专利名称：一种生物样品微型富集芯片及其制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物样品微型富集芯片及其制作方法，这种微型生物样品富集芯片利用抗原抗体反应或受体和配体反应对生物样本中的特定成分进行富集。
背景技术：
微型生物样品富集和分离芯片是样品预处理芯片的一种。其目的是在进行检测前对生物样本中某一种含量较少的特定成分进行富集，并除去生物样品中其它干扰成分，从而提高待检物质的检测灵敏度。
微全分析系统(micro total analytical system，μTAS)又称芯片实验室(Lab-on-a-chip)是在上世纪90年代由Manz et al.提出的概念，是将微机电技术(micro-electromechanical systems，MEMS)和分析化学检测相结合，把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的技术。这个概念一经提出就受到关注，经过十多年的发展，在微芯片上对核酸、蛋白质、有机化合物及无机离子的分离、分析及检测系统方面发展很快，已经有集成的商品化微全分析系统出现。如安捷伦公司2100微分析系统和岛津公司推出的MCE-2010型微芯片电泳系统。但生物样品的富集和分离微系统发展相对滞后，一方面是因为生物样本的多样性(如血液、尿液、粪便，污染水等)，性质各不相同(气体、液体、流体等)。其次，生物样本还有多种复杂成分，在检测和分离时相互干扰。
在芯片上实现生物样本中特定成分的微量富集，往往利用待检生物样本自身的物理、化学或生物学性质。依据分子大小不同、介电性质、超声场受力、固相萃取和电磁学性质实现特定成分的分离。
较好的微型生物样品富集和分离芯片具有以下几个方面的特点1)有较高的富集比例；2)非特异性的残留成分较少；3)富集速度较快；4)富集的过程不影响富集成分的性质。目前尚鲜有这方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物样品微型富集芯片机器制作方法。它是基于微加工技术和表面修饰技术，在微芯片上实现生物样本中特定成分的富集。
本发明解决的关键问题是如何将微加工技术和表面修饰技术相结合，将特异性抗体或受体固定在微加工的微柱阵列上，实现生物样本中特定成分的富集和分离，从而提高检测的灵敏度，并可减少试剂的用量，同时又可不必依赖大型的离心设备和过滤设备，操作简单。根据在微柱阵列表面固定成分的不同，可以灵活调整生物样本中不同成分的富集。该微型生物样品富集芯片选用硅和Pyrex玻璃作为加工得主要基底材料，材料来源丰富，价格低廉，微加工工艺成熟，可以批量生产。
本发明采用的技术方案是首先应用MEMS工艺在硅片表面加工出微柱阵列，严格清洗除去微柱表面的保护层，并进行氧化形成二氧化硅层，然后与预先打好样品进出孔的Pyrex玻璃片实现阳极键合。然后用3-氨丙基-3-乙氧基硅烷对微柱表面进行硅烷化，衍生活性氨基基团，使用刚性很强的双分子交联剂对苯二甲醛和微柱表面的氨基基团发生共价反应，另一个活性的醛基可以和蛋白质的氨基反应生成稳定的化学键，将抗体或配体固定在微柱的表面。当含特定成分的生物样品流经微柱阵列时，发生抗原-抗体反应或受体-配体反应，使其固定在微柱表面，用少量洗脱液进行洗脱，实现对特定生物样本中成分的富集。
本发明提供的一种生物样品微型富集芯片的制作方法是基于微加工技术和表面修饰技术相结合，将特异性抗体或受体固定在硅柱表面，并和流经液体中相应的抗原或配体发生特异性反应，使其固定在微柱表面，用洗脱液洗脱，从而实现对生物样本中成分的富集。
所述的生物样品微型富集芯片的制作方法具体步骤是(A)用MEMS加工工艺在硅片表面刻蚀出微柱阵列；(1)根据设计的图形制掩模版；(2)清洗有氧化层的硅片并烘干；(3)涂1813#光刻胶，光刻和显影；涂光刻胶时的转速为3000转/分，时间为30秒；(4)用深反应离子刻蚀，刻蚀后划片；刻蚀深度为50μm；(5)去除表面光刻胶和二氧化硅，用洗液清洗；(6)在芯片表面生长100纳米的二氧化硅层；且加工后划片；(B)芯片键合(1)清洗已打好加样孔和出样孔的Pyrex玻璃片；(2)在键合机上将步骤(A)加工好的基片和上述Pyrex玻璃片进行阳极键合；(C)芯片的表面引入活性官能基团(1)将步骤(B)键合后的微型生物样品富集芯片内充入浓度为98％的H2SO4和30％的H2O2按体积比为7∶3的比例配制的洗液进行表面处理，时间为30-45分钟；(2)漂洗，吹干并充入浓度为10-15mmol/L 3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液，组装时间为30-45分钟。
