专利名称：一种代替阳性血清用作诊断试剂标准品的交联复合物及其作为标准品的使用方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，有关于一种新的可用作诊断试剂标准品的复合物及其作为诊断试剂标准品的使用方法，尤其有关于一种可以代替阳性血清用作诊断试剂标准品的抗原特异性抗体与人免疫球蛋白的交联复合物及其作为诊断试剂标准品的使用方法。
背景技术：
抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，由B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，分子基本结构包括两条完全相同的重链(H链)和两条完全相同的轻链(L链)组成，轻、重链之间和两重链之间由二硫键连接。根据重链恒定区的不同，抗体分为5类，即IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，IgG的重链分子为γ链，IgM、IgA、IgE和IgD的重链分别为μ、α、ε和δ链，多肽重链不同，使得各类抗体在不同类型的免疫反应以及免疫应答过程中的特定时期发挥不同的作用。尽管有5种不同的重链，但轻链只有两种，即κ和λ链(E.哈洛，D.莱恩.《抗体技术实验指南》.)。
轻链大约有220个氨基酸残基，分为两个区，每区大约含有110个氨基酸残基，靠近氨基端的区是异质性的可变区(V区)，靠近羧基端的是恒定区(C区)。IgG重链大约有440个氨基酸残基，包括一个可变区和3个恒定区，每一个区域由110个氨基酸残基组成，不同类的重链可能有不同数量的恒定区，如IgM有1个可变区和4个恒定区。
一条重链和一条轻链的可变区结合形成一个抗原结合部位。可变区的不均一性可以用来启动有效的免疫反应，而形成庞大抗体种类。但是序列的不一致性并非随机发生在所有可变区，而是集中分布在一些由5-10个氨基酸残基组成的高变区，重链和轻链各有3个高变区，这些高变区组成了抗体和抗原结合的主要接触残基，而且位于与抗原相互作用的短氨基酸残基环上。因为高变区是与抗原真正结合的部位，故又称为互补决定区(complementarydetermining regions，CDRs)。可变区提高抗原结合位点和特异性，恒定区决定抗体的功能，在所有抗体的恒定区均提供了一系列的结合部位，发挥重要功能，如提供了和Fc受体细胞结合的功能区，促进了巨噬细胞和粒细胞的吞噬及促进了淋巴细胞和NK细胞发生抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。还提供了结合补体链反应的重要区域，促进了外来入侵抗原的溶解。
抗原和抗体之间的高度特异性结合的特性，使得它们成为理想的临床诊断试剂。据统计，现有临床诊断中，50％的检测项目是通过抗体或抗原的检测实现的。免疫分析提供了快速和敏感的检测传染病原物、生理指标、过敏、自身免疫性疾病、癌症、药物代谢等的实验方法。手动和自动免疫分析通常使用特定抗体来检测特异抗原或相关抗原。现在已经有了很多种免疫分析方法，但主要可以分为两大类竞争性和非竞争性分析。抗体或抗原通过共价或非共价交联于固相载体上，例如，多孔或无孔材料、乳胶颗粒、磁性材料、微载体、玻璃珠、膜、微孔和塑料管等。根据分析方法的特性决定固相材料和抗原/抗体标记方法。如，在一些免疫分析中，无需标记，如检测可观察到的血红细胞表面的抗原时，可通过凝集反应判断。另外，抗原-抗体反应也可生成可观测的变化。在多数情况下，免疫检测中都包括一种信号分子或“标记物”标记的抗原或抗体。这种信号分子或“标记物”自身是可以检测的，或通过和其他一种/几种其他化合物反应来产生可检测信号。信号分子包括染料、同位素(如125I，131I，32P，3H，35S，14C)、荧光材料、化学发光材料、微粒(可见或荧光)、核酸、复合物或催化剂如酶等(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)。在使用酶标记时，还需要化学、荧光或可见光生成底物产生可检测信号。时间分辨荧光分析法、内部反射荧光法、核酸扩增(PCR)和拉曼光谱分析法也有应用。
