专利名称：针对肝细胞生长因子的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及单克隆抗体(mAb)和用于开发新生物制剂的重组DNA技术的组合，更具体的是，例如，涉及结合并中和肝细胞生长因子的单克隆抗体的生产。
背景技术：
人肝细胞生长因子(HGF)是由间叶细胞产生的一种多功能异型二聚多肽。已显示HGF刺激血管新生、形态发生和有丝分裂(motogenesis)，以及各种细胞类型的生长和扩散(Bussolino等，J.Cell.Biol.119629，1992；Zarnegar和Michalopoulos，J.Cell.Biol.1291177，1995；Matsumoto等，Ciba.Found.Symp.212198，1997；Birchmeier和Gherardi，Trends Cell.Biol.8404，1998；Xin等Am.J.Pathol.1581111，2001)。HGF的多效性活性通过其受体，一种由原癌基因cMet编码的跨膜酪氨酸激酶介导的。除调节多种正常的细胞功能外，已显示HGF及其受体c-Met参与肿瘤的引发、侵入和转移(Jeffers等，J.Mol.Med.74505，1996；Comoglio和Trusolino，J.Clin.Invest.109857，2002)。HGF/cMet在多种人类实体肿瘤，包括源自肺、结肠、直肠、胃、肾、卵巢、皮肤、多发性骨髓瘤和甲状腺组织的肿瘤上共表达，通常过量表达(Prat等，Int.J.Cancer 49323，1991；Chan等，Oncogene 2593，1988；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993；Derksen等，Blood 991405，2002)。HGF作为这些肿瘤的自分泌(Rong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914731，1994；Koochekpour等，Cancer Res.575391，1997)和旁分泌生长因子(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993)及抑制细胞凋亡的调节剂(Gao等，J.Biol.Chem.27647257，2001)。
HGF是一个102 kDa的蛋白质，其序列和结构类似于血纤维蛋白溶酶原和其他凝血酶(Nakamura等，Nature 342440，1989；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993，每篇在此处引入作为参考)(图1)。人类HGF以728个氨基酸前体(preproHGF)合成，其经过细胞内剪切形成无活性的单链形式(proHGF)(Nakamura等，Nature342440，1989；Rosen等，J.Cell.Biol.1271783，1994)。通过细胞外分泌后，proHGF被剪切产生具有生物学活性的二硫键连接的异型二聚分子，由α-亚基和β-亚基组成(Nakamura等，Nature 342440，1989；Naldini等，EMBO J.114825，1992)。α-亚基包含440个残基(糖基化69 kDa)，由N-末端的发夹结构域和4个环饼(kringle)结构域组成。β-亚基包含234个残基(34 kDa)，并具有一个丝氨酸蛋白酶类结构域，其缺乏蛋白水解活性。HGF的剪切对于受体的激活是必需的，但对于受体的结合不是必需的(Hartmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911574，1992；Lokker等，J.Biol.Chem.26817145，1992)。HGF包含4个推测的N-糖基化位点，1个位于α-亚基中，3个位于β-亚基中。HGF具有2个独特的细胞特异性结合位点一个cMet受体的高亲和力(Kd＝2×10-10M)结合位点和一个发夹硫酸蛋白多糖(HSPG)的低亲和力结合位点(Kd＝10-9M)，其存在于细胞表面和细胞外基质上(Naldini等，Oncogene 6501，1991；Bardelli等，J.Biotechnol.37109，1994；Sakata等，J.Biol.Chem，2729457，1997)。NK2(包括α-亚基的N-末端和前两个环饼结构域的一种蛋白质)足以结合到cMet并激活活动性的信号级联，然而全长蛋白质对于促有丝分裂的应答是必需的(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993)。HSPG通过与HGF的N末端互作而结合到HGF(Aoyama等，Biochem.3610286，1997；Sakata等，J.Biol.Chem.2729457，1997)。假定HSPG-HGF互作的功能包括HGF生物利用率、生物学活性和寡聚化的增强(Bardelli等，J.Biotechnol.37109，1994；Zioncheck等，J.Biol.Chem.27016871，1995)。
cMet为IV类蛋白质酪氨酸激酶受体家族的一个成员。全长cMet基因已被克隆，并被鉴定为cMet原癌基因(Cooper等，Nature 31129，1984；Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846379，1987)。cMet受体最初以单链的部分糖基化的前体P170(MET)(图1)合成(Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846379，1987；Giordano等，Nature 339155，1989；Giordano等，Oncogene 41383，1989；Bardelli等，J.Biotechnol.37109，1994)。通过进一步的糖基化作用，蛋白质被水解剪切为一个异型二聚的190 kDa成熟蛋白质(1385个氨基酸)，由50 kDaα-亚基(残基1-307)和145 kDa β-亚基组成。β-亚基的细胞质酪氨酸激酶结构域参与信号转导。
研究了几种不同方法以获得HGF/cMet互作的拮抗分子截短的HGF蛋白，例如NK1(N-末端结构域加环饼结构域1；Lokker等，J.Biol.Chem.26817145，1993)，NK2(N末端结构域加环饼结构域1和2；Chan等，Science 2541382，1991)和NK4(N-末端结构域加4个环饼结构域；Kuba等，Cancer Res.606737，2000)，抗-cMet mAbs(Dodge，Master’s Thesis，San Francisco State University，1998)和抗-HGF mAbs(Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 987443，2001，在此处引入作为参考)。
