 73，1067-78(1993)；Li et al.，FASEB J.7，957-63(1993)；Zang et al.，Nature 364，308-13(1993)；Golemis et al.，Mol.Cell.Biol.，12，3006-14(1992)；Sato et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，91，9238-42(1994)；Coghlan et al.，Science，267108-111，(1995)；Kalpana et al.，Science，266，2002-6(1994)；Helps etal.，FEBS Lett，340，93-8(1994)；Yeung et al.，Genes & Devel.，8，2087-9，(1994)；Durfee et al.，Genes & Devel.，7，555-569，(1993)；Paetkau et al.，Genes & Devel.，8，2035-45，(1994)，Spaargaren et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，12609-13，(19g4)；and Ye et al.，Proc.Natl Acad.Sd.USA，91，12629-33(1994).
该系统的变体可用于筛选酵母噬菌粒(见，例如，Harper，CellularInteractions and DevelopmentA Practical Approach，153-179(1993)；Elledge等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，1731-5(1991))或质粒(Bartel，1993和Bartel，Cell，14，920-4(1993))；Finley等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，91，12980-4(1994))cDNA文库以克隆相互作用蛋白，以及研究已知的蛋白质配对。
可以将具有多种报告基因盒的整合拷贝的酵母菌株，如例如GAL.fwdarw.LacZ，GAL.fwdarw.HIS3，或GAL.fwdarw.URA3(Bartel，in Cellular Interactions and DevelopmentA Practical Approach，153-179(1993)；Harper等，Cell，75，805-16，(1993)；Fields等，Trends Genetics，10，286-92(1994))用两个质粒一起共转化，所述质粒每个都表达不同的融合蛋白。一个质粒编码蛋白″X″和例如GAL4酵母转录激活子的DNA结合结构域之间的融合(Brent等，Cell 43，729-36(1985)；Ma等，Cell，48，847-53(1987)；Keegan等，Science，231，699-704(1986))，而另一个质粒则编码蛋白″Y″和GAL4的RNA聚合酶激活结构域之间的融合(Keegan等，1986)。可以将质粒转化进酵母的菌株内，所述菌株包含报告基因，如lacZ，它的调控区包含GAL4结合位点。如果蛋白X和Y相互作用，它们就通过将两个GAL4组分充分接近来重构一个功能性GAL4转录激活子蛋白以激活转录。通过测量β半乳糖苷酶或转化子在缺乏特定营养成分的基本培养基上的生长来评估转录激活，所述特定营养成分允许转录产物的营养缺陷选择，例如，URA3(尿嘧啶选择)或HIS3(组氨酸选择)。见，例如，Bartel，(1993)；Durfee等，Genes & Devel.，7，555-569(1993)；Fields等，Trends Genet.，10，286-292(1994)；和美国专利号5,283,173。
其它的双杂交分析或筛选方法对于熟练技术人员是显而易见的。见，例如，Finley et al.，″Two-Hybrid Analysisof Genetic Regulatory Networks，″in The Yeast Two-Hybrid System(PaulL.Bartel etal.，eds.，Oxford，(1997))；Meijia Yang，”Use of a Combinatorial Peptide Library in theTwo-Hybrid Assay，”in The Yeast Two-Hybrid System(Paul L.Bartel et al.，eds.，Oxford，(1997))；Gietz et al.，”ldentification of proteins that interact with a protein ofinterestApplications of the yeast two-hybrid system，″Mo1.& Cell.Biochem.，172，67-9(1997)；K.H.Young，″Yeast Two-HybridSo Many Interactions，(in)so Little Time，″Biol.Reprod.，58，302-311，(1998)；R.Brent et al.，”Understanding Gene and AlleleFunction with Two-Hybrid Methods，”Annu.Rev.Genet.，31，663-704(1997).
可以将Ror的全长或不同部分克隆入酵母双杂交载体。这些载体包括但不限于pAS，pAS2-1，pGBT9，pGBKT7。与已知结合结构域(例如，GAL4或LexA)作为融合蛋白表达的克隆的Ror(SerebriiskiiI.G.等，BioTechniques，30，634-655，(2001))将对已知或未知的蛋白质呈现诱饵。克隆入激活结构域载体(例如，GAL4或VP16)(Serebriiskiil.G.等，BioTechniques，30，634-655，(2001))的cDNA可以来自cDNA文库，所述文库由表达Ror的不同成骨细胞系、骨、脑和其它组织制得。
一旦鉴定了相互作用配偶体，就可以分离并克隆全长cDNA。此外，可以在哺乳动物双杂交系统中确认相互作用。另外，可以进行实验，这将更清楚地确定Ror中的结合结构域。
如果Ror的相互作用配偶体是在成骨细胞中表达的新基因，那么可以进行另外的实验方法以确定该蛋白在骨形成和/或吸收中的作用。不过，如果Ror的相互作用配偶体是具有已知生物学功能的基因，它可以表明Ror相互作用配偶体在骨形成和/或吸收的调节中的作用。
诊断用途本发明的Ror分子还可以用作骨相关病症或疾病状态的标记，疾病状态前兆的标记，疾病状态易感性的标记，药物活性的标记，或受试者药物基因组学模式的标记。利用本文所述的方法，可以检测本发明的Ror分子的存在、缺失和/或数量，并且可以与体内的一种或多种生物学状态相关。例如，本发明的Ror分子可以作为一种或多种骨病症或疾病状态或导致疾病状态的状况的生化标记而起作用。如本文所用的，生化标记与一种疾病或病症的缺失或存在，或与疾病或病症的进程(例如，与降低的骨矿物质密度(BMD))相关。所以，这些标记可以作用来指示一个特定治疗过程是否对减轻疾病状态或病症有效。
本发明提供一种在患者中诊断骨相关病症的方法，包括将患者中的Ror分子表达和/或活性的水平与来自正常受试者的可比样品中的Ror分子表达和/或活性的水平相比较。样品可以是患者组织、细胞或体液样品。
此外，本发明提出了Ror分子鉴定在正常状态或疾病状态中对骨修饰剂反应的细胞或组织的用途，这通过在给药试剂之前和之后测量在这些细胞或组织中Ror分子表达和/或活性的水平来进行。Ror分子表达和/或活性的变化将反映细胞或组织对所述试剂的反应性。
例如，Ror分子可以用作有助于设计和/或鉴定化合物的靶，所述化合物可以用作发病骨质疏松症的治疗或减少绝经前妇女或其它危险个体发展成骨折和骨质疏松症的危险的预防疗法的药物。
这些化合物可以用于绝经期间妇女的骨质疏松症治疗以预防骨的进一步恶化和/或诱导新的骨形成。它可以作为单独疗法和/或结合以现存抑制骨流失的疗法或作为雌激素的额外疗法而给出。
另外，本发明提供了证据，即人Ror2在增殖性前成骨细胞中达峰值。所以，在培养物中或原位中Ror2可以用作这种类型细胞的标记。
利用Ror分子评估药物的效力本发明提供监测用试剂(例如，激动剂、撷抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其它由本文所述筛选测试所鉴定的药物候选物)治疗受试者的效力的方法，包括步骤(i)在给药试剂前从受试者获得给药前的样品；(ii)检测给药前的样品中Ror分子的表达或活性水平；(iii)从受试者获得一种或多种给药后的样品；(iv)检测给药后的样品中Ror分子的表达或活性水平；(v)比较给药前和给药后的样品中Ror分子的表达或活性水平；和(vi)相应地改变所述试剂对受试者的给药。例如，增强给药所述试剂可望更强地调节Ror的表达或活性，即，提高试剂的效力。根据这一实施方案，Ror分子的表达或活性可以被用作试剂效力的指征，即使是在缺少一种可观察到的表型反应时。
本发明进一步提供评估药物效力和监测参与骨相关病症治疗的临床试验的患者的进展的方法。监测试剂(例如药物)对Ror分子的表达或活性的影响不仅可以应用于基础药物筛选，还可以应用于临床试验或任何其它应用期间。例如，通过本文所述的筛选测试所测定的试剂提高Ror基因或多肽表达水平的效力，可以在呈现降低的Ror基因或多肽表达水平的受试者的临床试验中进行监测。或者，通过筛选测试所测定的试剂降低Ror基因或多肽表达水平的效力，可以在呈现提高的Ror基因或多肽表达水平的受试者的临床试验中进行监测。在这种临床试验中，Ror基因或多肽以及其它涉及例如Ror关联病症的基因和多肽的表达或活性水平可以被用作特定细胞，例如，骨细胞中表型的“读出值”(read-out)或标记。此外，Ror基因或多肽表达可以被用作特定药物或试剂对于骨相关病症状态的作用的读出值。
例如，并非限制性的，可以鉴定在细胞中受试剂(例如，化合物、药物或小分子)治疗的调节的基因，所述试剂调节Ror分子表达或活性(例如，在本文所述筛选测试中所鉴定的)。因而，为了研究试剂对于Ror关联病症(例如，骨相关的)的作用，例如，在临床试验中，可以分离细胞并制备RNA并进行基因阵列分析(例如，基因芯片分析)。在未处理状态和处理状态之间表达显著变化的基因可以作为指示细胞对所述试剂生理反应的标记。因此，这种反应状态可以在用所述试剂治疗个体之前或期间各时间点进行测定。
转基因动物在“转基因动物”中的术语“动物”包括所有脊椎动物，除了人以外。它还包括全部发育阶段的个体动物，包括胚胎和胎儿阶段。“转基因动物”是包含载有遗传信息的一个或多个细胞的动物，所述遗传信息是通过在亚细胞水平上有意的遗传操作，如通过用重组病毒微注射或注射而直接或间接接受的。引入的DNA分子可以整合入染色体中，或者它可以是染色体外复制的DNA。术语“转基因”意为通过人类干预的方式导入动物种系的DNA序列。术语“种系细胞系转基因动物(germ cell-line transgenic animal)”指一种转基因动物，其中将遗传信息引入种系细胞，由此赋予向后代传递信息的能力。如果这些后代事实上具有一些或全部该信息，那么它们也是转基因动物。