免疫分析已经用于体液如血浆、血清、脑脊髓液、唾液、泪液、鼻液或组织和细胞水溶液抽提物的检测。两种常用的形式用于人体特定抗体的检测(1)抗原包被，人类的体液包含特定的抗体，可以和抗原起反应，然后，抗体结合包被的抗原，用标记的抗人抗体(抗抗体，又称二抗)检测；(2)抗体包被，人类的体液包括特定的抗原，可以和包被抗体起反应，然后，用标记的针对同一抗原不同表位的第二个抗体检测；在这两种方法中，抗体可以是单抗也可以是多抗。
抗体是机体对外来分子、微生物或者其他因子免疫应答产生的免疫球蛋白，在一定的条件下，免疫系统发生紊乱，也会针对自身抗原产生免疫应答，产生自身抗体，导致机体的自身组织和器官出现病理性改变并出现相应的临床表现，这类疾病统称为自身免疫性疾病。自身免疫性疾病在欧洲和北美的发病率高达5％，在美国总患病人数约为一千三百万，自身免疫性疾病是继癌症和心血管疾病的第三大类疾病，其中类风湿性关节炎的发病率为1％(Advances inthe Laboratory Diagnosis of Autoimmune Diseases，Business Briefing Global Health Care2002，Issue 3.)，这些疾病的诊断除了各自不同的临床症状之外，患者血清中的抗体的检测是诊断的关键性指标。
因许多抗体的滴度和疾病的发生、发展和预后有很大关联性，如抗肝细胞浆I型抗原抗体(Liver Cytosol Antigen type 1 Autoantibodies，LC-1)滴度与疾病活动程度、血清转氨酶和丙种球蛋白水平明显相关。高效价的抗-LC1只在有着高活动度的慢性肝炎或肝硬化中检测到(Lenzi M，Mantotti P，Muratori L，Cataleta M，et al.Liver cytosolic 1antigen-antibody system in type 2 autoimmune hepatitis and hepatitis C Virusinfection.Gut，1995，36749-754.)。抗-LC1对皮质类固醇和硫唑嘌呤的疗效没有预测意义，LC-1是反映疾病进程和治疗效果的一个较好的血清免疫学指标。因此对自身抗体的定性，和进一步定量至关重要。对抗体的检测，除了明确存在以外，还应对其类和亚类进行鉴定，一般来说，IgM类主要常见于急性感染性疾病，IgG4亚类主要见于器官特异性自身免疫病，而IgG1，IgG3主要见于器官非特异性自身免疫病(邓安梅，仲人前，孔宪涛.自身免疫病患者可抽提核抗体谱与体液免疫的关系.中华医学检验杂志，1999，22299-300.)。
临床诊断试剂盒一般都包括标准品或阴性和阳性对照品，定量自身抗体诊断试剂盒的标准品往往来自于抗体滴度较高的阳性血清的系列稀释品，或直接使用不同滴度的病人血清。但用病人血清做标准品有很多缺点1)很难获得具有高滴度，高特异性的病人血清；2)个体之间的抗体滴度和特异性差异性较大，难以标准化；3)由于血清是多抗，具有不同的抗体类型、亲和性和特异性，限制了它的应用；4)价格昂贵，由于资源的限制，可能不能保证标准品的产量。因此，开发生产标准品的方法，用以检测特异性抗体的水平具有重要意义。
人鼠嵌合抗体可以用于人血清抗体检测的标准品，用于制备标准曲线(美国专利6,015,662)，但该方法具有很大的局限性1)工艺非常复杂，包括动物免疫，细胞融合，单抗的筛选，抗体基因克隆，人鼠嵌合基因工程抗体的构建和表达等，时间长，费用高；2)每次构建的抗体只包括一种抗体的恒定区，检测其他抗体类型需要重新构建。