NK1和NK2可有效地与HGF竞争结合其受体，但已显示在体外具有部分的激动活性(Cioce等，J.Biol.Chem.27113110，1996；Schwall等，J.Cell Biol.133709，1996)，并非如期望的单纯的拮抗活性。最近，Kuba等，Cancer Res.606737，2000，在一个裸鼠模型中，通过NK4的连续灌输，证明NK4可部分抑制鼠的肺肿瘤LLC的原位生长(图2)和转移。NK4必须被连续施用以获得原发肿瘤的部分生长抑制的事实，表明NK4分子具有潜在的短半衰期和/或缺乏效力。与NK4相比，使用抗体的方法将受益于其有利的药物代谢动力学及获得具有更高效力的抗体的可能性。
作为另一个方法，Dodge(Master’s Thesis，San Francisco StateUniversity，1998)生成了拮抗性的抗-cMet单克隆抗体(mAbs)。一种mAb，5D5，在ELISA中显示强烈的拮抗活性，但是诱导表达cMet的BAF-3细胞的增殖应答，推测由膜受体的二聚作用引起。Prat等，J.CellSci.111237，1998也报道了抗-cMet mAbs的这种拮抗活性。Zaccolo等，Eur.J.Immunol 27618，1997利用噬菌体显示法，确实开发了抗鼠和人肝细胞生长因子的人Fab片段。这些Fab片段当单独使用时，对HGF的活性没有影响。当其中一个抗-人类HGF Fab片段与结合到Fab片段本身的抗体相结合时，在一个生物学分析中确实增强了HGF的活性。
Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 987443，2001，证明施用三种抗-HGF mAbs的混合物在异种移植裸小鼠模型中(图3)能够抑制人肿瘤的生长，所述抗-HGF mAbs是基于它们在体内抑制HGF的扩散活性的能力进行选择的。他们假设识别HGF上的三个不同结合位点的三种mAbs是在体内抑制HGF的生物活性所必需的两种mAbs抑制HGF结合到cMet，一种mAbs抑制HGF结合到发夹。然而，因为商业和受规章限制的原因，开发三种新mAbs组合的药物是不切实际的，例如，因为需要单独地证明每种抗体的一些临床活性。
因此，需要在体外和体内阻断HGF生物学活性的单一的单克隆抗体。本发明满足这个和其他的需要。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供针对人肝细胞生长因子(HGF)的中和mAb。该mAb抑制HGF的至少一种，并优选几种或所有生物学活性，包括结合到其受体cMet，诱导细胞如Madin-Darby犬肾细胞的扩散，诱导4MBr-5猴上皮细胞和/或肝细胞和/或HUVEC的增殖，并诱导血管新生。当抗-HGF mAb用作单一药剂时，可抑制这样的活性。优选的抗-HGF mAb抑制，最优选完全抑制人类肿瘤异种移植物在小鼠体内的生长。本发明的mAb优选为嵌合的、人源化的、似人类的或人类的。示例性的抗体为L2G7及其嵌合和人源化的形式。也提供了产生这种抗体的细胞系。在另一个实施方案中提供了一种药物组合物，包括一种中和抗HGF-抗体，例如，嵌合或人源化L2G7。在第三个实施方案种，将该药物组合物施用于病人以治疗癌症或其他疾病。
图1.HGF和cMet的图示模型。
图2.图示了NK4部分抑制裸鼠鼠肺肿瘤LLC的原位生长(来自Kuba等，Cancer Res.606737，2000)。在肿瘤s.c.移植到裸鼠后第四天开始，用NK4连续灌输14天。
图3.图示了需要三种抗-HGF mAbs的混合物来抑制裸鼠人脑瘤U-118细胞的生长(来自Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 987443，2001)。U-118肿瘤细胞被s.c.注射到裸鼠。从第一天开始施用抗-HGFmAbs A-1，-5和-7或mAbs 7-2和-3，200μg/注射，2次/周，共10周。
图4.用竞争结合ELISA，确定mAbs L1H4，L2C7，L2G7的相关结合表位。板用重组HGF(rHGF)进行涂层，用脱脂牛奶封闭，并用亚最佳浓度的生物素酰化mAbs在100×过量未标记的mAbs存在在温育。通过加入HRP-链霉亲和素检测结合的生物素酰化mAb。
图5.在直接HGF结合ELISA中测定抗-HGF mAbs与rHGF的结合。板用含有rHGF的HI-F11上清进行涂层，以2％脱脂牛奶封闭并用mAbs温育，随后加入HRP-GαMIgG(如以下实施例所述)。
图6.抗-HGF mAbs捕获溶液中rHGF-Flag的能力。抗-HGF mAbs被捕获在用山羊抗-小鼠IgG涂层的ELISA板上。然后板用2％脱脂牛奶封闭并用rHGF-Flag温育，随后用HRP-M2抗-Flag mAb温育(如以下实施例所述)。
图7.在捕获ELISA中，抗-HGF mAbs抑制rHGF-Flag结合到cMet-Fc。在山羊抗人IgG涂层的板上捕获的cMet-Fc用HGF-Flag温育，所述HGF-Flag用/不用mAbs进行预温育。通过加入HRP-M2抗-FlagmAb检测结合的rHGF-Flag(如以下实施例所述)。
图8.抗-HGF mAb L2G7中和诱导MDCK扩散的HGF。(A)不做任何处理的对照。(B)rHGF+IgG。(C)rHGF+mAb L2G7。在10μg/ml的mAbs存在下，MDCK细胞用H1-F11培养物上清的1∶20稀释物温育(～3μg/ml HGF)。照片在100×放大倍数下拍摄。
图9.L2G7 mAb抑制HGF诱导的Mv 1 LU细胞增殖。水平轴表示mAb超过HGF的摩尔倍数，垂直轴表示结合的cpm×10-2。数据点通过三个重复获得。
图10.L2G7 mAb和对照小鼠抗体(mIgG)抑制HGF-诱导的HUVEC增殖。数据点通过三个重复获得。
图11.L2G7和L1H4抗体对HGF-诱导的HCT 116结肠肿瘤细胞增殖的影响。数据点通过三个重复获得。
图12.在NIH III Beige/裸鼠组(n＝6)中，用L2G7 mAb或PBS(对照)处理对U-118肿瘤生长的影响。箭头指出注射开始的时间。(A)肿瘤大小对从肿瘤移植开始的天数。(B)实验结束时的肿瘤质量。
发明详述本发明提供了中和抗-HGF单克隆抗体，包含其的药物组合物以及使用其治疗疾病的方法。
1.抗体抗体是具有复杂内部结构的很大的复合分子(分子量为～150,000或大约1320个氨基酸)。天然的抗体分子包含两对相同的多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每条轻链和重链依次由两个结构域组成一个参与结合靶抗原的可变(“V”)区域和一个与免疫系统其他成分互作的恒定(“C”)区域。轻链和重链可变结构域在3-维空间折叠在一起，形成结合抗原(例如，细胞表面的受体)的可变结构域。在每条轻链或重链可变结构域内有三个短的片段(长度平均为10个氨基酸)，称互补决定区域(“CDRs”)。一个抗体可变结构域的6个CDRs(三个来自轻链，三个来自重链)在3-D空间折叠在一起，形成实际的抗体结合位点，其锁到靶抗原上。已经精确地阐述了CDRs的位置和长度。Kabat，E.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1983，1987。不包含于CDRs的可变区域部分称为构架，其形成CDRs的环境。
