专利名称：一种达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法
技术领域：
本发明提供一种含有微量达玛烷型四环三萜皂苷的样品检测方法。
背景技术：
现代研究表明中药人参、西洋参、三七中的皂苷类物质是活性成分，且均含有达玛烷型四环三萜皂苷(中药化学，匡海学P231-232)，其苷元主要有20(S)-原人参二醇型和20(S)-原人参三醇型两种，在C3、C12和C20位有β-OH存在。原人参二醇型和原人参三醇型的区别仅在于后者还具有C6位的α-OH，成苷的位置通常在C3、C20和C6位。
目前为止，人们对三七(Panax notoginseng F.H.Chen以及himalaicus)的不同部位分离得到了28种单体皂苷。其中，原人参三醇型皂苷13种，原人参二醇型皂苷15种，原人参三醇型皂苷与原人参二醇型皂苷的含量比为3∶1(1.Masayuki Yoshikawa，et a1.Bioactive Saponinsand Glycosides.VIII.Notoginseng(1)New Dammarane-TriterpeneOligoglycosides，Notoginsenosides-A，-B，-C，and-D，from the Dried Root of Panax notoginseng(Burk.).Chem PharmBull，1997，45(6)1039。
人参(Panax ginseng)中含原人参三醇型皂苷5种，原人参二醇型皂苷8种(中药化学，匡海学P252-257)。
西洋参(Panax quinquefolium L.)中含5种原人参二醇型皂苷(曹敏.概述西洋参化学成分研究的近况，江苏药学与临床研究，2004，12(2)25)。
但是由于口服这类皂苷后血浆中的皂苷浓度太低，现有技术无法检测到，从而对于其生物利用度，体内作用机制等无法进行深入的评价与研究。因此，如果建立一种能够检测到口服这类皂苷后血浆中的皂苷及其苷元或次生苷元的方法，将有利于上述研究的发展。
发明内容
本发明的一个目的在于提供了一种新的用于检测达玛烷型四环三萜皂苷中单体皂苷在血浆中含量的方法，本发明的另一个目的在于提供了一种新的用于含有达玛烷型四环三萜皂苷中单体皂苷制剂的质量控制方法。
技术方案本发明的检测方法是采用高效液相色谱-质谱联用仪进行的，用于检测达玛烷型四环三萜皂苷，其中包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及原人参二醇型皂苷的次生苷元人参二醇、原人参三醇型皂苷的次生苷元人参三醇的检测方法。本发明所述的皂苷来自三七总皂苷、及其提取物和以三七为活性成分的片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、以及其他制剂形式，亦可适用于人参皂苷，绞股蓝皂苷，西洋参皂苷等四环三萜皂苷类。本发明的检测方法可以用于含有上述达玛烷型四环三萜皂苷药物制剂的质量控制。
其中本发明高效液相色谱-质谱联用仪的高效液相色谱条件为色谱柱ODS(十八烷基键合相)C18柱，流动相
检测器三重四极杆串联质谱检测柱温20-38℃质谱条件离子源Turbo Ionspray源，喷射电压3000-5000V，Tem250-300℃，正离子检测扫描方式为多反应检测(MRM)CE17-36V； DP80-110V检测离子对一级全扫描质谱的达玛烷型四环三萜皂苷的单体皂苷的准分子离子峰进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子，采用多反应检测(MRM)扫描方式，对上述离子反应进行定量分析。其中，例如达玛烷型四环三萜皂苷中单体皂苷的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及原人参二醇型皂苷的次生苷元人参二醇、原人参三醇型皂苷的次生苷元人参三醇的一级全扫描质谱准分子离子峰及进行碰撞诱导解离得到二级碎片离子的峰值为一级全扫描质谱的三七皂苷R1准分子离子峰为m/z 355.6，m/z 405.8，m/z 423.6，m/z441.7，m/z 735.7，m/z 753.9，m/z 950.8，m/z 956.0，m/z 971.8，m/z 1006.9，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 203.3，m/z 643.1，m/z 723.5，m/z 423。
人参皂苷Rg1一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 374.3，m/z 396.6，m/z 405.7，m/z 423.0，m/z 441.7，m/z 491.6，m/z 603.7，m/z 801.6，m/z 823.8，m/z 830.7，m/z 840.6，m/z 874.9，m/z 878.6，m/z 915.9，m/z 940.7，m/z 962.8，m/z 1006.9，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 203.3，m/z 643.1，m/z 823.5，m/z 423.5。
