专利名称：制备用以分离朊病毒和PrP的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及检测血液中朊病毒的方法。
背景技术：
朊病毒(prion)是一种感染性病原，可引起人和动物中枢神经系统海绵样脑病。朊病毒与细菌、病毒和类病毒不同。目前普遍认为，朊病毒蛋白质的感染性不需要核酸。而且，感染一种动物(例如人)的朊病毒不一定感染另一种(例如小鼠)。
在朊病毒及其所致疾病研究中最重要的进步是所谓朊病毒蛋白质(PrP)的发现和纯化(Bolton等，科学，2181309-11(1982)；Prusiner等，生物化学，216942-50(1982)；McKinley等，细胞，3557-62(1983))。完整的朊病毒蛋白质基因已被克隆，测序并在转基因动物中表达。PrPC由单拷贝宿主基因编码(Basler等，细胞46417-28(1986))，一般存在于神经元外表面。最新的假释认为，朊病毒疾病是因PrPC转化为其修饰形式PrPSc导致的。
看起来，人和动物传染性神经退行性疾病的传播和发生都必需朊病毒蛋白(PrPSc)羊瘙痒症异构象参与。参见Prusiner，S.B.，“朊病毒疾病的分子生物学”，科学，2521515-1522(1991)。动物中最常见的朊病毒疾病是羊瘙痒症和牛海绵样脑病(BSE)[Wilesmith，J.和Wells，分子免疫学，17221-38(1991)]。已经鉴定到4种人朊病毒疾病(1)库鲁病(Kuru)；(2)克罗伊茨费尔特-雅各布综合征(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)，(3)格-斯-切三氏综合征(Gerstman-Strassler-Scheinker)(GSS)和(4)致死性家族性失眠症(Fatal Familial insomnia)(FFI)(Gajdusek，D.C.，科学，197943-960(1977)；Medori等，新英格兰医学杂志，326444-449(1992))。人类朊病毒疾病作为散发性、遗传性、感染性疾病，曾一度难以解释，目前已可用PrP的细胞遗传来源进行解释。
大多数CJD是散发性的，但约10-15％是遗传获得，即人PrP基因突变引起的常染色体显性遗传病(Hsiao等，神经学，401820-1827(1990)；Goldfarb等，科学，258806-808(1992)；Kitamoto等，Proc.R.Soc.Lond，343391-398)。医源性CJD是由尸体垂体和硬脑髓移植物产生的人生长激素引起的(Brown等，柳叶刀，34024-27(1992))。尽管一直试图发现CJD与某种传染源(例如食用被羊瘙痒症感染的羊肉)之间的关联性，但至今除了医源性诱导的病例外尚无已证实的信息(Harries-Jones等，神经与神经外科及精神病治疗杂志，511113-1119(1988))。另一方面，数十年来困扰新几内亚高地前部及其邻近部落的库鲁病被认为是通过人吃人仪式中的感染而传播的(Alpers，M.P.，神经系统的慢传播疾病，第1卷，S.B.Prusiner和W.J.Hadlow编辑(New York，Academic Press)，pp.66-90(1979))。
最早CJD传染实验灵长类动物始于William Hadlow发现库鲁病与羊瘙痒症之间的相似性。1959年，Hadlow提出将提取自库鲁病死亡患者的提取物接种给非人灵长类动物，观察其是否如同预计地在长期潜伏后发病(Hadlow，W.J.，柳叶刀，2289-290(1959))。7年后，Gajdusek，Gibbs和Alpers证明了在潜伏18-21个月后，库鲁病可传染给猩猩(Gajdusek等，自然，209794-796(1966))。由于库鲁病与CJD神经病理学上的相似性，人们开始用猩猩进行实验，并在1968年报道了疾病传染病例(Gibbs，Jr等，科学，161388-389(1968))。在最近的25年中，已发现约300例CJD，库鲁病和GSS传染猿和猴的病例。
此类实验的昂贵，稀少和不人道制约了这方面的工作，并因此限制了相关信息的积累。虽然据说最可靠的是非人灵长类动物实验所得的数据，但已有报道用人朊病毒疾病传染啮齿动物，但规律性显然较差(Gibbs Jr.等，神经系统的慢传播疾病，第2卷，S.B.Prusiner和W.J.Hadlow编辑(New York，Academic Press)，pp.87-110(1979)；Tateishi等，人和动物的朊病毒疾病，Prusiner等编辑(LondonEllisHorwood)pp.129-134(1992))。
Pattison在其有关羊瘙痒症在羊与啮齿动物间传播的研究中首次提出“种间屏障”，人朊病毒罕见传染啮齿动物曾被引为“种间屏障”的例证(Pattison，I.H.，国立神经病和视觉缺失研究所，专题2，D.C.Gajdusek，C.J.Gibbs Jr和M.P.Alpers编辑(Washington，D.C.U.S.Government Printing)，pp.249-257(1965))。在那些研究中，最早的朊病毒种间传播与潜伏时间长相关联，且只有少数动物发病。此后在同种间的传播则具有动物全部发病，且潜伏期大大缩短的特征。
