专利名称：有机磷杀虫剂浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种杀虫剂的测定方法，尤其涉及一种有机磷杀虫剂的测定方法。
背景技术：
有机磷化合物广泛应用于农业和其它领域，例如植被控制、草坪杀虫等等。这类化合物毒性很强，可不可逆地抑制酶的活性，从而影响人类中枢神经系统的功能，常常引起呼吸系统瘫痪，严重可导致死亡。因而有机磷化合物的广泛使用直接威胁着人类健康，为防止有机磷化合物在使用过程中影响人类健康，需要对对其进行检测。因此，研究快速、灵敏、特异和稳定的有机磷检测方法亟为重要。目前，色谱技术已经用来对有机磷杀虫剂的特异性进行检测，但是这种检测方法需要专业的检测人员进行操作，而且在检测前需要对样品进行预处理，成本较高，并且不利于野外检测。
发明内容
1、发明目的本发明的目的是提供一种操作快速简便、测量精度高、成本低的有机磷杀虫剂浓度的测定方法。
2、技术方案为了实现上述发明目的，本发明的有机磷杀虫剂的测定方法包括下列步骤(1)将酶滴涂在表面复有交联壳聚糖-多壁纳米碳管膜的电极表面上，得到生物传感器；(2)将上述生物传感器作为电化学分析仪的工作电极，置于反应池中，然后流动注入底物，使上述电极表面的酶与底物反应产生具有电化学活性的胆碱，再用电化学分析仪测试得到胆碱的氧化电流值I0；(3)用载液流动清洗电极后，向反应池中注入以该载液为溶剂的有机磷杀虫剂溶液，有机磷杀虫剂溶液在反应池中驻留，然后用载液清洗电极；(4)向反应池中再流动注入底物，用电化学分析仪测试得到胆碱的氧化电流It；(5)根据下列公式
I%=I0-ItI0×100]]>计算得到有机磷不可逆抑制胆碱酯酶的活性的抑制值I％，然后重复步骤(2)至(4)，再测得对应的I0和It，并计算得到I％平均值，取平均值I％对数；(6)改变有机磷杀虫剂溶液的浓度，重复进行上述的步骤(2)至(5)，得到上述抑制值I％的对数与有机磷杀虫剂浓度之间的线性关系，利用所得线性关系定量测定出有机磷杀虫剂的浓度。
其中在步骤(1)中，生物传感器的制备包括下列步骤(1)将戊二醛与壳聚糖溶液混和搅拌，得到混合溶液；(2)将多壁纳米碳管加入上述的溶液，得到交联壳聚糖-多壁纳米碳管的混和溶液；(3)将上述的交联壳聚糖-多壁纳米碳管混和溶液滴涂到表面洁净的电极上，干燥后清洗电极去除多余的戊二醛，得到在电极表面复合有交联壳聚糖-多壁纳米碳管的膜；(4)将酶的溶液滴涂在上述膜的表面，得到生物传感器。
在生物传感器的制备步骤中所用电极可以为玻碳电极，并且所述生物传感器可用复酶剂恢复酶的活性，所用酶可以为乙酰胆碱酯酶。
在机磷杀虫剂的测定方法的步骤(2)中，底物可以为氯化乙酰硫代胆碱，在步骤(3)中，载液可以为氯化钾溶液。
本发明利用有机磷杀虫剂中的有机磷成分对酶的生物活性具有抑制作用的原理，利用良好地固定在电极表面的交联壳聚糖-多壁纳米碳管复合膜上的酶与有机磷杀虫剂溶液接触，检测与有机磷成分反应前后酶的活性分数的变化，从而可以得出其活性抑制值的对数，再用不同浓度的有机磷杀虫剂进行酶活性抑制分数的检测，则可得到酶活性抑制值与有机磷杀虫剂浓度之间的线性关系，这样就可以利用这种线性关系检测某一种类有机磷杀虫剂的检测样本的浓度值。交联壳聚糖-多壁纳米碳管复合膜是一种仿生界面，具有低毒性、亲水性、良好的化学稳定性和生物兼容性以及电子传导性，有利于生物分子的固定，本发明即是利用该复合膜的这些特点，将具有生物活性的酶固定在其表面以进行检测，而且可以利用解磷定去除酶的活性中心--丝氨酸上结合的有机磷基团，从而可以恢复酶的活性，可重复利用固定有酶的电极进行检测。
3、有益效果本发明具有以下优点(1)所用电化学仪器和流动注射装置操作简便灵活、试剂消耗少、成本较低、分析速度快，适用于有机磷杀虫剂的快速检测。
(2)利用壳聚糖这种天然高分子材料与纳米碳管复合膜固定酶分子具有较好的使用效果，该复合膜价廉、低毒性、制备简单，且具有良好的传导性、化学稳定性和生物兼容性。
(3)将复合膜和酶固定集于一电极表面，将酶的固定化技术应用于有机磷杀虫剂的测定领域，利用流动注射分析装置，因而酶试剂所需量及其它试剂的耗量少，测定时间短，从而降低了测定成本；(4)该方法表现出很好的精确性、重复性和稳定性，制备方法简单，可重复检测的次数多，检测限较现有的有机磷杀虫剂测定方法，如电化学检测方法要低得多。