人参皂苷Rb1一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 1109.9，m/z 1112.2，m/z 1127.0，m/z 1129.3，m/z 1132.8，m/z 1148.9，m/z 1173.7，m/z 1217.6，m/z 1216.1，m/z m/z 1231.7，m/z 1300.6，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 144.7，m/z 163.4，m/z 325.4，m/z 487.3。
人参二醇一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 425.6，m/z 443.6，m/z 444.7，m/z 459.6，m/z 461.5，m/z 462.6，m/z 463.6，m/z 483.6，m/z 484.4，m/z 499.5，m/z 524.5，m/z 534.6，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 99.0，m/z 109.4，m/z 122.0，m/z 127.1，m/z 191.5，m/z 203.2，m/z 206.9，m/z 217.5，m/z 235.0，m/z 271.3，m/z 369.4，m/z 407.6，m/z 425.4，m/z 443.5，m/z 461.4。
人参三醇的一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 127.2，m/z 423.5，m/z 441.6，m/z 459.6，m/z 477.5，m/z 499.6，m/z 550.7，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 99.1，m/z 109.6，m/z 123.0，m/z 127.1，m/z 187.6，m/z 203.1，m/z 205.2，m/z 207.2，m/z 217.3，m/z 405.7，m/z 423.5，m/z 441.5，m/z 459.6，m/z 477.5。
血浆样品的处理方法精密量取血浆0.5ml，加入2-5倍体积量的有机溶媒沉淀蛋白，涡旋并高速离心后，取上清液进样，进样体积为20μl。
处理方法还可以是精密量取血浆0.5ml，8000-15000r/min转速离心，吸取上清液上固相萃取小柱，采用2ml重蒸水，2ml 15-25％甲醇淋洗后，以2ml色谱甲醇洗脱，收集洗脱液，50-70℃下氮气吹干，以50-70％甲醇溶液复溶，高速离心后取上清液进样，进样体积为20μl。
血浆样品的处理方法可以优选为a.精密量取血浆0.5ml，加入3或4倍体积量的有机溶媒沉淀蛋白，涡旋并高速离心后，取上清液进样，进样体积为20μl；或b.精密量取血浆0.5ml，10000r/min转速离心，吸取上清液上固相萃取小柱，采用2ml重蒸水，2ml 20％甲醇淋洗后，以2ml色谱甲醇洗脱，收集洗脱液，60℃下氮气吹干，以50％甲醇溶液复溶，高速离心后取上清液进样，进样体积为20μl。
上述高效液相(HPLC)-质谱(MS)分析系统优选条件为色谱柱Kromasil C18柱(50mm×2.1mm，5μm)，流动相采用甲醇、10mM醋酸铵进行梯度洗脱，0时刻甲醇、10mM醋酸铵的体积比为50％∶50％，以第4分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为50％∶50％，在第4.1分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为90％∶10％，在第14.0分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为90％∶10％，在第25分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为50％∶50％，流速为0.25(ml/min)；质谱条件中离子源Turbo Ionspray源，喷射电压4000V，正离子检测，温度为300℃。
有益效果本发明建立的高效液相(HPLC)-质谱(MS)分析系统一次进样能同时准确地测定出达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷的浓度，从而能准确地反映达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷的血药浓度。该方法适合于含有达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷药物的动物和临床试验中达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷的血药浓度的检测，对评价生物体对达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷的吸收和作用机理有着重要的作用。该方法特别能准确地反映三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、原人参二醇型皂苷的次生苷元人参二醇、原人参三醇型皂苷的次生苷元人参三醇的血药浓度。该方法也更适合于含有三七总皂苷的药物的动物和临床试验中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、原人参二醇型皂苷的次生苷元人参二醇、原人参三醇型皂苷的次生苷元人参三醇的血药浓度的检测，对评价生物体对三七总皂苷的吸收和作用机理有着重要的作用。本发明检测方法具有优良的灵敏度及线性关系，能够满足微量(10-9g/ml)样品的分析要求。同时通过加样回收率实验各种单体都能达到回收率的要求。