所述信息对于受体所属的动物物种来说可以是外源的，只对特定个体受体是外源的，或者遗传信息已经为所述受体所具有。在最后一种情况中，引入的基因与固有内源基因相比可以是差异表达的。
基因可以通过将它们从基因组来源中分离，通过由分离的RNA模板制备cDNAs，通过直接合成，或通过其某些组合而获得。
为了进行表达，基因被操作性地连接到调控区上。调控区，如启动子，可以用于提高、降低、调控基因的表达或将基因的表达限定(designate)到某些组织或某些发育阶段。启动子不必是天然发生的启动子。
能够将DNA导入细胞中的方法是通常现有的并且是本领域公知的。可以使用不同的导入转基因的方法。通常，受精卵是微注射的最佳靶目标。例如，在小鼠中，雄性前核直径达到大约20μm，这允许可重复的注射1-2pl DNA溶液。受精卵用作基因转移的靶目标具有很大的益处。在大多数情况下，注射的DNA于首次卵裂之前将整合入宿主细胞中(Brinster，等，1985)。结果，几乎全部的转基因非人动物细胞都将携带整合的转基因。一般，这还将导致转基因有效传递给起始者的后代，因为50％的精细胞将具有所述转基因。受精卵的微注射是在实施本发明中掺入转基因的优选方法。
反转录病毒感染也可以用于将转基因导入非人动物中。可以将发育中的非人动物胚胎在体外培养至胚囊阶段。在此时期中，分裂球可以是反转录病毒感染的靶目标。通过酶学处理去除透明带而获得分裂球的有效感染。用于导入转基因的病毒载体系统一般是携带转基因的复制缺陷型反转录病毒。通过在产病毒细胞的单层上培养分裂球轻易而有效地获得转染(Van der Putten，同上；Stewart等，1987)。或者，可以在后面的阶段进行感染。可以将病毒或产病毒细胞注射入囊胚腔。大多数起始动物对转基因是嵌合式的，因为掺入仅在一小组细胞中发生，所述细胞形成转基因非人动物。而且，所述起始动物可以在基因组的多个位置上包含转基因的反转录病毒插入；这些通常在后代中分离。此外，通过中期受孕胚胎的子宫内反转录病毒感染，尽管低效，也有可能将转基因导入种系中(Jahner等，(1982)同上)。
转基因导入的第三种类型的靶细胞是胚胎干(ES)细胞。ES细胞获自体外培养的移植前的胚胎(Evans，M.J.等，1981；Bradley，A.等，1984；Gossler等，1986；和Robertson等，1986)。通过DNA转染或通过反转录病毒介导的转导可以有效地将转基因导入ES细胞中。随后可以将得到的转化ES细胞与来自非人动物的胚泡结合。ES细胞形成胚胎并有贡献于得到的嵌合动物的种系(见综述Jaenisch，R.，1988)。
产生转基因动物的一般方法是本领域已知的，并在，例如，Strategies in Transgenic Animal Science(Glenn M.Monastersky and James M.Robl eds.，ASM Press；Washington，DC，1995)；Transgenic Animal TechnologyA Laboratory Handbook(Carl A.Pinkert ed.，Academic Press 1994)Transgenic Animals(Louis Marie Houdebine，ed.，HarwoodAcademic Press，1997)；Overexpression and Knockout of Cytokines in TransgenicMice(Chaim O.Jacob，ed.，Academic Press 1994)；Microinjection and TransgenesisStrategies and Protocols(Springer Lab Manual)(Angel Cid-Arregui and AlejandroGarcia-Carranca，eds.，Springer Verlag 1998)；andManipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual(Brigid Hogan et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press1994).中进行了介绍。评估引入DNA的存在及其表达的方法是可轻易获得的并且是本领域公知的。这些方法包括但不限于，DNA杂交(southern杂交)或PCR以检测外源DNA或PAGE和蛋白质印迹以检测蛋白质。
为了确定Ror是否在骨相关病症中发挥作用，制成在全部组织或仅在骨骼中过表达全长基因或其任何片段或变异体或突变体的转基因小鼠。为了建立Ror在骨骼以及非骨骼组织中的广泛过表达，使用一种普遍存在的启动子(例如，CMVβ肌动蛋白)。利用Mifepristone依赖性基因可诱导系统可以将Ror的表达变成条件性的。通过诸如大鼠3.6kb I型胶原蛋白或大鼠1.7kb骨钙素启动子的启动子驱动大鼠cDNA的骨特异性过表达。大鼠3.6kb I型胶原蛋白启动子对于提供发育中骨骼的早期表达是有用的，而大鼠1.7kb骨钙素启动子可以给予更严格骨骼限制性表达模式。相同的构建体也用于产生转基因大鼠。对于Ror的条件性表达来说，骨钙素启动子(Capparelli，F.B.，Endocrinol.，138，2109-2116，(1997))驱动基因可诱导系统而Gal4最小启动子驱动Ror。将独立的转基因系杂交并用Mifepristone处理双转基因小鼠以根据需要调控Ror表达。转基因动物的表型分析包括体内和离体测试的结合。提高的BMD为这样的概念提供证据，即Ror分子确实是骨相关病症的潜在新靶目标。而且，这些转基因动物可以用来确定Ror过表达是否能够在这些建立的骨质减少症模型的大鼠和小鼠中挽救卵巢切除术诱发的骨质减少症(Y.P.Kharode等.J.BoneMin.Res.，14(1)，S523，(1999)，Y.P.Kharode等.J.Bone Min.Res.，16(1)，S540，(2001))。
用各种本领域已知的组织形态参数，转基因动物可以用于分析骨骼的各种骨的骨表型，包括扁骨(头盖骨，肩胛骨，下颌骨和髂骨(ileum))和长骨或轴骨(胫骨，股骨和肱骨)等。
此外，可以在各种骨流失模型中对Ror转基因动物检验骨流失的保护，所述模型包括卵巢切除诱导的骨质减少症、糖皮质激素诱导的骨质减少症和各种本领域已知的废用模型等。可以对各种骨合成代谢剂(例如，鉴定的小分子)组合的作用进行研究和测定从而进一步以合成代谢的方式(协同式地，加成式地)或以分解代谢的方式改变骨表型。
另外，可以利用Ror转基因动物研究Ror在骨祖细胞和成骨细胞活性、增殖率和凋亡率中的作用，所述骨祖细胞和成骨细胞活性、增殖率和凋亡率一起影响骨的形成。
Ror转基因动物可以用于鉴定对骨相关病症的治疗有效的试剂。可以将试剂向本发明的转基因动物给药。能够测量治疗过的动物中骨形成和其它骨相关活性的变化，并与未处理的对照动物中骨形成和其它骨相关活性相比较。
条件性敲除动物可选地，作为编码所述基因的内源基因和导入动物胚胎细胞的编码相同多肽的改变的基因组DNA之间同源重组的结果，可以构建“敲除”动物，其具有编码在筛选中鉴定的基因的缺陷型或改变的基因。例如，根据公认的技术，可以用编码一种鉴定过的基因的cDNA来克隆编码该多肽的基因组DNA。编码鉴定过的基因的基因组DNA的一部分可以被删除或用另一种基因代替，如编码能够用于监测整合的可选择标记的基因。一般，将几千个碱基的未改变侧翼DNA(在5’和3’末端)包括在载体中(见例如，Thomas and Capecchi，Cell，51(3)，503-12，(1987)对同源重组载体的介绍)。将载体导入胚胎干细胞系中(例如，通过电穿孔)并选择其中导入的DNA已与内源性DNA同源重组的细胞(见例如，Li等，Cell，69(6)，915-26，(1992)。随后将选择的细胞注射入动物(例如，小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(见例如，Bradley，in Teratocarcinomas and EmbryonicStem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，ed.IRL，Oxford，113-1521，(1987)。随后将嵌合胚胎移植入适合的假孕雌性代养动物体内，而所述胚胎用于产生“敲除”动物。通过标准技术可以鉴定在其种系细胞中具有同源重组DNA的后代并用于繁殖动物，其中所述动物的全部细胞都包含同源重组的DNA。敲除动物的特征为，例如，它们能够防御某些病理状况和由于所鉴定基因的缺失而发展出病理状况。
敲除动物能够用来筛选可以影响生化参数和病理参数的药物，所述参数是与正在研究的特定生理病症相关的。细胞系也可以源自这些动物以用作生理病症的，或药物筛选中的细胞模型。例如，通过在Ror1或Ro2序列中导入突变，由此制成一种不再表达功能性Ror1或Ro2基因的动物，而发展出敲除动物。这种敲除动物，对于，例如，研究Ror1或Ro2在骨相关活性或其它相关生理功能中的作用是有用的。
本发明提供Ror基因被条件性灭活的动物。条件性灭活指基因在选定的组织(即，在骨中)和/或发育期间的特定时间的灭活。条件性灭活的基因在灭活之前于所有其它组织中和所有时间上都以正常的内源水平表达。在一个实施方案中，本发明提供基因信息以发展条件性Ror敲除小鼠。
制成可能依赖于Cre重组酶在骨中特异性表达的条件性小鼠敲除。通过将靶基因动物与在骨中特异性表达Cre的转基因小鼠杂交来进行骨中靶向等位基因的删除。例如，制成转基因小鼠，其中Cre可以被大鼠3.6kb I型胶原蛋白启动子或大鼠1.7kb骨钙素启动子驱动。
预期的表型是骨形成受到改变的表型。靶动物的表型分析包括体内和离体测试的组合。无法发育成正常的骨或无法正常地重塑骨提供了Ror在骨发育中的作用及其作为骨相关病症新靶的用途。
用各种本领域已知的组织形态参数，条件性敲除动物可以用来分析骨骼的各种骨的骨表型，包括扁骨(头盖骨，肩胛骨，下颌骨和髂骨)和长骨或轴骨(胫骨，股骨和肱骨)等。
而且，条件性Ror敲除动物可以用来评估在缺失Ror时骨祖细胞和成骨细胞活性、增殖率和凋亡率。
本发明通过参考文献并入分子和细胞生物学领域中公知的方法和技术。这些技术包括但不限于在下列出版物中描述的技术Old，R.W.& S.B.Primrose，Principles of Gene ManipulationAn Introduction To GeneticEngineering(3d Ed.1985)Blackwell Scientific Publications，Boston.Studies inMicrobiology；V.2409pp.(ISBN 0-632-01318-4)，Sambrook，J.et al.eds.，MolecularCloningA Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，Miller，J.H.& M，P.Calos eds.，Gene TransferVectors For Mammalian Cells(1987)Cold Spring Harbor Laboratory Press.NY.169pp.(ISBN 0-87969-198-0).