(3)漂洗，吹干并烘烤(4)烘烤后的芯片再放在浓度为10-15mmol/L对苯二甲醛丙酮溶液中组装，组装时间为45-60分钟，取出、漂洗、吹干；
(D)抗体或受体的固定和富集(1)将浓度为0.5-2mg/ml的单克隆抗体充入芯片池固定，固定2-5小时后将多余的液体吸出，然后用含体积比为0.2-1％的吐温-20PBS缓冲液洗涤；(2)将含富集对象的生物样本加入加样池或微注射泵内，设定流速，使生物样本缓慢流过微柱阵列，固定在微柱上的抗体或受体捕获富集对象，最后在样品池内加入洗脱液，将捕获的对象进行洗脱，达到富集的目的。
用丙酮去除上述步骤(A)中所述的表面光刻胶；用重量比HF∶NH4F∶H2O＝3∶6∶9腐蚀液去除步骤(A)中所述的二氧化硅。
上述步骤(B)中所述的阳极键合温度为400℃，电压为1kv。
上述步骤(C)中所述的烘烤温度为100-110℃，时间为45分钟。
按上述工艺过程制作的生物样品微型富集芯片，其特征在于硅片表面刻蚀出的微柱阵列，微柱表面引入活性官能基团，抗体或受体固定在微柱表面；微柱为微米级且呈圆形。
本发明的优点和有益效果是1.本发明采用的加工基底材料为硅片和玻璃，其来源丰富，价格较低，加工工艺成熟，能够批量生产。
2.本发明的微型生物样品富集芯片体积小，便于携带，不依赖离心机等大型设备，操作较为简单。
3.可以依据在微柱上固定的抗体或受体的不同，灵活调整生物样品中所需富集的对象。
4.本发明采用的微加工工艺技术，制作完成的用于吸附样品的微柱仅为微米级别，呈圆柱形，富集表面积更大，具备更好的富集效果。
5.本富集芯片的主要工作单元为经过化学基团和抗体修饰的硅微柱阵列，耐常规的生物化学反应和清洗，因而可以重复使用。
6.由于在富集过程中采用的是特异的抗体-抗原反应或受体和配体反应，因此特异性高，且在富集过程中不破坏被富集成分的结构。
图1用MEMS加工工艺在硅片表面刻蚀微柱阵列图2制作工艺流程a.硅片清洗，烘干；b.硅片上涂光刻胶；c.光刻和显影；d.清洗；e.深反应离子刻蚀；f.去除保护的光刻胶和二氧化硅层；g.表面氧化生成纳米二氧化硅层。
图3加工好的芯片和打好孔的Pyrex玻璃键合图4在微柱表面修饰活泼的醛基图5抗体或配体在微柱表面的固定图中1.二氧化硅层；2.硅；3.光刻胶；4.氧化层；5.微柱；6.玻璃片；7.醛基；8.抗体。
具体实施例下面结合实施例对本发明作进一步的说明实施例1.用MEMS加工工艺在硅片表面刻蚀出微柱阵列(图1)首先应根据设计的图形定制掩膜版，制作工艺流程如图2所示。表面有氧化层的硅片清洗和烘干(图2a)，在涂胶机上涂1813#光刻胶(转速3000转/分，时间30秒)(图2b)，然后光刻和显影(图2c)。用质量比为HF∶NH4F∶H2O＝3∶6∶9的腐蚀液二氧化硅层，用丙酮去除光刻胶(图2d)接着进行深反应离子刻蚀(图2e)，刻蚀深度为50μm。去除保护的光刻胶和二氧化硅层(图2f)。最后在芯片表面热氧化100纳米二氧化硅层(图2g)。芯片加工后划片。
2.分别用98％硫酸、1#洗液(体积比氨水∶30％H2O2∶H2O＝1∶2∶5)和2#洗液(体积比HCl∶30％H2O2∶H2O＝1∶2∶8)各清洗10分钟。同时用该清洗程序清洗打好加样孔和出样孔的Pyrex玻璃片。
3.芯片的键合(图3)在键合机上对加工好的基片和玻璃片进行阳极键合，键合温度为400℃，电压为1KV，制作完成微型富集芯片用于下一步的微柱表面修饰处理。
4.芯片的表面修饰(图4)将微型生物样品富集芯片进行表面处理、漂洗和吹干后，充入浓度为10-15mmol/L的3-氨丙基-3-乙氧基硅烷的无水乙醇溶液，组装30分钟，结束后用无水乙醇漂洗两遍，并用氮气吹干，放置在110℃烘烤45分钟。将烘烤好的芯片充入浓度为10-15mmol/L的对苯二甲醛的丙酮溶液，组装30分钟，然后取出，去离子水漂洗两次，并用氮气吹干。
5.抗体的固定(图5)将浓度为1mg/ml的单克隆抗体(PBS缓冲液)充入芯片池，固定24小时，将多余液体吸出，然后用体积比为0.5％吐温-20PBS缓冲液洗涤两次，PBS缓冲液洗涤两次，每次5分钟。
6.富集过程将含有富集对象的生物样品加入加样池或微注射泵内，设定流速，让生物样品缓慢流过微柱阵列，固定在微柱上的抗体或受体捕获富集对象。然后在样品池加入少量洗脱液，将捕获的对象进行洗脱，达到富集目的，并进行下一步检测。
