专利名称：亲和性物质的测定方法
技术领域：
本发明涉及利用了载体粒子的凝集反应的亲和性物质的测定方法及装置。
背景技术：
作为检测或测定生物学的特异反应性物质存在的方法，目前一直使用着例如酶免疫测定法或放射线免疫测定法等。这些方法具有高的灵敏度，且精度也高。但是，由于使用酶或放射性同位素作为标记，故试剂不稳定。另外，在利用放射性同位素时，由于保管及保存上受限，故在测定时要求认真的考虑或技术。因此，要求更简便的测定方法。由于这些方法在测定时需要较长的时间，故难以应对紧急的检查。在这样的背景下，高灵敏度且迅速的测定方法研究开始盛行。
1970年以来，以载体粒子的凝集为指标测定免疫学反应的分析方法被实用化。该方法可通过光学性测定载体粒子的凝集程度来进行定量的分析。利用胶乳粒子作为载体粒子的光学测定免疫学粒子凝集反应的方法称为胶乳凝集比浊法(Latex Agglutination Turbidimetry)。这些分析方法的反应温度通常在37～45℃的范围内进行，通过利用搅拌片等进行搅拌，进行特异性凝集反应。此时，测定(反应)所需要的时间约为10～20分，比酶免疫测定法或放射线免疫测定法快。另一方面，在测定灵敏度或测定范围方面，可以说不如酶免疫测定法等好。
胶乳凝集法的粒度分布测定法也是公知的(非专利文献1，Cambiaso et al.，J.Immunol.Methods 18，33，1977，非专利文献2，松沢等，化学和工业，第36卷，第4号，1982)。胶乳凝集比浊法测定粒子悬浊液的光透过度，与此相对，在粒度分布测定法中测定分散后的各个粒子的状态或数量。在Cambiaso等的报告中，在37℃下使抗体键合于粒子直径0.8μm的胶乳的试剂与抗原反应20分钟。对反应后的粒子数量进行计数，根据凝集造成的粒子数量的减少程度测定抗原。粒子数量利用以激光散射光为原理的计数器进行测定。
另一方面，松沢等将使抗体与粒子直径1μm的胶乳粒子键合的试剂与抗原反应6小时。在反应后，利用电气阻抗法测定平均粒子容积，测定抗原。但是，实用化且普及了的只有使用了鞘流的激光散射法的PAMIA系统(SYSMEX公司。PAMIA中使用粒子直径0.78μm的胶乳粒子。在45℃下反应15分钟后，对胶乳粒子进行计数，进行免疫测定。PAMIA与胶乳凝集比浊法相比，具有高的灵敏度，但一般认为当与称作放射免疫测定法(RIA)或酶免疫测定法(EIA)的高灵敏度免疫测定相比时，则灵敏度不好。
在胶乳凝集比浊法中，通常使用粒子直径0.05～0.6μm的胶乳粒子。在胶乳凝集粒度分布解析法的情况中，这样小的粒子容易受到测定干扰物质的影响。例如，在血液或尿等体液中，类脂质、蛋白、血球成分等共存。这些共存物质难以与载体粒子识别。因此，存在不能正确地对载体粒子计数的情况，为避免这些测定干扰物质的影响，使用了较大的粒子。另一方面，如松沢等所述，当构成1μm左右的粒子直径时，由于难以产生凝集反应，故使用了0.8μm左右的胶乳粒子。另外，松沢等在计量平均粒子容积时使用的小孔(细孔)的口径为30μm。该尺寸容易受到小孔堵塞的影响。但是，利用比其大的口径的小孔不能检测0.8～1μm的粒子。
另外，为促进生物学的特异性凝集反应，且容易地检测到形成的凝集块，对反应系统施加交流电压的方法是公知的(专利文献1/特开平7-83928号)。该方法是利用载体粒子的生物学的特异性凝集反应检出或测定生物学的特异反应性物质存在的方法，对该反应系统施加交流电压，使其在10mM以上的盐共存下达到5～50V/mm的电场强度。
当载体粒子置于电场中时，其沿电场直线地进行排列(珠链状排列)。之后，当将电场停止时，则直线排列的载体粒子进行再分散。在珠链状排列化时，当生物学的特异反应性物质存在时，则在将电场停止后，也不会引起载体粒子的再分散，也确认了珠链状排列后的载体存在。上述测定方法利用该现象。即，在电场中，促进生物学的特异反应性物质的反应。而且，如若在将电场停止后，使载体粒子再分散，则可检测到反应生成物。
发明内容
在上述公知技术中，生物学的特异反应性物质的反应以载体粒子的凝集为指标进行检测。载体粒子的凝集通过对二维图像数据的解析进行检测。具体地说，首先，在载玻片上以预定间隔粘接电极，在该电极间(元件)滴下将试剂和检测体混合形成的反应液，由盖玻片覆盖该部分，对电极施加电压，给予电场。在将电场停止后，利用显微镜等观察电极间的反应液中的载体粒子的凝集块。
但是，因为这种试验操作复杂，所以成为机械化的障碍。另外，在用显微镜观察载玻片的方法中，难以维持高灵敏度或再现性。例如，可容纳于载玻片这样的有限空间内的反应液为微量。即，样品与载体粒子的数量都受限。其结果是，难以期待足够的测定灵敏度。另外，在微量的反应液中，为将样品和载体粒子的量的比例或反应温度等反应条件保持一定，要求高的技术。因此，难以以高的水平维持再现性。
而且，公知的方法在检测凝集粒子的方法中也有问题。在公知的方法中，凝集粒子是基于用显微镜观察到的图像信息进行计数。即，基于二维信息观察凝集粒子。但是，在二维信息中，由于各种原因而不能正确检测凝集块的情况已经明确。
如果从相对珠链状排列的长度方向为直角的方向观察例如键合成珠链状排列状的凝集块，则不能正确地评价其大小。当从与长度方向相同的方向观察珠链状排列状的凝集块时，仅看到与未凝集的粒子几乎相同大小。相反，即使在粒子不形成凝集块的情况下，当处于粒子之间看起来相互重叠的位置关系时，可能作为凝集块进行计数。二维信息仅表示可从特定方向捕捉到的粒子的形态。因此，当粒子由于观察的方向而表示不同的形态的情况下，不能根据二维信息正确地评价粒子的大小。这样，基于二维信息的粒子的计数方法成为限制测定精度的主要原因。
本发明以改善这样的问题点为目的。更具体地说，本发明的课题在于提供机械化容易，且测定精度容易维持的测定方法。
本发明者为解决上述课题，对载体粒子的凝集块的检测方法反复进行了探讨。其结果是，通过以其三维信息为指标对粒子或凝集块进行计数，测定精度得到改善，完成了本发明。即，本发明涉及以下的测定方法及测定装置。
一种包含以下工序的亲和性物质的测定方法，
(1)将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子、和测定对象亲和性物质混合，并施加电压脉冲的工序；或者(1’)将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质与凝集试剂成分混合，并施加电压脉冲的工序中，所述载体粒子通过凝集试剂凝集，并且利用测定对象亲和性物质阻碍其凝集的工序。
(2)在进行工序(1)后，将通过与作为测定对象的亲和性物质的键合所形成的载体粒子的凝集块以及不与作为测定对象的亲和性物质键合而未形成凝集块的载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的工序；或者(2’)在进行工序(1’)后，将通过与凝集试剂键合所形成的载体粒子的凝集块以及利用其与作为测定对象的亲和性物质键合而阻碍凝集的载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的工序，以及(3)在进行工序(2)或(2’)后，基于凝集块的形成程度以及未形成凝集块的载体粒子的程度的任一种或两种，决定测定对象物质的程度的工序。
如[1]所述的方法，在工序(2)或(2’)中，物理性地测定凝集块或载体粒子的三维信息。
如[2]所述的方法，用于物理性地测定三维信息的方法是从由电气阻抗法、激光衍射散射法以及三维图像解析法构成的组中选择的任一种方法。
如[1]所述的方法，电压脉冲是交流电压脉冲。