单克隆抗体(mAB)是抗体的一种单分子种类，因此不包含通过为动物(例如啮齿动物，兔子或山羊)注射抗原并从动物血清中提取而生产的多克隆抗体。人源化抗体是基因工程(单克隆的)化抗体，其中来自小鼠抗体的CDRs(“供体抗体”，其也可以是大鼠，仓鼠或其他类似种)被移植到人抗体(“受体抗体”)。人源化抗体也可用来自小鼠抗体的少于完全CDRs来制造(例如，Pascalis等，J.Immunol.1693076，2002)。因此，人源化抗体是具有来自供体抗体的CDRs和来自人抗体的可变区域构架和恒定结构域的抗体。因此，一般地，人源化抗体包括(i)一条轻链，包括来自小鼠抗体例如L2G7的三个CDRs和来自人抗体的一个可变区域构架以及一个人类恒定区域，和(ii)一条重链，包括来自小鼠抗体例如L2G7的三个CDRs和来自人抗体的一个可变区域构架以及一个人恒定区域。另外，为了保持高结合亲和力，至少两种另外的结构元件之一可被利用。见美国专利5,530,101和5,585,089，在此处它们均被引入作为参考，其为人源化抗体的构建提供了详细的说明书。
在第一个结构元件中，通过从许多已知的人类抗体中适当地选择受体抗体，选择人源化抗体的重链可变区域构架从而与供体抗体的重链可变区域构架具有最大的序列同一性(在65％和95％之间)。当被比抗体序列按照Kabat编号规则进行比对时，可确定序列同一性。在第二个结构元件中，在构建人源化抗体时，根据具体的规则，选择的人受体抗体构架中的氨基酸(在CDRs之外)被来自供体抗体的相应氨基酸替代。具体而言，构架中被替代的氨基酸基于它们与CDRs互作的能力进行选择。例如，被替代的氨基酸可邻近供体抗体序列的一个CDR，或在3-维空间测量的人源化抗体的一个CDR的4-6埃之内。
嵌合的抗体是小鼠(或其他啮齿动物)抗体的可变区域与人抗体的不变结构域组合的一种抗体；通过基因工程方法构建它们是公知的。这样的抗体虽然具有大约三分之二的人抗体部分，但保持了小鼠抗体的结合特异性。存在于小鼠、嵌合和人源化抗体中的非人类序列部分，表明嵌合抗体的免疫原性介于小鼠和人源化抗体之间。相对于小鼠抗体可能具有降低的免疫原性的其他基因工程抗体类型包括用噬菌体显示法(Dower等，WO9/17271；McCafferty等，WO92/001047；Winter，WO92/20791；和Winter，FEBS Lett.2392，1998，每篇在此处均引入作为参考)或用转基因动物(Lonberg等，WO93/12227；KucherlapatiWO91/10741，每篇在此处均引入作为参考)制造的人抗体。
在此使用的术语“似人类的”抗体指其中一条或两条链氨基酸序列的主要部分(例如大约50％或更多)起源于人类免疫球蛋白基因的一种mAb。因此，似人类的抗体包括但不限制于嵌合的、人源化的和人抗体。在此使用的“免疫原性降低的”抗体是期望当施用于人类病人时比小鼠抗体具有显著减少的免疫原性的抗体。这样的抗体包括嵌合、人源化和人抗体，以及通过替换小鼠抗体中的特定的氨基酸而制造的抗体，这些氨基酸可能决定B-或T-细胞表位，例如暴露的残基(Padlan，Mol.Immunol28489，1991)。在此使用的“基因工程化”抗体是在重组DNA技术的帮助下，基因被构建或放到一个非天然的环境中(例如小鼠或噬菌体中的人基因)的抗体，因此，例如，不包括用传统的杂交细胞技术制造的鼠mAb。
mAb的表位是与mAb结合的其抗原区域。如果每个抗体竞争地抑制(阻断)其他的抗体与抗原的结合，则两个抗体结合到同一个或重叠的表位。那就是，与缺乏竞争抗体的对照相比，在一个竞争结合分析中测量到一种抗体的1×，5×，10×，20×或100×过量，抑制其他抗体的结合达到至少50％，但优选75％，90％，或甚至99％(参见，例如Junghans等，Cancer Res.501495，1990，在此处引入作为参考)。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变降低或消除其他抗体的结合，则这两种抗体具有相同的表位。
2.中和抗-HGF抗体如果结合可部分地或完全地抑制HGF的一种或多种生物学活性(即当mAb作为单一药剂使用时)，结合HGF的单克隆抗体(mAb)(即，抗-HGF mAb)将中和HGF，或中和HGF。中和抗体可能抑制的HGF的生物学特性如下结合到其cMet受体，引起某些细胞系例如Mardin-Darby犬肾(MDCK)细胞的扩散；刺激某些细胞，包括肝细胞，4MBr-5猴上皮细胞和多种人类肿瘤细胞的增殖(即，致有丝分裂)；或刺激血管新生，例如，通过刺激人类血管内皮细胞(HUVEC)增殖或导管形成，或当应用于鸡胚胎绒(毛)膜尿囊膜(CAM)时诱导血管测定的。本发明的抗体优选结合到人类HGF，即由目录号为D90334的GenBank序列编码的蛋白质(引入作为参考)。
当用以下实施例中描述的或本领域已知的方法进行分析时，本发明的中和mAb在浓度为例如，0.01，0.1，0.5，1，2，5，10，20或50μg/ml时将抑制HGF的生物学功能(例如刺激增殖或扩散)达到大约至少50％，但优选75％，更优选90％或95％或甚至99％，且最优选接近100％(基本上完全)。对于缺乏HGF的阴性对照，如果活性水平在误差范围内，则抑制被认为是完全的。一般地，当使用的HGF数量刚好足以完全刺激生物学活性，或为0.05，0.1，0.5，1，3，或10μg/ml时，测量抑制程度。优选，当抗体与HGF的摩尔比为0.5×，1×，2×，3×，5×，或10×时，获得至少50％，75％，90％，或95％或基本上完全的抑制。优选，当作为单一药剂使用时，mAb具中和性，即抑制生物学活性，但可能需要两种mAb共同提供抑制。最优选mAb不但中和上面列出的一种而是几种的生物学活性；为了此目的，作为单一药剂使用的抗-HGF mAb中和HGF的所有生物学活性称“完全中和”，这样的mAb是最优选的。本发明的mAb优选对HGF具有特异性，即它们将不结合，或仅以更小的程度(例如Ka至少小于10倍)结合到与HGF相关的蛋白质，例如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。优选的抗体缺乏针对HGF的激动活性。即抗体不直接刺激具有HGF的细胞就阻断HGH与cMet的互作。本发明的mAbs通常具有对HGF的结合亲和力(K2)至少107M-1，但优选108M-1或更高，且最优选109M-1或更高或甚至1010M-1或更高。
本发明的mAbs包括天然四聚体形式的抗-HGF抗体(2条轻链和2条重链)，且可以是任一已知的同种型IgG，IgA，IgM，IgD和IgE及它们的亚型，即人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，和IgG3。本发明的mAbs也意味着包括抗体例如Fv，Fab和F(ab’)2的片段；双功能杂交抗体(例如Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17105，1987)，单链抗体(Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879，1988；Bird等，Science 242423，1988)；和具有改变的恒定区域的抗体(例如美国专利5,624,821)。mAbs可以是动物(例如小鼠，大鼠，仓鼠或鸡)来源，或由基因工程构建。啮齿动物mAbs可通过本领域公知的标准方法制造，包括用在适当佐剂中的HGF的i.p.，i.v.多重免疫或对脚垫进行免疫，随后提取脾脏或淋巴结细胞，并与适当的永生细胞系进行融合，然后选择产生结合HGF的抗体的杂交瘤，例如见下面的实施例。通过上述在本领域已知的方法制造的嵌合和人源化的抗体是本发明优选的实施方案。例如通过噬菌体显示法或转基因小鼠法制造的人抗体也是优选的(例如见上述的Dower等，McCafferty等，Winter，Lonberg等，Kucherlapati)。更广泛地，如在此定义的似人类的、降低免疫原性的和基因工程的抗体都是优选的。
