专利名称：判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法
技术领域：
本发明涉及了一种判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，尤其是以大豆豆饼、豆粕或者是以它们的粗提物为底物进行酸水解或微生物转化时，能够快速、准确、简便地判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法。并且涉及了一种快速、有效地筛选能够酶解大豆异黄酮糖苷菌种的方法。
背景技术：
大豆异黄酮是大豆等豆科植物生长过程中形成的一类次生代谢产物，具有多种生理功能，它不仅参与调节植物的生长活动，还能对人体发挥有益的生理调节作用。对于大豆异黄酮，天然苷类的分子结构并不是活性发挥的最佳状态，普遍认为苷元才是活性发挥的最佳状态。然而，在大豆中，大豆异黄酮主要是以染料木黄酮、大豆苷和黄豆苷糖苷形式存在的，它们对应的苷元染料木素、大豆苷元和黄豆苷元的含量很少。为了得到生物活性高的大豆异黄酮苷元，在工业上大多以大豆豆饼或豆粕为底物，采用酸水解或微生物转化的方法将糖苷转化为苷元。判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度，通常是通过水解前后苷元含量的变化来判断的。然而，此方法过程相对比较繁琐。
发明内容
本发明目的是提供一种判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，该方法快速、简便、准确，是将水解后得到的样品经薄层层析，通过在紫外灯下观察硅胶板上第三条荧光斑荧光的有无或强弱判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度。
本发明判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法包括商品豆粕经乙醇提取、提取液抽滤除杂质、减压蒸馏浓缩至无乙醇得水相、以水相为底物进行水解、用乙酸乙酯从水解液中萃取大豆异黄酮苷元、萃取液减压浓缩、浓缩相进行薄层层析、在紫外灯下观察层析结果判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度，其特征在于本发明商品豆粕经30～80％的乙醇提取，其中乙醇体积(mL)与豆粕重量(g)之比为2∶1到10∶1，提取温度20～40℃，超声提取30～120分钟。
本发明用真空泵抽滤除去乙醇提取液中的固体物质，得乙醇相。
本发明减压浓缩是用减压蒸馏法进行浓缩，温度为50～70℃，浓缩至无乙醇，得到水相。
本发明以水相为底物进行水解，是用酸水解(如1～2moL/L的盐酸或0.5～1.0moL/L的硫酸等在30～100℃水浴中水解0.5～2.0h)或用能产生β-糖苷酶的微生物转化(在含5～10％脱脂豆粕、pH＝4.0～8.0的培养基中，温度为28～30℃条件下，150～300r/min，摇瓶培养)。
本发明用乙酸乙酯从水解液中萃取大豆异黄酮苷元，是先将水解液调pH至4～5，用水解液一倍体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，并减压蒸馏浓缩。
本发明对浓缩相进行薄层层析，是在GF254硅胶板上，以体积比甲苯∶氯仿∶丙酮＝4∶1.8∶1.8为展开剂对浓缩相进行层析。
本发明在紫外灯下观察浓缩相以上述展开剂层析后的GF254硅胶板，发现空白样、酶解样和酸水解样在与标准品染料木素和标准品大豆苷元展开距离相同位置处都有两个荧光斑出现，酸水解样除了上述两个荧光斑外还出现了第三个荧光斑，而酶解样经薄层层析后有的出现了第三条荧光斑有的没有出现。
本发明对第三个荧光斑进行定性分析，首先刮起硅胶板上在紫外灯下观察到的第三个荧光斑位置处的硅胶，用分析纯的甲醇洗脱硅胶，离心并浓缩甲醇相得样品。取少量样品用于HPLC-PDA分析，由它的三维色谱图可知，它在紫外区末端有吸收并且在波长为205nm处有最大吸收，这与已报导的大豆精醇的色谱特征相符，大豆精醇为甾体类物质。取少量样品进行Liebermann-Burchard反应，反应成阳性，证明样品中有甾体母核结构存在。取少量样品进行HPLC-MS分析，ESI/MS(+)的基峰是496.9(M+Na)、480.9(M+Na)，对应的分子量为473.9、457.9分别与大豆精醇A和大豆精醇B的分子量相对应。由以上分析可确定第三个荧光斑为大豆精醇。
本发明分别测定了空白样、酸水解样(在不同的时间内以同浓度的酸水解大豆异黄酮糖苷或在相同的时间内以不同浓度的酸水解大豆异黄酮糖苷)、酶解样(能产生β-糖苷酶的微生物转化)中染料木素和大豆苷元的含量，是将空白样、酸水解样和酶解样经上述方法层析后，在GF254硅胶板上分别刮取与标准品染料木素和标准品大豆苷元展开距离相同位置处的硅胶，用甲醇洗脱硅胶，离心并浓缩甲醇得到染料木素样品和大豆苷元样品，然后用紫外—可见分光光度计在λ＝263nm处测定染料木素并根据其标准曲线确定染料木素的含量，在λ＝254nm处测定大豆苷元并根据其标准曲线确定大豆苷元的含量。空白样经薄层层析后没有出现第三条荧光斑，酸水解样经薄层层析后有第三条荧光斑出现，而酶解样经薄层层析后有的出现了第三条荧光斑有的没有出现，并且样品经薄层层后出现的第三条荧光斑的荧光越强其所对应的样品中大豆苷元和染料木素的含量(由上述方法测得)也越高。由上述可知，通过样品经薄层层析后硅胶板上第三条荧光斑荧光的有无或强弱可以判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度。
