专利名称：无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及水产品检测技术，具体涉及无色孔雀石绿在生物体内的快速检测。
背景技术：
无色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)是孔雀石绿(malachite green，MG)在生物体内主要代谢残留物，对人类有致癌危险。
孔雀石绿又称为苯胺绿、维多利亚绿或中国绿，是一种具有金属光泽的绿色晶体，溶于水、乙醇和甲醇，水溶液的颜色为蓝绿色(最大吸收波长为618nm)，最早在1913年有人发现孔雀石绿等染料可使某些组织着色，可破坏病原菌而不引起宿主损害，从而使这些染料用做防腐剂、杀锥虫药和其它医疗作用。自磺胺类药物和其它抗菌素的出现，孔雀石绿作为抗菌素在畜牧业中的应用已日渐衰退。然而在水产养殖中由于价格低廉和抗菌、抗真菌效果好，广泛用于进行水体消毒和防止鱼水霉病。
近年来发现孔雀石绿特别是其代谢物在水产体内有明显的蓄积残留现象，残留时间也较长，由于其化学官能团三苯甲烷是一种致癌物质，所以国外一些发达国家，如欧盟、美国已宣布禁止其在经济鱼类(观赏鱼除外)养殖过程中使用。我国农业部发布的《无公害食品 中华绒鳌蟹》(NY5064-2001)和农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》文件(农牧发 1号)中明确规定所有可食组织中禁用孔雀石绿。
《2000年度中国出口动物源性食品中有毒有害物质残留监控计划》首次将鳗鱼中孔雀石绿项目的监控列入年度计划，并延续至今。试验证实孔雀石绿在动物体内8小时后50％转变为无色孔雀石绿，24小时后84％转变成无色孔雀石绿，而长期滞留在组织中。国内外检测MG主要采用以色谱技术(HPLC)检测技术，虽然灵敏、定量准确，但大批量检测时速度慢，成本相对较高。以竞争性酶联免疫法(ELISA)为代表的快速筛选法是免疫学主流技术，快速、成本低、可以大批量检测以蛋白类检测物为目标的产品，而无色孔雀石绿无与蛋白偶联的基团，不能形成完全抗原用于制备特异性抗体，无法用竞争性酶联免疫法(ELISA)批量检测，国内外无该技术报道。为了建立快速检测孔雀石绿在水产品体内残留的技术，无色孔雀石绿完全抗原及单克隆抗体成功地制备成为关键。
发明内容
由于无色孔雀石绿无与蛋白偶联的基团，因而本发明先合成硝基无色孔雀石绿并还原、纯化，获氨基无色孔雀石绿。并与蛋白偶联成完全抗原，免疫BALB/C小鼠，制备单克隆抗体。
1、无色孔雀石绿完全抗原的制备过程包括下述步骤A、以N、N二甲基苯胺为原料，按1∶3～4摩尔量比加入对硝基甲醛，合成硝基无色孔雀石绿；B、硝基孔雀石绿按摩尔量比加入10倍量的稀HCl、5～8倍的金属粉末，还原为氨基无色孔雀石绿；C、将氨基无色孔雀石绿溶液滴加于碱溶液中，析出沉淀，沉淀物为纯化的氨基无色孔雀石绿；D、按每100mg纯化的氨基无色孔雀石绿溶解于6ml 0.3mol/L HCl的比例，将纯化的氨基孔雀石绿搅拌溶解，然后在冰浴搅拌条件下缓慢加入1％NaNO2，使氨基孔雀石绿重氮化，取淀粉/碘化钾溶液滴于白色干燥波片，滴加一滴上述重氮化溶液，混合后30秒内呈现蓝黑色，即为完成氨基孔雀石绿的重氮化；E、上述重氮化的氨基无色孔雀石绿继续反应20分钟，称取4倍于氨基无色孔雀石绿重量的兔白蛋白(RSA)，溶于碳酸盐缓冲液成2％蛋白溶液，在冰浴搅拌条件下缓慢加入重氮化的氨基无色孔雀石绿溶液，边加边用0.01mol/L NaOH调节pH至7.5～8.0，获氨基无色孔雀石绿与兔白蛋白的偶联物(NLMG-RSA)，置4℃冰箱中过夜后，于4℃条件下用0.1mol/L pH7.2的PBS透析三天，每天换透析液三次，分装、冻干后，-20℃保存。
