专利名称：当归、川芎中药材及其制剂指纹图谱的建立方法及标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用高效液相色谱方法(HPLC)进行的指纹图谱研究，建立当归和川芎中药材及由二者单独或复方而制备的制剂的标准指纹图谱，对中药材和制剂的真伪及质量进行监控。
背景技术：
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，川芎为伞形科植物Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。二者伍用称为佛手散，方出《千金要方》，名见《医方类聚》，互补为用，活血，养血，行气三者并举，且润燥相济，当归之润可制川芎之燥，川芎之燥可制当归之腻，祛阏而不伤气血，养血而不滞血瘀，从而起到活血祛瘀，养血和血功效。本方在现代临床上应用极广，主要应用在血虚、血瘀及妇科顽疾的治疗上，是治疗心脑血管疾病及妇科病症的优选药物。
然而，由于当归和川芎品种较多，产地、采收季节等均会影响中药材的质量，因而制成的制剂尤其是注射剂质量参差不齐，难以确保其疗效的一致性。而且，目前当归和川芎中药材或制剂大多是以其中所含的一种活性成分(阿魏酸)作为指标进行含量测定，对其质量进行控制，并仅以其含量多少来评价其是否合格。例如，以阿魏酸含量(陈汉平，中草药，1988，19(10)15)来评价当归药材的质量；以阿魏酸的含量(张涛，广西中医学院学报，2001，4(3)60)来评价当归注射液的质量；以阿魏酸的含量(罗兰等，中药材，1998，21(4)184)来评价川芎药材及炮制工艺对其的影响；以阿魏酸的含量(孟德宝等，军队医药，2000，10(3)18)评价复方川芎注射液的质量。然而，当归、川芎中所含活性成分包括以阿魏酸为代表的水溶性有效部位及藁本内酯为代表的挥发油有效部位两部分，仅以阿魏酸代表部分水溶性部位，来评价中药材及其制剂的质量，具有相当大的片面性。
中药指纹图谱是指某种中药材及其制剂中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有十分明确的情况下，指纹图谱的建立对于有效控制中药材及其制剂的质量具有重要的意义。目前，有关川芎药材的指纹图谱研究已有报道，但其仅涉及川芎中的部分有效成分，如王嗣岑等以阿魏酸为对照品关于川芎中水溶性部位的指纹图谱方法研究(王嗣岑等，西安交通大学学报(医学版)，2003，24(3)221)；中国专利申请号为02149769.9的一种治疗脑血管疾病的药物，是涉及川芎采用超临界萃取方法提取的挥发油类活性成分的指纹图谱；另外还有采用高效电泳法对川芎药材部分活性成分的研究(孙沂等，中国中药杂志，2003，28(2)167)，而采用高效液相色谱方法对川芎药材的水溶性部位和挥发油性有效部位同时进行检测的指纹图谱研究尚无相关报导。当归及由其复方组成的制剂的高效液相色谱方法指纹图谱研究均无报道。
发明内容
本发明的目的是通过用高效液相色谱法对当归、川芎中药材及两者组成的制剂的指纹图谱研究，提供一种质量控制方法，确立该指纹图谱的制备方法，并分别建立其标准指纹图谱。
本发明通过以下步骤实施1.当归药材标准指纹图谱的建立(1)当归药材供试品溶液的制备当归饮片粉碎，精密称重，加入甲醇或无水乙醇提取后过滤，取少量续滤液经0.45μm微孔滤膜过滤后，稀释至适当浓度，即为当归药材供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取藁本内酯对照品适量，加甲醇制成适宜浓度的参照物溶液。
(3)当归药材指纹图谱的测定精密吸取当归药材供试品溶液及参照物溶液，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以参照物的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算10批当归药材中名共有峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到当归药材标准指纹图谱。
所采用的色谱色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动性组成为A甲醇(含0.4％冰醋酸)、B水(含0.4％冰醋酸)，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1，检测波长为280nm。
表1 当归药材指纹图谱洗脱程序
