专利名称：生物检测用颗粒状标记物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域。
背景技术：
在生物分析检测过程中，为了获得检测信号或提高检测的灵敏度，经常需要将一种信号成分或通过反应后易产生检测信号的成分如荧光素、酶、生物素、同位素等，和另一成分如蛋白质、多肽、核酸等通过化学偶联剂进行偶联，其偶联产物就是传统的标记物。如用辣根过氧化物酶(HRP)标记免疫球蛋白IgG，一般需经过以下五个步骤一、用氟二硝基苯(FDNB)处理HRP，封闭其α-和ε-氨基，以阻止HRP发生自我交联；二、用过碘酸钠氧化HRP的碳水化合物基团，使HRP成为有多个醛基的蛋白质“聚合剂”HRP-CHO；三、让“激活”的HRP的醛基和IgG的自由氨基反应，形成Schiff硷后使两个蛋白质分子发生交联；四、用硼氢化钠还原成稳定的酶结合物；五、将未发生交联的HRP、IgG与已发生交联的HRP、IgG偶联物进行分离。又如传统的荧光标记、生物素标记和同位素标记等都需要经过偶联、透洗和分离纯化等步骤。其中的透洗过程需要十几个小时，分离钝化步骤多需要进行层析纯化，过程十分复杂。由此可见，传统方法制备标记物有四个明显的缺点一、制备过程繁琐，耗费时间过长；二、标记物与被标记物通过偶联剂直接偶联，这样的标记产物在实际应用中的检测信号相对较弱；三、由于偶联过程中反应条件的变化，和标记后形成的空间位阻，往往对被标记成分原有的性质产生一定影响，如被标记抗原或抗体的亲和力、反应性降低或消失等；四、不能进行多重标记。
发明内容
本发明的目的是通过颗粒状物体作为载体，并采用直接或间接的方法将标记物和被标记物吸附或结合或连接到颗粒载体上制备标记物，它能够克服传统技术制备标记物的缺点，它不仅使制备过程简便省时，且标记产物检测信号较传统标记产物信号成倍提高，还可使多种标记成分和被标记成分连结在同一颗粒状物体上进行多重标记。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的生物检测用颗粒状标记物，它有颗粒状物体，在颗粒状物体表面上分别有至少一种标记成分和至少一种被标记成分。
为进一步实现本发明的目的，还可通过以下技术方案来完成所述的生物检测用颗粒状标记物，在颗粒状物体表面上分别直接吸附至少一种标记成分和至少一种被标记成分。所述的生物检测用颗粒状标记物，在颗粒状物体表面上分别直接连接至少一种标记成分和至少一种被标记成分。所述的生物检测用颗粒状标记物，在颗粒状物体表面上分别间接连接至少一种标记成分和至少一种被标记成分。所述的生物检测用颗粒状标记物，所述颗粒状物体分别为规则的球形体、椭圆球形体、多棱形体。所述的生物检测用颗粒状标记物，所述颗粒状物体分别为不规则的球形体、椭圆球形体、多棱形体。所述的生物检测用颗粒状标记物，所述标记成分分别为酶、荧光物质、发光物质、生物素、同位素、稀土元素等。所述的生物检测用颗粒状标记物，所述被标记成分分别为蛋白质、多肽、核酸、毒素等。
本发明能够产生的有益效果以微小颗粒状物体作为载体，通过以下方式将至少一种标记成分和至少一种被标记成分吸附、偶联或结合到该颗粒状物体上；一、直接吸附法，依靠该颗粒状载体在一定条件下对蛋白、多肽、核酸等成分的吸附作用，将其吸附在该颗粒状物体的表面。在制备颗粒状标记物时，由于该颗粒状物体的表面积较大，它可同时吸附多分子的标记成分和被标记成分，因此吸附效率较高。而传统标记方法中主要依靠单分子被标记物中游离氨基的多寡与标记成分结合，故结合效率较低。