实施例在下列实施例中对本发明作进一步定义，其中所有部分和百分比都是由重量计算的，度是摄氏度，除非另外声明。应当理解这些实施例，尽管表明本发明的优选的实施方案，只是通过例证的方式给出。由以上讨论，实施方案和这些实施例，本领域的技术人员将会轻易地理解在例示性实施方案中许多改进是可能的，而不会在本质上背离本发明的新教导，并且不会背离其精神和范围。而且，可以做出本发明的各种变化和改进以使它适应各种用途和条件。因此，所有这些改进都意欲包括于如下列权利要求书中所定义的本发明的范围之内。
特此将本文所提及的专利、申请、试验方法和出版物的全部内容以引用的方式并入本文。
一般方法材料和组织培养除非注明，组织培养试剂购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)；其它的试剂和化学品购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)或Invitrogen。抗-flag M2小鼠单克隆抗体、抗V5兔多克隆抗体和抗-flagM2亲和性琼脂糖获自Sigma；抗-HA标签和抗-β-连环蛋白兔多克隆抗体和抗-磷酸酪氨酸小鼠单克隆抗体、克隆4G10，来自Upstate CellSignaling Solutions(Charlottesville，VA)；抗-his小鼠单克隆抗体来自BD Biosciences Clontech(Palo Alto，CA)；抗-β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体来自Sigma；辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二抗购自SantaCruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)或Amersham Biosciences(Buckinghamshire，England)。
利用包含10％热灭活胎牛血清、1％青霉素-链霉素和2mMglutaMAX-I的DMEM/F-12培养基在5％CO2/95％加湿空气培养箱中于34℃维持HOB细胞系。在包含10％热灭活胎牛血清、1％青霉素-链霉素和2mM glutaMAX-I的McCoy′s 5A改进培养基中将U2OS人骨肉瘤细胞保持于37℃。在包含10％热灭活胎牛血清、1％青霉素-链霉素和2mM glutaMAX-I的DMEM中于37℃维持COS-7细胞。
质粒于pUSEamp中HA表位标记的人Wnt-1(Wnt-1-HA)，于pUSEamp中HA表位标记的人Wnt-3(Wnt-3-HA)和pUSEamp(+)获自UpstateBiotechnology；pcDNA3.1(+)来自Invitrogen；CMV启动子驱动的β半乳糖苷酶报告基因(pCMVβ)来自BD Biosciences Clontech。人SFRP-1已经在WO 01/19855中进行过介绍。
包含16个拷贝的T细胞因子(TCF)DNA结合位点的萤光素酶报告基因(16xTCF-luc)构建如下，所述结合位点被5’融合于最小胸腺嘧啶激酶(TK)启动子上。制成包含最初在TCR-α增强子中鉴定的TCF DNA结合位点，Waterman，M.L.等，Genes Dev.，5，656-669，(1991)，CD3-e增强子，van de Wetering M.等，EMBO J.，10，123-132，(1991)，和共同的(consensus)TCF DNA结合位点Korinek，V.等，Science，275，1784-1787，(1997)的寡核苷酸。
这些寡核苷酸为(TCF结合位点被下划线)5’-CTAGCGAGAACAAAGGAGATTCAAAGGAGATCAAAGGAGATCAAAGGACTAGTTC-3’，(SEQ ID NO1)and，5’-TCGAGAACTAGTCCTTTGATCTCCTTTGATCTCCTTTGAATCTCCTTTGTTCTCG-3’(SEQ ID NO2)利用T4多核苷酸激酶将寡核苷酸磷酸化，于80℃加热10分钟并使其退火。退火的双链寡核苷酸于5’和3’末端分别包含NheI和XhoI兼容片段。将退火的寡核苷酸由TK-萤光素酶报告基因的上游克隆入NheI和XhoI消化的pGL3中(Promega Corporation，Madison，WI)以生成4xTCF-luc。通过DNA测序确认TCF结合位点和TK启动子。随后通过连接来自4xTCF-luc的Nhel-BamHl和Spel-BamHl片段而发展出具有TCF DNA结合位点8个拷贝(8xTCF-luc)的质粒。类似地，利用8xTCF-luc制备具有TCF DNA结合位点16个拷贝的质粒。通过测序确证所有质粒。
Flag-标记的人Ror1(Ror1-flag)构建如下。从人子宫RNA中克隆人Ror1并插入pcDNA3.1(+)的Kpnl和Notl位点以获得hRor1-pcDNA3。通过PCR介导的诱变进一步修饰这一克隆。去除3’非翻译区并利用下链引物将flag表位标签(下划线的密码子)加至终止密码子和Notl位点之前cDNA的3’末端5’-TGAGCGCGGCCGCTGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCAGTTCTGCAGAAATCATAGAT-3’(SEQ ID NO14).
上链引物与Ror1的内部区互补，其包含一个BamHl位点5’-CTCATCAGGATCCAATCAGG-3’(SEQ ID NO13).
用BamHI和NotI剪切扩增的DNA并克隆入BamHI和NotI消化的hRor1-pcDNA3。通过测序确证所计划的改变。
Flag-标记的人Ror2(Ror2-flag-pcDNA3)制备如下。包含密码子58-2296的人Ror2的部分克隆获自pCMV-Sport6中的Invitrogen′sIMAGE克隆集合(克隆ID 3146587)并通过测序全部二链进行确证。利用HOB-03-C5RNA作为模板和Ror2特异性引物通过RT-PCR产生3’部分(密码子2297-2832)。上链引物与Ror2的密码子2192-2216互补并包含一个内部Xmnl位点5’-AGTTCCCCAGCCGGCGGCCCCGCTT-3’(SEQ ID NO15)而下链引物包含一个与终止密码子相邻的Xbal位点(粗体字型)5′-TACGATTCTAGATGTCAAGCTTCCAGCTGGACTTGGG-3’(SEQ ID NO16).
用Xmnl和Xbal消化扩增的DNA以获得Ror2的3’端。用Notl和Xmnl将5’部分从IMAGE克隆中切除，将两个片段都克隆入Notl-和Xbal-消化的pcDNA3.1(+)中以获得Ror2-3′-pcDNA3。还利用HOB-03-C5RNA作为模板和Ror2特异性引物通过RT-PCR生产Ror2的开始57个密码子。上链引物在ATG密码子的5’包含Kpnl位点(粗体字型)5’-GACCTTGGTACCATGGCCCGGGGCTCGGCGCT-3’(SEQ ID NO17)；下链引物与Ror2的内部区互补，其包含BamHI位点5’-TCGTTCGGATCCAGAACCTCCAC-3’(SEQ ID NO18).
用Kpnl和BamHI消化扩增的DNA并克隆入Kpnl和BamHI消化的Ror2-3′-pcDNA3中以获得Ror2-pcDNA3。通过测序全部二链确证完整的编码区。随后，通过PCR介导的诱变制备flag-标记的人Ror2。利用下链引物将flag表位标签(下划线的密码子)加至终止密码子(粗体字型)和XbaI位点之前的hRor2cDNA的3’端5’-CTGGAATCTAGATCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAGCTTCCAGCTGGACTTGGGCC-3’(SEQ ID NO20).
上链引物与Ror2的内部区互补，其包含AleI位点5’-GCTCACACCACAGTGGCAGTGG-3’(SEQ ID NO19).
用AleI和XbaI剪切扩增的DNA并克隆入AleI和XbaI消化的Ror2-pcDNA3中。通过测序确证计划的改变。
基于公开的证据(Hikasa H，Shibata M，HiratiI，Taira M，Development，129，5227-5239，(2002))设计图A5中图示的Flag-标记的Ror2′激酶-灭活′突变体(Ror2KD-flag)。根据生产商的说明书利用QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，LaJolla，CA)通过PCR介导的诱变将赖氨酸507，510和512至异亮氨酸的三点突变导入Ror2-Flag-pcDNA3中。包含计划突变(黑体)的上链引物为5’-GGCTGTGGCCATCATAACGCTGATAGACATAGCGGAGGGGC-3’(SEQ ID NO21)而下链引物与上链互补5’-GCCCCTCCGCTATGTCTATCAGCGTTATGATGGCCACAGCC-3’(SEQ ID NO22).
通过测序确证计划的改变后，用BsrGI和EcoRI切出突变的部分并克隆入BsrGI和EcoRI消化的Ror2-flag-pcDNA3中。
通过PCR介导的诱变构建图A5中图示的Flag-标记的Ror2截短突变体(Ror2ΔC-flag)。利用下链引物将flag表位标签(下划线的密码子)导入于密码子1284之后刚好超出跨膜结构域的COOH末端，后跟终止密码子(粗体字型)和XbaI位点5’-GACCTTTCTAGATTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGCACATGCAAACCAAGAAGAAAAGGC-3’(SEQ ID NO24).
上链引物与Ror2的内部区互补，于SphI位点的5’5’-CCTTCTGCCACTTCGTGTTTCCTCT-3’(SEQ ID NO23).
用SphI和XbaI消化扩增的DNA，克隆入SphI和XbaI消化的Ror2-pcDNA3中，并通过测序确证计划的改变。
通过PCR介导的诱变构建V5-和his-标记的人Notch2的胞内结构域(bp 5125-7431)。利用包含EcoRI位点后跟ATG密码子的上链引物通过RT-PCR从人胎儿脑和肺RNA中生产5’末端(碱基5125-5906)5’-CATATGAATTCATGACCAAGCATGGCTCTCTCTGGCTGCCT-3’(SEQ ID NO45)；下链引物与包含BclI位点的Notch2的内部区互补5′-CGCTTGGCAGTTGATCAGTTCTG-3’(SEQ ID NO46).
包含密码子5907-7425的3’部分获自Invitrogen′s IMAGE克隆集合(克隆ID 5529009)并通过PCR进行扩增。包含BclI位点的上链引物为5’-GAATGGTGGCAGAACTGATCAACTG-3’(SEQ ID NO47)；而包含NotI位点的下链引物为5’-GATATGCGGCCGCCGCATAAACCTGCATGTTGTTGTGTG-3’(SEQ ID NO48).