下文所述的中和抗-HGF mAbs L1H4，L2C7和L2G7 mAbs是本发明的实施例，L2G7为优选实施例。与任何这些mAbs具有相同或重叠表位的中和mAbs，例如L2G7，提供了其他的实施例。L2G7或与LGF的嵌合或人源化形式是特别优选的实施方案。在此描述的至少一个，并优选所有的体外或体内分析中，与L2G7竞争结合HGF和中和HGF的mAb(包括嵌合的、人源化的和人抗体)也是优选的。本发明包括在氨基酸序列中，至少在CDRs中，与L2G7具有90％、95％、99％或100％同一性(通过按照Kabat规则抗体序列比对来确定的)的mAbs。优选这种抗体通过少数功能上不重要的氨基酸的取代(例如保守取代)、缺失、或插入而与L2G7不同。优选这种抗体保留L2G7的功能特征，即，这种抗体在此处描述的至少一个，并优选所有的体外或体内分析中，中和HGF。为了将氨基酸取代分为保守的或非保守的，氨基酸可被分组如下组I(疏水侧链)正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；组II(中性亲水侧链)cys，ser，thr；组III(酸性侧链)asp，glu；组IV(碱性侧链)asn，gln，his，lys，arg；组V(影响链方向的残基)gly，pro；和组VI(芳香侧链)trp，tyr，phe。保守取代包括相同类群内的氨基酸之间的替换。非保守替换指将其中一类群的一个成员替换为另一类群的一个成员。
本发明的天然mAbs可从它们的杂交瘤生产。基因工程mAbs，例如嵌合或人源化mAbs，可通过多种本领域已知的方法进行表达。例如，编码它们的轻链和重链V区域的基因可从重叠的寡核苷酸合成，并连同可得到的C区域共同插入到表达载体(例如，商业上可从Invitrogen获得)，其提供必需的调节区域，例如，启动子，增强子，多聚A位点等。优选使用CMV启动子-增强子。然后利用多种本领域公知的方法，例如脂质转染或电穿孔法，将表达载体转染到多种哺乳动物细胞系例如CHO或非生产骨髓瘤，包括Sp2/0和NSO，并用适当的抗生素选择法选择表达这些抗体的细胞。见，例如美国专利5,530,101。更大量的抗体可通过在商业上可得的生物反应器中培养这些细胞来生产。
一经表达，本发明的mAbs或其他抗体可按照本领域的标准程序例如微孔过滤、超滤、蛋白A或G亲和层析法、大小排阻色谱法、阴离子交换层析法、阳离子交换层析法和/或基于有机染料的其他形式的亲和层析法等方法进行纯化。对于药用，优选至少大约90％或95％匀质性的基本上纯的抗体，最优选98％或99％或更高的匀质性。
3.治疗方法在一个优选的实施方案中，本发明提供了一个包括在此所述抗体的药物制剂。即抗体可以用于治疗疾病的药剂的生产。抗体的药物制剂(即药剂)包含在生理上可接受的载体中的mAb，任选连同赋形剂或稳定剂，使用冻干或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在应用的剂量和浓度对于接受者是无毒的，并包括pH通常为5.0到8.0，最常为6.0到7.0的缓冲液，例如磷酸盐，柠檬酸盐，或醋酸盐；盐例如氯化钠、氯化钾等维持等渗压；抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物例如聚山梨醇酯80、氨基酸、碳水化合物、鳌合剂、蔗糖、及本领域技术人员已知的其他标准成分(Remington’sPharmaceutical Science 16thedition，Osol，A.Ed.1980)。mAb通常以1-100mg/ml，例如10mg/ml的浓度存在。
本发明的抗体中不受欢迎的污染物通常相当少。这意味着抗体通常至少具有大约50％w/w(质量/质量)的纯度，并且基本上不含干扰蛋白质和污染物。优选抗体的纯度至少90％、95％或99％w/w。肠胃外施用的药物组合物通常是无菌的、基本上等渗压的，并根据FDA或类似团体的Good Manufacturing Practices进行制备。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了利用在药物制剂中的抗-HGF mAb治疗有疾病的病人的方法。配制在药物制剂中的mAb可通过任一适当的途径，尤其通过静脉灌输，或肌肉内或皮下加强注射施用于病人。静脉灌输可在15分钟这么少的时间内给完药，但更常为30分钟，或多于1、2或甚至3小时。mAb也可被直接注射到疾病部位(例如肿瘤)，或封装入载体药剂例如脂质体的胶囊中。给药的剂量应足以减轻被治疗的疾病(“治疗有效剂量”)，且可能为0.1到5mg/kg体重，例如1，2，3，或4mg/kg，但可能高达10mg/kg或者甚至15或20mg/kg。也可给固定的单位剂量，例如，50，100，200，500，或1000mg，或可基于病人表面积的剂量，例如，100mg/m2。通常1和8个剂量之间(例如1、2、3、4、5、6、7或8)被施用于治疗癌症，但可给10、20或更多个剂量。mAb可每天一次、每两周一次、每周一次、每隔一周一次，每月一次或在一些其他的时间间隔，取决于例如mAb的半衰期，施用1周，2周，4周，8周，3-6个月或更长。由于是长期施用，重复的疗程也是可能的。减轻或至少部分地抑制疾病症状(生化的，组织学的和/或临床的)，包括其并发症和该疾病发展的中间病理表型的施用剂量和间隔方案被认为是治疗有效的方案。
本发明的药物组合物也可用于对在癌症危险中的病人进行预防。这样的病人包括那些对癌症具有遗传易感性的病人，经历暴露于致癌剂例如辐射或毒素的病人，及以前经历癌症治疗且具有复发危险的病人。预防剂量是足以消除或减少危险，减轻严重性，或延缓疾病发作，包括疾病的生化、组织学和/或临床的症状，其并发症和在疾病发展期间出现的中间病理表型的量。药物组合物以有效实现一个或多个这些目标的量和间隔施用，被称作预防有效的方案。
尤其易受用本发明的抗-HGF mAbs治疗影响的疾病包括已知或设想需要血管新生或同提高的HGF水平联系在一起的实体肿瘤，例如儿童或成人的卵巢癌、乳腺癌、肺癌(小细胞或非小细胞)，结肠癌，前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、脑颈肿瘤、恶性黑素瘤、肉瘤和脑瘤(例如成胶质细胞瘤)。治疗也可施用于具有白血病或淋巴瘤的病人。在一个优选的实施方案中，抗-HGF mAb可连同其他的抗-癌治疗剂共同施用(即之前，同时或之后)。例如，抗-HGF mAb可与肿瘤学领域技术人员已知的任一种或多种化疗药物共同施用，例如紫杉醇(Taxol)[太平洋紫杉醇(paclitaxel)]或其衍生物，铂化合物例如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin)，anthrocyclines(小红莓)例如阿霉素(doxorubicin)，烷基化剂例如环磷酰胺(cyclophosphamide)，抗代谢物例如5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)，或依托泊苷(etoposide)。抗-HGFmAb可根据标准的化疗方案，结合两种、三种或多种这些药剂施用，例如用于治疗乳腺癌和卵巢癌的紫杉醇(Taxol)和卡铂(carboplatin)。抗-HGF mAb可结合施用的其他药剂包括生物制剂例如单克隆抗体，包括抗HER2抗原的HercepinTM，抗VEGF的AvastinTM，或EGF受体的抗体，也包括抗-血管新生的小分子或EGF受体拮抗药物。另外，抗-HGFmAb可与放疗或手术共同使用。