2、无色孔雀石绿单克隆抗体的制备过程包括下述步骤A、NLMG-RSA免疫小鼠；B、免疫小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞以2～5∶1混合，1分钟内加入50％PEG融合，90秒之内加入30～40ml的1640培养液，静置10分钟，离心，细胞用含HAT和小鼠腹腔巨噬细胞的含血清1640培养液重悬后加入96孔培养板孔，置CO2培养箱中37℃培养，5天后用含HAT的1640完全培养液换液培养，10天后用含HT的1640完全培养液换液培养，以后改为1640完全培养液培养。
C、NLMG-OVA包被酶标板，筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；D、阳性克隆的杂交瘤细胞移植降植烷处理的BALB/C鼠制备单克隆抗体。
所述氨基孔雀石绿与兔白蛋白的偶联物(NLMG-RSA)被取样后，用紫外分光光度计检测其纯度，在190～600nm的波长下分别对氨基无色孔雀石绿、载体蛋白以及经过透析的偶联物进行扫描，以制定氨基孔雀石绿与载体的偶联比。
上述用NLMG-RSA免疫小鼠的具体操作为选择3月龄，30g左右的BALB/c小鼠，首免用NLMG-RSA溶于0.1mol/L PH7.4 PBS，与等体积的完全福氏佐剂混匀，150μgNLMG-RSA/鼠，足垫皮内注射0.1mL，2周后，用NLMG-RSA加等体积的不完全福氏佐剂混匀，250μgNLMG-RSA/鼠皮下注射，再过2周同量肌肉注射，第四次尾静脉注射。
上述步骤C筛选阳性克隆的杂交瘤细胞采用的是二步筛选法首先标记单个克隆或二个克隆(细胞克隆相互分开)的细胞培养孔，包被NLMG-OVA以筛选所有标记孔；2天后，将疑似阳性克隆(P/N＞2.1)用NLMG-OVA、OVA、进行第二次筛选，对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，及时转种并进行克隆化。
上述步骤D制备单克隆抗体的具体操作是取7周的BALB/c小鼠，用降植烷0.5ml/只，7天后腹腔接种用无血清培养基或生理盐水稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射细胞数为5×106个，间隔4天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒死不动时，采集腹水，离心，取上清，测定效价，分装，-70℃冻存备用，用硫酸铵沉淀法加DEAE纤维素柱脱盐纯化。
图1为硝基隐性孔雀石绿薄层和还原产物薄层层析图图中A为硝基隐性孔雀石绿薄层层析图1、对硝基苯甲醛；2、合成产物；3、N，N-二甲基苯胺(合成)。B为硝基隐性孔雀石绿的还原薄层层析图4、硝基隐性孔雀石绿；5、氨基隐性孔雀石绿(还原)。
图2为产物红外色谱图图中A为硝基隐性孔雀石绿红外色谱图，出现了硝基特征峰1342；B为氨基隐性孔雀石红外色谱图，出现了氨基的氢特征峰3353.3和3433.1。
图3为氨基隐性孔雀石绿、兔白蛋白及偶联物紫外扫描图图中A为氨基隐性孔雀石绿紫外扫描图；图中B为兔白蛋白紫外扫描图；图中C为氨基隐性孔雀石绿-兔白蛋白偶联物紫外扫描图。
图4为无色孔雀石绿的标准抑制曲线，图中的纵坐表为抑制率＝OD(加入LMG)/OD(未加入LMG)横坐表为LMG溶液浓度的对数。
具体实施例方式
以下提供较为详细的技术操作过程(1)硝基无色孔雀石绿合成对硝基甲醛10克，N、N-二甲基苯胺30ml搅拌加热回流，获硝基无色孔雀石绿24.0克。
(2)硝基无色孔雀石绿还原硝基无色孔雀石绿1克加入20ml 2M HCl再加锌粉末1克获氨基无色孔雀石绿0.80克。
(3)氨基无色孔雀石绿纯化将氨基无色孔雀石绿溶液滴加于碱溶液析出氨基孔雀石绿沉淀。
(4)氨基无色孔雀石绿重氮化称取50mg氨基无色孔雀石绿溶于3ml 0.3mol/L HCl，不断搅拌溶解，在冰浴中条件下，缓慢加入1％ NaNO2，边加边搅拌。同时检测NaNO2反应是否过量。检测方法是取一滴淀粉/碘化钾溶液于白色干燥玻璃上，然后取一滴重氮化溶液，加入并与之混合，30秒内混合液变蓝黑色表明已经重氮化。