将5’和3’部分于框中克隆入pcDNA3.1/V5-His(Invitrogen)的EcoRI和NotI位点中，将V5和His标签并入蛋白质序列中。
RNA分离以9.8×104细胞/cm2接种HOB细胞，使其于34℃过夜贴附，并转移到39℃的DMEM/F-12培养基中，所述培养基包含0.25％(wt/v)的牛血清白蛋白(Serologicals Proteins，Inc，Kankakee，IL)，1％青霉素-链霉素，2mM glutaMAX-I，50μg/ml抗坏血酸盐-2-磷酸盐(WakoPure ChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)，和10nM亚硫酸氢钠甲萘醌(维生素K3)。四十八小时后，将细胞在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中洗涤并根据生产商的说明书用TRlzol试剂(Invitrogen)分离全细胞RNA。随后，根据生产商的说明利用Oligorex mRNA Maxi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取polyA(+)RNA级分。
瞬时转染和蛋白质免疫印迹将COS-7或U2OS细胞以～80％的汇合密度(confluentdensity)进行接种并在24小时后根据生产商的说明利用FuGENE 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)以40μg的总质粒DNA/143cm2进行转染。24-72h之后，将细胞溶解于裂解缓冲液中(150mM NaCl，50mM Tris-HCI，pH 7.5，1mM EDTA，1％ Triton X100，20mM NaF，2mM钒酸钠，蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)，250μM苯甲磺酰氟)。为了分析HOB-01-09细胞系，在裂解缓冲液中溶解之间将细胞生长到汇合。通过于4℃以500,000xg离心30min澄清提取物。为了评估β-连环蛋白的稳定性，以～80％的汇合密度将U2OS细胞接种于6孔板中并于24h后根据生产商的说明利用6.9μg的总质粒DNA和Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。24h后，通过在低渗缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，200μM MgCl2；蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(二者都来自Sigma))中溶解随后在Dounce匀浆器中经过40次并于4℃以100,000xg离心90min而制备细胞质蛋白提取物。为了进行免疫印迹，在转移到0.45μm硝酸纤维素膜之前将50μg的总细胞裂解物或19μg的细胞质提取物通过SDS-PAGE在变性和还原条件下进行分离(resolve)。将膜在包含0.1％ Tween-20和5％ blotto(SantaCruz)的PBS中进行封闭，随后用一抗(抗-flag表位标签，10μg/ml；抗-his标签，1.4μg/ml；抗-HA标签，2μg/ml；抗-磷酸酪氨酸，2μg/ml；抗-β-连环蛋白1.5μg/ml；抗-β-肌动蛋白1∶5000；抗-V5，3μg/ml；或抗-Ror2，1μg/ml)于25℃温育2小时。在25℃以1∶2000添加了HRP缀合的二抗1小时后，通过增强的化学发光(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，England)，随后暴露于X射线膜来分析膜。在指明时，将膜在剥离缓冲液中(62.5mM Tris-HCI(pH 7.5)，2％SDS，0.1％(β-巯基乙醇)于55℃剥离30分钟并用下一组抗体进行重新探测。
免疫沉淀和体外自磷酸化作用分析将U2OS细胞转染进行蛋白质免疫印迹并且在24小时后在裂解缓冲液中裂解并通过于4℃以500,000xg离心30min进行澄清。将一毫克的总细胞裂解物与50μl的M2 flag亲和性琼脂糖(Sigma)一起于4℃旋转温育1小时。通过离心收集珠，在包含350mM NaCl的裂解缓冲液中洗涤三次并在裂解缓冲液中洗涤三次，在50μl 2x LDS-PAGE缓冲液中与还原剂(Invitrogen)一起煮沸，并通过SDS-PAGE分离溶解的蛋白质。在用每种特异性抗体检测之前，将凝胶转移到0.45μm的硝酸纤维素膜上。
为了进行自磷酸化作用分析，将激酶裂解缓冲液中的3mg总细胞裂解物(无EDTA的裂解缓冲液)与50μl的M2 flag亲和性琼脂糖(Sigma)一起于4℃旋转温育1小时。通过于4℃以500,000xg离心30min将提取物进行澄清。将3mg总细胞裂解物与50μl的M2 flag亲和性琼脂糖(Sigma)一起于4℃旋转温育1小时。通过离心收集珠，在包含350mM NaCl的激酶裂解缓冲液中洗涤三次，在激酶裂解缓冲液中洗涤三次并在激酶反应缓冲液(10mM MgCl2，50mM Tris-HCI pH7.5，1mM二硫苏糖醇)中洗涤两次。取10％的珠进行SDS-PAGE分析并将剩余物重悬于包含1mM ATP和15μCi[γ-32P]ATP的50μl激酶反应缓冲液中。让激酶反应于30℃进行30分钟并通过在1xLDS缓冲液中加上还原剂(Invitrogen)煮沸来终止。通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移到0.45μm的硝酸纤维素膜上并于-80℃以增感屏暴露于X射线膜12小时。在指明时，随后用在蛋白质免疫印迹中所述的抗flag抗体对膜进行探测。
统计学分析数据表示为平均值±标准误差(SE)。利用Student′st检验确定统计学显著性。当p＜0.05时结果被认为是统计学上不同的。
实施例1在人成骨细胞分化晚期Ror2基因表达降低并且受SFRP-1抑制利用基因芯片技术发现Ror2参与人成骨细胞分化。为了这些实验，将代表成骨细胞分化不同阶段(分别为增生性的，早期和成熟成骨细胞的，前骨细胞的，和骨细胞的)的来自proprietary HOB细胞系(HOB-03-C5，HOB-03-CE6，HOB-02-C1，HOB-01-C1和HOB-05-T1)的polyA(+)RNA样品利用富含骨和软骨cDNAs的GLHuman1a芯片进行基因芯片分析。基本如在Hill AA等，Genome Biol.，2，(2001)，Hill AA等，Science，290，809-12，(2000)中所述的制备靶互补RNA(cRNA)并杂交到Affymetrix GeneChips上。将十一种生物素标记的对照cRNA转录物以已知的浓度加入杂交溶液中用于生成平均差异(AD)值和皮摩尔浓度之间的校准曲线。基于平均cRNA长度为1kB的假设将皮摩尔浓度值转换为Frequency Per Million。利用Affymetrix MAS 4.0软件对芯片进行扫描和分析并根据Affymetrix说明书(Santa Clara，CA)计算每个探针组的AD值。随后利用由对照转录物获得的校准曲线用AD值导出每个探针组的Frequency PerMillion值。这一分析鉴定出29种在成骨细胞分化期间变化超过两倍的激酶。
Bodine等之前曾经显示Wnt信号的撷抗剂，SFRP-1，促进成骨细胞凋亡(Bodine，P.V.N.等，WO 01/19855，Bodine，P.V.N.等，The23rd Meeting of the ASBMR.Phoenix，AZ，2001)，并且被工程化为缺少SFRP-1的小鼠(与Lexicon Genetics，Inc.，Woodlands，TX合作制成)具有提高的骨形成，Bodine，P.V.N.等，The 24thMeeting ofthe ASBMR，San Antonio，TX，2002。为了对SFRP-1作用机制作特征鉴定，对来自HOB-01-09前骨细胞的polyA(+)RNA进行基因芯片分析，所述前骨细胞稳定地过表达SFRP-1或对照载体。基因芯片技术还用来研究SFRP-1敲除小鼠与野生型对照相比的转录模式。
比较基因芯片筛选的结果，申请人发现一种激酶的表达不仅在成骨细胞分化期间改变，还受到SFRP-1表达的调控。这是Ror2激酶，它的mRNA表达随着成骨细胞向骨细胞表型发展而降低(图1A)，同时SFRP-1的表达提高。通过RT-PCR确认Ror2 mRNA水平的变化(图lA)。根据生产商的说明书利用ABI PRISM 7700 Sequence DetectionSystem(Applied Biosystems，Foster City，CA)将用于基因芯片分析的相同PolyA(+)RNA样品进行实时RT-PCR。所用引物和探针的序列列于表1中。
表1在人Ror1的实时RT-PCR分析中所用的引物和探针
在人Ror2的实时RT-PCR分析中所用的引物和探针
探针获自Applied Biosystems并且用报告物荧光染料FAM进行标记。用对18SrRNA特异的报告物荧光染料VlC标记的引物和探针购自Applied Biosystems并包括在反应中作为内部对照。反转录酶步骤于48℃进行30分钟并且将cDNA于下列条件扩增40个循环95℃15秒和60℃1分钟。利用在User Bulletin#2(Applied Biosystems)中所述的标准曲线方法计算每种基因的mRNA量并标准化为18SrRNA的表达。
还利用RT-PCR确证Ror2在原始的人成骨细胞中的表达(图1A)。在人成骨细胞中Ror2表达水平类似于在HOB模型中早期成骨细胞中观察到的水平。HOB-01-09细胞中SFRP-1的过表达导致Ror2mRNA水平的强烈抑制，而SFRP-1破坏的小鼠的颅盖骨比野生型对照表达两倍多的Ror2信息(图2)。Ror家族唯一的其它已知成员Rorl的表达也在成骨细胞分化期间降低(图1B)，但似乎并不受SFRP-1调控。事实上，Ror1水平低于野生型以及SFRP-1-无效小鼠二者的颅盖骨中的检测极限并且在HOB-01-09细胞中SFRP-1过表达之后不改变(图2)。
DeChiara等，Nature Genetics，24，271-4，(2000)和Takeuchi等，Genes to Cells，5，71-8，(2000)报道在小鼠中破坏Ror2基因导致广泛的骨骼异常。此外，Masiakowski等，Journal of BiologicalChemistry，267，26181-90，(1992)报道Ror1和2激酶具有与SFRP-1同源的Frizzled-相关的结构域，其介导与Wnt蛋白的结合(图3)。Roszmusz等，Journal of Biological Chemistry，276，18485-90，(2001)报道在Ror1的Frizzled-相关的结构域中二硫键的定位与SFRP-1相同。这些数据提示Ror2参与成骨细胞分化并且它参与Wnt和SFRP-1信号途径。