用转基因(Tg)小鼠发现，Syrian仓鼠(Sha)与小鼠间种间屏障的分子基础在于PrP基因的序列(Scott等，细胞，59847-857(1989))。ShaPrP与MoPrP在254个氨基酸残基中有16处不同(Basler等，细胞，46417-428(1986)；Locht等，美国科学院院报836372-6376(1986))。表达SHaPrP的Tg(ShaPrP)小鼠在接受SHa朊病毒接种后的潜伏期缩短。在用表达人或绵羊PrP转基因的小鼠进行类似实验时，种间屏障没有消除，即，受感染动物百分比极低，潜伏期过长。因此，以人朊病毒为例，至今尚不能用转基因动物(例如具有另一物种PrP基因的小鼠)检测样品，以确信其是否被朊病毒感染。以下所述可证明此类检测的缺乏造成健康危害的严重性。
曾有45名以上曾接受由人脑垂体制得的HGH治疗的年轻成人发生CJD(Koch等，新英格兰医学杂志，313731-733(1985)Brown等，柳叶刀34024-27(1992)Fradkin等，JAMA265880-884(1991)；Buchanan等，英国医学杂志302824-828(1991))。所幸的是，现在使用的是重组HGH，但已有人提出看似不大的可能性，即，用高剂量HGH提高wtPrPC表达可能引起朊病毒疾病(Lasmezas等，生物化学生物物理学研究通讯1961163-1169(1993))。猴子在接受疑被污染的HGH接种后66个月染病，证明由垂体制备的HGH可被朊病毒污染(Gibbs Jr等，新英格兰医学杂志328358-359(1993))。朊病毒疾病的长潜伏期将在数十年内无法完全反映在全世界数以千计接受HGH治疗的人中医源性CJD的范围。还发现，4名接受被污染人垂体产生的促性腺激素治疗的不孕症妇女似乎也发生了医源性CJD(Healy等，英国医学杂志307517-518(1993)；Cochius等，澳大利亚和纽西兰医学杂志20592-593(1990)；Cochius等，神经学神经外科和精神病治疗学杂志551094-1095(1992))，至少11名接受硬脑髓移植物的患者也发生了医源性CJD(Nisbet等，美国医学协会杂志2611118(1989)；Thadani等，神经外科杂志69766-769(1988)；Willison等，神经外科和精神病治疗学杂志54940(1991)；Brown等，柳叶刀34024-27(1992))。这些医源性CJD病例突出反映了对于筛选药物由于防朊病毒污染的迫切要求。
最近，两名法国医生被指控过失杀害一名曾接受自尸体提取的生长素治疗的患儿。该患儿发生了CJD。(参见新科学家1993年7月31日，p.4)。据Pasteur研究所统计，自1989年来，已报道了24例1983-85年间接受人生长素治疗的年轻人CJD病例。其中15名儿童已死亡。目前看来，在法国，可能有数百曾接受自尸体提取的生长素治疗的患儿具有CJD危发性(参见新科学家1993年11月20日，p.10)。更多的人曾输受过从未进行朊病毒检测的血液。因此，需要一种分离并鉴定血液中朊病毒的方法。本发明就提供了这样的方法。
发明概述本发明主要是一种血液样品的制备方法，该方法可分离、鉴定并按需要只检测样品中某蛋白质(例如PrPSc)的致病构象。让血液在室温下凝结，然后离心分离血清。在分离出的血清中加入结合剂，例如磷钨酸钠(PTA)，该结合剂与血清中的PrPSc结合，由此可浓缩存在的PrPSc。可进一步浓缩怀疑含有PrPSc的浓缩组分，并鉴定PrPSc，或者，根据需要只分析是否存在PrPSc。PrPSc检测可避免使用被其污染的血液。出人意料的是，在用血浆、血小板或白细胞制备的样品检测朊病毒时，得到阴性的结果，但用相同血液按本发明制备的样品检测时，得到的阳性结果。因此，本发明方法是一种新的预处理方法，可分离并鉴定，并根据需要用一种以上不同方法检测血液中有否朊病毒或其它蛋白质的致病构象。
本发明方法包括样品的制备方法，其步骤包括获取一定量的血液，让其凝结，从中分离出血清，将血清与结合剂接触，与蛋白质的致病构象形成蛋白质/结合剂复合物，浓缩样品中的该复合物。浓缩后的复合物即本发明制备的样品。如此制备的样品能够经分析鉴定某些原先不可能鉴定的特征。例如，本发明可确定所制备的样品中是否含有蛋白质(例如朊病毒蛋白)的致病构象，而其它方法制备的样品中是不可能进行朊病毒检测的。血液可采自各种哺乳动物，以疑患与蛋白质构象改变相关疾病的哺乳动物为佳。例如，血液可采自如下人、牛和羊还没有表现出疾病的症状，但可能患有与蛋白质构象改变相关的疾病，例如朊病毒相关疾病，其与PrP蛋白即朊病毒的构象改变相关。
虽然有许多不同的结合剂和样品浓缩手段，但就检测血液，例如人或农畜血液中的朊病毒来说，本发明是最好的。在检测朊病毒时，为了实施本发明，并正确制备样品，结合剂以磷钨酸盐为佳，最好是磷钨酸钠。而且，样品中复合物的浓缩可用多种不同方法进行，但以离心为佳。本发明的一项重要内容是，让血液自然凝结，不用抗凝血剂等手段来阻碍凝结。可用很简单的方法让血液凝结，例如不加抗凝血剂，在无菌容器内，室温下静置。血液凝结后，宜通过离心等方法分离出血清，然后将血清与结合剂接触，结合剂与蛋白质的致病构象形成蛋白质/结合剂复合物。然后用离心等已知方法浓缩形成的复合物，得到本发明的样品，然后可分析其中是否存在构象改变了的蛋白质。
本发明的主要目的是提供一种制备样品的方法，该方法可发现以致病构象存在于血液中的蛋白质(如朊病毒)，并可由此分离，并对血液中的这些蛋白质进行鉴定，而不是在其存在于其它器官中时进行鉴定。
本发明的目的还在于提供一种方法，其最初的步骤是发现朊病毒形成的天然抑制因子，这样的抑制因子可以其天然形式或修饰形式用于与某些蛋白质致病构象相关疾病(例如朊病毒疾病)的治疗。
本发明的目的还在于提供(用本发明方法制备的)样品，该样品可用于多种方法对血液中蛋白质致病构象(如PrPSc)的检测。
本发明的目的还在于提供一种检测血液是否存在感染性朊病毒(PrPSc)的方法。
本发明的目的还在于提供一种用血样诊断朊病毒相关疾病的方法。