如[1]所述的方法，其特征在于，在工序(2)或(2’)中，在将电场停止后，对载体粒子进行计数。
如[5]所述的方法，在工序(2)或(2’)中，还包含在将电场停止后，进一步附带地将载体粒子进行稀释的工序。
如[1]所述的方法，其特征在于，给予多次电压脉冲。
如[7]所述的方法，包含下述工序，在施加电压脉冲后，将载体粒子进行分散，然后施加下一个电压脉冲。
如[7]所述的方法，多次电压脉冲是不同方向的电压脉冲。
如[1]所述的方法，载体粒子的平均粒径为1μm以上。
如[10]所述的方法，载体粒子的平均粒子直径为1μm～20μm。
一种亲和性物质的测定装置，其包含以下装置，(a)对键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质进行保持的空间，(b)用于对保持在所述空间的载体粒子施加电压脉冲的电极，及(c)将保持于所述空间的载体粒子通过凝集所产生的凝集块以及未凝集的所述载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的装置。
如[12]所述的装置，将保持于(c)所述空间的载体粒子的凝集所产生的凝集块以及未凝集的所述载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的装置，是用于物理性地测定三维信息的装置。
如[13]所述的装置，用于物理测定三维信息的装置，是利用从由电气阻抗法、激光衍射散射法以及三维图像解析法构成的组中选择的任一种方法，对三维信息进行物理测定的装置。
如[12]所述的装置，具有用于施加至少两组电压脉冲的电极。
如[12]所述的装置，其特征在于，具有驱动用于施加电压脉冲的电极的装置，并且给予相对于所述空间不同方向的电场。
在本发明中，所谓的亲和性物质及与亲和性物质具有键合活性的键合配对含有可构成键合反应的所有的物质的组合。即，在某种物质和某种物质键合时，一种为亲和性物质，另一种为键合配对。本发明中的亲和性物质及键合配对既可以为天然物质，也可以为人工合成的化合物。另外，亲和性物质及键合配对既可以为精制的物质，也可以允许杂质共存。另外，亲和性物质及键合配对也可以存在于细胞或病毒表面。
在本发明中，作为亲和性物质和键合配对的键合反应的例子，例如可表示如下所示的反应。构成这些反应的物质都可以作为本发明的亲和性物质键合配对。
抗原或半抗原和抗体的反应(免疫反应)
具有相辅的碱排列的核酸间的杂化外源凝集素和其受体的反应外源凝集素和糖链的反应配位体和受体的反应DNA和转录调节因子的反应在上述键合反应中，作为本发明中优选的键合反应，例如可示出免疫反应。作为构成免疫反应的抗原，可示出如下所示的物质。这些抗原不仅是抗原分子本身，也可以是其碎片或存在于细胞表面的状态。另外，这些物质是抗原物质的例子，当然，本发明也可以应用在除此之外的抗原物质上。例如，将可基于胶乳、血球等作为载体使用的免疫学的凝集反应进行测定的抗原性物质都可以作为本发明中的亲和性物质。
肿瘤标记AFP、CEA、CA19-9、PSA等凝固纤维蛋白溶解作用系统标记蛋白质C、蛋白质S、抗凝血酶(AT)III、FDP、FDP-D-二聚物等感染症标记CRP、ASO、HBs抗原等激素甲状腺刺激激素(TSH)、催乳激素、胰岛素等组织成分肌红蛋白、肌球蛋白、血红蛋白其它DNA等核酸等抗原性物质和将其指认的抗体可以以任一种作为亲和性物质，并且将另一种作为键合配对利用。在本发明中所谓的亲和性物质是在将该物质作为测定对象时称为亲和性物质。另一方面，所谓键合配对是指为测定亲和性物质而可作为探针使用的相对该亲和性物质具有键合活性的物质。因此，在测定抗原时，可将抗体作为键合配对来利用。相反，在测定抗体时，可将识别该抗体的抗原作为键合配对来利用。例如，基于将胶乳、血球等作为载体使用的免疫学凝集反应可测定的抗体都可以作为本发明的亲和性物质。对HBs(B型肝炎病毒表面抗原)、HBc(B型肝炎病毒核抗原)、HCV(C型肝炎)、HIV(AIDS病毒)、TP(梅毒)等的抗体利用免疫学的凝集反应进行测定。
用于以载体粒子的凝集作为指标测定亲和性物质和键合配对的反应的若干反应原理都是公知的。这些反应原理都可以在本发明中应用。下面例举以载体粒子的凝集作为指标的利用亲和性物质和键合配对反应的测定原理。
直接凝集反应利用测定对象物质和载体粒子上的键合配对的反应检测载体粒子的凝集。例如，利用作为键合配对的抗体测定抗原分子的情况属于该原理。或者相反，以键合了抗原的载体粒子的凝集作为指标，测定作为亲和性物质的抗体的情况也属于该原理。在直接凝集反应中，通常凝集程度和作为测定对象物质的亲和性物质的量成正比。即，在凝集块的形成程度高时，亲和性物质的程度(即浓度)高。相反，在未形成凝集块的载体粒子的程度高时，亲和性物质的程度(即浓度)低。
阻止凝集的反应称为半抗原的低分子抗原难以制作介由载体粒子的凝集所需要的抗原的交联结构。为此，利用直接凝集反应原理不能检测半抗原。因此，利用将多个分子的半抗原或含有该表位的碎片键合于载体的聚半抗原、和其与载体粒子上的抗体的键合的凝集反应。聚半抗原由于可将多个抗体分子交联，故将载体粒子凝集。但是，当半抗原存在时，聚半抗原和抗体的反应被阻止，且载体粒子的凝集被阻止。凝集阻止的程度与半抗原的存在成正比。换言之，测定对象物质的量和凝集反应的程度成反比。即，在凝集块的形成程度高时，亲和性物质的程度(即浓度)低。相反，在未形成凝集块的载体粒子的程度高时，亲和性物质的程度(即浓度)高。
被分类为半抗原的测定对象抗原例如有如下成分激素雌激素、雌二醇试剂茶碱在本发明中，为了根据阻止凝集反应的原理测定半抗原，可以使相对半抗原键合有抗体的载体粒子凝集的成分是必要的。在本发明中，将可使对半抗原键合了抗体的载体粒子凝集的成分称为凝集试剂。凝集试剂定义为具有与抗体特异性的亲和性并且具有通过与抗体键合将载体粒子交联的作用的试剂。如前所述的聚半抗原在半抗原的测定时可以作为凝集试剂使用。
不管是直接凝集反应，还是阻止凝集反应，对预先含有一定量的亲和性物质的标准试剂都以相同的反应系统进行测定，测定凝集块或未凝集的载体粒子的程度，可制作标准曲线或回归式。如若通过测定样品得到的凝集块的形成程度及未凝集的载体粒子的程度中的哪一个适用于标准曲线或回归式，则可决定样品中亲和性物质的程度。
在本发明中，键合配对与载体粒子结合使用。本发明的载体粒子例如有胶乳粒子、陶土、金胶体、红血球细胞、明胶、核蛋白体等。胶乳粒子可使用在凝集反应中通常使用的物质。聚苯乙烯类胶乳、聚乙烯甲苯类胶乳、聚甲基丙烯酸酯类胶乳粒子是公知的。优选的粒子载体是聚苯乙烯类胶乳粒子。也可以使用通过具有官能团的单体的共聚将官能团引入胶乳粒子表面的胶乳粒子。例如，具有-COOH、-OH、-NH2、-SO3等官能团的胶乳粒子是公知的。可在具有官能团的胶乳粒子上化学结合键合配对。
载体粒子的平均粒径例如在胶乳粒子的情况下优选0.5～20μm。当平均粒径为0.5μm以下或20μm以下时，难以形成珠链状排列，不优选。载体粒子的平均粒径例如是乳胶粒子的情况下，具体地为2～10μm，优选1～10μm，更优选2～5μm。另外，通过使用极化大的椭圆形粒子，也可以使用更小的载体粒子。
这样，与公知的胶乳凝集比浊法中的载体粒子为0.05～0.6μm的情况相比，在本发明中，可利用1μm以上的大尺寸的粒子。通过利用施加电压脉冲的工序促进凝集反应，其结果是，即使为大尺寸的粒子，也可以在短时间内进行充分的反应。载体粒子大具有如下所述的优点。首先，可将用于测量粒子的小孔尺寸增大。其结果是难以堵塞小孔。另外，通过增大载体粒子，与体液中含有的测定干扰物质的识别变得容易。其结果是可提高测定精度。
