检定方法

专利名称：检定方法
技术领域：
本发明属于抗体检定领域，具体涉及利用简单方法检测血液样品中经诸如感染或接种等之类的抗原激发而产生的抗体，所述简单方法包括在同一血液样品中确定淋巴细胞和血浆抗体存在。优选的是，以单一检定方法同时估定血浆和淋巴细胞抗体。
背景技术：
存在几种可利用来检测样品中抗体水平的技术，例如ELISA检验。最常见的情况是，将ELISA用作血清学检定，但是它也可用于研究抗原或抗体的免疫化学特性，还经常用于，例如，免疫反应的评估及定性，另外还可在杂交瘤技术中用于通过细胞培养研究抗体的产生。
ELISA检定使用简单，敏感且相对快速，但是它仅仅能够对样品中分泌的靶抗体的存在进行检定；它无法将应答抗原而即时合成的抗体合成与感染或被动转移后业已存在的抗体区分开来。只有已经从淋巴细胞中分泌的抗体被检测到。该技术没有检测到没有分泌的淋巴细胞抗体。
除了ELISA检验之外，已经使用ELISPOT或酶联免疫斑点检定，综述参见，例如，Czerkinsky等，ELISA中及其它固相免疫检定(in ELISA and other Solid phase Immunoassays)，Eds.D.M.Kenneny和S.J.Challacombe编著，1988，第10章，217-239。该技术以ELISA方法为基础，可对分泌抗一种或多种靶抗原之抗体的淋巴细胞计数。所述ELISPOT基本上是ELISA方法的一种变体，因而可以通过以下方法来揭示抗体分泌细胞(ASC)，即在用靶抗原包被过的经专门改进的ELISA孔中培养淋巴细胞，用酶-底物复合物代替标准ELISA试剂，该酶-底物复合物可在分泌细胞近处生成显色沉淀(斑点)。然后可通过斑点计数来测算出抗体生成细胞的数目。可在培养基中加入蛋白质合成抑制剂，以确保所检测到的斑点是由体外孵育期间的抗体从头合成途径生成的。
尽管ELISPOT技术在研究体液免疫应答动力学中非常有用，并可用于检测经免疫受试者外周循环中瞬时出现的自发ASC，但该方法的某些特性限制了它在临床诊断中的应用。首先，由于每个样品的斑点都须单个测量，耗时且费力，该方法尤其不适用于大量样品的分析，例如临床诊断试验室中的操作。其次，只检定每个样品中的抗体分泌细胞的数目，一般来说，这理论上讲需要相当大量样品体积，例如，几毫升。另外ELISPOT检定板也很昂贵，而且该检定不易自动化。
最近，开发了检测即时抗体合成的检定。在此通过参考被结合的WO 96/26443描述了这样的一种检验。在该检定中，分离淋巴细胞然后进行培养，检定该培养过程中生成的和从淋巴细胞分泌的抗体水平。
因此，为了能对孵育过程中分泌的抗体进行检定，该技术需要在约37℃下孵育测试样品的淋巴细胞。平均孵育时间为2-5小时，这就极大地限制了该检定的操作速度。另外孵育还需要在测试位点提供适当的装置，以便其能在检定步骤前立即执行。这通常意味着淋巴细胞的检定必须在样品离体后很短的时间内执行，因为不可以通过例如冷冻贮存样品，这会导致细胞活力的下降。通过在0℃的冰上储存或稍差一点在4℃保存纯化后的细胞，也只能在相当短的时间内保持活力。
在此通过参考被结合的WO00/77525描述了另一种抗体检定。该检定被专门设计检测在其分泌之前包含抗体的淋巴细胞。在该检定中，样品的淋巴细胞被溶解，进而检测到通过该溶解从淋巴细胞中释放的抗体。这个检定基于以下发现，即淋巴细胞裂解可产生足够数量的“新合成的抗体”，以允许用于免疫诊断目的的检测。便利地，以这种方法，在溶解之前纯化样品中的淋巴细胞。
因此，WO00/77525中所述的检定方法不要求用于检测目的的足够抗体合成的体外孵育样品，而这是使用标准抗体检测检定的情况，该标准抗体检测检定检测在体外或体内分泌的抗体。因此，该检定具体用于检测在诸如感性或防染处理的激发之后较短时期内的急性感染，此时应答该激发而淋巴细胞快速产生抗体。
然而，WO00/77525中所述的方法仅仅允许活性抗体产生出现时的感染检测，也就是在激发之后的短时期期间。这个窗口对应于细胞处于正在产生可检测的抗体水平的时限。在激发后，B淋巴细胞开始合成抗体且应答抗原激发而分割。在该时期中，通常感染3到10天，淋巴细胞快速合成感兴趣的抗体，且因此这些细胞中的抗体水平为高的。然而，这些细胞是短命的，结果是，在感染后大约两周，由淋巴细胞产生的相关抗体的数量明显下降。距离感染近似两周，存在于溶解的淋巴细胞中的相关抗体的数量回归到低水平。例如，这被示出在WO00/77525中所示的流行性感冒研究中。因此，这种方法，尽管对检测急性感染非常有用，但是不能检测即时感染或感染之后，因此仅仅用于诸如感染或防染处理的激发之后相当短时限。
能够理解的是，需要允许对来自病人的样品中的感染进行快速且准确检测的方法，并且该方法具有对感染的早期检测相关联的明显优点。尽管存在允许对急性感染的检测技术(例如WO00/77525)和允许对感染后或即时感染的检测技术，但是不存在单一的测试，即能够对个体在其生命期中某些点处是否暴露于特定激发(例如感染，也就是具有极性的、即时的(慢性)感染或感染后)的问题提供一种快速反应。因此，在不需要了解激发时间的情况下，能够识别激发是否已经发生应该是及其有价值的。然后，同样测试可被用于不管激发时间的样品分析，例如用于慢性和急性感染。目前没有单一测试符合这些需要。
这种测试在高吞吐量筛查(high-throughput screening)中将尤其有用，在该高吞吐量筛查中需要关于源有机体的感染状态的信息。例如，血库需要快速和准确的测试来确定将被用于输血的血液的安全。这在高流行血液传染病的世界区域内尤其重要，诸如HIV(艾滋病)和肝炎，其可被传递给血液受体。
检测HIV感染的目前方法和对经输血而HIV传播的风险的控制在某些地区是现场的。例如，在南非已经执行血液安全政策，以及高感染风险的个人接受调查问卷、供体训练和一对一访问便于其处理。这种规定和自我排除均有助于明显降低这群人的血清阳性率。这与普通人口中HIV/AIDS广泛流行的逐步扩大形成对比。
预期的血液供体中的高HIV血清阳性率在传染力的免疫静止“窗口期限”中增加了HIV传播的风险。在1994年，在南非，估计这种风险在该窗口期限中为每100,000供体中2.2个感染者(Sitas F等的S.Afr.Med.J.1994；84142-144)。在免疫静止窗口期限期间，使用已知的商业化的可利用的检定不可能检测到HIV感染。
如使用标准数学模型所估计的，对构造的风险管理计划的执行将对血液制品的受体的风险降低至100,000供体中的大约1个。这种实测的风险大约降低四倍，但是这可能是由于难于实现对输血传递的疾病诊断的因素。
目前存在可利用的某些HIV检验。例如，使用发展中国家研究所显示的对HIVI p24抗原检验的引入，以缩短免疫静止窗口期限。P24检定检测感染后15-18天的感染(图1)。