(5)氨基无色孔雀石绿与蛋白偶联上述溶液继续在4℃以下反应20分钟，称取兔白蛋白200mg溶于10ml的0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，在冰浴中条件下，一边搅拌一边慢慢加入重氮化溶液。用0.01mol/L NaOH调pH值至7.5～8.0，然后放4℃冰箱中反应，过夜。偶联混合液装入透析袋中，于4℃下，用0.1mol/L PBS(pH7.2)透析3天，每天换三次透析液。取样用紫外分光光度计检测其纯度，并将偶联物小瓶分装，冷冻干燥，储存于-20℃备用。在190到600nm的波长下分别对氨基无色孔雀石绿、载体蛋白以及经过透析的偶联物进行扫描，来计算氨基无色孔雀石绿与载体蛋白偶联比。
(6)动物免疫选择3月龄，30g左右的BALB/c小鼠4只。首免用NLMG-RSA溶于0.1mol/LpH7.4 PBS，与完全福氏佐剂混匀，150μg NLMG-RSA/鼠，足垫皮内注射0.1mL。2周后，用NLMG-RSA加不完全福氏佐剂混匀，250μg NLMG-RSA/鼠皮下注射，再过2周，同上肌肉注射，第四次300μg NLMG-RSA/鼠尾静脉注射。
单抗制备过程无菌取BALB/c鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞，以2～5∶1混合，1分钟内加入50％ PEG融合，90秒内加入30ml 1640培养液静置10分钟，离心，离心沉淀物加入含HAT和小鼠腹腔巨噬细胞的有血清1640培养液，96孔培养，NLMG-OVA包被酶标板筛选阳性克隆，移植降植烷处理的BALB/c鼠制备抗体、鉴定。
采用二步筛选法首先标记单个克隆或二个克隆(细胞克隆相互分开)的细胞培养孔，先用NLMG-OVA包被96孔酶标板以筛选所有标记孔；2天后，将疑似阳性克隆(P/N＞2.1)用NLMG-OVA、OVA、进行第二次筛选。对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，应及时转种并进行亚克隆。
(7)腹水的制备与纯化取7周的BALB/c小鼠，用降植烷0.5ml/只。7天后腹腔接种用无血清培养基或生理盐水稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞。每只小鼠注射细胞数为5×106个。间隔4天后，每天观察小鼠腹水产生情况。待小鼠腹部膨大，精神变差，濒死不动时，用16号针头无菌采集腹水。将腹水离心，上清液即为无色孔雀石绿单克隆抗体，ELISA测定效价为1∶20000，分装，-70℃冻存备用。
硫酸铵沉淀法加DEAE纤维素柱将上述无色孔雀石绿单克隆抗体脱盐纯化。
为验证本发明效果的可靠性，进行以下鉴定1、化学产物经红外扫描分析见图2
在红外扫描图中比较合成物硝基无色孔雀石绿(图2.A)和氨基无色孔雀石绿(NLMG)(图2.B)与无色孔雀石绿(LMG)，发现硝基无色孔雀石绿出现了硝基特征峰1342和氨基无色孔雀石绿(NLMG)出现氨基的氢特征峰3353.3和3433.1，三者的其它峰是一致的，说明合成的物质与目标半抗原相符。
2、偶联物鉴定所得的偶联物进行紫外扫描分析见图2，A和B分别是偶联前的半抗原和载体，C是偶联后经过纯化的偶联物，偶联特征峰发生漂移，说明偶联成功。
3、单抗针对药物决定簇的鉴定部分强阳性孔上清1∶6稀释用NLMG-OVA、OVA分别包被酶标板进行ELISA再筛选，其中有一孔NLMG-OVA偶联物的OD值是载体的20倍左右，说明该克隆的产生的抗体是针对药物决定簇的，特异性较强。该克隆命名为5E9。