二、通过偶联剂将蛋白、多肽、核酸等成分分别结合到该颗粒状物体表面，制成呈颗粒状标记物，而传统的标记方法是标记成分和被标记成分通过偶联剂直接偶联。三、通过免疫球蛋白、蛋白A、亲和素、螯合金属离子等作为连接桥将蛋白、多肽、核酸等成分分别结合到该颗粒状物体表面，制成呈颗粒状标记物，避免了传统标记方法对被标记物本身性质或作用的影响。如传统的标记方法用HRP对重组的丙型肝炎病毒核心区抗原进行标记时，由于该区抗原富含赖氨酸和精氨酸，HRP与游离氨基结合后形成空间位阻，妨碍了重组的该区抗原与其相应抗体的结合，使标记产物无法应用。本发明技术利用带有螯合金属离子如Cu++、Ni++的微粒，与分别带有六聚组氨酸的重组丙型肝炎病毒核心区抗原和HRP进行结合(也可用抗六聚组氨酸抗体将两者直接结合)，其结合产物不仅不影响重组的丙型肝炎病毒核心区抗原与其相应抗体的结合，且该结合产物在双抗原夹心ELISA法检测中应用后，其灵敏度较传统方法标记物的灵敏度成倍提高。四、将传统方法制备好的标记物通过直接或间接的方法结合到该颗粒状物体的表面，能够大大提高标记物的使用效率及检测信号的强度。
采用直接吸附法进行标记，可将至少一种标记成分和至少一种被标记成分按一定比例混合后(也可以是传统方法标记好的标记物)，在一定PH条件下，与颗粒混合，在一定的温度下低温震荡或颠倒(使用颗粒不发生沉淀)吸附一定时间，然后离心弃上清，除去未被吸附的标记和被标记成分，用封闭液封闭后，离心沉淀，最终将沉淀物重新悬浮于含有稳定剂和防腐剂的缓冲液中低温保存备用。也可将沉淀物冷冻干燥后低温保存备用。
间接标记法，可根据标记成分和被标记成分的不同，选用不同的方法。如用表面带羧基的聚苯乙烯微球作载体，标记成分为辣根过氧化物酶，被标记成分为免疫球蛋白IgG，可首先用碳二亚氨作为偶联剂，将亲和素或链霉亲和素与颗粒状物体连接，再分别用生物素标记辣根过氧化物酶和IgG，然后利用亲和素与生物素特异性结合的原理，将辣根过氧化物酶和IgG结合到颗粒状物体上去。也可利用抗原抗体特异性结合的原理，或金属螯合原理进行间接连接。
具体实施例方式
根据标记产物的用途不同，可从市场上购买所需材料和所需直径大小不同的颗粒(直径从5nm至50μm均可使用)，也可按常规方法自行制备，然后根据颗粒的材料和标记产物的用途选择直接法或间接法进行标记。由于颗粒状物体有一定的表面积，且不同材料或不同处理方法处理后的颗粒状物体表面可带有不同的化学基团。因此它可直接或间接结合许多蛋白、多肽、核酸等分子，也可结合标记成分与被标记成分已偶联好的标记物，使标记产物的使用效率及最终的检测信号大大增强，也可同时结合多种标记或被标记成分，实行多重标记。
实施例1 直接法1.取0.01％氯金酸水溶液10-100ml，加入0.1-1％的枸橼酸三钠1-5ml，加热煮沸5-50分钟，直至颜色变成酒红色，即得金颗粒溶液。
2、取上述金颗粒溶液10ml，用0.1mol/LK2CO30.1mol/LHCL调pH至6-11。
3、取一定量的HIV抗原和碱性磷酸酶溶液，逐滴加入调好pH的溶液中，搅拌10-30分钟后，加入BSA至终浓度为0.1-1％。
4.20000rpm低温离心1小时，弃上清。
5、沉淀重悬于含有防腐剂和稳定剂的缓冲液中，低温保存备用。
实施例2 间接法1.在装有搅拌器、冷凝管、加料器和氮气导气装置的四口瓶中，加入去离子水50-100ml、丙酮30-90ml、苯乙烯10-30g，在一定温度下水浴20-50min，加入过硫酸钾0.2-0.5g，反应8-12h，所得乳液经25000rpm高速分离，沉淀用缓冲液洗涤后稀释，即得胶乳微粒。