下面实施例对本发明做进一步的详细说明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1口服市售三七皂苷片(血塞通片)的比格犬体内血药浓度检测试验1.给药方法试验前比格犬禁食12h，清晨按三七总皂苷90mg/kg剂量给药。服药前取空白血，于服药后0.5、1、2、3、4、、6、8、10、12、16、24、36、48h取前腿静脉血3ml，肝素抗凝，立即于3000rpm离心5min，分离出血浆于-20℃保存备用。
2.血浆样品的处理精密量取血浆0.5ml，10000r/min转速离心，吸取上清液上固相萃取小柱，采用2ml重蒸水，2ml 20％甲醇淋洗后，以2ml色谱甲醇洗脱，收集洗脱液，60℃下氮气吹干，以50％甲醇溶液复溶，高速离心后取上清液进样，进样体积为20μl。
3.分析条件高效液相色谱条件色谱柱Kromasil C18柱(50mm×2.1mm，5μm)流动相
检测器三重四极杆串联质谱检测柱温22℃质谱条件离子源Turbo Ionspray源，喷射电压4000V，正离子检测，Tem300℃扫描方式为多反应检测(MRM)CE17-36V；DP80-110V检测离子一级全扫描质谱的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参二醇、人参三醇的准分子离子峰分别为m/z 950.8、m/z 801.6、m/z 1127.0、m/z 461.5和m/z 477.5，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 423、m/z 423.5、m/z 487.3、m/z 127.1和m/z 127.1，采用多反应检测(MRM)扫描方式，对以上述离子反应进行定量分析，保留时间分别为2.13min，2.85min，9.06min，12.47min，9.51min。内标物为格列里脲，其的二级碎片离子保留时间为6.21min。
以浓度为横坐标，与内标物的峰面积之比为纵坐标，通过加权最小二乘法进行回归运算，得标准曲线方程，计算出血浆浓度。
4.标准曲线的建立精密量取空白血浆0.5ml，置离心管中，分别精密加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参二醇和人参三醇的不同浓度的标准品溶液，涡旋混合1min，加入2ml甲醇沉淀蛋白，涡旋并高速离心后，取上清液进样，进样体积为20μl，记录色谱图。
标准曲线以血浆中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1、人参二醇和人参三醇的浓度为横坐标，与内标物的峰面积之比为纵坐标，通过加权最小二乘法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线。
结果如下(1)三七皂苷R1标准曲线线性范围2.8-140ng/ml检测限为0.5ng/mly检测二级离子峰面积/内标峰面积x浓度ng/ml(10-9g/ml)R相关系数方程为y＝0.0024x+0.0068R＝0.9967(2)人参皂苷Rg1标准曲线线性范围3.8-190ng/ml，检测限为0.8ng/mly检测二级离子峰面积/内标峰面积x浓度ng/ml(10-9g/m1)R相关系数方程为y＝0.001x+0.0015R＝0.9991(3)人参皂苷Rb1标准曲线线性范围18-900ng/ml检测限为1ng/mly检测二级离子峰面积/内标峰面积x浓度ng/m1(10-9g/m1)R相关系数方程为y＝0.001x+0.0197R＝0.9982(4)人参二醇标准曲线线性范围1.0ng/ml-1000ng/ml检测限0.5ng/mly检测二级离子峰面积/内标峰面积x浓度ng/ml(10-9g/ml)R相关系数方程为y＝0.0201x+0.8045
R＝0.9951(5)人参三醇标准曲线线性范围0.53-26.5ng/ml检测限0.05ng/mly检测二级离子峰面积/内标峰面积x浓度ng/ml(10-9g/ml)R相关系数方程为y＝0.0083x+0.0147R＝0.9969以上结果表明，所建立的方法具有很好的灵敏度及线性关系，能够满足微量(10-9g/ml)样品的分析要求。
5.方法回收率考察精密量取空白血浆0.5ml，分别精密加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参二醇和人参三醇的高、中、低三种浓度的标准溶液，按上述实验例1血浆处理方法操作，记录色谱图，另取同样浓度标准品直接进样，记录色谱图。平行测定三份，计算相对回收率。
相对回收率＝(处理后测得量/加入量)×100％结果如下三七皂苷R1
人参皂苷Rg1
人参皂苷Rb1
人参二醇
人参三醇
结果符合分析方法的要求。
6.血浆浓度结果如下表三七皂苷R1
人参皂苷Rg1
人参皂苷Rb1
人参二醇
人参三醇
实施例2口服西洋参胶囊后比格犬体内血药浓度的检测试验给药方法试验前比格犬禁食12h，清晨按西洋参皂苷100mg/kg剂量给药。服药前取空白血，于服药后0.5、1、2、3、4、、6、8、10、12、16、24、36、48h取前腿静脉血3ml，肝素抗凝，立即于3000rpm离心5min，分离出血浆于-20℃保存备用。
血浆样品的处理精密量取血浆0.5ml，置离心管中，加入2ml甲醇沉淀蛋白，涡旋并高速离心后，取上清液进样，进样体积为20μl，记录色谱图。