交联抗体在标准品的使用方面具有很大的优势，非人的非IgM和人的IgM交联(美国专利5,478,753)，用作诊断IgM血清试剂盒标准品，交联抗体非人的非IgM对检测抗原特异，人的IgM可以和标记二抗结合，这些试剂盒很好的解决了传染性疾病在急性感染阶段IgM阳性血清来源的困难，使标准品的大规模生产成为可能。其它的交联还包括抗体的一条重链和轻链通过二硫键和IgG的重链和轻链或Fc交联(美国专利5,523,210)，构建的双价抗体可用于酶等化学分析；两个对不同抗原特异的抗体通过交联剂交联，(美国专利4,433,059)，异源交联抗体可用于凝集分析。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种代替阳性血清用作诊断试剂标准品的抗原特异性抗体与人免疫球蛋白的交联复合物，其能够解决对某一种抗原特异性结合及与抗人免疫球蛋白抗体(抗人二抗)的反应。
本发明的另一目的在于提供一种交联复合物，其中制备特异性抗体的抗体技术可以是单克隆抗体技术(杂交瘤技术，包括小鼠、大鼠和家兔杂交瘤等)技术为主制备的抗原特异性抗体，也可以用抗原免疫动物(如家兔、羊、马、牛等)获得的抗血清，再经抗原特异性亲和层析制备的抗原特异性多克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供一种交联复合物，其中抗体复合物用于检测人体针对某一种抗原产生的特异性抗体的水平时，可以作为标准品替代来源于人体的血清标准品或参照品。
本发明的另一目的在于提供一种交联复合物，利用其检测人体抗原特异性抗体水平的方法可以用于疾病诊断、疾病筛查，如感染性疾病(抗乙肝抗体、抗丙肝抗体、抗艾滋病抗体等)，自身免疫性疾病(类风湿因子、抗核抗体等自身抗体)，过敏性疾病(血清IgE水平等)，还可以用于血型检测、组织配型和健康体检等。
本发明的再一目的是提供一种抗原特异性抗体与人免疫球蛋白交联复合物用作标准品的方法，使用本方法制备的标准品，抗体特异性和亲和力均一，制备方法简单，来源不受限制，可以大规模生产。
为了达到以上目的，本发明揭露了一种可以代替阳性血清用作诊断试剂标准品的复合物，其特征是该复合物是抗原特异性抗体与人免疫球蛋白的交联复合物，抗原特异性抗体是通过单克隆抗体技术或者通过抗原免疫动物获得的抗血清制备的。
为了达到以上目的，本发明还揭露了一种方法，该方法至少包括如下步骤a.用抗原免疫动物，获得的特异性抗体；b.用交联剂将所述特异性抗体和所述人免疫球蛋白交联；c.将所述交联后的抗体梯度稀释，绘制标准曲线；以及，d.所述交联后的所述抗体作为标准品应用于定量诊断检测方法中。
图1为本发明较佳实施例的标准曲线。以及，图2为本发明较佳实施例的统计结果图。
具体实施例方式
本发明包括一种方法，该方法至少包括如下步骤(a).用抗原免疫动物，获得的特异性抗体；(b).用交联剂将所述特异性抗体和所述人免疫球蛋白交联；(c).将所述交联后的抗体梯度稀释，绘制标准曲线；以及，(d).所述交联后的所述抗体作为标准品应用于定量诊断检测方法中。
本发明的一种较佳实施例是制成用于抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体类风湿关节炎诊断的试剂盒。该试剂盒是用于定量测定病人血清中抗CCP IgG型抗体的酶联免疫检测试剂盒。抗CCP IgG型抗体的检测能够辅助诊断类风湿性关节炎。在96孔反应板上包被CCP抗原，将稀释后的待检血清和对照品阳性血清加入反应板孔中，如果被检血清中存在抗CCP抗原成分的抗体，经温育后，则血清中的特异性抗体与固相CCP抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗去未结合的抗体成分，加入酶标记抗人IgG抗体(抗人二抗)温育，固相抗原抗体复合物再与酶标记抗IgG抗体结合。洗去未结合的酶标抗体成分，再加入酶的底物。底物被酶催化成为有色产物，可以通过酶标仪检测读取标本和对照品阳性血清的颜色反应的数值。用不同滴度的阳性品对照血清，作出一条酶标仪检测颜色反应数值和对照品阳性血清抗CCP抗体滴度之间相互关联的标准曲线，根据待检血清酶标仪检测数值在标准曲线上的位置，就可以判断出待检血清中相应的抗CCP抗体水平。