本发明的优点在于提供了一种可用于检测血样中朊病毒的样品。
本发明的特征在于，只有血清可用于检测PrPSc，即，用血液、血浆、血小板和白细胞检测会得到假阴性结果。
本发明的优点还在于，可对血液、血制品、骨髓及其它任何器官和组织(例如用于人体移植手术)进行检测，确定是否有朊病毒。
本发明的特征还在于，可用多种不同的结合剂浓缩血清中的任意PrPSc，从而得到本发明的经处理样品，然后用于检测。
本发明的特征还在于，所述的结合剂可以是杂多酸或其金属盐，或例如肽、小分子、选择性结合PrPSc的抗体和PrP结合性抗体等生物试剂。
本发明的特征还在于，优选的结合剂是磷钨酸的金属盐，尤其是钠盐。
本发明的特征还在于，本发明方法可发现血液中的朊病毒，从而有助于纯化消除血液和其它器官和/或组织中的朊病毒感染性。
本发明的目的还在于用本发明制备的样品进一步检测是否存在复合物形式的蛋白质，从而测定蛋白质的特殊特征，包括其溶解度、三维结构和感染性。
本发明的一个重大进步是，可从血液中提取蛋白质的致病构象，然后通过与提取自其它组织(例如脑组织)的同种蛋白质比较来进行分析。
根据以下对本发明方法更详细、更完整的描述，本领域技术人员将可清楚地理解本发明的以上及其它目的、内容、优点和特征。
附图简述
图1显示用无朊病毒对照，和采自感染了朊病毒，标记为“羊瘙痒症”的动物的白细胞进行构象依赖性免疫试验的结果。过程与结果参见比较实施例1。
图2显示用无朊病毒对照，和采自感染了朊病毒，标记为“羊瘙痒症”的动物的血小板进行构象依赖性免疫试验的结果。过程与结果参见比较实施例2。
图3显示用无朊病毒对照，和采自感染了朊病毒，标记为“羊瘙痒症”的动物的血浆进行构象依赖性免疫试验的结果。过程与结果参见比较实施例3。
图4显示用本发明制备的血清样品进行的构象依赖性免疫试验的结果。对不含朊病毒对照进行该试验。并对采自感染了朊病毒，标记为“羊瘙痒症”的动物的血清进行相同的试验。过程与结果参见实施例4。
图5即实施例4和图4中的数据。该图显示了中值(中线)，50％值(虚线)和95％值(外框线)。以上数据显示，所测对照血清和所测朊病毒感染样品不重叠。
优选实施方式的详细描述以上说明并描述了所制备的检测样品、方法以及所用的组分，需要指出的是，本发明不限于特定的样品、方法、步骤、结合剂、蛋白质、标记或试验，因为这些显然是可变的。还需要指出的是，本发明中的术语只用来说明特定的实施例，并无限定的意思，因为，本发明的范围仅由后文权利要求书来限定。
除非另作说明，本文中科技术语的意义与本领域技术人员的惯常理解相同。虽然在实施或验证本发明时，与在此所述类似或相当的各种方法和材料均可采用，但优选的是本文所述的方法和材料。本发明结合并参考了文中提及的所有出版物，用于揭示和描述与之相关的方法和/或材料。
引用在此讨论的出版物，只是因为它们公开于本发明申请之前。但根据先发明的原则，并不等于承认本发明发明于这些出版物之后。而且，如果出版物的实际出版日晚于本文的记载，则应予以更改。
定义“血清”指如下制得的血液组分，抽取血液，置于容器中，不加防腐剂，任其凝结。血清是血液中的液体部分，此时可将其与血凝块分离。血凝块由可溶性蛋白质(血纤蛋白原)转化为不溶性蛋白质(血纤蛋白)而形成。血纤蛋白形成海绵样的纤维网，截留血细胞形成固体物质。凝结在室温下通常需10-15分钟，但可能会根据具体血型和装载血液的容器类型而不同。广义地讲，“血清”指血液中的非固体样物质，且不包括凝血蛋白。血清与血浆之间的差异在于，血清是用含血纤蛋白的凝结血制备的，含血纤蛋白原的血浆则是由加入抗凝血剂阻止其凝结的血液制得的。用血纤蛋白原试验可确定样品是血清还是血浆。在血清中加入血纤蛋白原不会发生反应。抗血凝血浆样品可在收集后立即离心。不含抗凝血剂的血清样品必须让其在室温下凝结至少30分钟。凝血时间会受玻璃或硅颗粒等物理因素的影响，也会因加入凝血酶而缩短。为了获得血浆，可加入抗凝血剂，例如EDTA，柠檬酸钠(可缓冲或不缓冲)或肝素。比较实施例1-3使用柠檬酸钠缓冲液作为抗凝血剂。在需用血清的本发明方法中没有使用抗凝血剂。
“结合剂”在此指可选择性结合或络合蛋白质紧密构象(例如PrPSc)和/或其松散构象(例如PrPC)的各种材料。所述的结合剂可以是生物分子，例如肽或抗体(例如各种构象(天然或变性)PrPSc的特异性抗体)，或化学试剂，例如磷钨酸(PTA)(也可以是盐形式，例如磷钨酸钠)。可使用一种或多种结合剂。例如，可先后使用生物结合剂和化学结合剂，例如肽和化学试剂。另一实施例中，可同时使用两种同类的结合剂，例如磷钨酸(及其盐)与三氯乙酸的混合物。所形成的复合物需能够用某种方法将其与组合物中的其它组分分离，例如将结合剂固定于一个表面。例如，结合剂与目标蛋白(PrPSc)结合形成结合剂/蛋白质复合物，其比重大于单独的蛋白质或结合剂。因此，可利用重力，最好辅以离心分离出结合剂/蛋白质复合物。优选的结合剂与PrPSc的结合性高于与PrPC的结合，特别好的是高亲和力结合PrPSc，与PrPC则没有明显结合的结合剂。客观上，优选的结合剂与PrPSc的亲和力比与PrPC的高2倍以上，高5倍以上则更好。
“蛋白质”在此包括各种氨基酸序列，包括糖蛋白之类修饰序列。它包括天然蛋白质和多肽，以及重组或合成蛋白质和多肽。结合本发明，“蛋白质”特指至少具有2种不同构象的天然蛋白质，这2种构象具有相同或基本相同的氨基酸序列，但有2种或更多种不同的三维结构。蛋白质的这两种构象中，至少一种与疾病无关，至少一种与疾病相关一致病构象。本发明的一个特定优选例子是PrP蛋白，它具有非致病型PrPC，和疾病相关型PrPSc。虽然朊病毒或PrP蛋白的PrPSc型具有感染性和致病性，其它蛋白质的病原构型则致病但不传染。在此，“致病”表示蛋白质实际引起疾病，或仅表示蛋白质与疾病相关，因而存在于疾病发生时。因此，本发明所述的病原蛋白质不一定是特定的病因。