实施例2在人成骨细胞分化的起始阶段期间和小鼠成骨细胞分化的起始和晚期阶段期间Ror2基因的表达增强为了评估在人成骨细胞分化的早期阶段期间Ror激酶的表达，对多能人间质干细胞(hMSC，BioWhittaker，Inc.，San Diego，CA)的成骨分化进行分析。利用包含10％热灭活胎牛血清(BioWhittaker)、1％青霉素-链霉素和2mM glutaMAX-I(生长培养基)的无酚红DMEM培养基在5％CO2/95％加湿空气培养箱中于37℃维持hMSC细胞系。将hMSC以992细胞/孔接种于96孔板中并且于24小时后(0天)通过加入成骨培养基(0.1uM地塞米松，0.05mM抗坏血酸和10mM β-甘油磷酸酯于生长培养基中)诱导骨发生21天。每7天，分离总细胞RNA并通过如实施例1中所述的实时RT-PCR分析利用表1中所列的引物和探针评估Ror基因的表达。如图4A中所示，Ror2表达在分化时期显著提高，到第21天观察到超过300倍的诱导。相反地，Ror1表达在整个分化时期内没有变化(图4A)。
此外，对在小鼠MC3T3-E1成骨细胞样细胞的抗坏血酸诱导的分化期间Ror的表达进行监测。在包含10％热灭活胎牛血清、1％青霉素-链霉素和2mM glutaMAX-I的MEM培养基中于5％CO2/95％加湿空气培养箱中37℃维持MC3T3-E1细胞。以3×106细胞/皿将细胞接种于100mm塑料培养皿中并且在72小时后(汇合时，0天)通过加入添加了10mM β-甘油磷酸酯和抗坏血酸(第一次加料(feeding)加12.5μg/ml而随后的加料加25μg/ml)的生长培养基来诱导分化。每48小时换培养基。每3天，分离全细胞RNA并实施如实施例1中所述的实时RT-PCR，除了利用对啮齿类GAPDH(Applied Biosystems)特异的引物和VIC标记的探针作为内对照。
用作Ror分析的引物和探针的序列列于表2中。
表2在小鼠Ror1的实时RT-PCR分析中所用的引物和探针
在小鼠Ror2的实时RT-PCR分析中所用的引物和探针
通过RT-PCR用表3中所列的引物和探针分析如下两种特异性成骨细胞标记的表达来监测MC3T3分化为成骨细胞表型的过程碱性磷酸酶(AP)和骨钙素(OC)。
表3在小鼠碱性磷酸酶的实时RT-PCR分析中所用的引物和探针
在小鼠骨钙素的实时RT-PCR分析中所用的引物和探针
图4B中所示的AP和OC表达的时间过程显示MC3T3细胞在成骨培养基中6天后达到特征为最高水平AP表达的成熟成骨细胞表型并且在9天后进入基质矿化阶段，OC升高。Ror2表达在整个分化时间过程中提高(图4B)。相反地，Ror1表达在相同的时间过程上逐渐降低并在第19天降至其起始值的大约20％(图4B)。
因而，在人成骨细胞中，Ror2表达在分化的早期提高，在增殖性前成骨细胞中达到峰值并且随后在末期骨细胞分化过程中下降。在鼠成骨细胞中，Ror2表达在整个分化早期和晚期都提高。
实施例3人Ror1和Ror2克隆与表达与Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)合作克隆人Ror1和Ror2，并分别表示为SEQ ID NO3和5。Ror1序列具有下列取代T590C(沉默)，T1580G(沉默)，T1963C(M518T)，和A3142G(K911R)。Ror2序列与US 5,843,749中公开的序列有两个核苷酸不同C2088T(沉默)和G2455A(V8191)。由于5’UTRs长度的变化US 5,843,749中的排号不同并且能够通过对Ror1减去35和通过对Ror2添加199而获得。
制备对于全长Ror1和Ror2以及对于两种Ror2突变体的表达质粒(图5A)。在第一种Ror2突变体中(Ror2KD)，将位置504(在推定的ATP结合结构域中)，507和509上的3个赖氨酸用异亮氨酸替代并且在第二种突变体中(Ror2ΔC)删除了包括酪氨酸激酶同源区的完整细胞质部分。全部四种表达质粒都包含一个COOH-末端flag表位标签用于蛋白质的鉴定。蛋白质免疫印迹显示Ror1-flag，Ror2flag，和Ror2KD-flag在U2OS骨肉瘤细胞中高水平表达，而Ror2ΔC-flag显示更低水平的表达(图5B)。Ror2-flag和Ror2KD-flag二者都能够在flag亲和性琼脂糖上从U2OS提取物中沉淀出来(图5C，下部版块)。不过，Ror2KD突变体在体外自磷酸化测试中不能使其自身磷酸化(图5C，上部版块)确认了它已经丧失了其激酶活性。如在一般方法中所述的实施Flag免疫沉淀和体外自磷酸化测试。
实施例4Ror2激酶抑制Wnt-3，但是增强Wnt-1活性为了评估Ror2激酶是否参与Wnt信号，实施一种萤光素酶报告物测试。以20,000细胞/孔将U2OS细胞接种于96孔板中并于24小时后在不含抗生素的培养基中利用0.16μl/孔的Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)根据生产商的说明进行转染。每孔使用下列DNAs的组合，用pcDNA3.1(+)调节到230ng180ng 16xTCF-luc(在一般方法的质粒部分进行了描述)；5ngWnt-1-HA或Wnt-3-HA；15ngSFRP-1；5ngpCMV；指定量的Ror1-flag，Ror2-flag或Ror2ΔC-flag。加入DNA后4小时更换培养基，并在24小时后，在吸出培养基和于PBS中漂洗后，将细胞裂解并对提取物利用Luciferase Assay Reagent(Promega)测试萤光素酶活性和利用Galacto-Light(AppliedBiosystems)测试β-半乳糖苷酶(β-gal)活性。通过MicroLumat LB 96P发光计(EG & GBerthold，Bandoora，Australia)测量光发射，对萤光素酶为超过10秒的整合而对β-gal为5秒。将对于萤光素酶获得的光发射值标准化为β-gal的值。在U2OS细胞与Wnt-3-HA构建体共转染后萤光素酶报告基因的表达被刺激超过20倍，所述基因包含16拷贝的于5’融合到最小胸腺嘧啶激酶启动子上的Wnt-反应性TCF结合位点(图6A)。用Ror2-flag共转染剂量依赖性地抑制了Wnt-3-诱导的启动子激活，IC50＝5.8ng/96孔板的孔，最大抑制68％(图6A)。IC50指在只存在Wnt时观察到的实现50％最大活性抑制所需的试剂量。Ror2-flag自身对于启动子活性没有影响(图6A)。SFRP-1，Wnt信号的强抑制剂，抑制Wnt-3-HA活性，并且SFRP-l和Ror2-flag一起对它更进一步地抑制。相反地，当相同的启动子由Wnt-1-HA激活时，Ror2-flag增强Wnt-1活性，伴有两阶段的剂量反应(图6B)。加入SFRP-1克服了这种增强并将萤光素酶活性抑制到与只存在Wnt-1-HA时相同的水平(图6B)。
实施例5Ror1激酶抑制Wnt-3，但对Wnt-1活性没有作用为了评估Ror1对于Wnt途径活性的作用，如实施例4中所述进行萤光素酶报告物分析。如图7A中所示，Rorl-flag本身对于TCF启动子没有活性，但通过Wnt-3-HA抑制信号，IC50＝5ng/孔，最大抑制37％.。所检查的以任何剂量加入的Ror1-flag都对Wnt-1-HA-刺激的转录没有影响(图7B)。
实施例6Ror2的酪氨酸激酶活性对于Wnt-1的增强和对于Wnt-3活性的大部分抑制是必需的为了研究Ror2激酶活性是否对于Wnt信号的调节是必需的，利用没有酪氨酸激酶活性的Ror2KD点突变如实施例4中所述进行萤光素酶报告物分析(见图5C)。这种突变体并不增强Wnt-1至TCF启动子的信号(图8A)并且仅仅微弱地抑制启动子的Wnt-3诱导的激活(图8B)。
利用缺少完整胞质结构域的Ror2突变体(Ror2ΔC-flag)获得类似的结果。Ror2ΔC-flag并不增强Wnt-1-HA活性(图9B)并且也丧失了其在U2OS细胞中抑制Wnt-3信号的部分能力(图9A)。因而，Ror2的酪氨酸激酶活性对于Wnt-1信号的增强和对于Wnt-3活性的大部分抑制是必需的。
实施例7Ror2和Ror2KD结合Wnt-1和Wnt-3Ror2在不同的Wnts之间区别为了评估Ror2对Wnts可能的直接结合，如在一般方法中所述的实施免疫沉淀实验，所述实验利用以Ror2-flag和HA-标记的Wnts1和3进行共转染的COS-7或U2OS细胞。图10显示Wnt-1和Wnt-3二者都在与Ror2的复合物中免疫沉淀。相互作用的特异性为这样的事实所证明，即抗-flag不能在缺失Ror2-flag共表达时免疫沉淀Wnts。失去激酶活性并不影响Ror2结合Wnts的能力，因为Wnt-1和Wnt-3二者都在与Ror2KD的复合物中免疫沉淀(图10)。
为了说明Ror2-Wnt相互作用的特异性，实施一种免疫沉淀实验，所述实验利用一组不同的Wnt蛋白(图11)。在此实验中，在缺失或存在Ror2时，在COS7细胞中过表达十种不同的HA-标记的Wnts。如图11中所示，观察到Ror2最优地结合Wnt3a，随后是Wnt3，4，2，1，5b和5a。Ror2仅仅微弱地结合Wnt6和7a，尽管COS7细胞中的Wnt6表达没有其它Wnts高(图11，下部版块)。Ror2并不在我们的实验条件下结合Wnt7b。因而，Ror2在其与Wnts的相互作用中显示特异性。
实施例8Wnt-1和Wnt-3的过表达对Ror2自磷酸化没有影响当Ror2免疫沉淀出U2OS提取物时，它有能力在体外使其自身磷酸化(见图5C)，可能是因为它固有的酪氨酸激酶活性。为了确定Wnts的共表达是否影响Ror2自磷酸化的程度，在存在Wnt-1，Wnt-3或对照质粒的情况下用Ror2瞬时转染U2OS细胞。24小时后分离全细胞提取物。在flag亲和性琼脂糖上免疫沉淀Ror2-flag并且如在一般方法(General Methods)中所述地进行体外自磷酸化测试。图12A显示一种例示性的放射自显影，后接相同膜的蛋白质印迹。在图12B中，利用Quantity One 1-D图像分析软件(Bio-Rad，Hercules，CA)对至少三个独立实验的结果进行量化并将放射性信号标准化为存在于每个反应中的免疫反应性Ror2的总量。在缺失或存在Wnts 1和3时Ror2自磷酸化没有显著差别。
实施例9Ror2抑制Wnt诱导的β-连环蛋白稳定化为了说明在经典的Wnt信号途径中Ror2于何处作用，对Ror2激酶影响Wnt介导的胞浆β-连环蛋白稳定化的能力进行评估。在Wnt1或3转染入U2OS细胞后，β-连环蛋白的细胞质水平分别可重复性地增长了1.7-或2.8倍(图13)。用量逐渐增加的Ror2进行共转染剂量依赖性地抑制Wnt1和Wnt3二者使细胞质β-连环蛋白稳定化的能力。令人感兴趣的是，激酶灭活的Ror2突变体与Ror2一样有力地抑制β-连环蛋白稳定化，表明激酶活性对于这种作用不是必需的。因而Ror2诱导的Wnt3对TCF启动子信号的抑制可以至少部分地归因于β-连环蛋白的降解。但是，Ror2必定通过在β-连环蛋白稳定化的下游作用而增强Wnt3对TCF启动子的信号作用。而且Ror2信号的这一其它途径必须克服Ror2诱导的β-连环蛋白水平降低。
实施例10Ror2在Wnt信号途径中功能的模型图14显示Ror2调节经典Wnt信号途径的工作模型。Ror2结合Wnt1和Wnt3并将它们从其FZ受体中分离，导致β-连环蛋白的降解增强。这一过程并不需要Ror2受体的酪氨酸激酶活性。此外，结合Ror2的Wnt1激活Ror2激酶依赖性信号途径，其最终导致TCF启动子活性的增强。Wnt结合似乎并不调节Ror2激酶活性的事实提示Wnt1起始对Ror2活性所必需的某些其它事件，即受体二聚体化，并且Ror2自磷酸化的背景水平足以行使功能。Wnt3结合似乎并不激活这一另外的信号途径并且Ror2抑制Wnt3对TCF启动子的活性。但是，在β-连环蛋白下游的另外的激酶依赖性事件对于这种抑制是必需的，因为激酶灭活性的Ror2拮抗β-连环蛋白的稳定化，但失去其抑制TCF启动子的能力。因此，Ror2对Wnt信号途径的净效应由在细胞中表达的特定Wnts所决定。
