专利名称：抗百合无症病毒的单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种抗百合无症病毒的单克隆抗体及其用途。
背景技术：
百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)是麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员，病毒粒子为略弯曲的线状，无包膜，长610-700nm，直径12-15nm，螺旋对称结构。病毒基因组为单分子线形正义ssRNA，长8394nt，含有6个ORF，其中ORF5编码32kD外壳蛋白，基因组RNA 3′端有一个Poly(A)。LSV的寄主范围很窄，主要侵染百合科植物，单独侵染百合寄主时表现为隐症，与其它病毒复合侵染时则可引起严重的田间症状，直接影响了百合的花和球茎质量，给花卉生产带来重大经济损失。LSV在我国百合产地广泛流行，感染率很高，因而迫切需要建立快速、准确、简单方便的检测方法，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种球的生产提供技术支撑和物质支持。目前，已报道的LSV的检测方法有电镜观测和多抗组合成的血清学检测方法两种，但电镜观测法需要昂贵的电子显微镜而不能普及，多抗组合成的血清学检测方法由于多抗存在非特异性高、准确性和均质性差、产量有限等缺陷而使这些血清学方法存在不足，本研究运用我们研制的LSV特异性单克隆抗体具有特异性强、均质性好、可无限量生产等优点从而使用该单抗建立的ELISA血清学方法具有准确性强、易标准化和大规模生等特点。此方法已有效地用于LSV在田间作物上的检测，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种苗的生产服务。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗百合无症病毒的单克隆抗体及其用途。
2A2、5H9、5H2和5E12共4株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-6以上；5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1，而2A2和5H2均为IgG3，4株单克隆抗体的轻链均为κ链；4株抗百合无症病毒单抗识别4个不相关的抗原结合位点；4株单抗均与百合无症病毒有特异性反应，而与其他病毒无交叉反应。
用单克隆抗体建立ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA方法检测百合无症病毒。
本发明的优点是1)提供的LSV病毒特异性单克隆抗体，运用ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA能够高度特异、准确、灵敏的检测LSV；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测LSV，不需要昂贵的电子显微镜设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物LSV的检测。
具体实施例方式
本发明制备了LSV的特异性强、效价高、稳定性好、能大量生产的单克隆抗体，并用这些单抗建立了检测LSV具有高度特异性、灵敏性和正确性的快速诊断方法，即ELISA，可为百合脱毒鉴定和抗病育种提供有力的技术和产品支持，对该病毒病的综合防治及增产保收提供直接的理论依据和技术保障，同时，可应用于进出口检验，检疫及LSV疫情调查分析等方面。
单克隆抗体的制备1.免疫原的制备将LSV分离于浙江丽水地区的百合，用10％PEG离心沉淀和蔗糖不连续密度梯度方法提取LSV。病毒提纯液经2％磷钨酸(pH6.7)染色后置JEOL，JEM-1200EX电镜下观察粒子形态。
2.免疫动物用提取LSV病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠1mg/ml提取LSV病毒0.5ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
3.细胞融合取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(Sigma)作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养器皿中培养。
4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获150多个对LSV有反应的阳性孔，阳性率为28％。选择6个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得2A2、5H9、5H2和5E12共4株能分泌抗LSV的特异性抗体的杂交瘤细胞株。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，4株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
5.单克隆抗体的特异性检测用提纯的百合无症病毒(LSV)、香石竹斑驳病毒(CarMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒1(BBWV-1)、蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)、香石竹环斑病毒(CaRSC)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)1ug/ml包被ELISA反应板，以相应的健叶提取液作阴性对照，用间接ELISA法，分别测定4株单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病毒分别用包被液稀释成1ug/mL后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入单抗100ul/孔，37℃1-2小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37℃1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，4株单抗对LSV有特异性反应，而与CarMV、TMV、ToMV，CMV，SCMV、PVY、PVX、BBWV1、BBWV2、TuMV、CaRSC其他病毒均无特异性反应。
6.单克隆抗体腹水制备及纯化取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/ml腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。
7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b、IgG3，IgM抗体，作双向琼脂扩散试验，结果为，5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1，而2A2和5H2均为IgG3，4株单克隆抗体的轻链均为κ链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述4株腹水效价均在10-6以上。
8.AP-抗LSV单克隆抗体结合物的制备将30mgAP和1.0mg纯化的单克隆抗体混匀于0.5ml PBS(0.01mol/l、PH7.2)，加入戊二醛至终浓度为0.2％，于室温下温和搅拌2小时。反应物中加入10mMTris-HCL(pH8.0，0.15M NaC1，1MM MgCl2)至1ml，然后用上述Tris-HCL缓冲液于4C流动透析24小时。透析以后的产物即为AP-单克隆抗体结合物，结合物中加入灭菌甘油至50％(V/V)，于-20℃保存备用。
9.单克隆抗体识别位点分析3ug/ml抗原(提纯LSV)100ul/孔于96孔ELISA板中，4℃包被过夜；用PBST洗涤三次，2％BSA 150ul/孔37℃，封闭1小时，加一种单抗腹水50ul及AP标记的另一种单抗50ul，37℃1小时；PBST洗涤三次后加硝基苯磷酸盐底物100ul/孔，37℃20分钟，OD405测定吸收值。以单抗腹水对同一AP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值OD/阴性对照值OD)X100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关，结果表明4株抗LSV单抗识别4个不相关的抗原结合位点。