“PrP蛋白”，“PrP”等可互换使用，即表示已知可引起人和动物患病(海绵样脑病)的感染性PrPSc粒子，也包括适当条件下可转化为感染性PrPSc形式的非感染性PrPC。
“朊病毒”，“朊病毒蛋白质”和“PrPSc蛋白质”在此互换使用，表示PrP的感染性PrPSc形式，是“蛋白质”和“感染性”的缩写。粒子主要由PrP编码的PrPSc分子构成。朊病毒通常是PrPSc二聚体。朊病毒与细菌、病毒和类病毒不同。已知的朊病毒可感染动物，引起朊病毒疾病“羊瘙痒症”，这是一种传染性、羊神经系统退行性疾病，以及“牛海绵样脑病”(BSE)，或“疯牛病”和“猫海绵样脑病”。已知有4种朊病毒疾病可感染人(1)库鲁病，(2)克罗伊茨费尔特-雅各布综合征(CJD)，(3)格-斯-切三氏综合征(GSS)和(4)致死性家族性失眠症(FFI)。本文中的“朊病毒”包括朊病毒在所用的各种动物中(尤其是人和农畜)，引起以上疾病全部或任一或其它疾病的所有形式。
“PrP基因”在此表示表达PrP蛋白的遗传物质，包括其已知的多态型和致病突变。“PrP基因”泛指编码PrP蛋白各种形式的各种动物的各种基因。一些公知的PrP序列可参见Gabriel等，美国科学院院报899097-9101(1992)和美国专利5,565,186，5,763,740，5,792,901和WO97/04814，在此引用并参考，视为这些序列的公开和描述。PrP基因可取自任意动物，包括本文所述的“宿主”动物和“被测”动物，及其所有的多态型和突变型，而且还包括有待发现的此类PrP基因。该基因表达的蛋白质可归为PrPC型(非致病型)或PrPSc型(病原性)。
“抗体”指能够结合抗原的免疫球蛋白。本发明的抗体包括能够结合有意义的表位、抗原或抗原性片段的完整抗体和抗体片段(例如F(ab)′，Fab和Fv)。本发明试验的优选抗体对有意义的蛋白质，例如PrP蛋白，特别是PrPSc蛋白或PrPSc二聚体具有免疫反应性或免疫特异性，因而与之特异性结合。可以使用对天然非疾病型和疾病型(例如，天然PrPC和天然PrPSc)都具有免疫反应性和免疫特异性的抗体。PrP的抗体最好具有免疫特异性-例如，与相关物质基本上不发生交叉反应。可用于本发明的部分特异性抗体可参见PCT申请WO97/10505，在此引用，视为这些抗体的公开和描述。以上已公开的PCT申请对应于1998年12月8日申请的美国专利5,846,533，也在此引用。“抗体”包括各种类型的抗体，例如多克隆抗体，单克隆抗体，噬菌体展示法产生的抗体。本发明特别优选的是对天然PrPC和天然PrPSc的亲和力都较高的抗体，尤其是对PrPSc亲和力更高的。本发明的抗体之一是前文所述的“结合剂”。
结合PrPC的抗体之一是用1986年10月8日保藏于美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852)并公开于美国专利4,806,627的杂交瘤细胞系ATCC HB9222生成的单克隆抗体263K 3F4，在此引用，视为对选择性结合PrPC但不结合PrPSc的抗体的描述。
“纯化抗体”指抗体几乎不含天然与之结合的其它蛋白质、糖和脂类。这样的抗体“优先结合”PrPSc蛋白(或其抗原性片段)，基本上不识别不结合其它抗原性相关分子。本发明的纯化抗体具有对某一种物质的免疫反应性和免疫特异性，尤其是对天然PrPSc。
蛋白质(例如PrP蛋白)的“抗原性片段”指所述能结合抗体的蛋白质的一部分。
“特异性结合”指，抗体以高活性和/或高亲和力结合某种特定多肽，例如蛋白质表位，例如PrPSc。较好的是，抗体与该特异性多肽上其表位的结合强于该抗体与任意其它表位(特别是可能与有意义的特定多肽结合或共存于样品中的表位)的结合，例如，与蛋白质(例如PrPSc)的表位片段具有更强的结合性，因而，通过调节结合条件，可使得抗体几乎只与目标蛋白上的表位位点或片段(例如PrPSc的表位片段)结合。
“经可测标记的抗体”，“用经可测标记的抗PrP”或“经可测标记的抗PrP片段”表示连有可测标记的抗体(或保留结合特异性的抗体片段)。可测标记一般通过化学偶联连接，但当标记是多肽时，也可通过基因工程来连接。产生经可测标记的蛋白质的方法是业内所熟知的。业内所知的可测标记一般是放射性同位素，荧光团，顺磁性标记，酶(例如辣根过氧化物酶)，或其它基团及化合物，它们或发出某种可测知的信号(例如放射性，荧光，颜色)，或在标记与其底物接触后发出可测信号。各种可测标记/底物对(例如辣根过氧化物酶/二氨基联苯胺，亲和素/链霉亲和素，荧光素酶/荧光素)，标记抗体的方法，和使用经标记抗体的方法的是业内熟知的(参见，例如，Harlow和Lane编辑(抗体实验室手册(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。一种特别好的标记是铕。
本文中的缩写有CNS中枢神经系统；BSE牛海绵样脑病；CJD克罗伊茨费尔特-雅各布综合征；FFI致死性家族性失眠症；GdnHCl盐酸胍；GSS格-斯-切三氏综合征；Hu人；HuPrP人朊病毒蛋白；Mo小鼠；MoPrP小鼠朊病毒蛋白；SHaSyrian仓鼠；SHaPrPSyrian仓鼠朊病毒蛋白；PrPSc朊病毒羊瘙痒症异构型；PrPC朊病毒细胞内正常异构型；PrPCJD；PrP蛋白的CJD异构型；
FVB小鼠标准近交品系，常用于产生转基因小鼠，因FVB小鼠的卵子较大，对于显微注射异源DNA的耐受性较好。-β平面构象的朊病毒蛋白的浓度；[DRC]-蛋白质疾病相关构象的浓度；PTA-磷钨酸；NaPTA-磷钨酸钠；TCA-三氯乙酸；AC-亲合层析。