实施例11鉴定U2OS细胞中Ror2结合配偶体通过免疫沉淀，随后进行质谱分析来鉴定Ror2结合配偶体。为此，首先将用pcDNA3.1(+)或Ror2-flag瞬时转染的U2OS细胞的蛋白质提取物在抗flag亲和性琼脂糖上进行免疫沉淀并在不同百分比的SDS-PAGE凝胶上分离。银染鉴定了几条只存在于包含Ror2-flag的提取物中的条带(在图15A-C中用箭头标记)，可能包括在100kDa左右的Ror2-flag本身。重要的是，由箭头标示的几条带并不被抗flag抗体所识别(比较图15A和D)，表明这些蛋白有别于Ror2-flag或其蛋白分解片段。而且，这些蛋白质中的某一些被抗磷酸酪氨酸抗体识别(图15E)。如下对免疫沉淀的Ror2-flag和对照样品进行质谱(MS)分析。将SDS加至从免疫沉淀树脂洗脱的样品中至0.05％(w/v)。随后对样品相对于0.05％的SDS进行透析并通过蒸发将体积减少至原始体积的大约1/50。随后将样品应用于10％的tricine胶(Invitrogen)上并对胶进行银染。从胶上切下薄片，横跨每个样品的整个泳道。用DTT还原每个凝胶薄片中的蛋白质，用碘乙酰胺烷基化，并利用ProGestInvestigator(Promega)进行胰蛋白酶的凝胶内消化。通过蒸发减少消化样品的体积并且随后恢复至大约20μl，包括0.1M乙酸和2％乙腈。
随后将10微升每种样品加载到装了Pieofrit针头的10cm×75μmC18反相柱上(New Objectives；Woburn，MA)，其与LCQ Deca XP加质谱仪(Finnigan；San Jose，CA)连接在一起。通过扫描m/z范围375到1200来记录肽质量。以数据依赖性的方式获得片段离子谱(串联质谱分析(MS/MS))，其中每次MS扫描都后接对来自MS扫描的前三种最强离子的连续性MS/MS实验。利用Sequest程序(Finnigan)相对于NCBI的非冗余数据库对得到的MS/MS数据进行检索。
被发现由Ror2-flag特异性免疫沉淀的蛋白质列于表4中。
表4潜在的Ror2相互作用蛋白
实施例12Ror2与Notch2受体的细胞内结构域相互作用为了确认Ror2与Notch2之间的相互作用，如在一般方法中所述地制备标记了COOH末端V5和his标签的包含人Notch2细胞内结构域的构建体(Notch21C，bp 5125-7431)。将Notch2lC-V5-His和Ror2-Flag共转染入U2OS细胞，并如在一般方法中所述地将1mg的总细胞裂解物免疫沉淀于M2 flag亲和性琼脂糖上并在SDS-PAGE上进行分离。
图16显示Notch2lC与Ror2免疫沉淀成复合物。通过抗flag不能在缺失Ror2-flag共表达的情况下免疫沉淀Notch2lC的事实显示了相互作用的特异性。
实施例13制备稳定过表达Ror2和Ror1的HOB-01-09前骨细胞为了研究Ror激酶对成骨细胞生理学的效应，我们在一种我们的人成骨细胞系中稳定过表达Ror2、Ror2-Flag和Ror1-Flag。我们使用具有低水平内源Ror2的HOB-01-09前骨细胞(类似于图1中的HOB-01-C1前骨细胞)。之前曾经介绍过HOB-01-09细胞
(Bodine，P.V.N.(Wyeth Corp.)Composition comprising asecreted frizzled related protein-useful for the treatment of e.g.osteoarthritis.PCT#WO200119855-A2；2000)，该细胞用ATCC保藏。pcDNA3.1(+)中的Ror2、Ror2-Flag和Ror1-flag或空的pcDNA3.1(+)通过电穿孔转染入HOB-01-09细胞中。对每一次转染，都向PBS中的8×106细胞加入10μg的质粒DNA并在冰上温育5分钟。以下列参数100μF，48Ohms，150V(脉冲持续时间-10msec)，利用ECM 600电穿孔仪(BTX)在2mm间隙的比色杯(BTX，SanDiego，CA)中对混合物进行电穿孔。将细胞于冰上冷却5分钟，转移到150mm的培养瓶中，并利用包含10％热灭活胎牛血清、1％青霉素-链霉素和添加了500μg/ml G418(Invitrogen)的2mM glutaMAX-I的DMEM/F-12培养基(HOB生长培养基)在5％CO2/95％加湿空气培养箱中于34℃维持，直到形成G418抗性细胞的分离集落。将集落用胰蛋白酶消化并每孔一个地转移到96孔板上。将集落于34℃生长于添加了125μg/ml G418的HOB生长培养基中并通过实时RT-PCR和蛋白质印迹评估Ror表达的水平。这一操作产生了几种细胞系，所述细胞系在与过表达空白载体的HOB-01-09细胞比较时具有3-5倍Ror2，Ror2-Flag和Ror1-Flag mRNA过表达(图17A)。这些细胞系也显示出合适大小的免疫活性蛋白的表达(图17B)。我们推论这些细胞系过表达Ror2和Ror1并且能够用来评估Ror激酶对成骨细胞表型的效应，包括对凋亡、碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌的效应。
实施例14确证Ror2为骨质疏松药物靶通过体外和体内方法确证Ror2为骨质疏松药物靶。制备在哺乳动物细胞中特异性破坏Ror2表达的siRNA分子。在具有相对高水平Ror2mRNA的早期成骨细胞中过表达siRNA并监测Ror2破坏对细胞分化和/或存活的作用。进行基因芯片分析以鉴定成骨细胞中由Ror2表达调控的基因。基于Ror2表达模式及其与SFRP-1和Wnt信号的关系，Ror2的下调增强成骨细胞分化并且也促进凋亡。一种补充方法包括在不具有可检测水平Ror2mRNA的前骨细胞中过表达Ror2-flag，并监测这些细胞的分化状态。体外确证后，通过生成转基因小鼠以及通过生成条件性Ror敲除小鼠进行Ror2作为骨质疏松靶目标的体内确证，所述转基因小鼠以组织和/或时间依赖的方式条件性地过表达Ror2。
实施例15高通量筛选鉴定Ror2调控剂将Ror2磷酸化作用作为高通量筛选(HTS)的基础以鉴定小分子激动剂或撷抗剂。通过体外靶确证的发现确定是否寻求Ror2的活化剂或抑制剂并筛选受体激动剂。据认为受体酪氨酸激酶活化的一般机制是通过受体寡聚化和自磷酸化(参见，Forrester，W.C.，Cellular &Molecular Life Sciences，59，83-96，(2002)，以及其中的参考文献)，所以能够预期调节受体磷酸化的分子调节其活性。制成包含COOH末端GST标签的人Ror2表达质粒并生产细菌细胞中的蛋白质并结合到gluthatione涂布的多孔板上。将未结合的蛋白质洗去后，通过例如抗磷酸酪氨酸抗体，随后利用化学发光剂进行检测来测定Ror2对酪氨酸的磷酸化水平。随后在存在ATP和二价阳离子的情况下对化合物文库筛选增强Ror2磷酸化水平的分子。这是一种不含细胞的HTS，一般比基于细胞的筛选更加有力和易于建立，但是可能产生“假阳性”，即在完整细胞中无效的化合物。或者，可以利用其它的基于细胞以及不基于细胞的方法建立HTS。这些包括，但不限于，在TCF启动子萤光素酶报告物测试中对化合物筛选其撷抗Ror2破坏Wnt-3信号途径的能力的可能性。
实施例16确认影响Ror2激酶活性的组合物随后将在HTS中改变Ror2激酶活性的化合物继续进行其它体外分析。第一种台式确认测试包括在哺乳动物细胞系中过表达Ror2和用候选化合物进行处理，随后用抗磷酸酪氨酸抗体进行蛋白质免疫印迹。这种测试还用于测定被确认化合物对于调节Ror2激酶活性的能力和效力。其它的测试被设计用来测量这些化合物以Ror2依赖性或非依赖性的方式阻抑人成骨细胞死亡或促进成骨分化的能力，以及测定这些化合物对于这些效应的能力和效力。其它的测试还用来测定这些化合物的细胞选择性(例如，通过利用Hela或其它表达Ror2的细胞系)以及这些化合物对于Ror2以及对另一种家族成员Ror1的特异性。还采用其它测试来测定这些化合物是否调控下游的信号事件，所述事件涉及凋亡(例如，caspase活性)、分化(例如，碱性磷酸酶活性或骨钙素表达)，或Wnt活性(例如，通过TCF-萤光素酶测试的β-连环蛋白水平和功能)。最后，可以在多种骨形成、骨质减少或骨质疏松症的动物模型(例如，卵巢切除的大鼠或小鼠)中利用在这些体外测试中呈现适当活性的化合物。可以想像抑制成骨细胞/骨细胞凋亡或促进成骨细胞分化的化合物将会通过延长这些细胞的寿命并由此提高合成和矿化的骨基质的量和/或维持骨的完整性而成为一种合成代谢性骨试剂。
实施例17高通量筛选鉴定Ror2调控剂将Ror2磷酸化用作高通量筛选(HTS)的基础以鉴定小分子激动剂或撷抗剂。通过体外靶确证的发现确定是否寻求Ror2的活化剂或抑制剂并筛选受体激动剂。据认为受体酪氨酸激酶活化的一般机制是通过受体寡聚化和自磷酸化(参见，Forrester，W.C.，Cellular &Molecular Life Sciences，59，83-96，(2002)，以及其中的参考文献)，所以能够预期调节受体磷酸化的分子调节其活性。制成包含COOH末端GST标签的人Ror2表达质粒并生产细菌细胞中的蛋白质并结合到gluthatione涂布的多孔板上。将未结合的蛋白质洗去后，通过例如抗磷酸酪氨酸抗体随后利用化学发光剂进行检测来测定Ror2对酪氨酸的磷酸化水平。随后在存在ATP和二价阳离子的情况下对化合物文库筛选增强Ror2磷酸化水平的分子。这是一种不含细胞的HTS，一般比基于细胞的筛选更加有力和易于建立，但是可能产生“假阳性”，即在完整细胞中无效的化合物。或者，可以利用其它的基于细胞以及不基于细胞的方法建立HTS。这些包括，但不限于，在TCF启动子萤光素酶报告物测试中对化合物筛选其撷抗Ror2破坏Wnt-3信号途径的能力的可能性。
实施例18确认影响Ror2激酶活性的组合物随后将在HTS中改变Ror2激酶活性的化合物继续进行其它体外分析。第一种台式确认测试包括在哺乳动物细胞系中过表达Ror2和用候选化合物进行处理，随后用抗磷酸酪氨酸抗体进行蛋白质免疫印迹。这种测试还用于测定被确认化合物对于调节Ror2激酶活性的能力和效力。其它的测试被设计用来测量这些化合物以Ror2依赖性或非依赖性的方式阻抑人成骨细胞死亡或促进成骨分化的能力，以及测定这些化合物对于这些效应的能力和效力。其它的测试还用来测定这些化合物的细胞选择性(例如，通过利用Hela和其它表达Ror2的细胞系)以及这些化合物对于Ror2以及对另一种家族成员Ror1的特异性。还采用其它测试来测定这些化合物是否调控下游的信号事件，所述事件涉及凋亡(例如，caspase活性)、分化(例如，碱性磷酸酶活性或骨钙素表达)，或Wnt活性(例如，通过TCF-萤光素酶测试的β-连环蛋白水平和功能)。最后，可以在多种骨形成、骨质减少或骨质疏松症的动物模型(例如，卵巢切除的大鼠或小鼠)中利用在这些体外测试中呈现适当活性的化合物。可以想像抑制成骨细胞/骨细胞凋亡或促进成骨细胞分化的化合物将会通过延长这些细胞的寿命并由此提高合成和矿化的骨基质的量和/或维持骨的完整性而成为一种合成代谢性骨试剂。
序列表<110>WyethBodine，Peter V.N.