表1用NLMG-OVA、OVA分别包被酶标板对部分强阳性克隆分泌抗体进行ELISA筛选的结果 4、单克隆抗体特异性鉴定用系列稀释的孔雀石绿、无色孔雀绿、硝基孔雀石绿、结晶紫、副品红、甲基兰、氯霉素，做间接竞争ELISA包被抗原(NLMG-OVA)，100μl/孔，4℃作用过夜；洗板3次，加入200μl含1％明胶封闭，37℃ 2h，洗板3次；加入50μl药物稀释液和50μl单克隆抗体稀释液(1∶16000)，37℃ 2h，洗板3次，加入1∶I000稀释的HRP标记羊抗兔抗体，37℃ 2h，加底物反应，15min后终止反应，检测OD490。分别作抑制曲线，根据拟合曲线计算半数抑制率，然后计算药物的交叉反应率(交叉反应性＝产生50％抑制时LMG的浓度/产生50％抑制时的其它药物的浓度)，见表2。5E9细胞株产生的抗体除了孔雀石绿和其主要代谢物无色孔雀石绿外，对几种结构和用途相似的药物基本无交叉反应性。合成原药NLMG抑制效果最明显，其IC50达到6.4ng/ml；LMG和MG的IC50分别为25.7和70.3ng/ml。可见此抗体在很大程度上能同时进行MG及其代谢物LMG的检测。
表2与8种结构或作用类似药的交叉性
5. 5E9单克隆抗体实用性的鉴定，即运用该抗体探索建立检测LMG竞争ELISA，并进行相关参数计算以NLMG-OVA 1ug/ml 100μl/孔包被酶标板，将LMG作1×103至1×10-4作倍比为10的稀释，具体方法同上，根据以下公式计算抑制率和标准差、定量限。结果及相关参数见表3，表3竞争ELISA结果及相关参数
抑制率＝OD(加入LMG)/OD(未加入LMG)标准差(SD)＝[∑(X-Xi)2/(n-1)]1/2；检测下限(LOD)为(B-3SD)相对应的无色孔雀石绿浓度的值；定量限(LOQ)为(B-10SD)相对应的无色孔雀石绿浓度的值。
从图4可看到0.0016-1μg/ml范围内(B/B0)与LMG浓度的对数值呈一元二次曲线关系，回归曲线方程为Y＝-0.0139X2-0.1928X+0.2282，相关系数为r＝0.9848；半数抑制浓度为25.7ng/ml；用B0-3SD外推法经计算灵敏度为0.0023μg/ml。定量检测LMG的范围为0.955-10000ng/ml。试验结果表明该5E9单克隆抗体能用于建立检测LMG竞争ELISA。
权利要求
1.无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，其特征在于所述无色孔雀石绿完全抗原的制备过程包括下述步骤A、以N、N二甲基苯胺为原料，按1∶3～4摩尔量比加入对硝基甲醛，合成硝基无色孔雀石绿；B、硝基孔雀石绿按摩尔量比加入10倍左右量的稀HCl、5～8倍的金属粉末，还原为氨基无色孔雀石绿；C、将氨基无色孔雀石绿溶液滴加于碱溶液中，析出沉淀，沉淀物为纯化的氨基无色孔雀石绿；D、按每100mL纯化的氨基孔雀石绿溶解于6ml 0.3mol/L HCl的比例，将纯化的氨基孔雀石绿搅拌溶解，然后在冰浴搅拌条件下缓慢加入1％NaNO2，使氨基孔雀石绿重氮化，取淀粉/碘化钾溶液滴于白色干燥波片，滴加一滴上述重氮化溶液，混合后30秒内呈现蓝黑色，即为完成氨基孔雀石绿的重氮化；E、上述重氮化的氨基孔雀石绿继续反应20分钟，称取4倍于氨基无色孔雀石绿重量的兔白蛋白，溶于碳酸盐缓冲液成2％蛋白溶液，在冰浴搅拌条件下缓慢加入重氮化的氨基无色孔雀石绿溶液，边加边用0.01mol/L NaOH调节pH至7.5～8.0，获氨基无色孔雀石绿与兔白蛋白的偶联物(NLMG-RSA)，置4℃冰箱中过夜后，于4℃条件下用0.1mol/L pH7.2的PBS透析三天，每天换透析液三次，分装、冻干后，-20℃保存。
2.按权利要求1所述无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，其特征在于所述无色孔雀石绿单克隆抗体的制备过程包括下述步骤A、NLMG-RSA免疫小鼠；B、免疫小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞以2～5∶1混合，1分钟内加入50％PEG融合，90秒之内加入30～40ml的1640培养液，静置10分钟，离心，细胞用含HAT和小鼠腹腔巨噬细胞的含血清1640培养液重悬后加入96孔培养板孔中，置CO2培养箱中37℃培养，5天后用含HAT的1640完全培养液换液培养，10天后用含HT的1640完全培养液换液培养，以后改为1640完全培养液培养。C、NLMG-OVA包被酶标板，筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；D、阳性克隆的杂交瘤细胞移植降植烷处理的BALB/C鼠制备单克隆抗体。