本发明主要内容目前正在进行朊病毒检测的开发，但尚未商品化。而且，对于此类试验的成本、方便性或准确性(大规模)尚未确定。所以，当怀疑某种物质(例如人血浆)含有朊病毒时就将其销毁。参见华尔街杂志，1998年11月25日，p.1，“英国因疯牛病而销毁部分鲜血”，表明英国正在销毁其人血浆储备。采取这样的极端行为是因为1)朊病毒可能存在于人血浆中，2)朊病毒疾病是致死性的，目前尚无法治愈，3)目前尚无商品化的朊病毒检测方法，4)目前尚无从样品中去除朊病毒的商品化方法。本发明包括一种样品制备方法，可使样品能接受进一步的分析，例如检测有无某蛋白质的疾病型，例如PrPSc。
某些蛋白质，例如PrP基因表达的蛋白质，具有一种以上构象。例如，PrP可能呈其细胞形式，即PrPC，或呈其羊瘙痒症形式，即PrPSc。其中一种无害(例如PrPC)，另一种致病(例如PrPSc)。当动物(例如，人，牛，羊，猪或鸡)体内蛋白质的紧密、致病型(例如PrPSc)存在量很少时，不表现出疾病症状。然而，动物体内会发展成与此蛋白质致病型相关的疾病-例如发展成朊病毒疾病。要避免可能的疾病传播，重要的是测定生物液，尤其是准备输给受主的生物液(例如血制品)中是否存在PrPSc。本发明就可用于用特定方法制备样品，使得该样品可用于试验，从而测定其中是否存在蛋白质的疾病构象。如果测到蛋白质的疾病构象，则将剩余的血液销毁。如果没有检测到蛋白质疾病构象，则该血液可直接使用、储存或用来制备血制品。
与不溶性蛋白质相关的疾病本发明主要涉及用本发明发现血液中PrPSc的。然而，如前所述，本发明可用于鉴定或测定任何可能具有两种不同构象(其中之一与疾病相关)的蛋白质。以下非限定性地列举与具有2种以上构象的不溶性蛋白质相关的疾病。
需要指出的是，以上不溶性蛋白分别包括多种存在于不同物种中的变异体或突变体，这些都包括在本发明内。以下是已知与朊病毒疾病相关的PrP基因致病突变和多态型，人、羊和牛的序列可参见1996年10月15日的美国专利5,565,186。
突变表
需要指出的是，以上蛋白质具有相同氨基酸序列的两种不同三维构象。一种构象与疾病特征相关，一般是不溶性蛋白质，另一种与疾病特征无关，是可溶性蛋白质。本发明的方法不局限于所列举的疾病、蛋白质和品系。
一般方法本发明最重要的是检测加工过程中的步骤，是这些步骤使得制得的样品可接受进一步的分析，例如检测是否存在蛋白质的疾病构象，如检测有否PrPSc。当准确按照本发明制备样品时，可用许多不同的试验方法来检测有意义的蛋白质。然而，未按本发明制备的样品则则会在已知方法试验中给出假阴性结果。
简而言之，本发明包括首先，获得血液样品，任其凝结。分离出血清，用结合剂处理血清，结合剂与有意义蛋白质形成结合剂/蛋白质复合物。复合物的形成有助于有意义蛋白质的浓缩，例如，可提高其比重，于是可通过离心分离复合物并浓缩。至此，样品已适当制得，可进一步接受分析，例如用已知方法或研发中的方法检测有否有意义蛋白质。
本发明用来制备样品的血液可以是任何血液，但以人或农畜(例如牛、羊、马或鸡)的血液为佳。虽然让血液凝结很重要，但不需要用特殊的方法来实现凝结。可以简单地将血液静置于室温下(最好在无菌玻璃容器中)，观察其凝结。当然，绝对不能加入抗凝血剂、抗凝结剂，或者会阻止凝结的其它化合物。如此，就去除了血液中与凝血有关的蛋白质，去除这些蛋白质对于样品制备来说是十分重要的，因为，这些凝血蛋白会在某种程度上阻碍有意义蛋白质的检测。待血凝块形成后，用已知方法(例如离心)分离出血清，直至血清明显与血凝块分离，并可从样品上部倒出。
获得血清后，处理血清，以浓缩其中的有意义蛋白质。这最好是通过加入结合剂，结合剂形成结合剂/蛋白质复合物，其比重高于结合剂或有意义蛋白质本身。这样，复合物从样品中沉淀，离心则可大大加快沉淀的速度。
目的用途按照本发明制得的样品具有多种用途。例如，样品本身可用来进一步分析是否存在有意义蛋白质(例如朊病毒)。然而，本发明还提供了许多其它可能的用途。例如，样品可用于对与结合剂形成复合物的蛋白质进行特殊鉴定。对蛋白质的鉴定可提供有用的信息。所述的鉴定可包括测定蛋白质的溶解度，三维结构和感染性。然后，可将这些特征及其它特征与抽提自其它器官或组织(例如从脑组织中抽提和分离)的该蛋白质的已知特征比较。
在此不对本发明的作用机理进行结论性的阐述。因此，本发明的范围不局限于任何解释其潜在机理的特定理论。尽管如此，参与凝血的蛋白质似乎阻碍致病构象的形成。或者，凝血蛋白质可能去除某些可令蛋白质致病形式形成的其它抑制剂或因子。如果是这样，则分离出这种抑制剂将获得有价值的疾病治疗药。可在第一次发现与蛋白质致病型相关的疾病征兆后，将该抑制剂给予包括人在内的任何哺乳动物，于是可阻止蛋白质致病型的进一步形成，从而中止疾病的进程。
结合剂实施例之一中，结合剂是化学试剂，如杂多酸(例如PAT)，或者，更好的是其金属盐(NaPAT)。用该结合剂处理样品足够的时间，使得样品中几乎全部PrPSc都与PAT形成复合物。例如，样品可在约30-45℃(以37℃为佳)保温约1-16小时。结合剂与PrPSc形成复合物。重要的是，形成的化合物必须可用过滤、磁场、沉降等方法从样品中分离。
本发明制备的样品中，PrPSc或其它致病蛋白大大浓缩。
可用作本发明结合剂的化合物包括抗体，酶，肽，化学物质，结合性分子等。以合适的方式使用这些结合剂，令其可与血清中的朊病毒结合并将其浓缩，同时保持血清中其它重要元素完好，例如保持细胞形态和蛋白质完整性。