分析条件高效液相色谱条件色谱柱SGE C18柱(50mm×2.1mm，5μm)流动相
检测器三重四极杆串联质谱检测柱温25℃质谱条件离子源Turbo Ionspray源，喷射电压4000V，正离子检测，Tem280℃为多反应检测(MRM)CE17-36V； DP80-110V检测离子一级全扫描质谱的人参皂苷Rb1、人参二醇、人参三醇的准分子离子峰分别为m/z 1183、m/z 461.1和m/z 477.6，选择性对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 487.2、m/z 127.1和m/z 127.1，采用多反应检测(MRM)扫描方式，对以上述离子反应进行定量分析，保留时间分别为1.93min，11.52min，8.51min，内标物为格列里脲，其的二级碎片离子保留时间为6.21min。
以浓度为横坐标，与内标物的峰面积之比为纵坐标，通过加权最小二乘法进行回归运算，得标准曲线方程，计算出血浆浓度。
血浆浓度结果如下表人参皂苷Rb1
人参二醇
人参三醇
权利要求
1.一种达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法，其特征在于该方法采用高效液相色谱-质谱联用仪，其中高效液相色谱条件为色谱柱ODS C18柱，流动相采用甲醇、10mM醋酸铵进行梯度洗脱，0时刻甲醇、10mM醋酸铵的体积比为40-60％∶60-40％，以第4分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为40-60％∶60-40％，在第4.1分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为70-90％∶30-10％，在第14.0分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为70-90％∶30-10％，在第25分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为40-60％∶60-40％，流速为0.2-0.4(ml/min)，检测器三重四极杆串联质谱检测，柱温20-38℃；质谱条件离子源Turbo Ionspray源，喷射电压3000-5000V，Tem250-300℃，正离子检测，扫描方式为多反应检测(MRM)，CE17-36V，DP80-110V，检测离子对一级全扫描质谱的达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷的准分子离子峰进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子，采用多反应检测(MRM)扫描方式，对上述离子反应进行定量分析。
2.如权利要求1所述的达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法，其特征在于该方法中流动相采用甲醇、10mM醋酸铵进行梯度洗脱，0时刻甲醇、10mM醋酸铵的体积比为50％∶50％，以第4分钟时甲醇、10mMNH4Oac的体积比为50％∶50％，在第4.1分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为90％∶10％，在第14.0分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为90％∶10％，在第25分钟时甲醇、10mM醋酸铵的体积比为50％∶50％，流速为0.25(ml/min)，色谱柱ODS C18柱(50mm×2.1mm，5μm)；质谱条件中离子源Turbo Ionspray源，喷射电压4000V，正离子检测，温度为300℃。
3.如权利要求1或2所述的达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法，其特征在于该方法中血浆样品的处理方法包括如下方法的任一种a.精密量取血浆0.5ml，加入2-5倍体积量的有机溶媒沉淀蛋白，涡旋并高速离心后，取上清液进样，进样体积为20μl；b.精密量取血浆0.5ml，8000-15000r/min转速离心，吸取上清液上固相萃取小柱，采用2ml重蒸水，2ml 15-25％甲醇淋洗后，以2ml色谱甲醇洗脱，收集洗脱液，50-70℃下氮气吹干，以50-70％甲醇溶液复溶，高速离心后取上清液进样，进样体积为20μl。
4.如权利要求1、2或3所述的达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法，其特征在于所述达玛烷型四环三萜皂苷为三七总皂苷中的单体皂苷。
5.如权利要求4中所述的达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法，其特征在于所述达玛烷型四环三萜皂苷三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、原人参二醇型皂苷的次生苷元人参二醇、原人参三醇型皂苷的次生苷元人参三醇。