键合配对和粒子载体可利用各自原材料对应的方法进行键合。从业者可适当选择两者的键合方法。例如，可在胶乳粒子上物理吸附抗原或抗体、或它们的碎片等蛋白质。在表面具有官能团的胶乳粒子上可化学键合可与该官能基共价键合的取代基。例如，可在具有-COOH的胶乳上键合蛋白质的-NH2。
键合了键合配对的载体粒子可根据需要进行封闭。具体地说，通过由非活性蛋白质处理载体粒子表面，可防止相对于载体粒子表面的非特异性蛋白质的键合。作为非活性蛋白质可使用牛血清蛋白或脱脂乳粉等。另外，为提高载体粒子的分散性，可向分散剂中添加表面活性剂或糖类。另外，为防止微生物的繁殖，也可以向粒子载体中添加抗菌剂。
本发明包含对含有亲和性物质和载体粒子的反应液施加电压脉冲的工序。使载体粒子在电场中排列进行凝集反应的方法是公知的(特开平7-83928号)。即，通过对含有亲和性物质和载体粒子的反应液施加电压脉冲，可使载体粒子沿电场排列。
此时，在利用阻止凝集反应的原理的情况下，使亲和性物质和载体粒子在凝集试剂的共存下排列。凝集试剂可在载体粒子和测定对象亲和性物质接触后接触。或通过在预先混合测定对象亲和性物质和凝集试剂后添加载体粒子，可同时使三种成分接触。
电压脉冲可利用交流成分或直流成分。也可以将两者任意组合。反应液由于容易产生电解，故优选交流电压。交流电压可使用方形波、矩形波、或正弦波等。可根据反应液(试剂)的离子强度任意设定交流电压的电源频率。施加交流电压使其以峰值表示时得到5～50V/mm的电场强度。当电场强度小于5V/mm时，难以引起载体珠链状排列化，因此，凝集反应的促进不充分。当电场强度超过50V/mm时，反应液容易引起电解，难以测定凝集反应。更优选施加交流电压以得到10～20V/mm的电场强度。交流的频率优选10KHz～10MHz的频率。更优选50KHz～1MHz的频率。
在本发明中，电压脉冲是指具有通常振幅从稳定状态变化，即使仅持续有限的时间就返回到原来的状态的波或波形的电压。交流电压是代表性的电压脉冲。交流电压是电压平均值为0的时间的周期函数。例如，具有正弦波、矩形波、方形波、或锯齿波等的电压振幅明显地是周期性的，属于交流电压。通常，在交流电压中，在任意一周期，正电位侧的面积和负电位侧的面积相等，两者合计为0。各面积是利用横轴(电位差位为0)和上侧的曲线、或下侧的曲线规定的面积。在本发明中，为防止反应液的电解，施加电压脉冲。因此，不会引起反应液的电解，或即使引起电解也可以抑制在实际上不干扰反应的程度的情况下，也可以使用正电位和负电位合计不为0的电压脉冲。
在本发明中，方形波或矩形波的电压脉冲重复正电位/电位差0/负电位反复，并且正电位及负电位的至少一个叫做电压包含一定的状态的电源。而且，方形波或矩形波的电位差从0状态到下一个状态之间的时间是脉冲宽度。另外，方形波是指，在将电压的变化画成纵轴为电压、横轴为时间的图表时，大致形成四角形的形状的电压脉冲。四角形包括正方形和长方形。与此相对，矩形波是不包括正方形的长方形状的电压脉冲。因此，矩形波属于方形波。在本发明中，优选的脉冲宽度通常为50μsec以下。更优选的脉冲宽度可示例0.1～10μsec。
构成方形波或矩形波的电位差为0的状态的时间没有限制。一般地说电位差为0是在正电位和负电位之间过渡的瞬间。但是，本发明也可以使用更长时间持续电位差为0的状态的电压脉冲。例如，在使具有0.1～10μsec的脉冲宽度的正电位/负电位反复期间，0.1～100μsec的电位差可包含0的状态。
在本发明中，可对反应液从任意方向施加电压脉冲。例如，也可以施加多个不同方向的电压脉冲。具体地说，如图6所示，可将两组电极组合，对反应液施加电压脉冲。或者，可通过使电极相对于反应液移动，给予不同方向的电压脉冲。例如，可通过使电极旋转，给予任意角度的电压脉冲。移动的电极数既可以为一组，也可以使两组以上的电极移动。
在本发明中，图6表示将正交的可给予电场的两组电极组合的情况下形成的珠链状排列的结构。在图6的例子中，如若交替施加2个方向的电压脉冲，则载体粒子聚束于电压脉冲交叉的区域(图6下右侧)。或者，如若交替进行电压脉冲的施加和分散，则交替形成沿电极3-3间的电压脉冲的珠链状排列(图6下中央)、和沿电极3’-3’间的电压脉冲的珠链状排列(图6下左侧)。这种立体的珠链状排列的形成促进亲和性物质之间的反应。
在本发明中，多组电极的配置是任意的。在电极间的距离短的情况下，形成的珠链状排列变短。另一方面，当电极的距离长时，则施加的电压变大。另外，实际上通过电极的配置左右反应空间的结构。因此，一般的电极间的距离通常为0.01mm～数十mm。在一般的免疫学的粒子凝集反应中，优选0.1mm～5mm，例如可在0.5mm～3mm的范围内配置电极。
图5表示电极间的距离和此时反应液的体积的例子。以0.5～1mm的间隔配置电极，通过将元件的长度设为10mm～20mm，可容纳一般免疫学的凝集反应的反应液量即2.5～20μL的反应液。另外，在利用多组电极的情况下，优选在各组合之间使电极的距离和高度一致。
利用对单克隆抗体进行敏化反应后的载体粒子凝集的检测抗原性物质的方法是公知的。单克隆抗体通常识别抗原上单一的表位。因此，为使载体粒子凝集，而通常需要利用多种单克隆抗体。但是，只要使用单克隆抗体，在原理上可与抗原1个分子结键合的抗体数量(即载体粒子数量)不能超过所利用的单克隆抗体的种类。这成为限制基于使用了单克隆抗体的载体粒子的凝集反应的分析方法的检测灵敏度的原因之一。根据本发明，如若能够施加来自多个方向的电压脉冲，则由于施加方向的变化会使载体粒子和抗原分子的接触机会增大，其结果可期待检测灵敏度的提高。
在利用载玻片的公知的方法中，施加电压的方向受到了限制。另外，只要利用使用了显微镜等的观察方法，则不能利用立体的反应空间。与此相对，在本发明中，由于通过测定未凝集的粒子和凝集了的粒子的三维信息分析凝集率，故反应空间的形状没有限制。将通过亲和性物质的键合而键合的两个以上的粒子集合体称作凝集块(aggregate)。构成凝集块的粒子数量没有限制。多个粒子既可以直链状键合，也可以晶格状(矩阵状)结合。无论形成何种形态，只要处于多个粒子键合后的状态，则其为凝集块。因此，实现施加有来自多个不同方向的电压脉冲是本发明可以实现的最大优点。
通常，由于反应系统中载体粒子的浓度越高，越容易形成珠链状排列，因此越促进凝集。但在另一方面，伴随载体粒子的浓度上升，在生物学的奇异反应性物质不存在的情况下，进行再分散时的载体粒子的凝集率(背景)有变大的倾向。在根据二维信息观测凝集粒子的公知的方法(特开平7-83928号)中，载体粒子的浓度越高，未凝集的粒子被作为凝集粒子错误地捕捉的可能性越高。在粒子浓度高的情况下，由于粒子接近，故单一的粒子重叠，与因凝集而形成的粒子块的识别变得困难。因此，为特别地识别凝集块，必须使粒子浓度保持为低浓度。具体地说，特开平7-83928号中公开的反应系统中的载体粒子的浓度在例如为胶乳粒子的情况下，优选0.01～1重量％，更优选0.025～0.5重量％，特别优选0.05～0.1重量％。这样的粒子浓度在珠链状排列化中未必是最优的条件。即，在根据二维信息对凝集块进行计数的方法中，通过牺牲粒子浓度来实现凝集块的特别识别。
本发明由于基于三维信息检测凝集粒子，故可以与粒子浓度无关地对凝集块进行特别地识别。其结果是，可给予形成珠链状排列的最适宜条件。即，考虑测定对象亲和性物质和具有键合活性的键合配对的平衡，可决定载体粒子的浓度。例如，即使选择高的载体粒子的浓度，凝集块也会被特别地检测到。在本发明中，通常反应系统中载体粒子的浓度例如在胶乳粒子的情况下优选0.01～5重量％，更优选0.1～2重量％。该浓度范围是基于二维信息的方法的倍～10倍。最适宜的载体粒子的浓度可对应载体粒子的大小或测定对象亲和性物质的测定灵敏度等适宜调节。