本发明具有以下优点1、通过在紫外灯下观察硅胶板上第三条荧光斑荧光的有无或强弱可以快速、准确地判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度，避免了测定水解前后大豆异黄酮苷元含量变化的繁琐过程。
2、该发明为筛选能够酶解大豆异黄酮糖苷的菌种提供了快速、准确的方法。
3、用该发明方法可以检测以大豆豆饼或豆粕为原料制备的大豆功能性食品或保健品的前处理过程是否使生物活性物质—大豆异黄酮苷元的含量增加了。
具体实施例方式
实施例1
(1)以1#黑曲霉菌(Aspegillus niger)SFII(Sichuan Food IndustryInstitute)3.357、2#黑曲霉菌(Aspegillus niger)SFII 3.360、3#黑曲霉菌(Aspegillus niger)SFII 3.313、4#黑曲霉菌(Aspegillus niger)SFII M227、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SFII 10210、爪哇根霉菌(Rhizopus)SFII 03125分别在含8％脱脂豆粕、自然pH的培养基中，温度为28～30℃条件下，200r/min，摇瓶培养6天。
(2)用70％的乙醇(乙醇体积(mL)∶豆粕重量(g)＝6∶1)，在40℃下将上述经微生物发酵培养后的培养基分别超声提取40分钟，抽滤得乙醇提取液，在65℃下将其减压浓缩至浓缩液不含乙醇得到水相。
(3)用与水相相同体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相减压浓缩，得到乙酸乙酯浓缩相。
(4)在GF254硅胶板上，以体积比甲苯∶氯仿∶丙酮＝4∶1.8∶1.8为展开剂对乙酸乙酯浓缩相进行薄层层析。在紫外灯下观察除与标准品染料木素(Rf＝6.3)和标准品大豆苷元(Rf＝5.0)展开距离相同位置处的荧光斑外第三条荧光斑荧光的有无或强弱，并且通过发明内容中所述的测定染料木素和大豆苷元含量的方法测得经微生物发酵培养后各培养基中染料木素和大豆苷元的含量，结果如表1。
表1 经微生物发酵培养后各培养基中染料木素和大豆苷元的含量
注表中1、2、3、4表示第三条荧光斑的荧光由强到弱由以上结果可知，随着染料木素和大豆苷元含量的增加第三条荧光斑的荧光也由无到有，由弱到强。因此，水解样经薄层层析后可以通过在紫外灯下观察硅胶板上第三条荧光斑荧光的有无或强弱，快速、准确地判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度实施例2(1)称取2.5g脱脂豆粕，用70％的乙醇(乙醇体积(mL)∶豆粕重量(g)＝6∶1)，在40℃下超声提取40分钟，抽滤得乙醇提取液。
(2)分别用0.5、1.0、2.0moL/L的盐酸，在80℃水浴中水解上述乙醇提取液得到1#水解样、2#水解样和3#水解样。
(3)用NaOH调水解液的pH至4～5，用与各水解样相同体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相减压浓缩，得乙酸乙酯浓缩相。
(4)在GF254层析板上，以体积比甲苯∶氯仿∶丙酮＝4∶1.8∶1.8为展开剂对乙酸乙酯浓缩相进行薄层层析。在紫外灯下观察除与标准品染料木素(Rf＝6.3)和标准品大豆苷元(Rf＝5.0)展开距离相同位置处的荧光斑外第三条荧光斑荧光的有无或强弱，并且通过发明内容中所述的测定染料木素和大豆苷元含量的方法测得各酸水解样中染料木素和大豆苷元的含量，结果如表2。
表2 豆粕经不同浓度的盐酸水解后各水解样中染料木素和大豆苷元的含量
注表中1、2、3表示第三条荧光斑的荧光由强到弱由以上结果可知，随着盐酸浓度的增加水解样中染料木素和大豆苷元的含量也在增加，并且所对应的第三条荧光斑的荧光也越强。
实施例3(1)称取2.5g脱脂豆粕，同实施例2(1)方法处理得乙醇提取液。
(2)用2.0moL/L的盐酸，在80℃水浴中分别水解上述乙醇提取液0.5h、1.0h、1.5h得到1#水解样、2#水解样和3#水解样。
(3)同实施例2(3)方法处理水解样，得乙酸乙酯浓缩相。
(4)同实施例2(4)方法得到以下结果如表3。
表3 豆粕经同浓度的盐酸水解不同时间后各水解样中染料木素和大豆苷元的含量
注表中1、2、3表示第三条荧光斑的荧光由强到弱由以上结果可知，豆粕经同浓度的盐酸水解时，随着水解时间的增加水解样中染料木素和大豆苷元的含量也在增加，并且所对应的第三条荧光斑的荧光也越强。
实施例4(1)称取2.5g脱脂豆粕，同实施例2(1)方法处理得乙醇提取液。