6.如权利要求5中所述的达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法，其特征在于质谱条件中检测离子一级全扫描质谱的三七皂苷R1准分子离子峰为m/z 355.6，m/z 405.8，m/z 423.6，m/z 441.7，m/z 735.7，m/z 753.9，m/z 950.8，m/z 956.0，m/z 971.8，m/z 1006.9，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 203.3，m/z 643.1，m/z 723.5，m/z 423；人参皂苷Rg1一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 374.3，m/z 396.6，m/z 405.7，m/z 423.0，m/z 441.7，m/z 491.6，m/z 603.7，m/z 801.6，m/z 823.8，m/z 830.7，m/z 840.6，m/z 874.9，m/z 878.6，m/z 915.9，m/z 940.7，m/z 962.8，m/z 1006.9，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 203.3，m/z 643.1，m/z 823.5，m/z 423.5；人参皂苷Rb1一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 1109.9，m/z 1112.2，m/z 1127.0，m/z 1129.3，m/z 1132.8，m/z 1148.9，m/z 1173.7，m/z 1217.6，m/z 1216.1，m/z m/z 1231.7，m/z 1300.6，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 144.7，m/z 163.4，m/z 325.4，m/z 487.3；人参二醇一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 425.6，m/z 443.6，m/z 444.7，m/z 459.6，m/z 461.5，m/z 462.6，m/z 463.6，m/z 483.6，m/z 484.4，m/z 499.5，m/z 524.5，m/z 534.6，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 99.0，m/z 109.4，m/z 122.0，m/z 127.1，m/z 191.5，m/z 203.2，m/z 206.9，m/z 217.5，m/z 235.0，m/z 271.3，m/z 369.4，m/z 407.6，m/z 425.4，m/z 443.5，m/z 461.4；人参三醇的一级全扫描质谱的准分子离子峰为m/z 127.2，m/z 423.5，m/z 441.6，m/z 459.6，m/z 477.5，m/z 499.6，m/z 550.7，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 99.1，m/z 109.6，m/z 123.0，m/z 127.1，m/z 187.6，m/z 203.1，m/z 205.2，m/z 207.2，m/z 217.3，m/z 405.7，m/z 423.5，m/z 441.5，m/z 459.6，m/z 477.5。
7.如权利要求6中所述的达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法，其特征在于质谱条件中检测离子一级全扫描质谱的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参二醇、人参三醇的准分子离子峰分别为m/z 950.8、m/z 801.6、m/z 1127.0、m/z 461.5和m/z 477.5，对其进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子分别为m/z 423、m/z 423.5、m/z 487.3、m/z 127.1和m/z 127.1。
8.一种含有达玛烷型四环三萜皂苷药物制剂的质量控制方法，其特征在于该方法应用上述如权利要求7中所述的达玛烷型四环三萜皂苷的检测方法。
9.如权利要求8所述的含有达玛烷型四环三萜皂苷药物制剂的质量控制方法，其特征在于含有达玛烷型四环三萜皂苷药物制剂是指三七总皂苷或其提取物或以三七为活性成分或人参皂苷、绞股蓝皂苷、西洋参皂苷的各种制剂。
全文摘要
本发明公开了一种达玛烷型四环三萜皂苷与次生苷元的检测方法，该方法采用高效液相色谱－质谱联用仪，其中高效液相色谱条件为色谱柱ODS C18柱，柱温20－38℃；质谱条件离子源Turbo Ionspray源，喷射电压3000－5000V，Tem250－300℃，检测器三重四极杆串联质谱检测，正离子检测，扫描方式为多反应检测(MRM)，CE17－36V，DP80－110V，检测离子对一级全扫描质谱的达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷的准分子离子峰进行碰撞诱导解离，得到二级碎片离子，采用多反应检测(MRM)扫描方式，对上述离子反应进行定量分析。能准确地反映达玛烷型四环三萜皂苷单体皂苷与次生苷元的血药浓度。
文档编号G01N30/06GK1885032SQ20051007723
公开日2006年12月27日 申请日期2005年6月20日 优先权日2005年6月20日
发明者朱春燕, 陈卫 申请人:中国医学科学院药用植物研究所