在本发明中，可向反应液中添加促进凝集反应的盐。例如，通过以10mM以上较高的浓度添加盐，可促进凝集反应。但是，当盐的浓度在反应系统中以600mM以上的浓度存在时，由于容易引起反应液的电解，故不优选。更优选的盐的浓度为10～300mM，最优选的盐的浓度为25～150mM。生物体样品自身可能含有促进凝集反应的盐的情况下，可以调整试剂的盐浓度，使反应液中的最终盐浓度达到上述范围。另外，在使用直流成分作为电压脉冲的情况下，由于在约6mM的盐浓度的反应液中也引起电解，故在盐存在下难以测定生物学的特异性凝集反应。
本发明的盐可从促进生物学的特异性凝集反应的物质中选择。例如有氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯化铵，但不限于此。在10mM、25℃的水溶液中摩尔电导率表现为100cm2/(Ω·mol)以上的值的盐优选作为用于本发明的盐。更具体地说，例如氯化钠、氯化钾、及氯化铵等可作为优选的盐表示。
在本发明中，包含亲和性物质的检测物没有限制。即，可将含有作为测定对象的亲和性物质的任意样品作为检测物利用。例如，血液样品、从咽喉等局部采取的样品、唾液、咳痰、尿、或便是代表性的生体样品。另外，从生物体采取的所有的生物体材料可作为生物体物质测定用的检测物在本发明中利用。而且，通过培养这些生物体样品可得到的培养物也可作为本发明的检测物利用。生物体材料可以直接或根据需要进行处理后作为检测物。例如，生物体材料可经过分离、稀释、溶解、抽取等处理作成检测物。
本发明包括测定粒子三维信息的工序。因此，在检测物包含固体成分的情况下，优选通过将除去或溶解预先消除固体成分。固体成分可通过过滤或离心分离除去。但是，根据粒径等信息在可以将样品产生的固体成分的信号明确地识别为载体粒子的信号的情况下，不是必须将固体成分除去。
在本发明中，检测物也可以为原液，或自动稀释在测定时使用。稀释倍率可任意设定。反应所需要的试剂为多种时，也可以顺序添加两种以上的试剂。
在此所说的构成两种试剂的试剂，例如可示出如下试剂。
在本发明中，可使用用于预先分解及/或吸收导致非特异反应的物质的试剂。这种试剂作为包含非特异性抑制剂的试剂是有用的。包含非特异性抑制剂的试剂与包含载体粒子的试剂组合，构成两种试剂。包含非特异性抑制剂的试剂例如可预先与检测物混合。非特异性抑制剂例如可使用现有公知的物质。
在免疫分析中，构成非特异反应的原因的各种物质包含在样品中是已经明确的。例如，风湿症因子等球蛋白类有时干扰构成免疫分析的免疫反应。为防止球蛋白类对免疫分析的干涉，使用非特异性抑制剂。例如，利用识别球蛋白类的抗体可以吸收该非特异性作用。风湿症因子是根据IgG或IgM而来的风湿症。因此，通过使用抗人IgG抗体、或抗人IgM抗体，可吸收风湿症因子。另外，利用非特异原因物质的分解防止干扰的方法也是公知的。具体地说，已知可通过将球蛋白类还原使其分解，可以抑制该干扰作用。球蛋白类通过二硫苏糖醇、或2-巯基乙醇等还原。
另外，可组合2种以上试剂，该试剂包含将具有不同的键合活性的键合配对进行键合的载体粒子。通过这种结构，可同时测定不同种类的测定对象亲和性物质。各试剂可分别各自进行添加。或者，也可以预先将多种试剂混合后，与检测物混合。
优选检测物和试剂在施加电压之前预先混合。可使用搅拌器将两者进行物理混合。或者也可以利用电的方法将两者混合。电的方法例如有通过断续地施加不同方向的电压脉冲，使载体粒子的位置物理地动作的方法。
本发明涉及含有以下工序的亲和性物质的测定方法。
(1)将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子、和测定对象亲和性物质混合，并施加电压脉冲，使所述载体粒子沿电场排列的工序；(2)对通过与作为测定对象的亲和性物质的键合所形成的载体粒子的凝集块、及不与作为测定对象的亲和性物质键合未形成凝集块的载体粒子的任一种或两种进行计数并以其三维信息作为指标的工序；以及(3)基于凝集块的形成程度、及未形成凝集块的载体粒子的程度的任一种或两种决定测定对象物质的程度的工序。
下面，具体说明构成本发明测定方法的各工序。
混合后的反应液随后转移到介于电极间的槽内，施加电压脉冲。当施加电场时，载体粒子引起极化，排列成静电互相吸引的直链状。该现象被称为珠链状排列化。然后，当将电场停止时，直链排列的载体粒子瞬间再分散。另一方面，在进行珠链状排列化时，当生物的特异性反应物质存在时，参与生物性特异性反应的载体粒子在将电场停止后也未分散，一直以形成凝集块的状态存在。通过测定参与这些生物性特异凝集反应的凝集粒子及/或未参与的分散的载体粒子，可检测到或测定生物性特异性反应物质的存在。
本发明的测定方法中的特征在于，对与作为测定对象的亲和性物质键合所形成的载体粒子的凝集块、及未与作为测定对象的亲和性物质键合而未形成凝集块的载体粒子的任一种或双方进行计数并以其三维信息作为指标。在本发明中，可在将电场停止后进行粒子测定。或者也可以不停止电场，来测定置于电场中的粒子。例如，置于电场中的粒子可以通过从电场中取出进行计数。而且，在对粒子进行计数前，可实施使粒子分散的工序。通过计数前的分散工序，可使由于非特异性的原因而凝集的粒子分散。其结果是，可期待测定精度的提高。粒子通过搅拌或稀释反应液被分散。
在本发明中，粒子以三维信息进行计数。在本发明中，以三维信息为指标的计数是指，测定粒子及/或凝集块的三维信息，基于其结果对粒子及/或凝集块进行计数。解析显微镜图像的公知的方法根据二维信息决定凝集程度。因此，以三维信息为指标的本发明与公知的方法被明显区别开来。
用于测定三维信息的方法没有限制。另外，所谓本发明的计数是指求出粒子及/或凝集块的数量。粒子及/或凝集块的数量也可以仅简单地测定数量。或者也可以将凝集的粒子与未凝集的粒子区别开来进行测定。而且，凝集的粒子也可以对每个凝集的粒子数量测定其凝集块的数量。用于以三维信息作为指标对粒子进行计数的若干方法是公知的。
可用于本发明的粒子的计数方法中，基于物理原理的测定方法是有利的。在本发明中，物理的测定方法是指可以评价粒子或凝集块固有的物理信息的测定方法。粒子或凝集块固有的物理信息也可以说成标准的测定结果。与此相对，解析从图像信息得到的二维信息的方法实际上是将未凝集的粒子的重叠作为凝集块进行检测。这样的检测结果不能称为粒子固有的物理信息。
要物理测定粒子或凝集块，利用流动系统是有利的。流动系统是可以解析通过微小流动晶格中的粒子的物理信息的系统。通过利用流动系统，可容易地进行物理测定。即，本发明中的物理测定包含下述工序通过流动系统对粒子及凝集块的任一种或双方的三维信息进行测定、计数。用于以三维信息作为指标对粒子进行物理计数的方法例如有库尔特原理或激光衍射散射法。
库尔特原理(USPA2656508，1935年)是在小孔(细孔)的两侧设置电极，并基于通过小孔内的粒子产生的电气电阻的变化检测粒子的体积的方法。通过电解液在两电极间流过微小电流时，当电解液中悬浊的粒子被吸引而通过小孔时，相当于粒子体积的电解液被粒子置换。其结果是，由于两电极间的电阻产生变化，故可通过测定该变化可以测定粒子的计数和尺寸(体积)。作为检测体积的方法，有静电电容法，但几乎实用化了的方法是电阻抗法。
小孔尺寸可以与作为解析对象的粒子一致地进行调节。在检测到用于通常的免疫学的粒子凝集反应的载体粒子的凝集时，小孔尺寸通常可示出为30～1000μm，更优选50～200μm。