与同样但不用抗-HGF mAb的治疗(例如化疗)相比，包括抗-HGFmAb抗体的治疗(例如标准化疗)可增加具有这些肿瘤(例如卵巢、乳腺、肺、胰脏、脑和结肠，尤其是当旧病复发或难以控制时)的病人的中位无进展生存期(median progression-free survival)或总存活时间达至少30％或40％但优选50％、60％到70％或甚至100％或更长。另外或者，与同样但不用抗-HGF mAb的治疗(例如化疗)相比，包括抗-HGF mAb抗体的治疗(例如标准化疗)可增加具有这些肿瘤(例如卵巢、乳腺、肺、胰脏、脑和结肠，尤其是当旧病复发或难以控制时)的病人的完全应答率、部分应答率、或目标应答率(完全+部分)至少达30％或40％但优选50％、60％到70％或甚至100％。治疗可任选抑制肿瘤侵入或转移。
通常在临床试验中(例如阶段II，阶段II/III或阶段III试验)，前述以化疗加抗-HGF mAb进行治疗的病人的中位无进展生存期和/或应答率的增加，相对于单独接受化疗(或加安慰剂)的病人对照群，例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001的水平具有统计学显著性。技术人员也可理解完全和部分应答率是由在癌症临床试验中普遍使用的客观标准确定的，例如由National Cancer Institute和/或Food and DrugAdministration列出或接受的一样。
4.其他方法本发明的抗-HGF mAb在诊断、预防和实验室方法上也有用途。它们可被用来测量肿瘤中或具有肿瘤的病人血液中的HGF，因此追踪和指导肿瘤的治疗。例如，与高水平HGF关联的肿瘤将尤其对用抗-HGF mAb治疗有响应。在特定的实施方案中，mAbs可被用于ELISA或放射性免疫分析中测量HGF的水平，例如，在肿瘤活组织检查标本或血清或细胞培养中HGF-分泌细胞的培养基上清中。结合到不同表位的两种抗-HGF mAbs的应用(即不竞争结合)在开发敏感的“三明治”ELISA用于检测HGF上尤其有用。对于各种分析而言，mAb可用荧光分子、旋转标记分子、酶或放射性同位素进行标记，并且可连同所有必需的试剂以试剂盒的形式提供，用于实行HGF的分析。在其他的用途中，抗-HGF mAb可用于纯化HGF，例如通过亲和层析法。
实施例1.抗-HGF mAbs的产生为产生结合人类HGF并阻断其活性的mAbs，首先在哺乳动物表达系统中生产重组人HGF(rHGF)。编码重组人HGF(rHGF)或rHGF-Flag肽(连接到HGF的C-末端的Flag的8个氨基酸残基)的cDNAs被构建在一个pIND-诱导的表达载体中(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.933346，1996)。然后用Fugene转染剂(Roche)将这些cDNA转染到EcR-293人类肾成纤维细胞(Invitrogen)中。600μg/ml G418和400μg/ml Zeocin(Invitrogen)存在时，选择稳定的细胞系H1-F11和24.1，其分别分泌HGF和HGF-Flag。在没有血清的含有谷氨酰胺和抗生素的DMEM中，通过用4μM Ponasterone A(Invitrogen)处理4-5天，诱导H1-F11和24.1分泌HGF和HGF-Flag。在4℃，15,000rpm离心30min除去聚集物后，用带有截断MW 50,000的过滤器[amiconCentriprep YM-50过滤器，随后用microcon YM-50过滤器(Millipore)]的膜超滤滤筒将分泌到培养物上清的HGF浓缩将近100倍。这样浓缩的H1F11培养物上清含有～100μg/ml的HGF和～120μg/ml的牛血清白蛋白。
用重悬于MPL-TDM(Ribi Immunochem.Research)的1-2μg纯化的rHGF(Pepro Tech)或1-2μg rHGF加1-2μg BSA(浓缩的H1-F11培养上清)，每周对Balb/c鼠的每个后脚垫进行免疫一次，共＞10次。在最后一次加强免疫完成后3天，用35％聚乙二醇将腿弯部的淋巴结细胞与鼠骨髓瘤细胞P3X63AgU.1(ATCC CRL1597)融合。如前所述在HAT培养基中选择杂交瘤(Chuntharapai和Kim，J.Immunol.163766，1997，在此处引入作为参考)。融合后10天，杂交瘤培养物上清在直接的HGF结合ELISA及HGF-Flag捕获ELISA中进行筛选。后一个检测被用于进一步证实用直接HGF结合ELISA选择的抗-HGF mAb的特异性，并选择在溶液相(solution phase)中能结合HGF的mAbs。然后如所描述的(Jeffers等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514417，1998)HGF-Flag/cMet-Fc结合ELISA和MDCK扩散分析中测定所选mAbs的阻断活性。用限制稀释技术将所选的杂交瘤克隆两次。用同种型试剂盒(Zymed)确定mAbs的同种型。用ImmunoPure(A/G)IgG纯化试剂盒(Pierce)培养和纯化所选mAbs的腹水。根据Pierce提供的说明书用EZ-sulfo-NHS-LC-Biotin制备生物素酰化mAbs。在下面更详细描述这里所指的每一个分析。对于直接的HGF结合ELISA，将用PBS以1∶2的HGF/PBS比例稀释的含有rHGF的H1-F11培养物上清以50μl/孔对微量滴定板(Maxisorb；Nune)进行涂层，在4℃过夜。在洗涤板之后，用含有2％脱脂牛奶的PBS对非特异性结合位点在室温(RT)进行封闭1hr。洗涤板后，将纯化的mAbs或杂交瘤培养物上清以50μl/孔加入每孔中1hr。洗涤后，然后用1μg/ml HRP-山羊抗-小鼠IgG(HRP-GαMIgG，Capple)以50μl/孔将板温育1hr。通过加入四甲基联苯胺底物(Sigma)检测结合的HRP-GαMIgG。加入1N H2SO4中止反应，然后用ELISA板读数机在450nm读板。在洗涤缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。
对于HGF-Flag捕获ELISA，用在PBS中2μg/ml的对小鼠IgG(GαMIgG-Fc)的Fc部分具有特异性的山羊抗体，以50μl/孔对微量滴定板进行涂层，在4℃过夜，并用2％脱脂牛奶在室温封闭1hr。洗涤后，用纯化的mAbs或杂交瘤培养物上清以50μl/孔对板温育1hr。洗涤后，然后用含有rHGF-Flag的24.1细胞培养物上清以50μl/孔对板进行培养。洗涤后，然后用含有15μg/ml小鼠IgG的HRP-M2抗-Flag mAb(Invitrogen)以50μl/孔对板进行温育。通过加入如上所述的底物检测结合的HRP-抗-Flag M2。在洗涤缓冲液中洗涤3次。