已经被考虑的是，用以检测单个供体中的血浆衍生的病毒核酸的更敏感的检验，可能是最有效率的方法，以更进一步减少传染性的窗口。这使用核酸检验(NAT)是可能的，但是这种技术具有污染、训练、实验室空间、质量保证和显著的成本的后勤问题。这些因素限制了将NAT引入更流行地区的一些中心区(Busch M.P.Chapter 2；Blood Safety in the New Millennium；Stramer SL Ed；AABB，2001)。该核酸检验检测感染后大约7至10天的感染(图1)。
对血浆中IgG的检验也被用于诊断HIV，然而，因为在产生的强烈期之后的集聚和在感染之后2周中的分泌，在直到感染后20-24天之前，在血浆中没有出现处于通过常规检定可检测的水平的IgG(图1)。
因此，紧跟在感染之后有7-10天时限，在该时限中目前使用市售的可利用的检验不可能检测到HIV感染，尤其使用适用于在关于大样本数的常规基础上的使用的检验(图1)。
此外，由于这些不同检定依赖的免疫学事件的不同时标，需要平行地进行多重检定以可靠检测感染。例如，从图1可看出，只进行p24检验获得的阴性结果仅能排除疾病某一阶段感染的存在。类似地，过早进行的核酸检测(即早于感染后7～10天)不能检测感染。由于在实际中个体是否感染是未知的，更不用说他们发生感染的具体时间了，因此这些检测表现出很大的缺点。
上面提到的时标涉及HIV感染、抗体产生和检测。在其它的免疫反应激发情况下，该时标可能改变，尽管预期有基本平行的周期，尤其对于慢性感染。然而已认识到，作为基本免疫过程的结果，免疫原刺激引起抗体在血浆中积聚至可检测水平毫无疑问晚于抗体在淋巴细胞内的产生和该免疫原激发的可检测时标又可能不同的其它标志物的产生。因而，根据自免疫原刺激所经历的时间选择不同的检定是合适的。

发明内容
本发明针对这些缺点，进而提供能够在感染后尽可能早地识别感染，不排除在晚期阶段检测感染的可能性的单个检测。
惊人的是目前发现单个检验可用于确定哺乳动物是否被感染，例如，在感染后约3～7天的任何时间。在该检验中进行抗体检定以确定血浆(即已分泌的抗体)和取自单一血样中的淋巴细胞中的抗体的存在。该检定的实施使用样本的血浆和淋巴细胞部分，相关的淋巴细胞抗体或血浆抗体或两者的存在提供阳性结果。因此与其它任何公知技术相比，使用该技术时上述对于HIV由免疫静止“感染窗口”决定的时间间期变短，并且一旦淋巴细胞中的抗体被分泌而不能再从淋巴细胞中检测到，检测抗体的能力不消失。该方法因此能够检测例如少于20天，例如少于15或10天例如从感染后3或7天至10天。
尤其重要地，鉴于淋巴细胞和血浆抗体检测结果的结合，感染后淋巴细胞和/或血浆抗体处于低水平的时期可以通过其它类型抗体的加入而补偿和加强(例如感染后3周左右)。这在抗体水平处于检测极限而两种抗体的联合能产生可检测信号时尤其有利。因此，尤其优选结合样本的相关部分一起检定的方法，如下文所讨论的。这使检定的进行能够从早至感染后数天(其间主要检测新合成抗体)，至感染后数周(主要抗体为血浆抗体)，直到这些血浆抗体水平下降(在感染因素已从机体排出的情况下约产生后12～15个月)。在慢性感染激发因素遗留的情况下，例如HIV或肝炎感染，检定可持续进行。因此从感染后例如3～7起检测淋巴细胞抗体或血浆抗体都是可能的。
因此在一个方面，本发明提供在血液样品中确定针对免疫原的抗体的数量和存在的方法，包含至少以下步骤获得血液样本(包含血浆和淋巴细胞)；以及检测在所述样本中血浆抗体或其部分以及淋巴细胞抗体或其部分的数量和存在；其中所述血浆和淋巴细胞抗体一起检测或分别检定以及它们综合的数量或存在的检定确定了针对所述免疫原的抗体的数量和存在。
代替地描述的，所述第一步骤可缺如以及所述检测步骤可在从一个个体获得的血液样本上进行。
此处应用的术语“检测”和“确定......的数量或存在”包含对抗体产生水平的定量和定性分析，意义是获得样本中产生的抗体的数量的绝对值，和指数、比率、百分比、或类似的抗体产生水平的指示，以及半定量或定性分析。术语“确定......的存在”还包含提示抗体缺乏的阴性结果对评估受检者的免疫反应有价值的情况。
该“综合的”数量或存在指它们在例如数量或定性形式上获得的结果的相加，最优选抗体被一起检测以及它们的综合数量或存在是用于检测靶抗体的检定的读出，该检验作为单一测量来评价。此处应用的“靶”抗体指检定所针对的抗体，并且其识别特定抗原(至少包含免疫原的抗原决定基)。
此处涉及的“免疫原”是任何作为对免疫系统的激发出现的实体以及优选蛋白质性实体。针对所述免疫原的抗体是那些专门识别所述免疫原上的抗原决定基或所述免疫原一部分者。
此处涉及的“血液样本”是用于分析的可能以任何方便方式从任何方便来源获得的血液的样本。尤其优选取自肢体静脉的外周血液样本，对于人类优选臂部。这样的血液样本不是完整血液样本，如下文讨论的，包含其至少一种成分例如红细胞被去除的血液。
此处涉及的“血浆”对应于血液的流动性部分并且几乎缺乏任何细胞成分。血浆可由公知的技术获得，例如通过收集沉降后血液的流动性部分或离心细胞成分后的上清液。值得注意的是，血浆是几乎不含淋巴细胞的。此处应用时，“几乎”指无高水平的混杂成分，例如去除90至95％的混杂成分。
此处在本方法背景中涉及的“淋巴细胞”涉及产生抗体的淋巴细胞，即B淋巴细胞。但是在存在T淋巴细胞时和有关制备分离的淋巴细胞的方法是指制备包含B和T淋巴细胞的分离的细胞总体时本方法也能够实施。然而尤其优选在几乎纯化的B淋巴细胞群进行该检定。
“淋巴细胞抗体”指采取样本时位于淋巴细胞中的抗体，和/或淋巴细胞被分析时尚未分泌的抗体。这样的抗体已经在体内响应抗原刺激而产生；在样本取走后可能在淋巴细胞内继续产生，例如如果它们被以WO96/26443中所述的方法孵育。可以理解在取出样本和检测之间的时间段内可能发生低水平的分泌。因此在分析时那些抗体可能仍然或不再存在于淋巴细胞内，可能已在任何体外过程中被分泌。可能通过裂解而从淋巴细胞中释放的抗体是“新合成抗体”。
此处使用的术语“新合成抗体”涉及对抗原有活性的抗体(即能够识别和结合对应于免疫原的抗原)，其已经由淋巴细胞响应体内免疫原的存在作为持续的免疫反应的一部分在淋巴细胞内产生或合成。因此，在由体内免疫原的存在激发的免疫反应过程中抗体被淋巴细胞合成，即在从受检动物取出包含该淋巴细胞的样本之前或在其当时合成。该术语与“淋巴细胞抗体”同义。
“血浆抗体”涉及对抗原有活性的抗体(即能够识别和结合对应于免疫原的抗原)，其已经由淋巴细胞响应体内免疫原的存在作为持续的免疫反应的一部分在淋巴细胞内产生或合成并随之从个体的淋巴细胞分泌到血液内，因此仅在样本的血浆中被发现。因此，该抗体为体内免疫原的存在激发的免疫反应过程中由淋巴细胞合成并随之分泌至血液中的。该分泌因此发生在样本从动物取出之前或当时。
因此根据从何处检测来说，血浆抗体显然不同于上述“淋巴细胞抗体”和新合成抗体，尽管很明确的是一旦被分泌，“淋巴细胞抗体”将成为血浆抗体，并且这些抗体在化学上和结构上是相同的。区别仅反应了样本取出时抗体分布的瞬间。