小孔尺寸为相对于载体粒子的平均粒径最好为数倍～数百倍，例如数倍～数100倍，优选5倍～50倍是有利的。此时，可检测到与体积成正比的信号，可实现高精度的高灵敏度的测定。相对粒子直径，小孔尺寸的倍率越小，灵敏度越好，但当其过小时，粒子容易堵塞，当其过大时，粒子的检测灵敏度降低，故不优选。
更具体地说，例如在对粒子直径为1～5μm，特别是2～3μm的载体粒子进行计数时，小孔尺寸为30～100μm，优选50～80μm，例如可从65～75μm的范围选择。在本发明的亲和性物质的测定方法中，作为特别优选的粒子可列举出2～3μm的载体粒子。即，本发明提供包含以下工序的亲和性物质的测定方法。
(1)将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的具有平均粒径2～3μm的载体粒子和测定对象亲和性物质混合，并施加电压脉冲的工序；或者(1’)在将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的具有平均粒径2～3μm的载体粒子和测定对象亲和性物质于凝集成分混合并且施加电压脉冲的工序中，所述载体粒子通过凝集试剂凝集，并且利用测定对象亲和性物质阻碍其凝集的工序。
(2)在进行工序(1)后，利用具有50～80μm的小孔尺寸的库尔特原理，将通过与作为测定对象的亲和性物质的键合所形成的载体粒子的凝集块以及不与作为测定对象的亲和性物质键合而未形成凝集块的载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的工序；(2’)在进行工序(1’)后，利用具有50～80μm的小孔尺寸的库尔特原理，将通过与凝集试剂键合所形成的载体粒子的凝集块以及由于与作为测定对象的亲和性物质键合而阻碍凝集的载体粒子的的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的工序，以及(3)在进行工序(2)或(2’)后，基于凝集块的形成程度、以及未形成凝集块的载体粒子的程度的任一个或两方，决定测定对象物质的程度的工序。
通常，小孔尺寸小的可更准确地对非凝聚粒子进行计数。相反，通过增大小孔尺寸，凝集粒子难以堵塞小孔。小孔的堵塞成为解析效率下降的原因。降低堵塞频率与解析效率的提高有关。例如，在预测凝聚粒子大量生成的情况下，通过较大地设定小孔尺寸，可以防止小孔堵塞。或者，通过使用粒子直径小的载体粒子，可期待相同的效果。另外，通过稀释样品，降低凝集粒子的比例，也可以防止小孔的堵塞。通常，根据所期待的检测灵敏度、所预想的检测对象物质的浓度、以及设备结构(特别是小孔尺寸)，可以分别选择适宜的条件。
这样，通过对凝集粒子进行计数，可以了解凝集粒子的比例。凝集粒子的比例是占所计数的全部粒子的凝集的粒子的比例。另外，将凝集粒子的比例称为凝集率(aggligation rate)。而且，对预先了解浓度的标准试剂求取凝集率，将两者的关系作成图表，由此，可得到标准曲线。与此相对，如若对照检测物的凝集率，则可明确检测物含有的测定对象亲和性物质的浓度。
或者，也可以将所述标准曲线作为回归式来表示。如果可得到回归式，则也可以将凝集率代入回归式，从而算出测定对象亲和性物质的浓度。
另一方面，所谓激光衍射散射法是指，检测对粒子照射激光时产生的摇动，由此，测定粒子的计数和平均直径。无论何种情况，为提高测定精度，作为抑制粒子的误测定的目的，优选使用将反应粒子稀释、施加超声波或/以及鞘流方式等。
另外，可将以下这样的方法作为粒子体积测定方法来表示。离心沉淀法是利用表示液体中的粒子沉淀速度和粒径关系的斯托克斯公式测定粒径分布的方法。(在光透过式离心沉淀法中，使用斯托克斯法则，如果为相同比重的粒子，则可利用大粒比小粒沉淀快的事实。可将此时的粒子浓度作为光透过的混浊度变化进行解析，求出粒度分布。)毛细管方式在流过毛细管中的粘性流体的雷诺数小的情况下，在其中产生泊肃叶流体。该流动越在毛细管中央越快，越在管壁越慢，因此，大的粒子在平均快的流束中流动，小的粒子在平均慢的流束中流动。即，粒子在流过一定长度的毛细管中时，由于其运动速度不同，从而可从尺寸上分离检测。
三维图像解析对从不同方向进行摄影的多个图像信息进行解析，可求出粒子的三维信息。或者，通过使xy平面的图像信息向z轴方向扫描，可求出粒子的三维信息。
对本发明的测定方法来说，以三维信息为指标对凝集(或未凝集的)的载体粒子进行计数。根据计数的结果定性或定量地测定作为测定对象的亲和性物质。在定性的测定中，存在凝集粒子是指存在作为测定对象的亲和性物质。或者，在阻止凝集反应的情况下，在检测到阻止凝集时，证明存在测定对象。
另外，在定量的测定中，可使凝集的程度与作为测定对象的亲和性物质的量相关联。更具体地说，对预先了解亲和性物质的量的样品实施本发明的测定方法，基于三维信息的凝集粒子的检测结果和亲和性位置的量的关系变得明确。其次，对样品进行同样的测定，可从基于堆积的凝集粒子的检测结果使亲和性物质的量明确。即使在阻止凝集反应的情况下，也同样可以进行定量的测定。
作为粒子以及/或凝集块的计数方法，在对一定粒子数进行计数的装置中，可根据凝集成两个以上的粒子数/总粒子数或单粒子/总粒子数等目的选择运算式。总粒子数可以是未在某检测时间内所检测的全部粒子的数量，在以反应液的总量为解析对象的情况下，确实也可以是反应液中所含粒子的总数。对于反应液中所含的粒子总数来说，在反应液总容量明确的情况下，也可以通过对其一部分进行计数近似地计算出来。
或者，利用电阻抗法或激光衍射散射法等，基于每个一定时间检测到的粒子以及/或凝集块的数量，可以检测或测定亲和性物质。即，因为通过凝集反应使单粒子凝集，形成凝集块，故在每小时计数的粒子数量减少。或者，也可以将对预定数量的粒子以及/或凝集块进行计数所需要的时间作为指标。在本发明中使用这种计数方法的情况下，可将各粒子以及/或凝集块的数量和亲和性物质的量之间的关系作为回归式来表示。
根据抗原的浓度，对于抗体被敏化的粒子来说，由两个以上的粒子构成的凝集块的比例增大。而且，由凝集成两个以上的粒子数/总粒子数表示的凝集率收敛于1.00(100％)。
无论是库尔特原理还是激光衍射散射法，检测粒子三维信息的方法与解析二维图像数据的方法相比，可期待由简单的机械结构进行高精度的解析。如上所述，在二维图像数据的解析中，反应液的容积被限制。与此相对，因为检测三维信息的方法应用流动式的解析方法，故反应液的容积不受限制。另外，反应空间的物理形状也没有限制。根据这些理由，设备结构变得简单。而且，可自由设定反应液量，对再现性和检测灵敏度的提高有利。
或者，本发明提供含有以下工序的亲和性物质的测定方法。
(1’)将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质与凝集试剂成分混合并施加电压脉冲，使所述载体粒子沿电场排列的工序中，所述载体粒子通过凝集试剂凝集，并且利用测定对象亲和性物质阻碍该凝集的工序，。
(2’)在进行工序(1’)后，将通过与凝集试剂键合所形成的载体粒子的凝集块以及与作为测定对象的亲和性物质键合而阻碍凝集的载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的工序，以及(3)在进行工序(2’)后，基于凝集块的形成程度以及未形成凝集块的载体粒子的程度的任一种或两种，决定测定对象物质的程度的工序。
已经叙述了利用凝集试剂的基于阻止凝集反应的免疫学的粒子凝集反应法的原理。利用所述工序，可将本发明应用在免疫学的粒子凝集反应中。构成上述工序的电压脉冲的施加或凝集块的形成程度、或未形成凝集块的载体粒子的程度的解析可利用先前具体叙述的方法进行。