2、在10ml上述胶乳微粒中，加入5-10ml 0.05-0.1mol/L正氨基已酸和10-20ml 0.05-02mol/L PH7.2缓冲液。
3、取上述溶液2ml，加入链霉亲和素(5000mg/L)0.5-2ml及碳化二亚氨5-15mg，混匀，37℃2小时，加入PH8-10的缓冲液0.1-0.5ml，30分钟后，10000g离心1小时，弃上清，沉淀用PH7.2的缓冲液洗两次。最后将沉淀重悬于PH7.2的缓冲液中。
4、将辣根过氧化物酶和HIV抗原分别用生物素进行常规标记。
5、分别取生物素标记的辣根过氧化物酶和HIV抗原各0.5ml混合后，加入到结合了链霉亲和素的聚苯乙烯胶乳微粒中，轻轻混匀，37℃1小时。
6、加PH7.2的缓冲液10ml，充分混匀后，10000g-20000g离心1小时。
7、沉淀重悬，常规封闭后，离心，再将沉淀重悬于含有防腐剂和稳定剂的缓冲液中冷藏备用。
实施例3 颗粒性标记物在HIV抗体检测中的应用1、取预包被有HIV抗原的酶标板一块，每孔加待检血清50ul；阳性对照孔和阴性对照孔分别加阳性对照血清和阴性对照血清各50ul，置37℃1h。
2、用含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液洗板5次后，每孔加按一定比例稀释的，按实施例1或实施例2制备的颗粒性标记物50ul，置37℃1h。
3、用含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液洗板3次后，每孔加显色剂100ul，置37℃15min。
4、每孔加终止液50ul后，置于酶标仪上测定各孔的吸光度值，根据各孔吸光度值的大小判定结果。
权利要求
1.生物检测用颗粒状标记物，其特征在于它有颗粒状物体，在颗粒状物体表面上分别有至少一种标记成分和至少一种被标记成分。
2.根据权利要求1所述的生物检测用颗粒状标记物，其特征在于在颗粒状物体表面上分别直接吸附至少一种标记成分和至少一种被标记成分。
3.根据权利要求1所述的生物检测用颗粒状标记物，其特征在于在颗粒状物体表面上分别直接连接至少一种标记成分和至少一种被标记成分。
4.根据权利要求1所述的生物检测用颗粒状标记物，其特征在于在颗粒状物体表面上分别间接连接至少一种标记成分和至少一种被标记成分。
5.根据权利要求1所述的生物检测用颗粒状标记物，其特征在于所述颗粒状物体分别为规则的球形体、椭圆球形体、多棱形体。
6.根据权利要求1所述的生物检测用颗粒状标记物，其特征在于所述颗粒状物体分别为不规则的球形体、椭圆球形体、多棱形体。
7.根据权利要求1所述的生物检测用颗粒状标记物，其特征在于所述标记成分分别为酶、荧光物质、发光物质、生物素、同位素、稀土元素。
8.根据权利要求1所述的生物检测用颗粒状标记物，其特征在于所述被标记成分分别为蛋白质、多肽、核酸、毒素。
全文摘要
本发明公开了一种生物检测用颗粒状标记物，它有颗粒状物体，在颗粒状物体表面上分别有至少一种标记成分和至少一种被标记成分。通过颗粒状物体作为载体，并采用直接或间接的方法将标记物和被标记物吸附或结合或连接到颗粒载体上制备标记物，它能够克服传统技术制备标记物的缺点，它不仅使制备过程简便省时，且标记产物检测信号较传统标记产物信号成倍提高，还可使多种标记成分和被标记成分连结在同一颗粒状物体上进行多重标记。
文档编号G01N33/48GK1673739SQ200510043210
公开日2005年9月28日 申请日期2005年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者朱有名 申请人:朱有名