该诊断试剂盒中作为绘制标准曲线的标准品阳性血清，是试剂盒最关键的成分。目前标准品阳性血清取自抗CCP抗体水平增高的病人，这样会有很多问题。一是阳性血清是取自用已有诊断试剂盒检测抗CCP抗体水平增高的病人，现有诊断试剂盒阳性血清取自符合类风湿诊断标准的病人，而符合类风湿诊断标准的未必都有抗CCP抗体增加。二是病人阳性血清抗CCP抗体水平会随病情变化而变化，因此“标准品”并不标准。三是每个病人血清来源有限，可能每个批号的的血清来源均不相同，标准品批间有差异，因此对同一病人的同一份血清，用不同批次的诊断试剂盒检测会有不同的结果。而利用抗CCP单克隆抗体与人IgG的交联物代替阳性血清作为试剂盒的标准品则不会产生如上所述的缺点。
在步骤(a)中，CCP与牛血清白蛋白(BSA)交联方法参照E.哈洛，D.莱恩所著《抗体技术实验指南》。选用6-8周龄Balb/c小鼠，取1-100μg交联后的CCP与等量完全福氏佐剂充分乳化后腹腔注射。以后每隔2周以同样剂量抗原加等量不完全福氏佐剂充分乳化后腹腔注射，共3-5次。融合前3天腹腔或静脉注射无佐剂抗原50-100μg加强免疫一次。
取完成免疫的小鼠，摘眼球取血，分离血清备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％的酒精中3-5分钟。无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液。取处于对数生长期的P3-653细胞与小鼠脾细胞按1∶5-1∶10的比例混合，加入20ml RPMI-1640液，1000r/min，5分钟离心，弃上清。轻轻敲打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置37℃水浴中，取1ml 37℃预温的50％PEG缓缓滴入离心管内，1分钟内加完。37℃静置2分钟，在5分钟内滴加50mLRPMI-1640液终止PEG作用。800r/分钟，8分钟离心，弃上清。将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养基内，接种于96孔培养板中。将培养板放入37℃5％CO2培养箱中培养。7-10天后，换HT培养基。换液后三天吸取培养上清，做ELISA检测。挑出阳性孔细胞，用有限稀释法将细胞铺单克隆，即做细胞计数，使细胞的浓度为50个/ml，于96孔板接种三排，用培养液做倍比稀释，铺满1块96孔板。培养7-10天后，选取单个克隆做ELISA检测，挑出阳性孔细胞，再一次进行克隆。一般需要反复克隆3-5次，直达100％阳性孔即可将细胞扩大培养，冻存。
将筛选完成的杂交瘤细胞用无血清培养基作悬浮培养，收集培养上清以备进一步纯化。
用ProteinG或ProteinA Sepharose做亲和层析，纯化抗体。参照(E.哈洛，D.莱恩.《抗体技术实验指南》)。最后进行抗体筛选。
本发明的步骤(b)是鼠抗CCP单克隆抗体与人免疫球蛋白(IgG)的交联。称取人IgG 25mg溶于0.5ml含1.25％戊二醛的pH 7.2 0.1mol/L PBS中，于2-8℃静置过夜。反应后的溶液在pH 7.2 0.1mol/L PBS中充分透析，除去多余的戊二醛，加pH 7.2 0.1mol/L PBS至1.5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。将鼠抗CCP抗体12.5mg用pH 7.2 0.1mol/L PBS稀释至0.5ml，搅拌下逐滴加入到小烧杯中。加入1mol/L PH 9.6碳酸盐缓冲液中，继续搅拌3-4小时。最后加入0.25mL 0.2mol/L的赖氨酸溶液，室温置2小时。反应后的溶液经SephacrylS-300HR层析柱，用PH7.2 0.1mol/L PBS洗脱，收集第一出峰，此溶液就为鼠抗CCP抗体与人免疫球蛋白(IgG)的交联物。