另外，在根据阻止凝集反应的原理实施本发明的情况下，优选选择生成更多凝集有两个以上粒子的凝集块的条件。或者，优选以单粒子/总粒子数作为指标来评价凝集程度的方法。在基于阻止凝集反应的原理的情况下，利用这样的运算式，与基于凝集为两个以上的粒子数/总粒子数的运算式的解析相比，可期待高的灵敏度。
另外，本发明提供用于实施上述测定方法的装置。即，本发明涉及包含以下装置的亲和性物质的测定装置。
(a)保持键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质的空间，
(b)用于对保持在所述空间的载体粒子施加电压脉冲的电极，以及(c)将通过保持于所述空间的载体粒子的凝集而产生的凝集块以及未凝集的所述载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的装置。
在本发明中，在(a)保持键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质的空间中，可以利用用于保持反应液的任意空间。为使微量的样品反应，小容量的空间是有利的。例如，可利用1μL～10mL，优选10～500μL左右的空间。该空间根据需要也可以设置样品或试剂的供给装置、或后述的载体粒子的检测装置。
其次，对用于保持在本发明的(b)的所述空间的载体粒子施加电压脉冲的电极进行说明。用于使载体粒子在电场中排列的电极，也被利用在例如前面记载的先行技术文献中。可在本发明中利用这些公知的电极。在本发明的装置中可具有用于向电极供给电压的电源。
本发明装置中的用于施加电压脉冲的电极至少由一组(两个)电极构成。为给予多个不同方向的电压脉冲，也可以具有三个以上的电极。例如，可配置三个电极A、B、C，并在A-B间、B-C间、A-C间施加三个方向的电压脉冲。除此之外，也可以配置两组(四个)电极，并施加正交的电压脉冲(图6)。
而且，为施加不同方向的电压脉冲，可具有驱动电极的机构。例如，通过使电极在反应液中旋转，可从多个不同的方向施加电压脉冲。在从不同的方向施加电压脉冲时，施加的方向可为任意角度。
另外，本发明的装置具有如下装置(c)将利用保持在所述空间的载体粒子的凝集而产生的凝集块以及未凝集的所述载体粒子的任一种或两种以其三维信息为指标进行计数的装置。该计数装置可设于所述空间内。或者，也可以在将保持于所述空间的反应液从所述空间内取出，导入计数装置后，进行计数。
作为对以三维信息为指标凝集的或未凝集的载体粒子进行计数的装置，可利用使用了库尔特原理或激光衍射散射法的检测装置。为了使用库尔特原理，例如将所述空间内的反应液导入设有库尔特原理用的电极的小孔内，进行必要的解析。小孔的尺寸可根据上述的基准进行适宜调节。也可以采用下述结构根据用于试剂的粒子直径或被预测的凝集粒子的比例，切换利用具有不同尺寸的多个小孔。例如，本发明的装置可具有用于向多个小孔导入反应液的流路切换机构。另外，也可以根据试剂的种类或被预测的凝集粒子的比例等组合自动选择流路的机构。或者，本发明的装置可以具有通过切换小孔尺寸来自动调节检测灵敏度的机构。作为检测灵敏度的调节机构例如有如下结构首先利用大网眼的小孔尺寸进行解析，在预测为凝集粒子的比例小的情况下，切换为更小的小孔。在利用激光衍射散射法的情况也相同，只要将反应液导入用于解析的光学单元进行解析即可。
在本发明中，在电场中珠链状排列化了的载体粒子根据需要再分散后，可得到三维信息。在本发明的装置中可具有用于使载体粒子再分散的机构。载体粒子可通过稀释或超声波处理进行再分散。
构成本发明装置的所述(a)-(b)的要素可配置在一个连续的流路内。或者，将各要素作为不连续的空间来构成，通过使反应液在各要素间移动，可实施本发明的测定方法。
在本发明的装置中，可将用于实施所述测定方法的附加的机构进行组合。下面示出可在本发明的装置中组合的附加机构。
样品的分取机构 测定结果的显示机构样品的稀释机构 测定结果的印刷机构测定结果的记录机构另外，在本说明书中引用的全部先行技术文献作为参考应用在本说明书中。
图1(A)是表示基于本发明的装置结构的图。另外，图1(B)是表示构成基于本发明的装置的脉冲施加槽的剖面的图。
图中的符号分别表示如下要素，1分配+搅拌装置2反应槽3电极(脉冲施加装置)4稀释装置5粒度分布测定装置图2是表示基于本发明的亲和性物质测定方法的测定原理的图。
图中的符号分别表示如下要素，100胶乳粒子101抗体102抗原104反应槽3电极图3是表示用于实施基于本发明的亲和性物质的测定方法的具体设备结构的图。
图中的符号分别表示如下要素，1分配+搅拌单元2脉冲施加单元(3a、3b)3a电极(施加脉冲)3b脉冲电源单元4稀释单元5粒度分布测定单元6小孔7鞘流8电极(开槽计数器)9泵10废液11保护液12稀释液(清洗液)13计算机单元图4是表示利用具有图3的结构的测定装置实施本发明的测定方法时所得到的粒度分布的测定结果的图。图中纵轴表示粒度分布(％)，横轴表示粒子直径(μm)。
图5是表示配置了多组电极时的电极的配置和反应空间的体积的例子的图。
图6是表示利用如图5所示的配置的电极施加电压时所形成的珠链状排列结构的例子的图。
图中的符号分别表示如下的要素，
3电极(第一电极组)3’电极(第二电极组)100胶乳粒子图7是表示基于三维信息的本发明的测定方法和观测二维信息的利用公知的测定方法得到的测定方法的比较结果图。图中纵轴表示凝集率(P/T％)，横轴表示AFP浓度(ng/mL)。
图8是表示基于通过珠链状排列化的反应和三维信息测定的本发明方法的结果图。图中纵轴表示凝集率(P/T％)，横轴表示CEA浓度(ng/mL)。
图9是表示基于37℃、20分钟的保温的反应和三维信息测定的公知的方法的结果图。图中纵轴表示凝集率(P/T％)，横轴表示CEA浓度(ng/mL)。
具体实施例方式
下面，参照附图对本发明进行详细说明，但是这些并不限定本发明。
1.采用本发明的测定装置的测定例图1(A)是表示本发明装置的结构的图。
该装置具有分配·搅拌槽，将检测体和试剂1(缓冲液)分配混合，进一步分配混合试剂2(胶乳试剂)混合，配制反应液。将反应液移动到脉冲施加槽2内，通过电极3施加数秒到数十秒的脉冲电压，将其珠链状排列化。反应液在被珠链状排列化后，将其稀释(稀释槽4)，测定粒度分布。
图1(B)是表示脉冲施加槽剖面的图。电极间的距离为0.5mm，电极的厚度为0.03mm，电极的长度为20mm。
图2是表示使用图1的装置进行测定的生物学的特异性反应的测定原理的图。在直径为2μm的胶乳粒子100中，将键合有作为测定对象的物质的抗体101的胶乳试剂和用缓冲液稀释的检测物102混合，构成反应液。抗体或抗原等向胶乳粒子的键合可使用周知的技术进行，也可以通过疏水键合或化学键合来进行键合。检测物使用来自血液、尿等体液、大气、土壤或河川等的萃取物。
图3表示装置的具体例。利用分配+搅拌单元1分取血清检测物1μL和甘胺酸缓冲液10μL，进一步取在3μm胶乳粒子中敏化AFP抗体的胶乳试剂5μm，进行混合。将该反应液送入介于电极3a之间的反应槽内，从脉冲电源3b施加30秒的交流电压(100KHz，20V/mm)，将胶乳粒子珠链状排列化。然后，将反应液移入稀释槽内，添加1mL的稀释液12，将其稀释。在此，通过对稀释槽施加1秒的超声波，使不参与抗原抗体反应的粒子进行完全地再分散。将该反应液送入粒度分布测定单元5，在从鞘流系统7通过小孔6时，从由电极8检测到的信号测定胶乳粒子的粒度分布时，得到图4所示的粒度分布，由下式算出胶乳粒子的凝集率(AR)，可从预先同样测定AFP标准样得到的检测线测定AFP浓度。