然而在分泌之前，淋巴细胞抗体总体中至少一部分可能未经历翻译后修饰和/或未处于成熟状态(见下文)，这些抗体因此在化学和结构上不同于那些已分泌和因此成为血浆抗体的抗体。
此处涉及的“抗体或其部分”涉及对抗原有活性(即能够识别和结合至免疫原或其某部分)的抗体或其部分。对于淋巴细胞抗体来说这可能是在取样本时尚未从细胞分泌的物质，以及例如仍未处于最终的成熟状态尽管它们已具有抗原的性能。如前面提到的，这样的淋巴细胞抗体及其部分通常对应于早于检定和/或采集(如果细胞在适当条件下保存，在细胞裂解之前，可能完全在体内或至少部分在体外发生)2小时产生的抗体，尽管分泌途径的时间过程可能不同。
同时抗体可能在细胞内迅速产生(例如在1-2分钟内，尽管分泌慢得多)，组成抗体的自由链或未糖基化或部分糖基化的抗体或抗体链可能出现在淋巴细胞内，并在它们裂解时释放。由于它们如上所述对抗原有活性，合适情况下这些“部分”可以被检测和包含在新合成抗体的存在或数量检测中。从淋巴细胞释放的抗体或其部分包含新合成抗体或淋巴细胞抗体。
血浆抗体或其部分包含那些保持对抗原的活性(如上述)的部分，但其不相应于分泌形式，例如通过蛋白水解降解而已部分降解者。
此处涉及的“检定”为用于确定样本中抗体的存在和数量的合适的技术。下文描述了未达此目的的合适的检定。
依据本发明对当前和曾经的感染的早期、精确、快速检测在多种应用中十分有用，尤其在该认识用于确定样本或源有机体的实用性的应用中。因此，例如，动物的血液可以被检测以确定它们是否适于出口、进口、旅行、消费、饲养等，例如通过检测针对口蹄疫病毒群(足-和-口疾病的致病原因)刺激的抗体。
因此，将要分析的样本可来自于任何动物，血液从该动物取出。然而优选地所述动物为哺乳动物或实验室动物或农业动物。优选地该动物选自包含以下动物的组鱼、鸡、鸭、鹅、蚂蚁、大鼠、小鼠、兔、狗、猫、山羊、绵羊、奶牛、鹿、猪、马、驴和人。尤其优选本发明用于检测人类样本。
相对小量的血液可用于本检定。淋巴细胞抗体能够在来自少至50y1血液的淋巴细胞的溶胞产物中检测到。因此方便地只需要少于10ml的血液样本。方便地少至不足1ml可以被用于本发明的方法。然而优选应用少至100～500或100～200μl。
依据本发明检测其抗体的方法所针对的抗原或免疫原包含细菌和病毒抗原。临床的重要抗体包含，但不局限于那些来自由例如以下抗体组成的组中者单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV)以及任何肝炎病毒、弓形体(Toxoplasma gondii)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、结核病、梅毒(梅毒螺旋体pallidium)(Treponemapallidium)和衣原体(衣原体trachomatis)(Chlamydia trachomatis)。然而通常，作为激发例如感染或疫苗接种的结果产生的免疫原，引起明确的可被本发明的方法检测到的抗体反应。
在慢性感染导致淋巴细胞内可检测水平的靶抗体以及随后这些抗体分泌至血浆的情况下，也可以采用依据本发明的方法检定这些抗体。从而例如，针对任何免疫原可用传统ELISA方法检测的抗体可用本发明的方法检测。
检测针对这样的抗原的抗体可用于快速确定患者被感染，例如用于血液筛查目的或用于确定和/或监测感染。因此本发明还扩展到本发明的方法用于诊断或监测人类或非人类动物或所述动物的部分被免疫原，优选细菌或病毒感染，以及是否被所述免疫原，优选所述细菌或病毒感染或感染的程度，是参考正常对照和/或参照样本来确定的。
尽管该检测尤其适合于高吞吐量检验，该检测也可以用于任何需要是或否答案的情况，例如在医院内、诊所、实验室或医生的手术室。但更常见的是考虑多个样本采用同样的检测，例如，将用于血库，尤其在世界上血液传播感染性疾病如HIV或肝炎流行性高的地区，这些疾病能够传染给接受血液者。
血库需快速明确血液能否用于输血；不需要将感染划分为具体的阶段或感染后时期。如果发现供血者被感染，他们的详细诊断可个别实施。血库仅需要知道该血液能用或不能用。因此在优选的方面，本发明的方法用于同时或顺序筛查多个样本。尤其优选所述筛查为自动的，例如实施高吞吐量筛查。在尤其优选的方面，确定抗体数量或存在的方法用于确定样本用于移植或自体输血的适宜性，尤其例如样本为如由血库保存的，从一个或多个个体获得的储存血液的等分试样。
可以理解的是概述的用于HIV感染检测的情况仅是广泛的疾病、感染和免疫接种种类的一个例子，对它们的检测将受益于本发明在检测感染中的应用。
该检定具有一些优势，在用作筛查方法时尤其有用，因为它快速回答了个体是否已感染或目前被感染的问题。对这个问题的阳性回答将作出阳性诊断并且，例如排除供者或个体献血，并且随后的分析能够被实施以确定该感染是急性(即抗体位于淋巴细胞中)或曾经的感染(即抗体位于血浆中)。
对淋巴细胞抗体的检测可以通过任何方法方便地实施。例如使用WO96/26443的方法，在由于暴露于感染或免疫接种而导致的体内刺激之后，抗体的体外主动产生和分泌可以被检测。
代替地和最方便地对淋巴细胞抗体的检测通过在所述血液样本中裂解淋巴细胞来实施，例如如WO 00/77525中所描述的，以及下文更详细描述的。在WO 00/77525的例子中披露了制备和分析淋巴细胞抗体的合适方法。
因此在优选的方面，本发明提供了确定血液样本中针对免疫原的抗体的数量或存在的方法，包含至少以下步骤获得血液样本(包含血浆和淋巴细胞)；裂解所述血液样本的淋巴细胞而释放与所述淋巴细胞相关的抗体或其部分；以及检测由淋巴细胞释放的所述淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在和血浆抗体的数量或存在；其中所述血浆和淋巴细胞抗体一起或在分开的检定和确定中检测——它们的综合的数量或存在确定针对所述免疫原的抗体的数量和存在。
代替地描述的，所述第一步骤可缺如以及所述检测步骤可以在由个体获得的血液样本上实施。
此处涉及的淋巴细胞为出现在取自受试者的完整血液样本中的和用于该方法的血液样本中的淋巴细胞。在该方法过程中实施的各种处理和制备可包含从血液样本的其它成分部分或全部分离淋巴细胞。因此，淋巴细胞裂解步骤不需总在血液样本上实施，可以在从血液样本获得的淋巴细胞标本上实施。因此涉及所述血液样本的淋巴细胞涉及出现在全血样本中的淋巴细胞，无论它们是全部或部分从血液样本中纯化。
在一个优选实施例中，实行单一孔检定。换言之，血浆抗体和淋巴抗体检测步骤在单个样本上实施。如上面提到的，这样做的优势是当这些抗体的一种或全部的水平处于可检测阈值时将单个样本中的抗体水平增高到血浆和淋巴细胞抗体检定可检测到的水平。
在这个实施例中，检测步骤在其上实施的样本包含淋巴细胞和血浆。因此，单一检定将确定样本中是否存在任何血浆抗体或淋巴细胞抗体。由于这两种抗体类型将全部与待测抗原或抗体结合，在该检定中不区分这两型抗体。