用含1.59g/L Na2CO3、2.93g/L NaHCO3的包被缓冲液(CBS溶液)将多克隆的抗人IgG稀释为5μg/ml。然后将稀释好的溶液加入酶标板的各孔中，每孔100μl；2-8℃过夜，之后取出酶标板，甩去包被液，洗板三次，拍干，加入含1％牛血清白蛋白，8.7g/L NaCl，1.15g/L Na2HPO4·12H2O，0.2g/L NaH2PO4·2H2O，PH 7.4的封闭液，每孔200μl；置于37℃下2小时，之后取出酶标板，弃去封闭液，洗板三次，拍干。将交联后的CCP单抗进行对倍稀释，稀释比例还可以为1∶100，1∶200，直至1∶1000。将稀释后的单抗加到包被板中的各孔中，每孔100μl，每个交联单抗的稀释度作复孔，室温(18-25℃)反应30分钟。反应结束后，包被板用洗液洗3遍，拍干。每个反应孔中加入HRP标记的羊抗人IgG工作液100μl，室温(18-25℃)反应30分钟。反应结束后，包被板用洗液洗5遍，拍干。每孔加入显色液A(含柠檬酸35.8g/L，Na2HPO4·12H2O 9.34g/L，30％过氧化氢660μl)和显色液B(含3，3，5，5，-四甲基联苯氨0.2g/L，二甲基亚砜5ml/L，6N HCl 1ml/L)各50μl，混匀，室温避光反应30分钟。反应后每孔加入终止液(2N H2SO4)50μl，酶标仪OD450读数。
因无抗CCP抗体的国际参考质控，按抗体的OD450值自定义其抗体的相对单位，OD450＝2.0-2.2时，其对应的稀释度为1∶400，设定单位为400RU。其他稀释度以此类推，如1∶800为200RU，1∶1600为100RU等。
本发明的步骤(c)是用交联后的CCP单抗的不同稀释度绘制标准曲线。
用包被缓冲液将CCP稀释为5μg/ml。然后将CCP溶液加入酶标板的各孔中，每孔100μ1；置于2-8℃下17小时，之后取出酶标板，甩去包被液，洗板三次，拍干，加入封闭液，每孔200μl；置于37℃下2小时，之后取出酶标板，弃去封闭液，洗板三次，拍干；将酶标板板条放置在真空干燥箱内进行真空抽干并于真空箱内保存1小时；最后将酶标板条装入铝箔袋，真空封口机封口，贴标签和加盖批号。
将交联后的CCP单抗进行对倍稀释，起始浓度单位为400RU，共9个稀释度。稀释液是由1％牛血清白蛋白，8.7g/L NaCl，1.15g/L Na2HPO4·12H2O，0.2g/L NaH2PO4·2H2O，吐温-20 0.5ml，PH 7.4组成。
对照血清是综合研发和临床结果确定的抗CCP抗体阳性血清，弱阳性血清(临界值附近的血清)和阴性血清。将稀释后的单抗和对照血清(1∶100稀释)加到CCP包被板中的各孔中，每孔100μl，每个交联单抗的稀释度和对照血清作复孔，室温(18-25℃)反应30分钟。反应结束后，包被板用洗液洗3遍，拍干。每个反应孔中加入HRP标记的羊抗人IgG工作液100μl，室温(18-25℃)反应30分钟。反应结束后，包被板用洗液洗5遍，拍干。每孔加入显色液A和显色液B各50μl，混匀，室温(18-25℃)避光反应30分钟。反应后每孔加入终止液50μl，酶标仪OD450读数。
计算交联后的CCP单抗的不同稀释度平行测定的OD450平均值，以每个稀释度的OD450值为纵坐标，各自对应的浓度为横坐标，绘制出标准曲线。
本较佳实施例的标准曲线如图1所示。从曲线整个趋势看，线性段为0-100RU，100RU以上，曲线已趋向于饱和。在线性段内取5个点(100RU、50RU、25RU、12.5RU、0)，以此作为试剂盒的标准曲线。计算三份血清样本平行测定的OD450平均值，然后在标准曲线上读出相应的单位。阳性血清对应的单位为65RU、弱阳性血清对应的单位为18RU，阴性血清对应的单位为2RU。从数据看出，三个对照品血清全落在线性范围内，尤其是弱阳性血清(临界值)落在线段的中部，说明此线段能覆盖了整个阴阳性的检测范围，进一步说明此标准曲线可作为该试剂盒的定量曲线。从弱阳性血清对应的单位可定出试剂盒的临界值为18RU，即大于等于18RU为阳性，小于18RU为阴性。
本发明的步骤(d)是将标准曲线应用于抗CCP抗体检测试剂盒中。试剂盒测试200份正常人血清和200份RA病人血清，同时作以上五点的标准曲线，操作过程同上。计算样本平行测定的OD450平均值，然后在标准曲线上读出相应的单位。以18RU为临界值，统计结果如图2所示。
在该统计中，真阳性样本指200份类风湿关节炎患者血清样本用本试剂盒测试是阳性的样本，假阴性样本指200份类风湿关节炎患者血清样本用本试剂盒测试是阴性的样本。真阴性样本指200份正常人血清样本用本产品测试是阴性的样本，假阳性样本指200份正常人血清样本用本产品测试是阳性的样本。