从如前所述通过用在浓缩的H1-F11培养物上清中的rHGF免疫Balb/c小鼠而产生的杂交瘤获得的至少三种称为L1H4、L2C7和L2G7的mAbs，在直接rHGF结合ELISA和HGF-Flag捕获ELISA中都显示结合，并被选出作进一步研究。然后这些杂交瘤被克隆两次，通过标准方法培养小鼠的腹水，用蛋白质G/A柱纯化mAbs。用同种型试剂盒(Zymed Lab)测定mAbs的同种型。在2003年4月29日将L2G7杂交瘤保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549 Manassas，VA20108)，根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏号为ATCC PTA-5162。这些保藏物将被保存在经权威认可的保藏处，并且当发生突变、无活力或毁坏事件时将被替换，保存时期为在样品释放的最近要求被保藏处接受后至少五年，自存放之日起至少三十年，或相关专利强行有效时期，由最长的那个时期决定。在申请的专利授权后，这些细胞系对于公众的可获得性的所有限制将不可撤回的去除。
具有此处所描述的在体外中和HGF和/或在体内抑制(例如完全地)肿瘤生长的期望性质的单一原型(archtypal)抗-人-HGF mAb例如L2G7一经被分离，通过使用本领域公知的方法可直接产生其他的具有相似性质的mAbs。例如，小鼠可用如上所述的HGF进行免疫，产生杂交瘤，根据与原型mAb竞争结合HGF的能力筛选得到的mAbs。或者，在此引入作为参考的Jespers等，Biotechnology 12899，1994的方法，可被用于指导与原型mAb例如L2G7具有相同表位，从而具有相似性质的mAbs的选择。利用噬菌体显示，首先将原型抗体的重链与所有轻链(优选人类)的进行配对，以选择HGF-结合mAb，然后将新的轻链与所有重链(优选人)进行配对以选择(优选人)与原型mAb具有相同表位的HGF-结合mAb。
2.抗-HGF mAbs的体外表征通过竞争结合ELISA，其中100×过量的未标记mAb被用于与HGF结合ELISA中相同的或其他生物素酰化mAb进行竞争结合，部分表征抗体的结合表位。图4显示抗-HGF mAbs、L1H4和L2C7的结合仅受自身抑制，表明它们识别独特的表位。L2C7的结合被L2G7抑制，但不被L1H4抑制。这表明L2C7的表位与L2G7的表位重叠，但与L1H4不重叠。然而，L2C7不能抑制L2G7的结合，表明L2C7和L2G7表位重叠但是有区别的，和/或L2C7的亲和力比L2G7的低得多。L1H4、L2C7和L2G7的表位分别称作A、B和C。
用纯化的抗体在直接HGF结合ELISA中测量了三种抗-HGF mAbs的相对结合能力，其中rHGF首先结合到板上。在这个分析中，L2C7和L2G7比L1H4(图5)结合得更好。用HGF-Flag捕获ELISA也测定了mAbs结合溶液中rHGF-Flag的能力。所有三种mAbs在溶液相中都能够捕获rHGF-Flag，但mAb L2G7比其他的更有效(图6)。这些结果表明mAb L2G7在这三个mAbs中对HGF具有最高的结合亲和力。
HGF的生物学活性之一是结合其受体cMet的能力，因此分析了抗-HGF mAbs抑制HGF与cMET结合的能力。对于这个分析，首先用pDisplay表达载体(Invitrogen)中编码与人IgG1的Fc部分(残基216到446)连接的cMet的1-929 ECD残基的cDNA转染人成纤维293细胞，用于生产cMet-Fc，如Mark等，J.Biol.Chem.26726166，1992所述。用在PBS中的2μg/ml对人IgG的Fc部分(GαHIgG-Fc)具有特异性的上羊抗体以50μl/孔对微量滴定板进行涂层，在4℃过夜，并用2％BSA在室温封闭1hr。对板进行洗涤后，将cMet-Fc cDNA转染的50μl 293培养物上清加入到每孔中，在室温1hr。对板进行洗涤后，用不同浓度mAbs进行预温育的，含有rHGF-Flag的24.1细胞培养物上清以50μl/孔加入每孔中1hr。洗涤，然后用HRP-M2抗-Flag mAb(Invitrogen)以50μl/孔在板上进行温育。通过加入如上所述的底物检测结合的HRP-抗-Flag M2。在洗涤缓冲液中洗涤三次。
在这个HGF-Flag/cMet-Fc结合抑制分析中，证明所有三种mAbs具有某种程度的抑制，而Ig对照抗体无抑制(图7)。mAb L2G7在≥1μg/ml和mAb L1H4在50μg/ml时可完全消除rHGF-Flag与cMet-Fc的结合；mAb L2C7甚至在50μg/ml时仅提供85％的抑制。因此，mAbL2G7在抑制rHGF-Flag与cMet-Fc的互作上比其他抗体更有效(因此推测对于HGF与其受体cMet也一样)，这与推断的其对HGF具有更大亲和力是一致的。
由于在cMet-Fc/HGF-Flag结合ELISA中使用的受体蛋白是可溶性受体蛋白，其构型可能与天然的膜结合受体的构型不同。而且，HGF除结合到cMet外，可结合到HSPG，并且已知HSPG-HGF互作能提高各种HGF的活性。因此，阻断HGF与可溶性cMet互作的mAbs不一定具有中和细胞上HGF生物学活性的能力。因此，在选择生物学系统中进一步确定mAbs的阻断活性是重要的。已知HGF是一个有效的扩散因子。因此，也用Madin-Darby犬肾(MDCK细胞来自ATCC)扩散分析测定了抗-HGF mAbs的中和活性，如所描述的一样(Jeffers等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514417，1998)。在添加了5％FCS的DMEM中生长的MDCK细胞以103细胞/100μl/孔接种在板上，rHGF以预先确定的浓度存在，在添加了5％FCS的DMEM中含有或不含有mAbs。在5％CO2中，37℃下培养2天，然后将细胞在PBS中进行洗涤，于室温在2％甲醛中固定10min。在PBS中洗涤后，用50％乙醇(v/v)中的0.5％结晶紫在室温对细胞进行染色10min。通过显微镜检查测定扩散活性。
如上所述分泌HGF的H1-F11克隆的培养物上清，被用作扩散分析中的HGF来源。用1∶80这么小的稀释度的H1-F11培养物上清就能诱导MDCK细胞的扩散和生长。然而，用1∶20稀释度的H1-F11培养物上清(～3μg/ml)进行扩散分析。mAb L2G7甚至在HGF/mAb的摩尔比为1∶5时抑制HGF本身诱导的MDCK扩散(图8)，最后证明mAb L2G7的确是中和抗体。mAb L1H4在≥20μg/ml也可中和HGF诱导的MDCK扩散，而mAb L2C7甚至在20μg/ml仅提供部分的中和活性(数据未显示)。
上面分析中测定的三种抗-HGF抗体的各种特性概括于表1中。
表1.针对HGF的mAbs的表征