(2)分别用0.25、0.5、1.0moL/L的硫酸同实施例2(2)方法处理乙醇提取液得到1#水解样、2#水解样和3#水解样。
(3)同实施例2(3)方法处理水解样，得乙酸乙酯浓缩相。
(4)同实施例2(4)方法得到以下结果如表4。
表4 豆粕经不同浓度的硫酸水解后各水解样中染料木素和大豆苷元的含量
注表中1、2、3表示第三条荧光斑的荧光由强到弱由以上结果可知，随着硫酸浓度的增加水解样中染料木素和大豆苷元的含量也在增加，并且所对应的第三条荧光斑的荧光也越强。
实施例5(1)称取2.5g脱脂豆粕，同实施例2(1)方法处理得乙醇提取液。
(2)用1.0moL/L的硫酸同实施例3(2)方法分别处理乙醇提取液0.5h、1.0h、1.5h得到1#水解样、2#水解样和3#水解样。
(3)同实施例2(3)方法处理水解样，得乙酸乙酯浓缩相。
(4)同实施例2(4)方法得到以下结果如表5。
表5 豆粕经同浓度的硫酸水解不同时间后各水解样中染料木素和大豆苷元的含量
注表中1、2、3表示第三条荧光斑的荧光由强到弱由以上结果可知，豆粕经同浓度的硫酸水解时，随着水解时间的增加水解样中染料木素和大豆苷元的含量也在增加，并且所对应的第三条荧光斑的荧光也越强。
实施例6(1)、将以黄豆为原料依照传统工艺制备的豆鼓，在40～70℃下烘干，碾成粉末。
(2)、取适量豆鼓粉末，同实施例1(2)方法处理得水相。
(3)、同实施例1(3)方法处理水相得到乙酸乙酯浓缩相。
(4)、在GF254硅胶板上，以体积比甲苯∶氯仿∶丙酮＝4∶1.8∶1.8为展开剂对乙酸乙酯浓缩相进行薄层层析。在紫外灯下观察到第三条荧光斑，并且通过发明内容中所述的测定染料木素和大豆苷元含量的方法测得豆鼓中大豆苷元(0.525mg/g)和染料木素(1.717mg/g)的含量比黄豆中大豆苷元(0.134mg/g)和染料木素(0.206mg/g)的含量增加了。
实施例71、取一片天雌素(大豆异黄酮片)、两片天雌素，分别碾成粉末。
2、分别用1～5mL乙酸乙酯超声提取5～20min，离心得乙酸乙酯相。
3、在GF254硅胶板上，以体积比甲苯∶氯仿∶丙酮＝4∶1.8∶1.8为展开剂对乙酸乙酯相进行薄层层析。在紫外灯下观察到由一片天雌素或两片天雌素制备的样品经层析后都有第三条荧光斑出现并且后者的荧光更强。
权利要求
1.一种判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，其特征是商品豆粕经乙醇提取、提取液抽滤除杂质、减压蒸馏浓缩至无乙醇得水相、以水相为底物进行水解、用乙酸乙酯从水解液中萃取大豆异黄酮苷元、萃取液减压浓缩、浓缩相进行薄层层析、在紫外灯下观察层析结果判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度。
2.权利要求1所述的判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，其特征是提取用乙醇浓度百分比为30～80％，提取温度20～40℃；减压浓缩是用减压蒸馏法进行浓缩，温度为50～70℃；水解用酸水解或用能产生β-糖苷酶的微生物转化；用乙酸乙酯从水解液中萃取大豆异黄酮苷元，是先将水解液调pH至4～5，用水解液一倍体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相。
3.权利要求1或2所述的判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，其特征是判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度是根据第三条荧光斑荧光的有无或强弱。
4.权利要求1或2所述的判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，其特征是薄层层析采用GF254硅胶板，以体积比甲苯∶氯仿∶丙酮＝4∶1.8∶1.8为展开剂对浓缩相。
全文摘要
本发明涉及了一种判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，针对目前判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度方法比较繁琐的缺点，本发明公开了一种判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法，通过商品豆粕经乙醇提取、提取液抽滤除杂质、减压蒸馏浓缩至无乙醇得水相、以水相为底物进行水解、用乙酸乙酯从水解液中萃取大豆异黄酮苷元、萃取液减压浓缩、浓缩相进行薄层层析、在紫外灯下观察层析结果判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度，本发明方法具有快速、准确等优点。
文档编号G01N1/34GK1869660SQ200510020978
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者赵海, 苗慧, 戚天胜 申请人:中国科学院成都生物研究所