权利要求
1.一种可以代替阳性血清用作诊断试剂标准品的复合物，其特征是所述复合物是抗原特异性抗体与人免疫球蛋白的交联复合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，抗原特异性抗体是通过单克隆抗体技术制备的。
3.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，抗原特异性抗体是通过抗原免疫动物获得的抗血清制备的。
4.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，所述人免疫球蛋白是人免疫球蛋白IgG。
5.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，所述人免疫球蛋白是人免疫球蛋白IgM。
6.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，所述人免疫球蛋白是人免疫球蛋白IgE。
7.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，所述人免疫球蛋白是人免疫球蛋白IgA。
8.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，所述人免疫球蛋白是人免疫球蛋白的全长。
9.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，所述人免疫球蛋白是人免疫球蛋白的恒定区。
10.根据权利要求1所述的复合物，其特征是，所述人免疫球蛋白是人免疫球蛋白的Fc片段。
11.一种如权利要求1所述的复合物的使用方法，其特征是该方法包括以下步骤a.用抗原免疫动物，获得的特异性抗体；b.用交联剂将所述特异性抗体和所述人免疫球蛋白交联；c.将所述交联后的抗体梯度稀释，绘制标准曲线；以及，d.所述交联后的所述抗体作为标准品应用于定量诊断检测方法中。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征是，所述检测方法是试剂盒。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征是，所述检测方法是检测试剂。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征是，所述检测方法是仪器检测。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤a所述的抗原特异性抗体是单克隆抗体。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤a所述的抗原特异性抗体是多克隆抗体。
17.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤b所述的交联剂是戊二醛和过碘酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种可以代替阳性血清用作诊断试剂标准品的复合物。该复合物是抗原特异性抗体与人免疫球蛋白的交联复合物，抗原特异性抗体通过单克隆抗体技术或者通过抗原免疫动物获得的抗血清制备的。本发明还揭露了一种该复合物的使用方法，该方法至少包括如下步骤a.用抗原免疫动物，获得的特异性抗体；b.用交联剂将所述特异性抗体和所述人免疫球蛋白交联；c.将所述交联后的抗体梯度稀释，绘制标准曲线；以及，d.所述交联后的所述抗体作为标准品应用于定量诊断检测方法中。
文档编号G01N33/53GK1924579SQ20051002747
公开日2007年3月7日 申请日期2005年7月4日 优先权日2005年7月4日
发明者杨子义, 倪健, 罗鹏, 魏国兰, 陈闻卓, 司徒维娜 申请人:上海富纯中南生物技术有限公司