所得的当归药材指纹图谱图形如说明书附图中的图1所示，共有峰峰数为15个。
2.川芎药材标准指纹图谱的建立川芎药材的指纹图谱制备方法过程中的供试品溶液的制备、参照物溶液的制备、色谱条件及检测方法均与当归药材相同。以参照物藁本内酯的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算10批川芎药材中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，即得川芎中药材的标准指纹图谱。
所得的川芎药材指纹图谱图形如说明书附图中的图2所示，共有峰峰数为17个。
3.制剂标准指纹图谱的建立(1)供试品溶液的制备精密取制剂适量，甲醇溶解后稀释至适宜浓度，或制剂直接稀释至适宜浓度，必要时经微孔滤膜过滤，即得制剂供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取藁本内酯对照品适量，加甲醇制成适宜浓度的参照物溶液。
(3)制剂指纹图谱的测定精密吸取制剂供试品溶液及参照物溶液，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以参照物藁本内酯色谱峰的保留时间和峰面积作为1计算10批制剂中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，即得制剂标准指纹图谱。
所采用的色谱色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动性组成为A甲醇(含0.4％冰醋酸)、B水(含0.4％冰醋酸)，采用梯度洗脱，洗脱程序见表2，检测波长为280nm。
表2 复方当归川芎注射液指纹图谱洗脱程序
所得注射液指纹图谱图形如说明书附图中的图3所示，共有峰峰数为13个。
与现有技术相比，本发明具有以下优点1.本发明中采用无水乙醇回流提取的方法，兼顾其水溶性及挥发油两部分有效部位，具有简便、稳定、精密度高以及重现性好等优点，弥补了以往的技术中只涉及其中某一活性部位的缺点，使对中药质量的控制更加全面、真实、科学。
2.本发明采用高效液相色谱方法进行检测，检测波长为280nm，检测方法简便可行，较之于气相色谱法、高效电泳法等更为实用，大大节约了成本和时间。
3.本发明将当归或川芎中所含的化学成分进行全面分析，通过共有峰的有无来对中药材质量进行评价，与只采用药材中某一有效成分来分析评价药材质量的方法相比较，更为科学。
4.本发明包含了以当归和川芎组方的制剂指纹图谱研究，通过制剂中的共有峰的数目来控制制剂的质量，从而确保制剂质量的均一性，使中药制剂在应用过程中更加安全、可控，减少因中药制剂成分复杂不清所引起的各种潜在的危险。
图1是本发明的当归药材标准指纹图谱。
图2是本发明的川芎药材标准指纹图谱。
图3是本发明的复方当归川芎制剂标准指纹图谱。
图1中从左到右分别是共有峰1至15号峰。
图2中从左到右分别是共有峰1至17号峰。
图3中从左到右分别是共有峰1至13号峰。
具体实施例方式
本发明的优选实施方式如下实施实例1当归标准指纹图谱的建立1.仪器与试药SPD-M10A VP高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-M10A VP二极管阵列检测器(日本岛津公司)；CTO-10AS VP柱温箱(日本岛津公司)；98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；FW-100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
藁本内酯对照品(自制，纯度98％以上)；当归饮片购于天津中药饮片厂；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2.色谱条件色谱柱ODS C18色谱分析柱(4.6×200mm，5μm，迪马公司)；流动相A甲醇-HOAC(99.6∶0.4)，流动相B；水-HOAC(99.6∶0.4)；梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长280nm；流速1.0ml/min；柱温35℃；进样量20μl。
3.当归药材指纹图谱的测定3.1 当归指纹图谱的确立供试品溶液的制备当归饮片粉碎，精密称重，加入甲醇或无水乙醇回流提取0.5～2h，放冷至室温，过滤，取少量续滤液经0.45μm微孔滤膜过滤后，取1ml置于10ml棕色容量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，即为当归药材供试品溶液；参照物溶液的制备取藁本内酯对照品适量，加甲醇制成适宜浓度的参照物溶液。