化学试剂在本发明实施例之一中，用来从生物材料中去除朊病毒的化合物是可沉淀PrPSc的化学试剂。用作本发明结合剂较好的一类化学试剂是杂多酸及其盐。杂多酸是氧负离子的完全或部分质子化形式，它具有至少一个中心元素，和至少一个配位元素。杂多酸可能呈Keggin或Dawson结构。
一类特定的杂多酸是杂多钼酸盐的质子化形式。这些阴离子中心原子周围具有2-18个六价的钼原子。已鉴定到36种不同元素可作为杂多钼酸盐的中心原子。中心阴离子被高度氧化。杂多钼酸盐的例子包括[PMo12O40]3，[As2Mo18O62]6，和[TeMo6O24]6，其中的中心原子分别是P5+，As5+和Te6+。有关杂多钼酸盐更详细的内容可参见Kirk-Othmer化工技术大辞典，第三版，15，688-689(1981)。
另一类杂多酸，与杂多钼酸盐的质子化形式类似，是杂多钨酸盐的质子化形式。在杂多钨酸盐中，配位元素是钨而不是钼。本发明全文参考的美国专利4,376,219描述了各种杂多酸的制备方法。这些杂多酸的中心元素可选自P，Si，B，Ge，As，Se，Ti，Zr，Mn，F，V，Ce和Th。这些杂多酸中的配位元素包括Mo和/或W。可选的配位元素包括V，Mn，Co，Ni，Cu，Zn和Fe。配位元素与中心元素之比为2.5-12，以9-12为佳。具体的杂多酸，参见美国专利4,376,219，包括磷钨酸，硅钨酸，10-钨-2-钒磷酸，6-钨-6-钼磷酸，磷钼酸，硅钼酸，锗钨酸，钨氟酸，18-钨-2-磷酸，以及它们的盐，例如Na、K、Mg和Ca等金属盐。本发明所用的特定杂多酸是磷钨酸，即H3PW12O40，及其钠盐等金属盐。该结合剂可有效地结合PrPSc。
上述化学试剂可单独使用，混合使用，或与缓冲液、结合惰性化合物等其它非生物活性化合物联用。本发明的杂多酸宜用其金属盐形式，但并不局限于此。所述的金属盐包括但不限于钠，钾，钙等。
加入血清的杂多酸或其盐的量需足以浓缩血清中的所有PrPSc，更好的是，足以去除PrPSc直至检测不到，至少低于感染水平。杂多酸与血清的重量比为1∶20至1∶1。可用任何方法将杂多酸与血清混合，只要能充分分散杂多酸，从而提高杂多酸的有效表面积，确保形成复合物。
生物试剂另一实施例中，结合剂是蛋白质、肽或其它选择性结合PrPSc的生物分子。
实施例之一中，结合剂是为选择性结合朊病毒而设计的肽或其它小分子。较好的是，这些肽或小分子是为优先结合PrPSc而设计的。“优先结合”表示，经设计，肽结合生物溶液中的PrPSc比结合其它蛋白质快至少20倍，至少50倍，至少100倍，甚至至少1000倍。本发明的肽宜设计成可与PrPSc的天然形式而非变性形式结合，因为生物液所含的一般是PrPSc的天然形式。如本领域技术人员可以预计的，将肽设计成针对PrPSc上更容易结核的区域，可使得肽获得最大的PrPSc结合效率。可用的结合PrPSc的抗体可参见1998年12月8日的美国专利5,846,533，在此引用，视为对抗体及其制备方法的公开和描述。或者，可将肽设计成选择性结合PrPC或PrPSc和PrPC两者。
本发明的结合剂还可以是朊病毒选择性的抗体。可将所述抗体加入血清，使得抗体与有意义的蛋白质结合。该抗体可结合PrPSc，例如美国专利5,846,533中所述的抗体。为了去除样品中的PrPC，可使用选择性或只结合PrPC的抗体。这样的抗体参见1989年2月21日的美国专利4,806,627，其中描述了单克隆抗体263K3F4，是用1986年10月8日保藏的细胞系ATCC HB9222产生的。该产抗体细胞系可向美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852)获取。
通常，羊瘙痒症感染不会激发免疫反应，因为宿主抗体对于同种的PrPSc具有耐受性。美国专利5,846,533公开了结合PrPC或PrPSc的抗体。任何结合PrPC而不结合PrPSc的抗体均可使用，而且，本领域技术人员可用已知方法产生中心抗体，有关方法参见美国专利5,223,409中产生噬菌体展示抗体库的方法。已用大量甲酸或SDS-变性的SHaPrP 72-30免疫在家兔中产生了多克隆抗PrP抗体[Bendheim，Barry等(1984)，自然，310418-421；Bode，Pocchiari等(1985)，遗传与病毒杂志662471-2478；Safar，Ceroni等(1990)神经学40513-517]。类似的，已在小鼠中产生了少量抗PrP27-30的抗PrP单克隆抗体(Barry和Prusiner(1986)，传染病杂志154518-521Kascsak，Rubenstein等(1987)病毒学杂志613688-3693)。这些抗体抗甲酸或SDS-变性的SHaPrP 72-30，能够同样良好地识别来自SHa和人的天然PrPC和处理或变性PrPSc，但不结合MoPrP。显然，这些抗体的表位在图谱上是SHa与MoPrP不同的氨基酸序列区。(Rogers，Yehiely等(1993)美国科学院院报903182-3186)。
就本发明目的而言，如果没有发生结合，则表明平衡常数或亲和力常数Ka不超过106l/mol。而且，当Ka在107l/mol以上，更好的是108l/mol以上时，则出现结合。结合亲和力在在107l/mol以上可能是因为(1)一种单克隆抗体(即，大量的一种抗体)或(2)大量不同的单克隆抗体(即，5种单克隆抗体每一种的量都较大)或(3)大量多克隆抗体。优先的应该是与蛋白质的处理或变性PrPSc形式比结合PrPSc天然构象强至少4倍的抗体。要获得4倍的结合亲和力差异，可使用数种不同的上述(1-3)抗体，但是，以上数种抗体混合使用也可能使所述差异低于4倍。