权利要求
1.一种生物样品微型富集芯片的制作方法，其特征在于制作方法基于微加工技术和表面修饰技术相结合，将特异性抗体或受体固定在硅柱表面，并和流经液体中相应的抗原或配体发生特异性反应，使其固定在微柱表面，用洗脱液洗脱，实现对生物样本中成分的富集。
2.按权利要求1所述的生物样品微型富集芯片的制作方法，其特征在于具体步骤是(B)用MEMS加工工艺在硅片表面刻蚀出微柱阵列；(1)根据设计的图形制掩模版；(2)清洗有氧化层的硅片并烘干；(3)涂1813#光刻胶，光刻和显影；(4)用深反应离子刻蚀，刻蚀后划片；(5)去除表面光刻胶和二氧化硅，用洗液清洗；(6)在芯片表面生长100纳米的二氧化硅层；且加工后划片；(B)芯片键合(1)清洗已打好加样孔和出样孔的Pyrex玻璃片；(2)在键合机上将步骤(A)加工好的基片和上述Pyrex玻璃片进行阳极键合；(C)芯片的表面引入活性官能基团(1)将步骤(B)键合后的微型生物样品富集芯片内充入浓度为98％的H2SO4和30％的H2O2按体积比为7∶3的比例配制的洗液进行表面处理，时间为30-45分钟；(2)漂洗，吹干并充入浓度为10-15mmol/L 3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液，组装时间为30-45分钟。(3)漂洗，吹干并烘烤(4)烘烤后的芯片再放在浓度为10-15mmol/L对苯二甲醛丙酮溶液中组装，组装时间为45-60分钟，取出、漂洗、吹干；(D)抗体或受体的固定和富集(1)将浓度为0.5-2mg/ml的单克隆抗体充入芯片池固定，固定2-5小时后将多余的液体吸出，然后用含体积比为0.2-1％的吐温-20 PBS缓冲液洗涤；(2)将含富集对象的生物样本加入加样池或微注射泵内，设定流速，使生物样本缓慢流过微柱阵列，固定在微柱上的抗体或受体捕获富集对象，最后在样品池内加入洗脱液，将捕获的对象进行洗脱，达到富集的目的。
3.按权利要求2所述的生物样品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步骤(A)中(3)涂光刻胶时的转速为3000转/分，时间为30秒。
4.按权利要求2所述的生物样品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步骤(A)中(4)刻蚀深度为50μm。
5.按权利要求2所述的生物样品微型富集芯片的制作方法，其特征在于用丙酮去除步骤(A)中(5)所述的表面光刻胶；用重量比HF∶NH4F∶H2O＝3∶6∶9腐蚀液去除步骤(A)中所述的二氧化硅。
6.按权利要求2所述的生物样品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步骤(B)中所述的阳极键合温度为400℃，电压为1kv。
7.按权利要求2所述的生物样品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步骤(C)中所述的烘烤温度为100-110℃，时间为45分钟。
8.按权利要求1-7中任何一项权利要求制作的生物样品微型富集芯片，其特征在于硅片表面刻蚀出的微柱阵列，微柱表面引入活性官能基团，抗体或受体固定在微柱表面。
9.按权利要求8所述的生物样品微型富集芯片，其特征在于微柱为微米级，且呈圆形。
全文摘要
本发明涉及一种微型生物样品富集芯片及其制作方法，特征在于用MEMS加工工艺在硅片表面刻蚀微米级别的微柱，然后在微柱表面引入活性官能基团，最后抗体或受体的化学基团与衍生的活性化学基团发生共价化学反应，抗体或受体就被固定在微柱的表面，当溶液中有相应的抗原或配体通过时，就会和相应的抗体或受体发生特异性结合，从而被捕获。在一定的条件下加入少量的洗脱试剂，就能达到富集和分离相应生物样品的目的。芯片的制作包括MEMS工艺制作微柱，芯片的阳极键合，微柱表面引入活性官能基团和抗体或配体的固定四个主要步骤。优点在于能够在微型芯片上实现对微量样品中特定成分的富集，提高了检测的灵敏度，减少了试剂的用量。
文档编号G01N1/28GK1696639SQ20051002521
公开日2005年11月16日 申请日期2005年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者杨梦苏, 刘康栋, 金庆辉, 邹志清, 赵建龙 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所