10.用单抗建立间接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法检测病毒ACP-ELISA方法的操作步骤(1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)30倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，LSV病叶为阳性对照，相应健叶为阴性对照，37℃2h，或4℃过夜；(2)PBST洗涤后用5％脱脂奶粉封闭30min；(3)单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；(4)PBST洗涤后加入5000倍稀释的AP标记的羊抗鼠IgG结合物(Sigma)，100ul/孔，37℃，1h；(5)用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；(6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用酶联免疫检测仪测OD405值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
ACP-ELISA方法检测灵敏度检测单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1∶5至5120作倍比稀释，提纯病毒(5mg/l)从1∶1000至1∶512000作倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1∶5～500倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶500，ACP-ELISA方法对纯病毒的检测灵敏度可达2ng/ml，每孔的病毒绝对量检测为0.2ng。表现ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
11.LSV的单抗DAS-ELISA检测方法1)抗LSV的一株单抗5000倍稀释100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min3)加入检测样品100ul/孔。以LSV为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃1-2h；4)PBST洗涤后加入10000倍稀释碱性磷酸脂酶(AP)标记另一单抗结合物100ul/孔，37℃1-2h5)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色5-30min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性或用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
DAS-ELISA方法检测灵敏度检测对病叶从1∶5至5120作倍比稀释，提纯病毒(5mg/l)从1∶1000至1∶1024000作倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述DAS-ELISA方法检测。结果表明DAS-ELISA方法对1∶5～1000倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶1000，DAS-ELISA对纯病毒的检测灵敏度可达0.2ng/ml，每孔的病毒绝对量检测为0.02ng。表现DAS-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
12.LSV的TAS-ELISA检测方法12.1.TAS-ELISA方法的操作流程1)抗LSV的兔抗血清(本所自制)100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min3)加入检测样品100ul/孔。以LSV为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃1-2h；4)洗涤后用封闭液稀释的单抗腹水100ul/孔，37℃1-2h5)PBST洗涤后加入10000倍稀释碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗结合物(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h6)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色5-30min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性或用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
12.2.TAS-ELISA检测方法最适条件的确定采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向加兔抗LSV血清(本所自制)用包被缓冲液从1∶100至1∶102400倍比稀释；LSV 1ug/ml；纵向加用PBST缓冲液从1∶5至1∶2048000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1∶10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为LSV的兔抗血清最适稀释度均为1∶6000；2A2、5H9、5H2和5E12的最适稀释度分别为1∶8000，1∶10000，1∶5000，1∶10000。
12.3.TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将1ug/ml的LSV用含1-3％BSAPBST倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为TAS-ELISA检测4株单抗的灵敏度均在0.01ng以上，说明本方法具有很好的灵敏度。
13.上述ELISA方法的田间检测LSV的应用利用制备的LSV单抗建立的上述ELISA方法对田间百合进行检测。在浙江丽水地区百合上采收呈病毒症状的病样，作1∶30倍稀释，然后进行上述ELISA检测，用健株汁液作阴性对照，接种LSV的汁液作阳性对照。检测结果表明，百合上LSV的带毒率很高，47％样品呈阳性，与电镜观察检测结果一致，这表明所制备的单克隆抗体和建立的上述ELISA方法能很好的用于田间LSV的检测，同时，明确了百合无症病毒是田间百合上流行的主要病毒种类。
权利要求
1.一种抗百合无症病毒的单克隆抗体，其特征是，2A2、5H9、5H2和5E12共4株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-6以上；5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1，而2A2和5H2均为IgG3，4株单克隆抗体的轻链均为κ链；4株抗百合无症病毒单抗识别4个不相关的抗原结合位点；4株单抗均与百合无症病毒有特异性反应，而与其他病毒无交叉反应。
2.一种如权利要求1所述抗百合无症病毒的单克隆抗体的用途，其特征是，用单克隆抗体建立ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA方法检测百合无症病毒。
全文摘要
本发明公开了一种抗百合无症病毒的单克隆抗体及其用途。用提纯的百合无症病毒免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆，获得4株能稳定传代并分泌抗百合无症病毒(LSV)单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞，并分别制备它们的单抗腹水。4株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10
文档编号G01N33/569GK1683412SQ200510049388
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月17日 优先权日2005年3月17日
发明者吴建祥, 洪健, 刘成科, 周雪平, 叶美琴 申请人:浙江大学