四
附图是本发明的测定方法示意图。
五具体实施例方式
实施例1如图所示，蠕动泵1用于向反应池中输入杀虫剂溶液、底物、载物和复酶缓冲液，工作电极3为结合有酶的电极，与辅助电极2和参比电极4一起连接至电化学分析仪器7，三个电极放置在反应池5中；电化学分析仪器7连接至计算机8，由计算机分析处理电化学分析仪输出的测量信号。本实施例以治螟磷杀虫剂为检测对象，采用的酶为乙酰胆碱酯酶，底物为氯化乙酰硫代胆碱，载液为含0.1M KCl的0.1M pH7.4 PBS溶液，复酶缓冲液为解磷定溶液，采用BAS 100B电化学分析仪器。
为获得最优的检测信号和灵敏度，复合膜中壳聚糖的含量要满足固定酶所需的量，并使制备的膜不易干裂，有利于酶的负载和随后的酶促反应和产物的电化学氧化；多壁纳米碳管虽然有利于电子的传导，但如果含量过高，复合膜生物亲合性将会下降，因此要控制多壁纳米碳管的含量；酶的负载量直接由交联壳聚糖膜所带的醛基数量所决定，因此戊二醛与壳聚糖和多壁纳米碳管的含量应保证最佳的比例。此外，通过分别改变施加电位、缓冲溶液的pH值、底物的浓度和流动注射速度和治螟磷在流动池的停留时间，选择达到最大电流响应时对应的值作为治螟磷最佳测定条件。以下为生物传感器制备和治螟磷流动注射电化学检测条件的优化方法1、生物传感器的优化制备条件的确定通过分别改变复合膜中壳聚糖，多壁纳米碳管和戊二醛的含量，选择达到最大电流响应时对应的值作为生物传感器最佳制备条件。其检测过程为采用BAS 100B电化学分析仪器，三电极系统进行电化学测量，其中，铂丝作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，酶修饰GCE作为工作电极。含0.1M KCl的0.1M pH7.4 PBS溶液作为载液；在室温下，在反应池中施加相对于Ag/AgCl电极为+600mV的电位阶跃进行电化学测定；当电流信号的基线平稳后，体系中加入底物氯化乙酰硫代胆碱；流动系统中插入三电极并且连接到BAS 100B(见附图)。样品注射速度控制为0.5mL min-1，载液为PBS。依次改变壳聚糖，多壁纳米碳管和戊二醛的含量，记录传感器的电化学响应信号，可以得出制备生物传感器的优化条件为壳聚糖，多壁纳米碳管和戊二醛的含量分别为0.45(w/v)％，0.13(w/v)％和1.26(v/v)％；2、治螟磷流动注射电化学检测的优化条件在电化学检测中，不同电位对酶促反应产物的稳态电流信号有影响，可采取恒电位法进行，在适合的电位下，所得电流响应信号有最大值；由于酶在人体正常pH条件下才具有最佳活性，因此缓冲溶液的pH值应当与人体正常pH值一致；将底物ATC1连续注入到反应池中，进行电化学检测，在一定的ATC1浓度下所得电流信号有最大值；底物流动注射的速度直接决定了传感器的性能；治螟磷在反应池池的停留时间直接影响对电极表面固定化酶活性的抑制程度，根据以上原理，通过分别改变施加电位、缓冲溶液的pH值、底物的浓度和流动注射速度和治螟磷在反应池中的停留时间，选择达到最大电流响应时对应的值作为治螟磷最佳测定条件电位为+600mV，缓冲溶液的pH为7.4，底物的浓度为500μM，流速为0.5mL min-1，治螟磷在流动池的停留时间为14分钟。
下面按照上述最优化的条件进行治螟磷杀虫剂浓度的检测1.乙酰胆碱酯酶固定(1)电极抛光将3mm盘状玻碳电极分别用1.0，0.3和0.05μm的α-氧化铝悬浆在麂皮上抛光呈镜面，二次水冲洗干净，再依次用1∶1硝酸、丙酮、二次水超声清洗，得到新鲜、洁净的电极表面。
(2)复合膜溶液的配制取适量25％的戊二醛与0.5％壳聚糖溶液混和搅拌10min。然后1.3mg多壁纳米碳管加入1.0mL的上述混和溶液，超声至溶液混和均匀。
(3)交联壳聚糖-多壁纳米碳管复合膜的形成3.0μL(2)中混合溶液置于预处理好的GCE，于25℃下反应4小时在电极表面得到交联壳聚糖-多壁纳米碳管复合膜。修饰电极用二次水清洗干净以除去多余的戊二醛。