AR＝(凝集为两个以上的粒子数)/(总粒子数)×100(％)各单元被计算机单元13自动控制进行动作，并进行测定，测定结果显示在显示器上。
2.本发明的测定方法(三维信息)和公知的测定方法(二维信息)的比较抗人AFP抗体敏化胶乳试剂的配制方法向含有0.07mg/mL的抗人AFP抗体(IgG)的甘胺酸缓冲液1.0mL中添加使1.0％的Φ3μm胶乳(Polysciences公司)的甘胺酸悬浊的缓冲液，在室温下搅拌2小时后，将敏化后的胶乳悬浊液离心分离(10000rpm、10分钟)，除去上清液。使沉淀悬浊在含有1.0％的牛血清蛋白质、10％的蔗糖、50mM的NaCl、0.09％的NaN3的甘胺酸缓冲液中，配制抗人AFP抗体敏化胶乳试剂。使用该试剂实施如下三种测定方法。
方法(1)使用抗人AFP抗体敏化胶乳试剂和AFP标准品(校准品)，施加40秒交流电压(100KHz，12V/mm，方形波)，在将其珠链状排列化后，立刻切断电源，利用库特氏计数器对胶乳粒子进行计数。从凝集为两个以上的粒子数(P)和总粒子数(T)之比测定凝集率。
方法(2)使用抗人AFP抗体敏化胶乳试剂和AFP标准品(校准品)，施加40秒交流电压(100KHz，12V/mm，方形波)，在将其珠链状排列化后，立刻切断电源，放置20秒，使未参与特异性凝集反应的胶乳粒子再分散。在反复进行珠链状排列化及再分散的工序后，与方法(1)相同，利用库特氏计数器对胶乳粒子进行计数，测定凝集率。
比较例使用抗人AFP抗体敏化胶乳试剂和AFP标准品(校准品)，施加40秒交流电压(100KHz，12V/mm，方形波)，在将其珠链状排列化后，立刻切断电源，放置20秒，使未参与特异性凝集反应的胶乳粒子再分散。利用显微镜观察反应液，通过CCD照相机将得到的显微镜映像输入计算机，进行二维图像解析，从凝集为两个以上的粒子数(P)和总粒子数(T)之比测定凝集率。
结果表1及图7表示测定结果。在利用二维图像解析的公知的测定方法中，将凝集率收敛于10％。其结果是，只能得到特别低浓度(0.001～0.01ng/mL)下的凝集率的变化。在低浓度域，推测为由于粒子重叠的影响，实际上未凝集的粒子被误判断为凝集粒子造成的误差的影响大。与此相对，根据本发明，使用了电阻抗法的三维解析即使在低浓度域，也可以观测到大致直线的凝集率降低。其结果是，可确认有比二维解析法高约10倍的高灵敏度化。即，在本发明的方法中，在抗原(AFP)浓度为0.001～1000ng/mL范围，观测到了直线凝集率的变化。特别是通过反复进行珠链状排列化，特别是在0.1～100ng/mL的浓度范围为更高灵敏度。
表1
实施例2粒子测定和小孔口径的关系(1)抗CEA抗体敏化胶乳试剂(试剂2)的配制在1mL的甘胺酸缓冲液(含有50mM甘胺酸，50Mm氯化钠，0.09％NaN3，下面简称为GBS)1.0mL中添加悬浊有1.0％的Φ2μm胶乳(ポリサイエンス社)的GBS 1mL，在37℃下将0.1mg的抗人CEA抗体(ダコ社制)保温2小时后，将敏化的胶乳悬浊液离心分离(10000rpm，15分钟)，除去上清液。使沉淀悬浊在2％的牛血清蛋白质GBS中，在以37℃保温1小时后，再次进行离心分离(10000rpm，10分钟)，将上清液除去。使沉淀悬浊在含有0.2％的牛血清蛋白质、10％的蔗糖、5％的氯化胆碱的GBS，pH8.2中，配制抗人CEA抗体敏化胶乳试剂(胶乳浓度1％W/V，2μm试剂)。同样，使用Φ3μm的胶乳(Polysciences公司)配制3μm试剂。
(2)测定装置使用库特氏计数器(Backman Couter公司)和四种小孔(口径20μm、50μm、70μm、100μm)。
(3)测定方法在将0.5μL正常血清和0.5μL试剂2混合后，分配给图1(B)的带电极的元件，施加60秒交流电压(频率100KHz，12V，方形波)，形成珠链状排列，然后，立刻切断电源，添加到20mL生理盐水中，倒置混合。利用库特氏计数器对反应中的胶乳粒子进行计数。
(4)结果，在表2中表示结果。
表2
表2中“易堵塞度(％)”表示使用各口径的小孔进行计数时的载体粒子堵塞小孔的频率。例如，在使用了20μm的小孔的情况下，易堵塞度(％)为50％以上。这意味着在对反应液中的胶乳粒子进行计数时，两次测定中的至少一次小孔中的载体粒子的堵塞影响测定结果。测定次数是2μm试剂和3μm试剂的合计。即，易堵塞度(％)表示小孔的易堵塞度。
另外，“A/B/C；可能或不可能”表示使用各口径的小孔进行计数时的测定精度的评价比较结果。评价基准如下所示。另外，SN比是N(noise)÷S(signal)，即(作为错计的凝集粒子进行计数的非凝集粒子(单粒子)数)/(真实的非凝集粒子(单粒子)数)。在使用了平均粒子直径为2μm以及3μm的试剂时，可最准确并且高精度地测定半成品检测物(AFP浓度为检测限界以下)的非凝集粒子(单粒子)的小孔尺寸是20μm。根据该结果，将以20μm的条件对小孔尺寸计数的非凝集粒子(单粒子)数设为“真实的非凝集粒子(单粒子)”。另一方面，以各小孔尺寸进行计数的非凝集粒子(单粒子)数和“真实的非凝集粒子(单粒子)数”之差为各小孔尺寸中的“错误地作为凝集粒子计数的非凝集粒子(单粒子)数”。
A在对胶乳粒子进行计数时，非凝集粒子(单粒子)和凝集为两个的粒子的区别明确并且可以再现性好地测定，该SN比为1.5以下的情况BSN比小于1.5～3的情况C非凝集粒子(单粒子)和凝集为两个粒子的区别不能明确检测，或不能正确检出单粒子，而SN比小于3～6的情况不可测量的SN比为6以上的情况依照A/B/C的顺序表示测定精度低。在测定2μm胶乳粒子试剂的情况下，可高精度地对口径20～70μm的小孔进行计数(A或B)。另一方面，在口径100μm的小孔中，显示为测定精度稍微劣化(C)。
在使用2μm级别的载体粒子的情况下，口径50μm以下的小孔容易堵塞，100μm以上的小孔测定精度不好。因此，50以上并小于100μm的小孔适用，特别是口径70μm的小孔适用。另一方面，在测定3μm级别的载体粒子的情况下，50～100μm的小孔适用，特别是70～100μm的小孔适用。即，小孔尺寸优选其相对载体粒子的平均粒径为5倍～50倍。
实施例3胶乳尺寸和反应性的关系(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制进行与实施例1相同的操作，配制抗人AFP抗体敏化胶乳试剂。另外，使用Φ2μm、3μm、4.5μm、6μm、10μm的胶乳粒子，配制5种试剂。将胶乳粒子的浓度分别调整为1％、1％、3％、3％、10％。
(2)测定装置使用库特氏计数器和两种小孔(仅Φ2μm的胶乳试剂使用口径为70μm的小孔，其它的胶乳试剂的口径为100μm的小孔)。
(3)测定方法将3μL检测物和3μL抗AFP抗体敏化胶乳试剂混合，分配给图1(B)的带电极元件，施加40秒的交流电压(频率100KHz、14V、正弦波)，在形成珠链状排列后，立刻切断电源，向生理盐水20mL中添加，倒置混合。利用库特氏计数器检测混合后的反应液中的胶乳粒子。从凝集了两个以上的粒子数(P)和总粒子数(T)之比测定凝集率。
(4)结果表3表示结果表3
在粒子直径为3μm以下时，凝集率的比率大到40％以上，在为6μm以上时，凝集率的比率低到20％以下。可知该结果和表2的结果也吻合，在本发明中，胶乳粒子直径优选1～10μm，最好优选2～5μm。
实施例4(1)抗CEA抗体敏化胶乳试剂(试剂2)的配制与实施例2相同，对Φ2μm的胶乳敏化抗人CEA抗体，配制抗人CEA抗体敏化胶乳试剂(胶乳浓度为1％W/V)。