以前未认识到可实施这样的单一孔检定。血浆和淋巴细胞抗体的同时出现可能曾被认为对将获得的结果有负性影响，例如由于稀释以低于检测阈值的水平出现的抗体。然而本发明人发现，以两种成分混合的方式检测血浆抗体和/或淋巴细胞抗体而敏感性无显著减少是可能的。
单一样本，即包含淋巴和血浆抗体的血液样本可采取在很大程度上未纯化的样本到几乎纯化的淋巴细胞和血浆部分的各种形式。此处涉及的这样的“部分”涉及包含淋巴细胞或血浆的全部血液的哪些分数部分。这些部分可能包含血液的另外的其它成分。
因而检测步骤可在全血样本上实施，一种或更多血液样本成分已在检定实施前被去除以产生用于本发明的方法的“血液样本”。例如，在一个优选实施例中，可以通过利用标准技术，例如基于离心力或亲合力的去除，血红细胞可以从全血样本中去除。
进一步的成分也可被去除，例如非B淋巴细胞。方便地，这样的样本可通过具体成分的阳性选择获得，例如在梯度离心后包含B淋巴细胞的部分(例如血沉棕黄层)和包含血浆的部分可被收集用于检定。
如代替地或附加的，血浆和淋巴细胞部分可使用本领域公知的技术一起或分别从全血样本的剩余部分被完全或部分纯化。如果它们是从全血分别纯化，当进行单一孔检定时它们将被再次结合，即在进行单一孔检定之前混合在一起。
因此在优选的方面中，从全血样本从个体分离出开始，包含血浆的样本或部分被分离以及包含淋巴细胞的样本或部分被分别分离。这样的样本或部分可从全血样本的两个等分试样开始产生，或可以从分成两个单独部分(例如沉降或离心后的上清液和细胞团块)的单个等分试样产生，随后从两个单独部分进行两个分离。在单一孔检定的情况下，所产生的包含淋巴细胞的样本或部分和包含血浆的样本或部分被再结合用于检验。
在实行对包含血浆样本或部分和包含淋巴细胞样本或部分联合的检定中，用于分析的等分试样优选以1∶1的容积比再次结合。然而各种结合将被容许以及方便地可使用任何血浆淋巴细胞样本或部分在例如1∶0.4到1∶4的范围内的结合。优选地，由于淋巴细胞抗体水平相对较低，优选淋巴细胞样本或部分的容积较高，例如血浆淋巴细胞样本或部分在1∶1到1∶4的范围。上述比例依赖于出现在以最高浓度使用的样本或部分中的抗体，它们以该浓度存在于整个血液(其中淋巴细胞被裂解)。如所需要的，根据用于检测的检定的灵敏度和抗体存在的数量，可能进行样本或部分的稀释。因而例如达到1∶1的比例，对每1μl血液，存在于该1μl中的血浆可以与用该最初的1μl血液样本中的淋巴细胞数产生的溶解产物结合。因此，来自1μl完整血液以1∶1比例混合存在的淋巴细胞和血浆抗体数量大约等于该1μl完整血液中存在的抗体数量。在制备用于分析的样本的过程中，含血浆样本含淋巴细胞样本或溶解产物的稀释可被适当调整，因此保持该比例。
淋巴细胞可使用本领域公知的标准技术分离，例如使用过滤方法或应用吸收材料或淋巴细胞制备试剂盒的技术。这样例如各种全血标本可方便地用于获得淋巴细胞，例如从肝素化血液、EDTA-血液等在临床实验室常规制备的。
优选地淋巴细胞使用标准淋巴细胞分离介质例如淋巴细胞分离剂(Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)分离，或使用免疫磁性分离(IMS)或类似以固相为基础的分离系统或其它常用技术。在应用IMS或类似分离技术时，固相例如被覆某系列白细胞特异性抗体的磁珠可用于选择性分离有用的淋巴细胞。优选地抗-CD19抗体用于B细胞分离。应用分离的淋巴细胞时，细胞可能在应用之前采用标准的洗涤方法洗涤。
血浆可通过任何方便的方法制备，例如通过离心(例如1000xg、5分钟)全血样本或仅使全血直立而使细胞成分形成沉淀。
包含血浆和淋巴细胞的样本可针对其成分被浓缩或可被几乎纯化。此处涉及的“几乎纯化的”样本涉及那些在其中其它成分以相当小程度存在，例如占据样本总容量或重量的＜20％，优选＜10％或5％。这样，例如，血浆被可能包括淋巴细胞和它们的成分的细胞碎片沾染可以是可预测的和可容许的。类似地淋巴细胞标本可以包含一些其它细胞和/或血浆成分。然而优选这些应当尽可能减少，例如＜1％。
对于单一孔检定，当产生分离的血浆和淋巴细胞部分用于再次结合时，完全或部分纯化的淋巴细胞可以在从样本加入血浆部分之前或之后裂解。
检测结合的抗体后，如果样本产生阳性结果，针对免疫反应发生或阶段的进一步的信息可通过再次检测分离的淋巴细胞和血浆组分产生。
作为单一孔检定的替代，淋巴细胞和血浆抗体的检定可分别用两个检定进行并且那些检定获得的信息可以综合。优选这样的检定同时进行。在这种情况下，血浆和淋巴细胞样本可如上文描述的用于单一孔检定的方法制备，仅分别通过任何此处描述的无再结合的方法分别地检测。在这样的情况下血浆和淋巴细胞样本几乎分别无淋巴细胞或血浆抗体沾染(例如相对于其它抗体形式的数量＜20％，优选＜10或5％)。然而优选该检定采用单一孔形式实施。
“裂解”淋巴细胞意为包含任何已合成抗体的细胞成分从细胞膜以及内部膜结构的范围内释放以使它们能够被任何方便的生化或化学检定检测到。已知免疫球蛋白通过内质网和高尔基复合体在旁路期间合成和分泌。因此，必要地，裂解需要从这些内部结构中释放。因此，淋巴细胞的裂解可通过公知的细胞裂解方法达到，所述方法有效裂解外部和内部膜结构而不影响所释放的抗体结合至它们互补的抗原决定基的能力，例如通过使用物理裂解方法和细胞裂解缓冲液或溶液。
裂解可通过使用化学方法或另外的裂解方法达到，所述化学方法使用例如清洁剂、高离液序列制剂、裂解缓冲液例如包含EDTA，所述另外的裂解方法例如超声波降解或通过产生剪切压力物理裂解。
然而优选使用裂解缓冲液，因为这通常是最简单和最方便的技术，例如在此处例子中所描述的，即缓冲液包含清洁剂例如Tween 20和/或NP-40。优选使用终浓度为0.01至0.1％Tween，尤其优选在0.05％左右，和/或使用终浓度为0.1％至1％的NP-40，尤其优选在0.5％左右。可使用适当的裂解缓冲液以稳定释放的抗体，例如控制PH或降解。因此如果必要可使用例如包含蛋白酶抑制剂的缓冲液。
与裂解缓冲液的孵育在适当的时间内进行以使裂解最大化，例如室温3至15分钟，例如持续大约5分钟左右。
另外的裂解方法包含例如使用冻/融循环或甚至使用液氮。这导致溶解产物，其中释放的抗体位于用于随后的步骤的溶液中。
可以理解的是为了在待检测样本中获得足够数量的新合成抗体，希望的是尽可能多的淋巴细胞被裂解以释放抗体。于是，优选裂解方法适于此目的以及至少40％或50％、更优选至少60％、70％或80％以及更优选至少90％、95％样本中的淋巴细胞被裂解。淋巴细胞裂解后样本中的抗体成分通过合适的技术检测，该技术允许如下文所述检测靶抗体。
淋巴细胞和血浆抗体的检测可通过任何能识别那些结合至关心的免疫原(或其抗原决定基)引起免疫反应的抗体的方法。因此可以使用任何导致反映靶抗体存在的信号产生的检测技术。例如可使用酶联检定，其中可溶或不可溶产物可由底物产生，所述产物的数量可以被估测。