测定精密吸取当归药材供试品溶液及参照物溶液20μl，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以参照物的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到当归药材标准指纹图谱。
3.2 共有峰的确定通过10批当归药材指纹图谱的测定，比较其色谱图，确定共有峰15个，以15号峰(藁本内酯峰)为参照物超过总峰面积10％的共有峰为14号峰(RT 0.885)和15号峰(藁本内酯，RT1.000)，其余均小于10％。10批药材共有峰相对保留时间和相对峰面积统计结果见表3和表4。
表3 10批当归药材指纹图谱相对保留时间统计结果
表4 10批当归饮片指纹图谱相对峰面积统计结果
3.3 指纹图谱精密度考察按照指纹精密度考察要求，以第1批当归饮片为供试品，连续进样5次，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰(有规定的共有峰即超过总峰面积10％的指纹峰)的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。
3.4指纹图谱重现性考察以第1批当归饮片为供试品，按照指纹图谱重现性规定方法操作，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。3.5指纹图谱稳定性试验按照指纹图谱稳定性测定方法操作，以第1批饮片为供试品，考察24小时溶液的稳定性，分别对共有峰相对保留时间及有规定的共有峰的相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％，供试品溶液24小时内稳定。
以上试验表明，该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定。
实施实例2 川芎标准指纹图谱的建立以实施实例1中当归药材指纹图谱的建立为基础，建立川芎药材标准指纹图谱，其仪器与试药、色谱条件、指纹图谱制备方法均与实例1中相同。其方法的精密度考察、重现性考察均符合指纹图谱研究的技术要求，溶液24小时内稳定。与实例1的区别在于共有峰的确定。通过10批川芎药材指纹图谱的测定，比较其色谱图，确定共有峰17个，以16号峰(藁本内酯峰)为参照物超过总峰面积10％的共有峰为6号峰(阿魏酸，RT 0.373)、12号峰(RT 0.689)和16号峰(藁本内酯，RT1.000)，其余均小于10％。10批药材共有峰相对保留时间和相对峰面积统计结果见表5和表6。
表5 10批川芎药材指纹图谱相对保留时间统计结果
表4 10批当归饮片指纹图谱相对峰面积统计结果
实施实例3 复方当归川芎注射标准指纹图谱的建立1.仪器与试药SPD-M10A VP高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-M10A VP二极管阵列检测器(日本岛津公司)；CTO-10AS VP柱温箱(日本岛津公司)；98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；FW-100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
藁本内酯对照品(自制，纯度98％以上)；当归川芎饮片购于天津中药饮片厂；复方当归川芎注射液(本实验室自制，由当归川芎饮片经一定工艺制备而成)，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2.色谱条件色谱柱ODS C18色谱分析柱(4.6×200mm，5μm，迪马公司)；流动相A甲醇-HOAC(99.6∶0.4)，流动相B水-HOAC(99.6∶0.4)；梯度洗脱，洗脱程序见表2；检测波长280nm；流速1.0ml/min；柱温35℃；进样量20μl。
3.复方当归川芎注射指纹图谱的测定3.1 注射液指纹图谱的确立供试品溶液的制备精密吸取注射液1ml置于25ml棕色容量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，即得注射液标准溶液；参照物溶液的制备取藁本内酯对照品适量，加甲醇制成适宜浓度的参照物溶液。