(2)甘胺酸缓冲液(试剂1)的配制配制含有0.5％的牛血清蛋白质、0.6mg/mL的非特异抑制混合液的GBS、pH8.2，构成试剂1。
(3)测定装置使用图1(A)的装置以及(B)的带电极元件，根据抗原抗体的反应测定亲和性物质(抗原)。
(4)测定方法使用含有0.5％牛血清蛋白质的GBS，将CEA抗原液稀释，调整浓度0、0.015、0.03、0.06、0.49、0.98、1.95、3.9、125、250、500ng/mL。将1μL这些检测物和15μL试剂混合，在45℃下保温3分钟后，添加6μL试剂2并混合后，注入带电极元件内。此时的最终反应液中的胶乳浓度为0.5％。使用上述的装置，在室温下施加60秒交流电压(频率100KHz、12V、方形波)，在形成珠链状排列后，立刻切断电源，利用库特氏计数器(小孔使用口径70μm)对胶乳粒子进行计数。从凝集了两个以上的粒子数(P)和总粒子数(T)之比测定凝集率。
图8表示结果。
比较例2将实施例5的各检测物和试液等量放入试验管内，在37℃下保温20分钟。将0.5μL该反应液稀释为生理盐水20mL，与实施例5相同，使用库特氏计数器测定胶乳粒子的粒度分布，同样算出凝集率。另外，与实施例5相同，反复进行5次测定，表4、表5及图9表示其结果。
表4脉冲100KHz、±12V、方形波
表5对照37℃、20分、保温
抗原浓度为0时的测定值如果可识别为测定某浓度的抗原时的值，则可测定该浓度的抗原。可测定的抗原浓度的最小值为检测范围。通常，如若测定抗原量为0ng/mL的凝集率的平均值+2.6SD、和测定了某浓度的凝集率的平均值-2.6SD没有重叠，则可检测到其浓度以上的抗原。
当从图8及图9比较检测范围时，本发明的方法(图8)的检测范围为0.015ng/mL。另一方面，现有方法(图9)中的检测灵敏度为1.9ng/mL，本发明为100倍以上的高灵敏度。另外，本发明的各抗原量的再现性也好，CV值大概为1～2％(抗原量为1.95ng/mL的同时再现性在本发明中CV＝1.33％，在现有方法中CV＝9.86％)，抗原量为500ng/mL之前得到良好的直线性。由此，本发明施加电源脉冲，通过珠链状排列化促进反应，与现有方法相比，在非常短的时间内更具有高灵敏度，以及有良好的再现性，并且，可直线性优良地进行测定。
产业上的可利用性本发明提供利用载体粒子的凝集的新型的亲和性物质的测定方法。本发明的测定方法是根据粒子的三维信息对载体粒子的凝集进行计数。其结果是，操作更简便，并且可高精度地进行测定。另外，用于测定的装置可为廉价的结构。
另外，在本发明中，因为根据粒子的三维信息对载体粒子的凝集进行计数，故用于进行凝集反应的反应空间的形状不被限制。其结果是，可利用多组电极从不同的方向施加电压脉冲。另外，通过加大反应空间，可期待灵敏度和再现性的提高。
与此相对，在根据二维信息(面积)观察载体粒子的凝集的公知的方法中，由于仅可观察焦点吻合的被限制的范围的粒子，故反应空间的形状被显著限制。如移动焦点，则可加宽观察范围，但即使这样，平面扫描也是有限的。这样，本发明的测定方法与公知方法相比，是可更简便并且高精度地进行测定的方法。
而且，通过施加电压脉冲促进反应的结果可利用更大的载体粒子。其结果是，可期待测定精度的提高。
权利要求
1.一种包含以下工序的亲和性物质的测定方法，(1)将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质混合，并施加电压脉冲的工序，或者(1’)将键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质，与凝集试剂成分混合，并施加电压脉冲的工序中，所述载体粒子通过凝集试剂凝集，并且利用测定对象亲和性物质阻碍其凝集的工序，(2)在进行工序(1)后，将通过与作为测定对象的亲和性物质的键合所形成的载体粒子的凝集块以及不与作为测定对象的亲和性物质键合而未形成凝集块的载体粒子中的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的工序，或者(2’)在进行工序(1’)后，将通过与凝集试剂键合所形成的载体粒子的凝集块以及利用与作为测定对象的亲和性物质键合而阻碍凝集的载体粒子中的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的工序，(3)在进行工序(2)或(2’)后，基于凝集块的形成程度以及未形成凝集块的载体粒子的程度的任一种或两种，决定测定对象物质的程度的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其中在工序(2)或(2’)中，物理性地测定凝集块或载体粒子的三维信息。
3.如权利要求2所述的方法，其中用于物理性地测定三维信息的方法是从由电阻抗法、激光衍射散射法以及三维图像解析法构成的组中选择的任一种方法。
4.如权利要求1所述的方法，其中电压脉冲是交流电压脉冲。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在工序(2)或(2’)中，在将电场停止后，对载体粒子进行计数。
6.如权利要求5所述的方法，其中在工序(2)或(2’)中，还包含在将电场停止后，进一步附带地将载体粒子进行稀释的工序。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，施加多次电压脉冲。
8.如权利要求7所述的方法，包含下述工序，在施加电压脉冲后，将载体粒子进行分散，然后施加下一个电压脉冲。
9.如权利要求7所述的方法，其中多次电压脉冲是不同方向的电压脉冲。
10.如权利要求1所述的方法，其中载体粒子的平均粒径为1μm以上。
11.如权利要求10所述的方法，其中载体粒子的平均粒径为1μm～20μm。
12.一种亲和性物质的测定装置，包含以下装置，(a)对键合有与测定对象亲和性物质具有键合活性的键合配对的载体粒子和测定对象亲和性物质进行保持的空间，(b)用于对保持在所述空间的载体粒子施加电压脉冲的电极，及(c)将保持于所述空间的载体粒子的通过凝集所产生的凝集块以及未凝集的所述载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的装置。
13.如权利要求12所述的装置，其中将保持于(c)所述空间的载体粒子的凝集所产生的凝集块以及未凝集的所述载体粒子的任一种或两种，以其三维信息为指标进行计数的装置，是用于物理性地测定三维信息的装置。
14.如权利要求13所述的装置，其中用于物理性地测定三维信息的装置是用于利用从电阻抗法、激光衍射散射法以及三维图像解析法构成的组中选择的任一种方法，对三维信息进行物理性地测定的装置。
15.如权利要求12所述的装置，其中具有用于施加至少两组电压脉冲的电极。
16.如权利要求12所述的装置，其特征在于，具有驱动用于施加电压脉冲的电极的装置，并且可以施加相对于所述空间不同方向的电场。
全文摘要
作为测定对象的亲和性物质和与该亲和性物质具有键合亲和性的键合配对的键合反应利用凝集反应测定。将在电场中键合有键合配对的载体粒子与亲和性物质键合，通过以粒子的三维信息为指标对所凝集的粒子程度进行计数来进行评价。通过以三维信息为指标，与现有的测定方法相比，可更简便并且迅速地、而且高灵敏度地检测或测定生物学的特异性反应物质的存在。
文档编号G01N15/10GK1836163SQ20048002350
公开日2006年9月20日 申请日期2004年6月11日 优先权日2003年6月16日
发明者轻部征夫, 岩田惠助 申请人:脉冲-免疫技术株式会社