方便地淋巴细胞和血浆抗体可例如通过固相结合检定的方法检测，例如ELISA，其中它们结合至该检定中使用的抗原，尽管所使用的抗原可以与在最初部位激发免疫反应的免疫原不同。因此，检定中使用的两种抗原和曾经或正在激发体内抗体产生的免疫原将依靠同样的或非常类似的抗原决定基同时结合至被检测的抗体，其它方面抗原和免疫原可能不相同。因此，本发明的方法中使用的抗原可以是包含相关免疫原的所有或某些部分的材料，例如来自感染个体，或来自相同或类似材料的纯化部分，以及可以合成制备，例如通过化学合成或重组表达，具有与天然抗体相关的添加的或删除的部分。因此可使用仅表达适合的抗原决定基的融合蛋白或分子。
方便地，对于检测步骤，样本可以与携带合适结合配偶体的固相接触以固定抗体或待检测抗体。此处涉及的“结合配偶体”为一起形成结合对的两个配偶体中的一个以及能够选择性和特异性结合至另一个，例如配基和受体或抗原和抗体。方便地结合配偶体为抗原(免疫原或其部分)或该抗原(即一个或更多)，被待检测的抗体或该抗体或其部分识别。
然而在另一替代中，可使用不是靶抗体的抗原的不同结合配偶体，例如蛋白A、蛋白G或识别和结合至待测抗体的抗体。在后者的情况中，不需要高度特异性结合，因为在该检定方法的实施例中特异性通过随后抗原的结合产生，所述抗原在检测过程中特异性结合至待检测抗体。因此，在所有实施例中产生特异性抗原抗体复合物。优选固定于固相支撑的这样的复合物的存在，在本发明方法的检测步骤中是被查实的。
因此在优选的方面中，本发明方法的检测步骤包含通过形成抗体抗原复合物检测抗体或其部分，其中所述抗原(优选不是抗体)包含或容纳免疫原或其包含至少该免疫原的抗原决定基的部分。
在具体优选的方面中，检测血浆或淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在的步骤包含使所述样本的包含血浆部分和所述样本的包含淋巴细胞部分接触优选携带于固相上的一种或更多抗原，其中抗原被待测抗体或该抗体识别。代替地识别待测靶抗体或该靶抗体的一种或更多抗体可以与所述部分接触。此处描述的样本的所述部分可以出现在单个样本并且它们的检验可通过结合至同样的固相支持同时实施。代替地，所述部分可以是独立的和分离的并且该抗体可在分离的检定中在那些部分中被检测。
在此处描述的这个和其它各方法中，结合的抗体的数量可通过与对照和/或参考样本对比来确定。适当的对照或参考样本可以是阴性或阳性对照，例如空白、正常样本或示踪样本(spiked samples)。
采用的固相可以是目前广泛使用或建议用于固定、分离等的任何众所周知的支撑或介质。这些可采用粒子、片、凝胶体、滤器、膜、或微滴定带、管或板等形式以及方便地可以由聚合材料制成。然而，为了操作容易和简便，可以方便地使用标准微滴定板和孔，优选标准ELISA板。
固相也可被修改以允许一个范围内不同抗原的特异性抗体的检测。因此例如，合适的固相材料例如硝化纤维或类似者的盘或条带等可以被覆不同抗原并同时加至微滴定孔或其它合适的容器，不包含任何接触抗原。抗体结合检测方法于是可用于在不同抗原间进行区分。因此本发明扩展为使用多个固相，每一固相携带可被或对不同靶抗体识别的不同的抗原或抗体。
方便地当使用夹心型检定时，固相携带一种或更多被待测抗体或该抗体或其部分(靶抗体)识别的抗原(固相抗原)。代替地，固相可携带一种或更多识别待测抗体或该抗体或其部分(靶抗体)的抗体(固相抗体)。为允许依据本发明的方法检测，合适的是，根据所述固相支撑是否如上述携带抗体或抗原，一种或更多被固定在所述固相上的靶抗体识别的抗原与所述固相接触，或代替地一种或更多识别固定在所述固相上的靶抗体的抗体与所述固相接触。这些抗原或抗体然后开始与固相支撑结合，这些抗原或抗体可能被适当标记以使如下文所述能够被检测。
均涂覆有与某临床状况或综合症一致的相关抗原的该套盘可被用于识别哪种被疑及的因素导致了疾病。该盘然后将在分离的孔中单独处理。这是特别节省材料的过程，因为能够使用同一小量血液实施同时检测多个不同抗原(或来自相同感染因素或来自在每一病例临床综合症或状况相关的不同感染因素)的检测。另一方法是在多个孔中使用多个样本例如包含裂解的淋巴细胞和血浆，所述多个孔均被覆不同的结合配偶体例如抗原或抗体，以及相应地进行检测。
用于结合配偶体的结合的技术例如抗原至固相也是及其众所周知和在文献中广泛描述的。很多标准的抗原被覆过程被描述，例如在ELISA和其它固相免疫检定中，理论和实践问题(Theoretical andPractical Aspects)1988，ed.D.M.Kemeny & S.J.Challacombe，JohnWiley & Sons。如需要，该板可被洗涤和封闭，再使用标准技术。因此，例如，标准微滴定板如ELISA板可简单地被包覆结合配偶体，通过在4℃将该板与含有如浓度为0.01至150μg/ml蛋白的结合配偶体的适当缓冲液如磷酸盐缓冲盐(PBS)孵育过夜，随之使用适当封闭介质(通常为包含封闭蛋白如牛血清或来自干牛奶的蛋白的中性缓冲液例如PBS，)封闭并在例如37℃孵育1至5小时。去除封闭液后该板即备好待用。
方便地，需用于实施本发明的方法的材料和装置可以试剂盒的形式提供，所述试剂盒例如包含用于检测步骤的结合配偶体包被的固相、裂解缓冲液和用于淋巴细胞分离的携带适当结合配偶体的固相。提供固相支撑时其可以包被有结合配偶体并适当封闭。
抗体与其抗原的结合然后被检测。检测步骤，就信号的阅读来说，方便地在溶液中发生。然而，可能产生不能在溶液中读出的不溶性产物或信号。可使用任何公知的检测抗体结合的方法，只要产生可读信号；例如依靠荧光、化学发光、比色或产生可检测信号的酶反应。不使用固相时，靶抗体可通过其它血清学方法例如光散射(如用悬液计测量悬液)和谐振过程。方便地，免疫检测可用作检定方法，优选酶联免疫吸附检定(ELISA)，例如Abbott PRISM ELISA(AbbottLaboratories，Chicago，USA)或Ortho ELISA(Ortho ClinicalDiagnostics，New Jersey，USA)。然而，在本发明检测抗体的范围内也可考虑除ELISA外的其它检测程序。使用包被的盘或玻璃板的技术，例如注满裂解的淋巴细胞和/或血浆的悬液也是合适的。任何本该领域公知的用于检测抗体的标准技术例如产生不溶或可溶产物的技术，可以被选择用于本发明的方法，或用于定量检测或用于定性(例如是/否)检测。
免疫检定，尤其ELISA技术是该领域众所周知并已在文献中描述(见例如ELISA和其它固相免疫检定，理论和实践问题；1988，ed.D.M.Kemeny & S.J.Challacombe，John Wiley & Sons)。