Billard，Julia<120>调节骨相关活性的新方法<130>AM101291<150>US 60/463,364<151>2003-04-16<150>US 60/501,340<151>2003-09-09<160>48<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>55<212>DNA<213>智人<400>1ctagcgagaa caaaggagat tcaaaggaga tcaaaggaga tcaaaggact agttc 55<210>2<211>55<212>DNA<213>智人<400>2tcgagaacta gtcctttgat ctcctttgat ctcctttgaa tctcctttgt tctcg 55<210>3<211>3458<212>DNA<213>智人<400>3ggtaccggtc cggaattccc gggatggagc gtggagagct ggagcagccg ccaccgccgc 60cgccgaggga gccccgggac ggcagcccct gggcgcaggg tgcgctgttc tcggagtccg 120acccagggcg actcacgccc actggtgcga cccggacagc ctgggactga cccgccggcc 180caggcgaggc tgcagccaga gggctgggaa gggatcgcgc tcgcggcatc cagaggcggc 240caggcggagg cgagggagca ggttagaggg acaaagagct ttgcagacgt ccccggcgtc 300ctgcgagcgc cagcggccgg gacgaggcgg ccgggagccc gggaagagcc cgtggatgtt 360ctgcgcgcgg cctgggagcc gccgccgccg ccgcctcagc gagaggagga atgcaccggc 420cgcgccgccg cgggacgcgc ccgccgctcc tggcgctgct ggccgcgctg ctgctggccg 480cacgcggggc tgctgcccaa gaaacagagc tgtcagtcag tgctgaatta gtgcctacct 540catcatggaa catctcaagt gaactcaaca aagattctta cctgaccctt gatgaaccaa 600tgaataacat caccacgtct ctgggccaga cagcagaact gcactgcaaa gtctctggga 660atccacctcc caccatccgc tggttcaaaa atgatgctcc tgtggtccag gagccccgga 720ggctctcctt tcggtccacc atctatggct ctcggctgcg gattagaaac ctcgacacca 780
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ggcgtggtga ccaaggacca gcccctgagc atgatcttca gctactgttc gcacggcgac 1680ctccacgaat tcctggtcat gcgctcgccg cactcggacg tgggcagcac cgatgatgac 1740cgcacggtga agtccgccct ggagcccccc gacttcgtgc accttgtggc acagatcgcg 1800gcggggatgg agtacctatc cagccaccac gtggttcaca aggacctggc cacccgcaat 1860gtgctagtgt acgacaagct gaacgtgaag atctcagact tgggcctctt ccgagaggtg 1920tatgccgccg attactacaa gctgctgggg aactcgctgc tgcctatccg ctggatggcc 1980ccagaggcca tcatgtacgg caagttctcc atcgactcag acatctggtc ctacggtgtg 2040gtcctgtggg aggtcttcag ctacggcctg cagccctact gcgggtattc caaccaggat 2100gtggtggaga tgatccggaa ccggcaggtg ctgccttgcc ccgatgactg tcccgcctgg 2160gtgtatgccc tcatgatcga gtgctggaac gagttcccca gccggcggcc ccgcttcaag 2220gacatccaca gccggctccg agcctggggc aacctttcca actacaacag ctcggcgcag 2280acctcggggg ccagcaacac cacgcagacc agctccctga gcaccagccc agtgagcaat 2340gtgagcaacg cccgctacgt ggggcccaag cagaaggccc cgcccttccc acagccccag 2400ttcatcccca tgaagggcca gatcagaccc atggtgcccc cgccgcagct ctacatcccc 2460gtcaacggct accagccggt gccggcctat ggggcctacc tgcccaactt ctacccggtg 2520cagatcccaa tgcagatggc cccgcagcag gtgcctcctc agatggtccc caagcccagc 2580tcacaccaca gtggcagtgg ctccaccagc acaggctacg tcaccacggc cccctccaac 2640acatccatgg cagacagggc agccctgctc tcagagggcg ctgatgacac acagaacgcc 2700ccagaagatg gggcccagag caccgtgcag gaagcagagg aggaggagga aggctctgtc 2760ccagagactg agctgctggg ggactgtgac actctgcagg tggacgaggc ccaagtccag 2820ctggaagctg actacaagga cgacgatgac aagtga 2856<210>10<211>951<212>PRT<213>智人<400>10Met Ala Arg Gly Ser Ala Leu Pro Arg Arg Pro Leu Leu Cys Ile Pro1 5 10 15Ala Val Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser Val Ser Arg Thr Ser20 25 30Gly Glu Val Glu Val Leu Asp Pro Asn Asp Pro Leu Gly Pro Leu Asp35 40 45Gly Gln Asp Gly Pro Ile Pro Thr Leu Lys Gly Tyr Phe Leu Asn Phe50 55 60Leu Glu Pro Val Asn Asn Ile Thr Ile Val Gln Gly Gln Thr Ala Ile65 70 75 80
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<223>用于构建Ror1-flag的上链引物<400>13ctcatcagga tccaatcagg20<210>14<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror1-flag的下链引物<400>14tgagcgcggc cgctgctcac ttgtcatcgt cgtccttgta gtccagttct gcagaaatca 60
tagat65<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2-flag的上链引物<400>15agttccccag ccggcggccc cgctt 25<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2-flag的下链引物<400>16tacgattcta gatgtcaagc ttccagctgg acttggg 37<210>17<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2-flag的上链引物<400>17gaccttggta ccatggcccg gggctcggcg ct 32<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2-flag的下链引物<400>18tcgttcggat ccagaacctc cac23<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2-flag的上链引物<400>19gctcacacca cagtggcagt gg 22<210>20<211>61<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于构建Ror2-flag的下链引物<400>20ctggaatcta gatcacttgt catcgtcgtc cttgtagtca gcttccagct ggacttgggc 60c 61<210>21<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2KD-flag的上链引物<400>21ggctgtggcc atcataacgc tgatagacat agcggagggg c 41<210>22<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2KD-flag的下链引物<400>22gcccctccgc tatgtctatc agcgttatga tggccacagc c 41<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2deltac-flag的上链引物<400>23ccttctgcca cttcgtgttt cctct 25<210>24<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建Ror2deltac-flag的下链引物<400>24gacctttcta gattacttgt catcgtcgtc cttgtagtcg cacatgcaaa ccaagaagaa 60aaggc 65<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定人Ror1的正向引物<400>25gtcgactagc actggccatg t 21
<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定人Ror1的反向引物<400>26catgtgtggt agtaaaggaa tatttgc 27<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定人Ror1的探针<400>27agcttgccct catcaggatc caatcag 27<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定人Ror2的正向引物<400>28cgtacgcatg gaactgtgtg a21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定人Ror2的反向引物<400>29caagcgatga ccagtggaat t21<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定人Ror2的探针<400>30ccctcgtgta gtccccgaga cagca25<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠Ror1的正向引物
<400>31ccccgatttc ccaattacat g21<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠Ror1的反向引物<400>32gccaatgaaa ccacggatct 20<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠Ror1的探针<400>33cccgagccaa gggattacac ccc 23<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠Ror2的反向引物<400>34atccaagacc tggacacaac aga 23<210>35<211>20<212>DNA<213>鉴定小鼠Ror2的反向引物<400>35gaaccccagt ggcagtgatg 20<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠Ror2的探针<400>36tcagcccgtt ggtagccaca cactg25<210>37<211>20<212>DNA<213>鉴定小鼠碱性磷酸酶的正向引物<400>37gagacccacg gtggagaaga 20
<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠碱性磷酸酶的反向引物<400>38ggaggcatac gccatcacat 20<210>39<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠碱性磷酸酶的探针<400>39cggcgtccat gagcagaact acattcc 27<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠骨钙素的正向引物<400>40cggccctgag tctgacaaa 19<210>41<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠骨钙素的反向引物<400>41gccggagtct gttcactacc tt 22<210>42<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鉴定小鼠骨钙素的探针<400>42ccttcatgtc caagcaggag ggca 24<210>43<211>2000<212>DNA<213>智人<400>43gggctgggag tctggagtcc atgacctgct gggacatact ttgggctgca ttttttcccc 60