蛋白质检测试验用本发明方法制成样品后，可用多种已知方法对其进行试验。本文中实施例和比较实施例所用的是1998年2月20日公开的PCT申请WO98/37411所述的构象依赖性免疫分析(CDI)。然而，也可用其它蛋白质检测试验。例如，可用生物试验，具体地说，即使用专用于检测朊病毒的转基因小鼠。有关此类小鼠，参见1996年10月15日的美国专利5,565,186，1998年6月9日的5,763,740，1998年8月11日的5,792,901。或者，可用1998年12月8日的美国专利5,846,533所述的抗体对制成的样品进行试验。在此引用以上出版物作为参考，权作为对于本发明样品所适用试验的公开和描述。然而，需要指出的是，本发明并非只可用于上述蛋白质试验。本发明样品还适用于其它试验，而且，无疑也将适用于新的方法，从而获得准确的结果。
由于构象依赖性免疫试验灵敏度高，所以本发明采用该方法，而且各实施例使用方式相同，从而使结果具有可比性。尽管PCT申请WO98/37411已详细描述了该试验，下文仍将就基本方法进行说明。
进行该方法，首先需将样品分成两份。一份与结合伴侣接触。结合伴侣对蛋白质第一构象的亲和力高于对该蛋白病理构象的亲和力。结合伴侣通常是抗体，诸如经标记的3F4。在结合伴侣与第一构象的蛋白质结合后，测定结合伴侣/蛋白质复合物的浓度。
用另一种方式处理另一份样品，增强蛋白质第二种构象与所述结合伴侣的亲和力。这种处理可用多种不同的方法，通常是让样品与蛋白酶在适当条件下接触足够的时间，使得蛋白质的第二构象松散，从而更容易与结合伴侣结合。
然后，将处理后的第二份样品与结合伴侣接触。结合后，测定第二份样品中结合伴侣/蛋白质复合物的浓度。
如果样品中没有蛋白质的第二种病理构象，则处理几乎没有效果。但是，处理会对蛋白质的第一种构象产生某些影响，可能略微提高其与结合伴侣的亲和力。所以，必须对第二浓度进行校正，得到的校正浓度应抵消第一构象蛋白质与结合伴侣因处理而提高的亲和力。
得到第一浓度和校正浓度后，将两者进行比较。如果校正浓度高于第一浓度，表明原样品含有第二构象的蛋白质。
可以对构象依赖性免疫试验进行修改。一种修改如PCT申请WO98/37411所述，不必将样品分成两份。对样品进行处理，并测定浓度。然后将该浓度与已知的标准值(事先用具有统计学显著性的样品组获得的数据)进行比较，从而确定被测样品中是否含朊病毒。
实施例以下实施例向本领域技术人员全面描述了本发明的实施，但并非以此作为对本发明的限定，也不表示发明人仅实施了以下实验。虽然尽可能确保所用数据(例如量，温度，等)的准确性，但需容许某些实验误差和偏差。除非另作说明，份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力约为一个大气压。
比较实施例1，2，3显示分别由(1)白细胞，(2)血小板和(3)血浆制备含朊病毒的样品时，都显示假阴性结果。然而，按本发明方法由血清制得样品时(实施例4)，得到了真阳性结果。在比较实施例1，2，3，以及实施例4中，所用的结合剂都是磷钨酸钠。而且，制得的样品都用构象依赖性免疫试验(CDI)进行检测。
比较实施例用构象依赖性免疫试验(CDI)检测柠檬酸钠处理的Sybian仓鼠血液组分中的PrPSc为例避免凝血，Sybian仓鼠的全血按(1∶9)与3.8％(w/v)柠檬酸钠缓冲液(pH7.2)混合，以1100RPM离心得到血浆，然后用Percoll梯度分离成不同组分(Pharmacia)。然后在蛋白酶抑制剂存在下，用PTA沉淀正常(对照)和羊瘙痒症感染的Sybian仓鼠的白细胞(WBC)，血小板和血浆。用CDI检测沉淀中有否朊病毒的感染性异构型(PrPSc)。加入柠檬酸钠是为了避免凝血，和提供比较实施例。
比较实施例1白细胞在羊瘙痒症感染的Sybian仓鼠的白细胞中无法测到PrPSc。柠檬酸缓冲的血液中的白细胞用2％十二烷基肌氨酸钠裂解，用磷钨酸钠沉淀。将用各样品制备的天然和变性等份与戊二醛活化的ELISA板交联，两等份都与铕标记的3F4单克隆抗体共培养。7步洗涤后，用Dicorvery(Packard Inc.)时间分辨荧光光谱法评价信号。结果表示为各样品变性(TRFD)等份与天然(TRFN)等份的信号之比。
比较实施例2血小板由柠檬酸缓冲的羊瘙痒症感染的Sybian仓鼠血液制得的血小板中无法测到PrPSc。柠檬酸缓冲的血液中的血小板用2％十二烷基肌氨酸钠裂解，用磷钨酸钠沉淀。将用各样品制备的天然和变性等份与戊二醛活化的ELISA板交联，两等份都与铕标记的3F4单克隆抗体共培养。7步洗涤后，用Dicorvery(Packard Inc.)时间分辨荧光光谱法评价信号。结果表示为各样品变性(TRFD)等份与天然(TRFN)等份的信号之比。
比较实施例3由柠檬酸缓冲的羊瘙痒症感染的Sybian仓鼠血液制得的血浆中无法测到PrPSc。柠檬酸缓冲的血液中的血浆用2％十二烷基肌氨酸钠裂解，用磷钨酸钠沉淀。将用各样品制备的天然和变性等份与戊二醛活化的ELISA板交连，两等份都与铕标记的3F4单克隆抗体共培养。7步洗涤后，用Dicorvery(Packard Inc.)时间分辨荧光光谱法评价信号。结果表示为各样品变性(TRFD)等份与天然(TRFN)等份的信号之比。
实施例4用构象依赖性免疫试验(CDI)检测由凝结的全血制得的血清中的PrPSc羊瘙痒症感染的Sybian仓鼠血清中的阳性PrPSc检测。当检测值高于2.5时，表示血清中存在PrPSc。让正常(对照)或羊瘙痒症感染的Sybian仓鼠全血在玻璃试管(Becton-Dickinson，Inc.)中凝结。通过3,000rpm离心将血清与血凝块分离，用蛋白酶抑制剂封闭。加入2％十二烷基肌氨酸钠，0.8-1.2％(w/v)磷钨酸钠，35-50mMMgCl2，样品在37℃培养过夜，然后14,000g离心。将沉淀重悬后分成天然和变性等份。各等份与戊二醛活化的ELISA板交连，两等份都与铕标记的3F4单克隆抗体共培养。7步洗涤后，用Dicorvery(Packard Inc.)时间分辨荧光光谱法评价信号。结果表示为各样品变性(TRFD)等份与天然(TRFN)等份的信号之比。每个数据点代表一个实验。