在裂解淋巴细胞样本的接触后，可以加入酶-抗体轭合物，例如在ELISA检测方法中，其结合至与固相上的抗原结合的抗体。类似地，如果待测抗体通过结合配偶体例如抗异种抗体的抗体非特异性结合至固相，可以加入特异性结合待测的已固定抗体的酶-抗体轭合物。然后加入酶底物以产生可检测信号。在本发明中，方便地使用可溶性底物，产生在溶液中可检测的信号。这是有优势的，因为其易化和简化了大量样本的操作和处理。能够估计抗体的产生量，尽管上面提到不需绝对定量，以及如需要，可获得定性或半定量结果。
为方便起见可选择底物产生分光光度计可检测的信号，其可通过读吸收率简便地读出，例如使用标准ELISA板读数器。实际上，可以使用标准ELISA试剂，其具有使本发明的检定与现有临床实验室常规采用的方法和技术兼容的优势。然而，可以使用其它检测/信号产生系统，产生可通过荧光、化学发光等检测的信号。
免疫-酶放大方法也可被用于提高信号和增加灵敏度，例如使用抗生物素蛋白-生物素方法如Sigma提供的Extravidin系统。生物素标记的第二抗体与过氧化物酶抗生物素蛋白复合物一起用作为ELISA试剂。由于一分子抗生物素蛋白能够结合数分子生物素，抗生物素蛋白-生物素过氧化酶复合物增加了过氧化物酶分子的表面浓度，使该方法具有更高灵敏度。
为确保本发明的检定方法可靠应用，可包含适当的对照用于确定抗体的存在或数量。例如为确定所记录的信号不是由于偶然和非特异性(旁观者)激活的淋巴细胞，可以使用阴性对照抗原。该抗原来自经研究最不可能引起该疾病或感染的感染因素，例如破伤风类毒素。这样的旁观者激活的淋巴细胞的数量无论如何应低于阳性结果所需要的。
本发明的淋巴细胞抗体在淋巴细胞裂解后检测，一个益处是避免了任何孵育步骤或特殊检定条件。因此，所述样本中的淋巴细胞优选不在能使抗体在本发明的方法之前，即从全血样本或衍生标本收集后产生和/或分泌的条件下孵育。允许产生和/或分泌的条件为例如在＞4℃例如从20℃到39℃例如在37℃左右孵育＞5秒钟，例如30秒钟至10分钟或更长。无孵育步骤意味着样本在取样后可以方便地处理以实现细胞的裂解或溶解，然后溶解产物在实施检定步骤之前可被保存，例如冷冻或冷藏一段时间。
代替地，如前所述，在淋巴细胞被裂解前，样本例如一成分已被去除的全血、半纯化(例如血沉棕黄层)或纯化标本可被保存例如通过冷冻或冷藏(根据样本选择)一段时间例如几小时或几天，例如大于4小时，例如从6小时到1、2、3或4天。例如，如必需或想要，在样本被处理以裂解细胞前纯化的淋巴细胞标本可被冷冻保存一段时间例如几小时或几天，或冷藏例如几小时。因此例如，纯化的淋巴细胞在被处理裂解或溶解细胞前可在＞0℃≤4℃(例如在4℃)保存几小时，例如4到6小时。血浆可以被类似地保存。
然而，已发现某些样本例如全血标本可冷藏保存更长时间而不对细胞产生不利影响以及不干扰检测结果。例如已发现在开始淋巴细胞纯化过程之前，全血样本可冷藏(例如4℃)至少6天，如果需要样本可间歇室温(18-25℃)存放至少6小时，而不对检测抗体的实验的实施产生不利影响。
当血液样本放置在实验室和冷藏保存而常规或辅助血浆/血清检测过程的结果尚未决定时尤其有用。这意味着淋巴细胞的物理完整性在保存过程中是保持的，因此允许随后淋巴细胞从保存的血液中纯化(如需要)并进行淋巴细胞裂解，而不显著减少被检测的抗体。
如果样本即将采取并保存更长时期，则标准方法是分离淋巴细胞，裂解它们，通过冷冻分别保存淋巴细胞溶解产物和血浆。
新的代替方法是冷冻全血。这能通过加入在冷冻过程中保存淋巴细胞完整性的溶液例如包含DMSO的溶液来实施。示例中描述了在冷冻之前向全血中加入等量包含柠檬酸盐+20％DMSO的缓冲液。DMSO保护细胞避免在冷冻过程中裂解以及，当解冻后，它们可如正常样本一样处理。因此在优选的方面，收集的样本被冷冻在包含终浓度为5-15％优选7.5-12.5％，例如10％的DMSO的溶液中。选择地DMSO可被补充聚乙二醇，这种情况下DMSO浓度可以减低，例如至3-7％，例如5％。
因此，在优选的实施例中在淋巴细胞裂解之前，例如血液样本可以保存几天例如直到6天或更多，尤其当在约4℃(例如从1到6℃)或更低冷藏保存时甚至允许在冷藏期间在两次或更多次偶然情况下样本从其冷藏环境取走例如在室温下例如4到6小时的间隙时期，而不对检定结果产生不利影响。当血液样本冷藏保存而但不可避免该样本被短时间在工作台上室温放置时这尤其有用。令人吃惊地，已发现依据本发明的检定方法细胞活性未被显著影响而干扰或妨碍获得可接受的结果。在另一优选实施例中，当使用纯化的淋巴细胞标本时，这些样本(和/或血浆)可以在低于4℃保存(例如＞0℃到4℃，例如几天或更长)或在4℃以上保存(直到6小时)。
在该检定中保存各种待用样本的可能性使本发明的方法尤其适合于较大型诊断性实验室，此时昂贵的自动实验室设备例如ELISA硬件能够同一时间使用相当大数量的样本最有效运转。它也意味着样本可以在很多不同场所采集并邮寄或运送至中心诊断实验室用于以类似于其它类型检测中建立的用于化学血清样本检测的过程的方式检测。
在本发明优选的方面中，使用单一孔检测，其中全血样本分为两个部分，从这两个部分中制备血浆样本和淋巴细胞样本或包含淋巴细胞部分和包含血浆部分被从单独的全血等分试样中分离。然后淋巴细胞被裂解以及样本再次结合，以及抗体水平被检测。
因此在特别优选的方面中，本发明提供了确定血液样本中针对免疫原的抗体的数量或存在的方法，包含至少以下步骤获得全血样本；从所述样本的等分试样分离血浆；从所述样本的等分试样分离淋巴细胞；结合所述血浆和淋巴细胞；裂解所述淋巴细胞以释放与所述淋巴细胞相关的抗体或其部分(此步骤可选择地在结合之前实行)；以及在单一检验中检测从淋巴细胞释放的所述淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在和血浆抗体的数量或存在；其中所述血浆和淋巴细胞抗体的综合的数量和存在确定针对所述免疫原的抗体的数量或存在。
特别优选地所述淋巴细胞通过所述固相支撑上的结合配偶体亲和结合至固相支撑(例如珠子，例如磁珠)，由此被分离，所述结合配偶体特异结合至所述淋巴细胞上它的结合配偶体，例如所述固相支撑携带结合至淋巴细胞上互补分子的抗-CD19。尤其优选地，使用清洁剂尤其优选NP-40和/或Tween 20进行裂解。尤其优选所述靶抗体的检测通过使靶抗体和一个或更多抗原在固相上接触而获得。尤其优选所述全血样本和/或从其分离的所述血浆或淋巴细胞在检定前被冷冻。还优选，本发明的方法在多个样本上实施，例如来自多个个体。


参考以下非限制性的示例，现在将更详细描述本发明，其中图1示出HIV感染中可检测的事件。
具体实施例方式
例1人工方法制备制备柠檬酸盐储存溶液(1O×柠檬酸盐)7g枸橼酸三钠二水化物和2.5g枸橼酸溶于90ml蒸馏水中。将最终容量调至100ml。该溶液在2-5℃储存。
制备急性血浆(PlasmAcute)缓冲液磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.2±0.5.