3.按权利要求1所述无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，其特征在于所述氨基无色孔雀石绿与兔白蛋白的偶联物(NLMG-RSA)被取样后，用紫外分光光度计检测其纯度，在190～600nm的波长下分别对氨基无色孔雀石绿、载体蛋白以及经过透析的偶联物进行扫描，以制定氨基孔雀石绿与载体的偶联比。
4.按权利要求2所述无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，其特征在于所述用NLMG-RSA免疫小鼠的具体操作为选择3月龄，30g左右的BALB/c小鼠，首免用NLMG-RSA溶于0.1mol/L pH7.4PBS，与等体积的完全福氏佐剂混匀，150μgNLMG-RSA/鼠，足垫皮内注射0.1mL，2周后，用NLMG-RSA加等体积的不完全福氏佐剂混匀，250μgNLMG-RSA/鼠皮下注射，再过2周同量肌肉注射，第四次尾静脉注射。
5.按权利要求2所述无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，其特征在于所述步骤C筛选阳性克隆的杂交瘤细胞采用的是二步筛选法首先标记单个克隆或二个克隆(细胞克隆相互分开)的细胞培养孔，包被NLMG-OVA以筛选所有标记孔，2天后，将P/N＞2.1的疑似阳性克隆用NLMG-OVA、OVA、进行第二次筛选，对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，及时转种并进行克隆化。
6.按权利要求2所述无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，其特征在于所述步骤D制备单克隆抗体的具体操作是取7周的BALB/c小鼠，用降植烷0.5ml/只，7天后腹腔接种用无血清培养基或生理盐水稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射细胞数为5×106个，间隔4天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒死不动时，采集腹水，将腹水离心，取上清，测定效价，分装，-70℃冻存备用，用硫酸铵沉淀法加DEAE纤维素柱脱盐纯化。
全文摘要
本发明公开了一种无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，涉及无色孔雀石绿在生物体内的快速检测。由于无色孔雀石绿无与蛋白偶联的基团，无法用竞争性酶联免疫法(ELISA)批量检测，为了快速检测孔雀石绿在水产品体内残留，本发明先合成硝基无色孔雀石绿并还原，纯化，获氨基无色孔雀石绿，再与兔白蛋白偶联成无色孔雀石绿完全抗原；用其免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0进行了细胞的融合，采用二步法进行阳性克隆的筛选，经过多次的亚克隆，获得稳定分泌抗无色孔雀石绿的单克隆抗体。
文档编号G01N33/577GK1944461SQ20051006099
公开日2007年4月11日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者王权, 陈沁 , 龚朋飞, 郭德华, 李健, 顾惠明, 陈永军, 陈燕军 申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所, 上海大学, 中华人民共和国上海出入境检验检疫局