实施例5正常(对照)与羊瘙痒症感染的Sybian仓鼠的数据没有重叠，说明血清PrPSc检测具有高度的灵敏性和特异性。实施例4的数据表示为中值(中线)，50％值(虚线)，和95％值(外框线)以上是发明人认为的本发明最佳实施例。然而，需要指出的是，在本发明范围内，实施方式可与之不同，而且，根据本发明所述，可作的修改是显而易见的。
权利要求
1.一种分析样品中是否存在蛋白质致病构象的方法，其步骤包括获得一定量的血液；让血液凝结；从凝结的血液中分离出血清；用结合剂处理血清，结合剂与蛋白质的致病构象形成结合剂/蛋白质复合物；浓缩样品中的复合物，以获得浓缩样品；将第一部分浓缩样品与一种结合伴侣接触，所述的结合伴侣对第一种构象的亲和力高于对第二种致病构象，检测第一部分浓缩样品中结合伴侣/蛋白质复合物的第一浓度；处理第二部分浓缩样品以提高第二构象与结合伴侣的亲和力；将处理后的第二部分浓缩样品与结合伴侣接触，测定经处理第二部分样品中结合伴侣/蛋白质复合物的第二浓度；对第二浓度进行校正，对于处理引起的蛋白质第一构象与结合伴侣的亲和力提高进行补偿，获得校正浓度；将第一浓度与校正浓度比较，确定是否存在第二种致病构象的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中就蛋白质致病型所述的蛋白质选自βA4蛋白质，PrP蛋白质和甲状腺素运载蛋白，通过离心分离血浆，所述结合剂是杂多酸或其盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其中的血液采自无疾病症状的以下哺乳动物人、牛或羊，所述的结合剂是磷钨酸盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其中的血液采自人，蛋白质致病构象是PrPSc，结合剂是磷钨酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，还包括分析复合物中的蛋白质，确定以下特征溶解度，三维结构和感染性。
6.根据权利要求5所述的方法，还包括将该蛋白质的特征与该蛋白质疾病构象的同一特征相比，后一蛋白质采自同一供血动物的脑组织。
7.根据权利要求1所述的方法，其中第一浓度和第二浓度用时间分辨增强荧光法进行；其中蛋白质第二致病构象在样品中的浓度不超过1×103粒/ml；其中所述的蛋白质选自βA4蛋白质，PrP蛋白质和甲状腺素运载蛋白；其中对第二部分样品的处理方法选自加热，加压和化学变性，直至使至少2％第二致病构象蛋白质转化为与结合伴侣亲和力有所提高的构象。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的结合伴侣包括标记的抗体，该抗体对蛋白质第一构象的亲和力比对第二构象至少高10倍；其中的血液采自哺乳动物人，牛，羊或猪。
9.一种分析样品中是否存在蛋白质致病构象的方法，其步骤包括获得一定量的血液；让血液凝结；从凝结的血液中分离出血清；用结合剂处理血清，结合剂与蛋白质的致病构象形成结合剂/蛋白质复合物；浓缩样品中的复合物，以获得浓缩样品；处理样品，使蛋白质第二构象转化为对结合伴侣亲和力提高的构象；将处理后的样品与结合伴侣接触，测定样品中结合伴侣/蛋白质复合物的浓度；校正上述浓度，对处理引起的第一构象与结合伴侣的亲和力升高进行补偿，得到校正浓度；将校正浓度与已知浓度比较，测定样品中是否存在第二构象蛋白质，所述的已知浓度选自对照浓度和预先测定的标准品浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的结合伴侣是标记抗体，结合剂是磷钨酸的金属盐，所述的浓度通过流式细胞计数法测定。
11.根据权利要求9所述的方法，其中的蛋白质是PrP蛋白，并将校正浓度与用经处理未感染对照样品测定的已知浓度比较。
12.根据权利要求9所述的方法，其中将校正浓度与用经处理未感染哺乳动物群体样品预先测定的已知浓度比较，所述群体选自人，牛和羊。
13.根据权利要求10所述的方法，其中的抗体是3F4，结合剂是磷钨酸钠。
14.根据权利要求9所述的方法，其中第二构象蛋白质在样品中的浓度不超过1×103蛋白质分子/ml，第一构象蛋白质不低于1×106蛋白质分子/ml。
15.一种检测血液中PrPSc的方法，其步骤包括采集哺乳动物人，牛或羊的血液，从中获得血清，将此血清与结合剂接触，该结合剂结合血液中的PrPSc形成复合物，该复合物的比重高于PrPSc，利用比重浓集浓缩样品中的复合物，分析该浓缩样品中的PrPSc。
16.根据权利要求15所述的方法，其中的结合剂是杂多酸或其盐，并通过离心加强利用比重进行的浓缩。
全文摘要
以适当方式由血液制备样品，使之可进一步用以进行蛋白质分析，即检测其中有否朊病毒。抽取血液，任其凝结，通过分离(例如离心)获得血清。用结合剂处理该血清，该结合剂与样品中的朊病毒形成结合剂/蛋白质复合物，由此可浓缩该复合物。浓缩而成的样品可进行分析，例如用各种方法检测其中有否朊病毒(见附图)。
文档编号G01N33/68GK1657942SQ20051000591
公开日2005年8月24日 申请日期2000年2月28日 优先权日1999年3月5日
发明者S·B·普鲁赛纳, J·G·萨法 申请人:加利福尼亚大学董事会