每升PBS加入100μl Tween20并混匀。每90ml上述混合液中加入10ml枸橼酸盐储存液。不用时需冷藏。
制备含奶粉的急性血浆缓冲液每100ml急性血浆缓冲液加入10g脱脂奶粉(Clover Elite FatFree)并混匀。使用前澄清泡沫。“脱脂”牛奶通常少于1％的脂肪。该制剂需在每次操作前新鲜配制以及不使用时需冷藏。
制备100ml 10×裂解缓冲液保存液 100ml 10×缓冲液
5M NaCl 30ml1M Tris 10ml100％NP-40 5mlTween 20 0.5ml蒸馏水 54.5ml制备磁珠计算需处理的患者样本数(EDTA血液)。将1ml急性血浆缓冲液加入艾本德(Eppendorf)管中。必需的磁珠(一种携带有共价结合的小鼠单克隆抗CD19抗体的λ荧光珠)容积的计算10μl每样本+5μl额外。将所计算量的(10μl每样本+5l额外)磁珠保存溶液加入艾本德管中。
各溶液被轻柔混合，将该管放置在磁力表座。当管放置在表座上时将液体从管中轻柔移出。管从表座移出。加入与开始加入的保存液相同量的急性血浆缓冲液。
分离淋巴细胞标记所处理的对应于患者样本的艾本德管。在管中加入635μl急性血浆缓冲液。加入10μl提前备好的磁珠悬浮液。在相对应的标记管中加入350μl未凝固血液并轻柔混匀。
以端-端翻转的方式每秒一次轻柔旋转各管5分钟。将各管在磁力表座上放置5分钟(不多于)。
当各管放置在表座上时将液体从管中轻柔吸出并弃去。各管从磁力表座上移去。
加入1,400μl急性血浆缓冲液，在磁力表座上再将洗涤步骤重复3次，每次3分钟。最终的磁珠悬浮在175μl急性血浆缓冲液中。
细胞溶解将18μl的10×裂解缓冲液加入175μl细胞悬液中。用吸液管以吸起和放出的方式将其彻底混匀并在室温下放置5分钟。加入175μl含10％奶粉的急性血浆缓冲液。
血浆的制备通过离心(1000g，5分钟)后回收血浆从全血样本中制备血浆。
抗体检测这在溶解产物和血浆上实施，混合在一起或并行。
将400μl样本加至Abbott PRISM ELISA系统(Abbott实验室，美国，芝加哥)。可选择地，可应用MUREX的微滴定(microtitre)HIV ELISA-HIV 1/2 Group 0进行分析。
例2自动方法本发明的方法方便地适用于自动分析，下面的方法描述了使用BioRobot M48制备用于分析的淋巴细胞溶解产物的方案。
概述在运行该方案之前，使用者必须将血液样本(每一待处理样本400μl)、塑料器具和各试剂(在塑料试剂容器内)放置在遥控设备(robot)内的适当位置。被启动后，遥控设备将用等量等于血液浓度的缓冲液1稀释样本。然后遥控设备将在稀释样本中加入CD19珠子并混合孵育5分钟以使细胞与珠子结合。进行磁性分离，保留珠子/细胞复合物并弃去液体。珠子/细胞复合物在缓冲液1中洗涤2次，最后悬浮于缓冲液2，缓冲液2将裂解细胞膜并释放细胞内抗体。缓冲液2保持细胞核完整，因此避免了否则将成为技术难题的粘性的增加。该方案的最后阶段是用缓冲液3稀释溶解产物，这样做是为了加强储存稳定性并与下游的应用相适应。
定义平台BioRobot M48具有六通道吸液管头，因此同时处理六个样本。所有与这样的六个样本的组直接相关的工作面位置称为平台。平台包含可随意处理的为每一样本备有7个孔的检定盘、六个专用样本位置(这些在急性血浆方案中未使用，因为它们处于周围环境温度)、六个位于加热平台上的位置(一行)和六个位于洗脱平台(温度控制的)上的位置(一行)。
试剂容器使用者在其中充满运行所用试剂的塑料盘。BioRobotM48具有7个小的和4个大的试剂容器。
缓冲液1优选PBS/枸橼酸盐/Tween缓冲液2优选1×裂解缓冲液缓冲液3优选PBS/枸橼酸盐/Tween/奶粉磁性分离概括地，这是一个过程，该过程中顺磁性的珠子和任何与它们相联系的物质被吸引至磁铁，而珠子起初在其中悬浮的液相被移除。在BioRobot M48上这通过吸出液相、珠子和细胞的混合物，然后在吸液管顶端加磁铁以保留珠子和CD19+细胞，同时弃去其它任何物质而完成。
洗涤步骤在洗涤缓冲液中悬浮珠子，然后进行磁力分离。
引导文件这是BioRobot M48方案的一部分，其中每一步骤对于所有选择的平台在进行至下一个步骤之前进行。导引文件常用于在样本处理开始之前向检定盘和其它平台位置分配试剂。
平台文件这是BioRobot M48方案的一部分，其中所有步骤对于一个平台在进行至下一个选择的平台之前进行。平台文件常用于样本的处理。
收尾文件这是BioRobot M48方案的一部分，其中每一步骤对于所有选择的平台在进行至下一个步骤之前进行。收尾文件常用于在样本处理后使运转正常，如热-和洗脱平台温度的稀释复位以及将分档器电机回复原位。
方案的描述引导文件P2小试剂容器1中的珠子被重新悬浮以防止任何沉淀物并确保珠子的均匀分布。
P2从小试剂容器1中吸出珠子。
P2将100μl珠子分配至所有待用检定盘的孔1中。
P3将900μl缓冲液1从大试剂容器1转移至所有待用检定盘的孔2和3中。
P4将400μl缓冲液1从大试剂容器2转移至加热平台上待用的所有行的每个管中。
P5将180μl缓冲液2从小试剂容器2转移至洗脱平台上待用的所有行的每个管中。
平台文件B2孔0中的珠子被重新悬浮并移至加热平台。
B3血液/缓冲液1/珠子在加热平台上混合孵育5分钟。
B4吸出血液/缓冲液1/珠子，珠子用磁力保留在顶端，液体被弃去。
B5珠子/细胞在孔2的缓冲液1中重新悬浮B5吸出缓冲液1/珠子/细胞，珠子用磁力保留在顶端，液体被弃去。
B6珠子/细胞在孔3的缓冲液1中重新悬浮。
B6吸出缓冲液1/珠子/细胞，珠子用磁力保留在顶端，液体被弃去。
B7珠子/细胞在洗脱平台上的各管内在180μl缓冲液2中被重新悬浮；细胞膜被溶解。
收尾文件E2将520μl缓冲液3从小试剂容器3中转移至洗脱平台上被用过的所有行的每个管中。
E2洗脱平台的温度减少至8℃用于保存。
例3处理前全血的冷冻冷冻全血细胞的效果被确定。所用冷冻混合物为含有枸橼酸盐(见例1)、含或不含20％DMSO的急性血浆缓冲液。
在全血中加入等量冷冻混合剂。然后混合物被冷冻和储存(或-20℃或-70℃)。然后样本被解冻至2-8℃并如新鲜全血一样被处理(NB 50％细胞/单位容积)。每一储存温度全血的四个重复样本在适当的温度下保存过夜，然后处理所有样本的等同容量以通过标准方法重新获得B细胞(见例1)。使用血细胞计数器对重获的B细胞显微计数。用4个重复样本的均值表示结果。

因此在DMSO存在情况下处理新鲜样本或冷冻样本以重获B细胞无显著差异。
例4B细胞溶解产物和血浆的混合已经分析了重新结合淋巴细胞溶解产物和血浆对检定敏感性的效果。所有样本在艾博特棱镜(Abbott prism)系统上检测。所示数据为6样本和两次重复的结果。给出了均值。阴性血浆和淋巴细胞溶解产物如例1中所述被制备和再结合，或如下所述与缓冲液结合以检测背景水平上的再结合的效果。
300μl血浆+100μl 2×裂解缓冲液 0.34sig/cov300μl血浆+100μl 裂解缓冲液 0.34sig/cov300μl血浆+100μl 同源溶解产物 0.4sig/cov仅400μl血浆 0.38sig/covsig/cov是ELISA中产生的信号，由截止值分割，使得任何大于1的sig/cov值作为阳性结果处理以及任何小于1的sig/cov值为阴性结果。截止值基于阴性对照样本的检测所产生的信号对于每一实验经统计学确定。
阴性血浆样本的值不因或溶解产物或裂解缓冲液的存在而改变。