HGF是肝素结合生长因子家族的一个成员，包括成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。而且，HGF与血纤维蛋白溶酶原具有～40％的总序列同源性(Nakamura等，Nature.342440，1989)，且与巨噬细胞刺激蛋白具有相似的结构域结构(MSF，Wang等，Scand.J.Immunol.56545，2002)。因此，必须测定抗-HGF抗体的结合特异性。用类似于上述HGF测定的直接结合ELISA来分析抗-HGFmAbs对这些HGF相关蛋白质(可从R&D系统得到)的结合。mAb L2G7，mAb L2C7和mAb L1H4不会显著结合到这些蛋白质，证明它们对HGF的特异性。
3.抗-HGF mAbs抑制HGF的促肿瘤生物学活性的能力HGF具有许多生物学活性，使得它很可能在某些人肿瘤的生长和侵入中起作用。HGF的其中一个这种活性是作为肝细胞和其他上皮细胞的有效分裂素(Rubin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88415，1991)。因此，为进一步证明抗-HGF mAbs的中和活性，测定了mAbs对HGF-诱导的4MBr-5猴上皮细胞(ATCC)或大鼠肝细胞的增殖的作用。肝细胞根据Garrison和Haynes，J.Biol.Chem.2694264，1985所述的方法进行分离。细胞以5×104个细胞/ml的浓度重悬于含有5％FCS的DMEM中，并用预先确定浓度的HGF连同各种浓度的mAbs进行刺激。在5％CO2中，于37℃下温育2天后，通过加入3H-胸苷4hr测定细胞的增殖水平。用自动化的细胞收获机收获细胞，在闪烁计数器上测定掺入的3H-胸苷水平。在足够的浓度下，mAb L2G7可以大量地或完全地抑制这些细胞的HGF-诱导的增殖，且mAbs L2C7和L1H4可至少部分地抑制增殖。这些抗体也可抑制其他上皮细胞系的HGF-诱导的增殖。
例如，测定了L2G7对貂肺Mv 1 Lu细胞的HGF-诱导的增殖的抑制活性(Borset等，J.Immunol.Methods 18959，1996)。生长在含有10％FCS的DMEM中的细胞通过用EDTA/trysin处理进行收获。洗涤后，细胞以5×104个细胞/ml的浓度重悬于不含血清的DMEM中，其中含有预先确定浓度(50ng/ml)的HGF+/-各种浓度的mAb。在5％CO2中，于37℃下温育1天后，通过加入1μCi3H-胸苷进行另外24hr，测定细胞的增殖水平。用自动细胞收获机将细胞收获到玻璃纤维过滤器上，在闪烁计数器上测定掺入的3H-胸苷水平。图9显示加入高于100倍摩尔浓度的L2G7 mAb完全抑制Mv 1 Lu细胞的增殖应答。实际上，L2G7甚至在mAb比HGF为3倍摩尔比值时，显示了完全抑制，而对照IgG甚至在100倍摩尔过量时不显示抑制。
也报道HGF是有效的血管新生因子(Bussolino等，J.Cell Biol.119629，1992；Cherrington等，Adv.Cancer Res.791，2000)，而血管新生，即新血管的形成，被认为对于肿瘤的生长是必需的。因此，在三个分析中显示了抗-HGF mAbs具有抑制HGF的血管新生功能的能力(i)人血管内皮细胞(HUVEC)的增殖，(ii)HUVEC的导管形成，和(iii)在鸡胚胎绒(毛)膜尿囊膜(CAM)上新血管的发育。由于已知HGF与VEGF能协同加强血管新生(Xin等，Am.J.Pathol.1581111，2001)，在VEGF存在和缺乏的情况下都要进行这些分析。
根据经改良后的描述的方法(Conn等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA871323，1990)进行HUVEC增殖分析。来自Clonetics的HUVEC细胞在含有10％FCS的内皮生长培养基(EMB-2)中生长，其中添加了由Clonetics提供的内皮细胞生长添加剂。优选来自4到7代的细胞用于本研究。细胞在含有抗生素、10mM HEPES和10％FCS的培养基-199(分析培养基)中重悬为105个细胞/ml。HUVEC细胞(50μl/孔)被加入含有适当浓度HGF连同各种浓度抗-HGF mAbs的微量滴定孔中，于37℃1hr。细胞在5％CO2中，于37℃下温育72hr后，通过掺入3H-胸苷4hr来测定细胞的增殖水平。在足够的浓度，mAb L2G7将大量地或完全地抑制HUVEC的HGF-诱导的增殖，而且mAbs L2C7和L1H4可至少部分抑制增殖。
或者，细胞增殖的水平可通过公知的比色MTT分析来测定。HUVEC(104个细胞/100μl/孔)在不含血清的培养基中生长24hr，然后用50ng/ml的HGF(预先确定为亚最佳量)100μl，连同各种浓度的mAb L2G7温育72hr。MTT溶液(5mg/ml)被加入每孔中(20μl/100μl培养基)4hr。然后100μl培养基/孔被移去，并与100μl/孔酸化的异丙醇(异丙基中含有0.04N HCl)混合。板在ELISA读数机上在560nm下读数。最大应答的％按如下公式计算[HGF+mAb处理细胞的OD值-未处理细胞的OD值]/[HGF处理细胞的OD值-未处理细胞的OD值]×100。图10显示甚至2倍摩尔过量的L2G7 mAb可大量地阻断HUVEC对HGF的增殖应答。
内皮导管分析基本上根据所描述的(Matsumura等，J.Immunol.1583408，2001；Xin等，Am.J.Pathol.1581111，2001)来实行。来自4-7代的HUVEC(Clonetics)在添加10％FBS和内皮细胞生长添加剂的Clonetics EGM培养基中生长。根据厂家的说明书，用Matrigel(BDBiosciences)在37℃对板进行涂层30min，并在加入HGF和各种浓度抗-HGF mAbs的1×基础培养基中以浓度为3×106个细胞/ml的细胞进行接种。在低放大倍数(10×)显微镜下评价导管形成。在足够浓度，mAb L2G7将大量地或完全地抑制HGF-诱导的内皮导管形成，mAbsL2C7和L1H4可至少部分地抑制它。
鸡胚胎绒(毛)膜尿囊膜(CAM)分析基本上根据所描述的(Kim等，Nature 362841，1992)实行。将三日龄的鸡胚胎从其壳中移去，并在皮氏培养皿中，在5％CO2中于37℃培育。7天后，含有HGF连同不同浓度抗-HGF mAbs的干燥的甲基纤维素圆片被分层堆积到CAM上。甲基纤维素圆片通过混合5μl PBS中的1.5％甲基纤维素与5μl用mAbs预温育的HGF进行配制。三天后检查甲基纤维素圆片周围血管的发育。在足够的浓度，mAb L2G7将大量地或完全地抑制这样的血管形成，且mAbs L2C7和L1H4可至少部分地抑制它。
也报道HGF能促进肿瘤生长(Comoglio和Trusolino，J.Clin.Invest.109857，2002)。在两个步骤中显示了抗-HGF抗体抑制这种活性的能力。首先，检查大量肿瘤细胞系分泌HGF的能力和应答HGF的增殖能力，因为HGF可能是其中一些细胞的自分泌生长因子。这些细胞系包括一组已知表达HGF和cMet的人肿瘤细胞系(Koochekpour等，Cancer Res.575391，1997；Wang等，J.Cell Bio1.1531023，2001)。被测试的特定细胞系包括U-118神经胶质瘤，HCT116结肠癌，A549肺癌和A431表皮状癌细胞，均可从ATCC获得。这些肿瘤细胞系一经确定，则使用类似于那些上述的方法，来测定抗-HGF mAbs对这些细胞对HGF的增殖应答的作用。在足够的浓度，mAb L2G7将大量地或完全地抑制许多或所有这些细胞系的HGF-诱导的增殖，且mAbs L2C7和L1H4可至少部分地抑制增殖。