注射液指纹图谱的测定精密吸取注射液供试品溶液及参照物溶液20μl，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以参照物的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到当归药材标准指纹图谱。
3.2 共有峰的确定通过10批注射液指纹图谱的测定，比较其色谱图，确定共有峰13个，以12号峰(藁本内酯峰)为参照物超过总峰面积5％的共有峰为3号峰(阿魏酸，RT 0.218)、5号峰(RT 0.304)和12号峰(藁本内酯，RT1.000)，其余均小于5％。10批注射液共有峰相对保留时间和相对峰面积统计结果见表7和表8。
表7 10批注射液指纹图谱相对保留时间统计结果
表8 10批注射液指纹图谱相对峰面积统计结果
该方法的精密度、重现性均符合指纹图谱技术要求，样品溶液在8小时内稳定。
上述指纹图谱均可以用于控制中药材及其制剂的质量。
权利要求
1.一种当归、川芎中药材饮片及其制剂标准指纹图谱的建立方法，其特征在于当归、川芎中药饮片经甲醇或无水乙醇提取后稀释至适当浓度、制剂直接稀释或先溶解再稀释后直接采用高效液相色谱方法制备而得。
2.根据权利要求1所述的当归、川芎中药材饮片及其制剂标准指纹图谱的建立方法，其特征在于当归、川芎饮片经甲醇或无水乙醇提取后，过滤，续滤液稀释后，直接采用高效液相色谱方法进行检测，所得标准指纹图谱中含有阿魏酸为代表的水溶性部位和藁本内酯为代表的挥发油部位两部分。
3.根据权利要求1所述的当归、川芎中药材饮片及其制剂标准指纹图谱的建立方法，其特征在于制剂经过稀释或先溶解再稀释后可直接采用高效液相色谱方法检测，得到标准指纹图谱，其中含有以阿魏酸为代表的水溶性部位和以藁本内酯为代表的挥发油部位两部分。
4.如权利要求2所述的当归、川芎药材标准指纹图谱，其特征在于当归药材标准指纹图谱中含有的主要特征指纹峰有4号峰，阿魏酸、6号峰、14号峰、15号峰，藁本内酯，4个峰；川芎药材标准指纹图谱中含有的主要特征指纹峰有4号峰，阿魏酸、6号峰、15号峰、16号峰，藁本内酯、7号峰、8号峰、12号峰7个。
5.如权利要求3所述的当归、川芎中药材制剂标准指纹图谱，其特征在于标准指纹图谱中含有的主要特征指纹峰有3号峰，阿魏酸、5号峰、6号峰、9号峰、12号峰，藁本内酯，5个峰。
6.根据权利要求4所述当归、川芎药材标准指纹图谱，其特征在于当归药材指纹图谱中主要的特征指纹峰占总峰面积的百分比分别为4号峰3％～10％ 6号峰2％～10％14号峰7％～20％ 15号峰60％～75％川芎药材指纹图谱中主要的特征指纹峰占总峰面积的百分比分别为4号峰3％～10％ 6号峰15％～25％15号峰3％～15％16号峰35％～50％7号峰1％～7％ 8号峰1％～7％12号峰7％～17％。
7.根据权利要求5所述的当归、川芎中药材制剂标准指纹图谱，其特征在于制剂中主要的特征指纹峰占总峰面积的百分比分别为3号峰3％～10％ 5号峰13％～25％6号峰45％～60％9号峰1％～7％ 12号峰2％～10％。
8.如权利要求1、3、5、7所述的制剂，其特征在于所述的制剂包括由当归或川芎单独制备而得，或含有此两味中药的复方采用常规工艺制备而成，剂型包括注射液、软胶囊、片剂等剂型。
9.如权利要求4或5所述的当归、川芎中药材制剂标准指纹图谱，其特征在于将上述图谱应用于当归、川芎中药材饮片及其制剂的质量检测中。
全文摘要
本发明涉及当归、川芎中药材饮片及其由此二味中药单独或复方制备的制剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱。当归、川芎饮片经甲醇或无水乙醇提取、制剂溶解或直接稀释至适宜浓度后可直接采用高效液相色谱法检测，记录色谱图，以藁本内酯色谱峰为参照，计算各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，从而建立起标准指纹图谱。本发明的优点是同时测定当归、川芎药材和制剂中的水溶性和挥发油两个有效部位，较之于以前的单指标检测方法更为科学，而且方法简便、稳定、精密度高、重现性好，对整体上把握当归、川芎药材及其制剂的品种和质量起到有益的帮助，将其作为当归、川芎质量控制以及真伪鉴别的指标之一。
文档编号G01N30/06GK1707260SQ200510046400
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月11日 优先权日2005年5月11日
发明者崔福德, 冯丽莉, 胡杰 申请人:沈阳药科大学