样本的再结合也在阳性样本上被检验。来自单一患者的血浆和淋巴细胞溶解产物中的抗体水平首先被分别检测，然后以不同比例再结合后被检测。
HIV阳性样本的血浆 ＝24.5sig/cov来自同一患者的B-细胞溶解产物 ＝0.42sig/cov检测两重复样本，均值在下面给出阳性血浆+同质溶解产物400μl400μl＝10sig/cov400μl0 ＝24.5sig/cov300μl100μl＝19sig/cov200μl200μl＝11sig/cov100μl300μl＝7sig/cov0 400μl＝0.42sig/cov可以看出信号仅有的减低是由于在阳性样本中加入缓冲液的稀释作用，即再结合溶解产物和血浆不抑制由检定产生的信号。
以上所述的适于在艾博特棱镜系统上应用的实践中的变化如下400μl血浆+400μl溶解产物；混合；→最少400μl进入PRISMELISA250μl血浆+250μl溶解产物；混合；→最少400μl进入PRISMELISANB仅100μl在该检定中检测。
权利要求
1.一种确定血液样本中对于免疫原的抗体的数量或存在的方法，至少包含以下步骤在所述样本中检测血浆抗体或其部分以及淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在，其中所述血浆和淋巴细胞抗体被一起或在分开的检定中被检测，并且它们的综合的数量或存在的确定确定了对于所述免疫原的抗体的数量或存在。
2.如权利要求1所要求的方法，其中所述血液样本的淋巴细胞被裂解由此释放与所述淋巴细胞相关的抗体或其部分；和从淋巴细胞释放的所述淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在以及血浆抗体的数量或存在被检测。
3.如权利要求1或2所要求的方法，还包含以下步骤从所述血液样本分离包含血浆的样本；和从所述血液样本分离包含淋巴细胞的样本。
4.如权利要求1至3中之任一个所要求的方法，其中所述全血样本被分成两部分，用于包含淋巴细胞的样本和包含血浆的样本的制备。
5.如权利要求1至3中之任一个所要求的方法，其中单一全血的等分试样被用于制备包含淋巴细胞的样本和包含血浆的样本。
6.如权利要求3至5中之任一个所要求的方法，其中所述包含淋巴细胞的样本和/或所述包含血浆的样本为纯化标本。
7.如权利要求3至6中之任一个所要求的方法，其中所述包含血浆的样本和所述包含淋巴细胞的样本在裂解淋巴细胞之前再结合。
8.如权利要求3至6中之任一个所要求的方法，其中所述包含血浆的样本和所述包含淋巴细胞的样本在裂解淋巴细胞之后以及在所述检测步骤之前再结合。
9.如权利要求7或8所要求的方法，其中所述包含血浆的样本和包含淋巴细胞的样本的比例为1∶0.4至1∶4之间，优选为1∶1。
10.如权利要求1至9中之任一个所要求的方法，其中所述血浆和淋巴细胞抗体在单一检定中检测。
11.如权利要求1至9中之任一个所要求的方法，其中所述血浆和淋巴细胞抗体在分开的检定中检测。
12.如权利要求1至11中之任一个所要求的方法，其中所述血液样本为哺乳动物，优选人类的血液样本。
13.如权利要求1至12中之任一个所要求的方法，其中所述血液样本少于1ml。
14.如权利要求1至13中之任一个所要求的方法，其中血红细胞被从所述血液样本中去除。
15.如权利要求1至14中之任一个所要求的方法，其中非B淋巴细胞被从所述血液样本中去除。
16.如权利要求1至15中之任一个所要求的方法，其中所述免疫原来自感染或接种疫苗。
17.如权利要求1至16中之任一个所要求的方法，其中所述免疫原为细菌或病毒抗原，优选抗原来自选自以下抗原的组单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、口蹄疫病毒、弓形体、结核、梅毒和衣原体。
18.如权利要求1至17中之任一个所要求的方法，其中淋巴细胞通过使用化学裂解缓冲液(优选包含清洁剂)或物理裂解方法被裂解。
19.如权利要求1至18中之任一个所要求的方法，其中通过将所述抗体或其部分与一种或更多识别所述抗体或其部分、优选携带在固相上的抗原或抗体相接触来检测所述抗体或其部分。
20.如权利要求1至19中之任一个所要求的方法，其中释放的抗体通过固相结合检定的方法来检测。
21.如权利要求19或20所要求的方法，其中所述固相携带一种或更多被待测抗体或其部分(靶抗体)所识别的抗原(固相抗原)。
22.如权利要求19或20中所要求的方法，其中所述固相携带一种或更多被待测抗体或其部分(靶抗体)所识别的抗体(固相抗体)。
23.如权利要求1至22中之任一所要求的方法，其中检测步骤通过免疫检定实施，优选为ELISA。
24.如权利要求19至23中之任一所要求的方法，其中一种或更多被固定在所述固相上的靶抗体所识别的抗原与所述固相接触。
25.如权利要求19至23中之任一所要求的方法，其中一种或更多被固定在所述固相上的靶抗体所识别的抗体与所述固相接触。
26.如权利要求1至25中之任一所要求的方法，其中所述检测步骤在溶液中发生。
27.如权利要求1至26中之任一所要求的方法，其中可溶性底物被用于检测步骤并产生分光光度检定法可检定的信号。
28.如权利要求1至27中之任一所要求的方法，其中使用阴性对照。
29.如权利要求19至28中之任一所要求的方法，其中应用多个固相，每个带有识别不同靶抗体的不同抗原或抗体。
30.如权利要求1至29中之任一所要求的方法，其中用于该方法的血液样本和/或包含淋巴细胞的样本和/或包含血浆的样本在淋巴细胞被裂解前在4℃或更低的温度下保存。
31.如权利要求30所要求的方法，其中在该方法中使用的血液样本从全血中获得，并且所述全血在淋巴细胞被裂解之前使用5-15％DMSO被冷冻。
32.如权利要求1至31中之任一所要求的方法，其中所述样本中的淋巴细胞不在能够使抗体先于所述方法产生和/或分泌的条件下孵育。
33.如权利要求1至32中之任一所要求的方法，其中多个样本被同时或按顺序检测。
34.如权利要求1至33中之任一所要求的方法，被用于识别被免疫原感染的动物，优选为被HIV感染的病人。
35.如权利要求34所要求的方法，其中所述动物被所述免疫原的感染，优选为HIV的感染，发生在从所述动物获取血液样本之前的小于10天内。
36.如权利要求1至35中之任一所限定的方法的用途，用于高吞吐量筛查中。
37.如权利要求36中所述的用途，其中所述筛查为血库血液样本的筛查。
38.如权利要求1至37中之任一所限定的方法或用途，用于确定样本用于个体间移植或移注的适用性。
39.如权利要求1至35中之任一所限定的方法的用途，或者由权利要求36或37所限定的用途，用于诊断或监测免疫原、优选为细菌或病毒对人或非人动物或所述动物的一部分的感染，并且由所述免疫原、优选为由细菌或病毒所感染的存在或程度，通过参考适当对照和/或参照样本来确定。
全文摘要
本发明涉及确定血液中针对免疫原的抗体的数量或存在的方法，包含至少以下步骤在所述样本中检测血浆抗体或其部分以及淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在，其中所述血浆和淋巴细胞抗体一起或在单独的检定中检测，以及它们的综合的数量或存在的确定确定了针对所述免疫原的抗体的数量或存在。也提供了该方法在高吞吐量筛查、血库样本筛查和诊断中的应用。
文档编号G01N33/68GK1950702SQ200480035469
公开日2007年4月18日 申请日期2004年11月1日 优先权日2003年10月31日
发明者戴维·派克 申请人:普拉斯马柯特有限公司