例如，人类HCT116肿瘤细胞在200μl添加5％FCS的DMEM中以5×103个细胞/孔接种到96-孔微量滴定板中。在5％CO2中于37℃下温育24hr后，用PBS洗涤细胞，并在不含血清的DMEM中培养48hr。然后细胞用含有100ng/ml HGF+/-20μg/ml mAbs的DMEM另外培养20hr。而在对照实验中，细胞在单独的DMEM中或添加5％FCS的DMEM中温育。在温育结束时，通过掺入3H-胸苷4hr测定细胞增殖水平。通过三个重复得到实验结果，显示于图11。HGF诱导HCT116的中度增殖，其通过加入L2G7抗体被完全地消除(但不能通过加入效力较低的L1H4抗体而被消除)。
在上述所有分析中，每个抗-HGF抗体在没有其他HGF拮抗剂而单独使用，即作为单一药剂时可中和或抑制活性，但可通过联合施用其他抗-HGF抗体或其他活性剂而获得加和的或协同的作用。
4.抗-HGF mAbs在体内抑制肿瘤生长的能力抗-HGF抗体抑制人类肿瘤生长的能力在免疫缺陷小鼠或其他啮齿动物例如大鼠的异种移植模型中被证明。可用的小鼠免疫缺陷株的例证性但并非限制性的例子为裸小鼠例如CD-1裸小鼠、Nu/Nu，Balb/c裸鼠，NIH-III(NIH-bg-nu-xid BR)；scid小鼠例如Fox Chase SCID(C.B-17 SCID)，Fox Chase远交SCID和SCID Beige；RAG酶缺陷小鼠；以及裸大鼠(nude rat)。实验如前所述实行(Kim等，Nature 362841，1992，在此处引入作为参考)。于HBSS中收获在完全DMEM培养基中培养的人肿瘤细胞。免疫缺陷的雌性，例如无胸腺的裸鼠(4-6周龄)，通常被用0.2ml HBSS中的5×106个细胞在脊背区域进行s.c.注射。当肿瘤大小达到50-100mm3时，小鼠被随机分组，并i.p.施用在例如0.1ml体积中的适量抗-HGF和对照mAbs(通常在0.1和1.0mg之间，例如0.5mg)，每周一次、两次或三次，共1、2、3、或4周或实验期间。通过测量二维[长(a)和宽(b)]，通常每周测定两次肿瘤大小。根据V＝ab2/2计算肿瘤体积，并被表达为平均肿瘤体积±SEM。每个处理组中小鼠的数量至少为3，但时常在5和10之间，例如7。用例如Student’s检验实行统计学分析。在本实验的一个更改实验中，与肿瘤细胞同时或在注射肿瘤细胞之后立刻开始施用抗体。也可通过小鼠存活时间的延长，或小鼠存活百分率的增加来估量抗体的作用。
在不同实验中，使用已知分泌或对HGF应答的各种肿瘤细胞系，例如U118人成胶质细胞瘤细胞，和/或HCT116人结肠肿瘤细胞。本发明的优选抗体，例如似人类的和免疫原性降低的抗体和L2G7抗体及其嵌合的和人源化的形式和与L2G7具有相同表位的抗体当作为单一药剂使用时，将抑制至少25％，但可能40％或50％，和差不多75％或90％或更多肿瘤生长，或在一段时间后甚至完全抑制肿瘤生长或引起肿瘤衰退或消失。当对不产生响应抗注射抗体的中和抗体的一种或多种免疫缺陷小鼠株进行测试时，其对于在至少一个小鼠株例如NIHIII Beige/Nude中的至少一个肿瘤细胞系例如U118发生抑制，但优选对于一种特定的(例如神经胶质瘤)或任何类型的2个、3个、几个、许多、或甚至基本上所有表达HGF的肿瘤细胞系发生抑制。在一个或多个异种移植模型中，用一些优选的抗体治疗导致50％，75％，90％或甚至基本上所有鼠的不限期存活，否则它们将由于肿瘤的生长而死亡或需要被处死。
例如，用在含有FCS的DMEM培养基中培养并在HBSS中收获的U-118成胶质细胞瘤细胞进行了这样的试验。用在0.2ml HBSS中的106个细胞在脊背区域对雌性NIH III Beige/Nude小鼠(4-6周龄)进行s.c.注射。当肿瘤大小达到～50mm3时，小鼠被随机分为2组，每组6只，i.p.供给在0.1ml体积中的200μg的L2G7 mAb(处理组)或PBS(对照组)，每周2次。肿瘤大小如上所述每周测定两次。在实验结束时，肿瘤被切除并称重。图12显示用L2G7处理能完全抑制肿瘤生长。
用抗-HGF抗体联合预期肿瘤类型能对其作出响应的一种或多种化疗剂例如5-FU(5-氟尿嘧啶)或CPT-11(Camptosar)的施用实行了类似的肿瘤抑制实验，如Ashkenize等，J.Clin.Invest.104155，1999所述。抗体与化疗药物的联合比单独任一药剂可对肿瘤的生长产生更强的抑制作用。其作用可能是加和或协同的，且强烈抑制生长，例如达到80％或90％或更多，或甚至引起肿瘤衰退或消失。抗-HGF抗体也可与针对另一种生长或血管新生因子的抗体例如抗-VEGF结合施用，预期具有加和或协同的生长抑制作用和/或使肿瘤衰退或消失。
虽然参考当前优选的实施方案描述了本发明，应理解为在不背离本发明的情况下可作各种改动。除非与上下文明显不同，本发明的任何步骤、要素、实施方案、特征或方面可和任何其他的一起使用。
所有引用的所有公开物、专利和专利申请在此全文引入作为通用目的的参考，与每一篇公开物、专利和专利申请被具体和单独全文引入作为通用目的的参考的程度是相同的。
权利要求
1.结合并中和人肝细胞生长因子(HGF)的单克隆抗体(mAb)。
2.权利要求1的mAb，其是嵌合的。
3.权利要求1的mAb，其是人源化的。
4.权利要求1的mAb，其是人的。
5.权利要求1的mAb，其抑制至少50％的HGF与cMet的结合。
6.权利要求1的mAb，其抑制Madin-Darby犬肾细胞的HGF-诱导的扩散。
7.权利要求1的mAb，其抑制HUVEC细胞的HGF-诱导的增殖。
8.权利要求1的mAb，其抑制HGF-诱导的血管新生。
9.权利要求1的mAb，其中和HGF的所有生物学活性。
10.权利要求1的mAb，其抑制小鼠的人肿瘤异种移植物的生长。
11.权利要求10的mAb，其完全抑制小鼠的人肿瘤异种移植物的生长。
12.权利要求1的mAb，其是Fab或F(ab’)2片段或单链抗体。
13.权利要求1的mAb，其以至少108M-1的结合亲和力特异性结合HGF。
14.一种嵌合或人源化的L2G7mAb。
15.与权利要求14的抗体竞争结合到人HGF的抗体。
16.产生权利要求1的mAb的细胞系。
17.包括权利要求14的mAb的药物组合物。
18.治疗病人癌症的方法，包括给病人施用包含中和抗-HGF mAb的药物组合物。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症为成胶质细胞瘤。
20.权利要求18的方法，其中所述mAb为嵌合的或人源化的L2G7mAb。
全文摘要
本发明涉及一种针对肝细胞生长因子的中和单克隆抗体，一种包括该单克隆抗体的药物组合物，以及包括将这种药物组合物对病人进行施用，例如用于抑制成胶质细胞瘤的治疗方法。
文档编号G01N33/53GK1964738SQ200480042750
公开日2007年5月16日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年4月15日
发明者金京珍, 苏怡绮 申请人:加拉克西生物技术有限责任公司