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<223>用来构建Notch2IC 5′部分的下链引物(1-782)<400>46cgcttggcagttgatcagtt ctg 23<210>47<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用来构建Notch2IC 3′部分的上链引物(783-2307)<400>47gaatggtggc agaactgatc aactg 25<210>48<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用来构建Notch2IC 3′部分的下链引物(783-2307)<400>48gatatgcggc cgccgcataa acctgcatgt tgttgtgtg 39
权利要求
1.一种包含编码Ror多肽或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体的多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸是在骨细胞中可操作的启动子控制之下。
2.权利要求1的表达盒，其中Ror多肽是Ror1多肽。
3.权利要求1的表达盒，其中Ror多肽是Ror2多肽。
4.权利要求1的表达盒，其中所述启动子与所述编码序列异源。
5.权利要求1的表达盒，其中所述启动子为骨特异性启动子。
6.权利要求5的表达盒，其中所述骨特异性启动子为大鼠3.6kb I型胶原蛋白或大鼠1.7kb骨钙素启动子。
7.权利要求1-6任一项的表达盒，其中所述启动子为可诱导的启动子。
8.一种包含权利要求1-7任一项的表达盒的载体。
9.权利要求8的载体，其中所述载体是病毒载体。
10.权利要求9的载体，其中所述病毒载体选自反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、牛痘病毒载体和疱疹病毒载体。
11.权利要求1的表达盒，其中所述表达盒进一步包含多腺苷酸化信号。
12.一种包含表达盒的宿主细胞，所述表达盒包含编码Ror多肽或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体的多核苷酸，其中所述多核苷酸是在真核细胞中可操作的启动子控制之下，所述启动子与所述多核苷酸异源。
13.权利要求12的宿主细胞，其中Ror多肽是Ror1多肽。
14.权利要求12的宿主细胞，其中Ror多肽是Ror2多肽。
15.一种调节骨相关活性的组合物，包含有效量的Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体。
16.权利要求15的组合物，其中Ror分子是Ror1分子。
17.权利要求15的组合物，其中Ror分子是Ror2分子。
18.权利要求15的组合物，进一步包含可药物的载体。
19.权利要求15的组合物，其中骨相关活性为成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。
20.一种筛选试剂的方法，该方法包括(a)将试剂与Ror分子组合；和(b)检测所述试剂对Ror活性的影响；其中检测到的Ror活性的降低或提高是试剂为骨相关试剂的指征。
21.权利要求20的方法，其中Ror活性降低或提高是通过Ror诱导的Wnt-3信号抑制的降低或提高而检测的。
22.权利要求20的方法，其中Ror分子为Ror1分子和Ror活性为Ror1活性。
23.权利要求20的方法，其中Ror分子为Ror2分子和Ror活性为Ror2活性。
24.权利要求20的方法，其中Ror分子为Ror2分子和Ror活性的降低或提高是通过Ror2诱导的Wnt-1信号的激活的降低或提高而检测的。
25.权利要求20的方法，其中Ror分子为Ror多肽而Ror活性的降低或提高是通过Ror自磷酸化的降低或提高而检测的。
26.权利要求25的方法，其中Ror多肽为Ror1多肽而Ror活性为Ror1活性。
27.权利要求25的方法，其中Ror多肽为Ror2多肽而Ror活性为Ror2活性。
28.一种筛选试剂的方法，该方法包括(a)将试剂与包含可操作地连接至报告基因上的Ror启动子序列的分离的细胞组合；和(b)检测所述试剂对报告物活性的影响；其中通过报告物活性测定的Ror启动子活性的降低或提高的检测到是试剂为骨相关试剂的指征。
29.权利要求28的方法，其中Ror启动子为Ror1启动子。
30.权利要求29的方法，其中Ror1启动子为人Ror1启动子。
31.权利要求28的方法，其中Ror启动子为Ror2启动子。
32.权利要求31的方法，其中Ror2启动子为小鼠Ror2启动子。
33.一种筛选调节Ror多肽对结合配偶体的结合的试剂的方法，该方法包括(a)将Ror多肽与Ror结合配偶体在存在试剂的情况下相接触；(b)将Ror多肽与Ror结合配偶体在存在对照或不存在所述试剂时相接触；和(c)通过对步骤(a)中所述Ror多肽与所述结合配偶体的结合和步骤(b)中所述Ror多肽与结合配偶体的结合进行比较来选择调节Ror多肽与Ror结合配偶体的结合的试剂。
34.权利要求33的方法，其中Ror多肽为Ror2多肽而Ror结合配偶体为Ror2结合配偶体。
35.权利要求34的方法，其中Ror2结合配偶体选自ADP/ATP载体蛋白、UDP-葡萄糖神经酰胺葡基转移酶样1，14-3-3蛋白β/α、14-3-3蛋白γ、核糖体结合糖蛋白1、精氨酸N-甲基转移酶1、细胞凋亡易感性蛋白、NOTCH2蛋白和人骨骼肌LIM-蛋白3。
36.一种在受试者中调节骨相关活性的方法，包括向受试者给药调节靶Ror分子表达或活性的试剂。
37.权利要求36的方法，其中所述试剂包含一种或多种Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体。
38.权利要求36的方法，其中所述试剂包含一种或多种Ror分子结合配偶体或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体。
39.权利要求36的方法，其中靶Ror分子为Ror1分子。
40.权利要求36的方法，其中靶Ror分子为Ror2分子。
41.权利要求36的方法，其中靶Ror分子活性为酪氨酸激酶活性。
42.权利要求36的方法，其中骨相关活性为成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。
43.权利要求36的方法，其中所述试剂选自抗体、小分子、肽、寡肽和多肽。
44.权利要求36的方法，其中所述试剂包含对Ror基因特异性的反义核酸或siRNA分子并且其中反义核酸或siRNA分子识别并结合核酸，该核酸编码一种或多种Ror多肽或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体。
45.权利要求44的方法，其中Ror基因为Ror1基因而Ror多肽为Ror1多肽。
46.权利要求44的方法，其中Ror基因为Ror2基因而Ror多肽为Ror2多肽。
47.权利要求36的方法，其中所述试剂通过结合Ror结合配偶体而调节靶Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体的表达和/或活性。
48.权利要求47的方法，其中所述试剂通过结合Ror结合配偶体而抑制靶Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体的表达和/或活性。
49.权利要求47的方法，其中所述试剂通过结合Ror结合配偶体而增强靶Ror分子或同源物或衍生物或片段或变异体或突变体的表达和/或活性。
50.如权利要求47-49的任一项中的方法，其中靶Ror分子为Ror2分子而Ror结合配偶体为Ror2结合配偶体.
51.权利要求50的方法，其中Ror2结合配偶体选自ADP/ATP载体蛋白、UDP-葡萄糖神经酰胺葡基转移酶样1，14-3-3蛋白β/α、14-3-3蛋白γ、核糖体结合糖蛋白1、精氨酸N-甲基转移酶1、细胞凋亡易感性蛋白、NOTCH2蛋白和人骨骼肌LIM-蛋白3。
52.权利要求36的方法，其中所述试剂调节Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体结合Ror结合配偶体。
53.权利要求52的方法，其中所述试剂增强Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体结合Ror结合配偶体。
54.权利要求52的方法，其中所述试剂增抑制Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体结合Ror结合配偶体。
55.如权利要求52的任一项中的方法，其中Ror分子为Ror2分子而Ror结合配偶体为Ror2结合配偶体.
56.权利要求55的方法，其中Ror2结合配偶体选自ADP/ATP载体蛋白、UDP-葡萄糖神经酰胺葡基转移酶样1，14-3-3蛋白β/α、14-3-3蛋白γ、核糖体结合糖蛋白1、精氨酸N-甲基转移酶1、细胞凋亡易感性蛋白、NOTCH2蛋白和人骨骼肌LIM-蛋白3。
57.权利要求36的方法，其中将所述试剂施用于培养物中的分离细胞。
58.权利要求57的方法，其中所述细胞为原代成骨细胞、成骨细胞起源的永生化细胞系或非成骨细胞起源的永生化细胞系。
59.权利要求58的方法，其中成骨细胞起源的永生化细胞系选自HOB、U2OS和SaOS-2细胞。
60.权利要求36的方法，其中将所述试剂施用于非人转基因动物。
61.权利要求60的方法，其中所述转基因动物为小鼠。
62.权利要求60的方法，其中将所述试剂施用于非人敲除动物。
63.权利要求36的方法，其中所述受试者为脊椎或无脊椎生物。
64.权利要求36的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
65.权利要求64的方法，其中所述哺乳动物为人。
66.一种在受试者中调节Wnt-1和Wnt-3活性的方法，包括以有效调控Wnt-1和Wnt-3活性的量给药调节靶Ror2分子表达或活性的试剂。
67.一种鉴定调节骨相关活性的试剂的方法，包括(a)在细胞中表达Ror分子或利用内源性Ror表达；(b)将所述细胞与所述试剂接触；和(c)监测Ror分子的表达或活性，其中在存在所述试剂时Ror分子表达或活性的增加或降低将所述试剂鉴定为调节骨相关活性的。
68.权利要求67的方法，其中Ror分子为Ror1分子。
69.权利要求67的方法，其中Ror分子为Ror2分子。
70.权利要求67的方法，其中Ror分子活性为酪氨酸激酶活性。
71.权利要求67的方法，其中骨相关活性为成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。
72.权利要求67的方法，其中所述试剂选自抗体、小分子、肽、寡肽、核酶和多肽。
73.权利要求67的方法，其中所述试剂包含对Ror基因特异性的反义核酸或siRNA分子并且其中反义核酸或siRNA分子识别并结合核酸，该核酸编码一种或多种Ror多肽或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体。
74.权利要求73的方法，其中Ror基因为Ror1基因而Ror多肽为Ror1多肽。
75.权利要求73的方法，其中Ror基因为Ror2基因而Ror多肽为Ror2多肽。
76.权利要求67的方法，其中所述试剂通过结合Ror结合配偶体而调节Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体的表达和/或活性。
77.权利要求76的方法，其中Ror分子为Ror2分子而Ror结合配偶体为Ror2结合配偶体。
78.权利要求77的方法，其中Ror2结合配偶体选自ADP/ATP载体蛋白、UDP-葡萄糖神经酰胺葡基转移酶样1，14-3-3蛋白β/α、14-3-3蛋白γ、核糖体结合糖蛋白1、精氨酸N-甲基转移酶1、细胞凋亡易感性蛋白、NOTCH2蛋白和人骨骼肌LIM-蛋白3。
79.权利要求67的方法，其中所述试剂调节Ror分子或其同源物或衍生物或片段或变异体或突变体结合Ror结合配偶体。
80.权利要求79的方法，其中Ror分子为Ror2分子而Ror结合配偶体为Ror2结合配偶体。
81.权利要求67的方法，其中所述细胞为原代成骨细胞、成骨细胞起源的永生化细胞系或非成骨细胞起源的永生化细胞系。
82.权利要求81的方法，其中成骨细胞起源的永生化细胞系选自HOB、U2OS和SaOS-2细胞。
83.权利要求67的方法，其中将所述试剂进一步给药于脊椎生物以监测Ror分子的表达或活性，其中在所述试剂存在时Ror分子的表达或活性的提高或降低将所述试剂鉴定为调节骨相关活性的。
84.权利要求83的方法，其中所述脊椎生物为哺乳动物。
85.权利要求83的方法，其中所述脊椎生物为非人转基因动物。
86.一种鉴定调节Wnt信号途径的试剂的方法，包括筛选一种或多种能够调节Ror分子表达或活性的试剂，其中所述能够调节Ror分子表达或活性的试剂是调节Wnt信号途径的试剂。
87.一种将生物活性分子连接到表达Wnt多肽的细胞上的方法，所述方法包括将细胞与结合生物活性分子的Ror2多肽相接触，并且允许Wnt多肽和所述Ror2多肽彼此结合，从而将所述生物活性分子连接到所述细胞上。
88.权利要求87的方法，其中Wnt多肽选自Wnt-1和Wnt-2。
89.一种对受试者筛选骨相关病症的方法，包括下列步骤测量在受试者中Ror分子的表达并确定在受试者中所述Ror多肽与其在正常受试者中相比的相对表达，或与其在进行过骨相关病症治疗后的同一受试者中的活性相比的相对表达。
90.一种鉴定参与骨形成的基因的方法，包括a)在细胞中过表达Ror分子，b)监测基因表达模式的变化和c)确定哪个基因受Ror表达调控，由此鉴定参与骨形成的基因。
91.一种鉴定调节Wnt信号途径的基因的方法，包括a)在细胞中过表达Ror分子，b)监测基因表达模式的变化和c)确定哪个基因受Ror表达调控，由此鉴定调节Wnt信号途径的基因。
92.一种利用Ror2作为标记鉴定正在增殖的人前成骨细胞的方法，包括确定在人成骨细胞中Ror2基因的表达，其中提高的Ror2表达将所述细胞鉴定为正在增殖的前成骨细胞。
全文摘要
本发明涉及通过调节Ror分子在受试者中调节骨相关活性。本发明进一步涉及进行骨相关病症的筛选、诊断和疗法开发的组合物以及方法。
文档编号G01N33/566GK1809588SQ200480016956
公开日2006年7月26日 申请日期2004年4月14日 优先权日2003年4月16日
发明者P·V·N·博丁, J·比亚尔 申请人:惠氏公司