(4)乙酰胆碱酯酶的固定取2.0μL酰胆碱酯酶(10mIU)溶液滴涂于上述交联壳聚糖-多壁纳米碳管复合膜修饰电极表面，25℃温育30分钟，通过与壳聚糖键合的戊二醛的自由醛基将乙酰胆碱酯酶与复合膜结合，实现乙酰胆碱酯酶的固定。将水份干燥除去后，用PBS洗涤除去未结合的乙酰胆碱酯酶制得所需的生物传感器传感器于-20℃下保存。
2、乙酰胆碱酯酶抑制测定首先，将500μM的底物氯化乙酰硫代胆碱加入流动管道6，所得电流信号记为I0(体积250μL，流速为0.5mL min-1)，用载液以1.0mL min-1流速清洗工作电极2分钟后，注入0.5mL治螟磷溶液，在反应池中停留14分钟，然后用载液以1.0mL min-1流速清洗工作电极2分钟，再加入500μM底物氯化乙酰硫代胆碱所得电流信号记为It。抑制分数(I％)按下面的方程式计算，三次测量后取其平均值。
I%=I0-ItI0×100]]>3、改变治螟磷杀虫剂的浓度，测定不同浓度时得到的电化学响应，根据计算所得的抑制分数(I％)对数与治螟磷浓度间的线性关系，可进行治螟磷浓度的定量测定。检测治螟磷的浓度范围为1.5-80nM，检测限在I％＝10％时为1.0nM。
此外，可采用解磷定作为乙酰胆碱酯酶的再生剂，可以通过解磷定除去乙酰胆碱酯酶活性中心丝氨酸上结合的有机磷基团。当工作电极与治螟磷杀虫剂等有机磷杀虫剂接触后，用载液以1.0mL min-1流速清洗工作电极2分钟后，用5.0mM解磷定再生15分钟，再用载液以1.0mL min-1流速清洗2分钟。可用底物的电流信号Ir来表示酶活性。酶再生效率(R％)可用下面的方程式来表示
R%=Ir-ItI0-It×100]]>这种方法可使工作电极连续检测和再生15次，保证酶的再生效率在95％以上。
权利要求
1.一种有机磷杀虫剂浓度的测定方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)将酶滴涂在表面复有交联壳聚糖-多壁纳米碳管膜的电极表面上，得到生物传感器；(2)将上述生物传感器作为电化学分析仪的工作电极，置于反应池中，然后流动注入底物，使上述电极表面的酶与底物反应产生具有电化学活性的胆碱，再用电化学分析仪测试得到胆碱的氧化电流值I0；(3)用载液流动清洗电极后，向反应池中注入以该载液为溶剂的有机磷杀虫剂溶液，有机磷杀虫剂溶液在反应池中驻留，然后用载液清洗电极；(4)向反应池中再流动注入底物，用电化学分析仪测试得到胆碱的氧化电流It；(5)根据下列公式I%=I0-ItI0100]]>计算得到有机磷不可逆抑制胆碱酯酶的活性的抑制值I％，然后重复步骤(2)至(4)，再测得对应的I0和It，并计算得到I％的平均值，取平均值I％的对数；(6)改变有机磷杀虫剂溶液的浓度，重复进行上述的步骤(2)至(5)，得到上述抑制值I％的对数与有机磷杀虫剂浓度之间的线性关系，利用所得线性关系定量测定出有机磷杀虫剂的浓度。
2.如权利要求1所述的有机磷杀虫剂浓度的测定方法，其特征在于步骤(1)中生物传感器的制备包括下列步骤(1)将戊二醛与壳聚糖溶液混和搅拌，得到混合溶液；(2)将多壁纳米碳管加入上述的溶液，得到交联壳聚糖-多壁纳米碳管的混和溶液；(3)将上述的交联壳聚糖-多壁纳米碳管混和溶液滴涂到表面洁净的电极上，干燥后清洗电极去除多余的戊二醛，得到在电极表面复合有交联壳聚糖-多壁纳米碳管的膜；(4)将酶的溶液滴涂在上述膜的表面，得到生物传感器。
3.如权利要求2所述的有机磷杀虫剂浓度的测定方法，其特征在于步骤(3)中使用的电极为玻碳电极。
4.如权利要求2所述的有机磷杀虫剂浓度的测定方法，其特征在于所述生物传感器可用复酶剂恢复酶的活性。
5.如权利要求2所述的机磷杀虫剂浓度的测定方法，其特征在于步骤(4)中的酶为乙酰胆碱酯酶。
6.如权利要求1所述的机磷杀虫剂浓度的测定方法，其特征在于步骤(2)中的底物为氯化乙酰硫代胆碱。
7.如权利要求1所述的机磷杀虫剂浓度的测定方法，其特征在于步骤(3)中的载液为氯化钾溶液。
全文摘要
本发明公开了一种有机磷杀虫剂浓度的测定方法，该方法主要包括生物传感器的制备、测试得到胆碱的氧化电流值I
文档编号G01N27/49GK1673732SQ200510038059
公开日2005年9月28日 申请日期2005年3月10日 优先权日2005年3月10日
发明者鞠熀先, 维卫克·巴布·坎地马拉, 陈进 申请人:南京大学