专利名称：一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，适用于测定动物性食品中呋喃唑酮残留标示物3-氨基-2-恶唑烷酮(简称AOZ，下同)的残留量，属于免疫化学分析技术领域。
背景技术：
呋喃唑酮又名痢特灵，属于硝基呋喃类药物，为人工合成的广谱抗菌药，曾作为促生长剂广泛应用于畜、禽、水产养殖中。毒理学研究发现，呋喃唑酮具有致癌和致突变性。欧盟于1995年将呋喃唑酮列为禁用药，随后美国、日本、澳大利亚等国均取消呋喃唑酮在畜禽生产上的使用，中国农业部2002年3月发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中将呋喃唑酮列为禁用药。由于呋喃唑酮确实具有很好的预防和治疗效果，价格便宜，目前仍在畜、禽、水产养殖中非法使用。因此为了保障动物性食品食用者的健康和扩大动物性食品的贸易往来，加强对动物性食品中呋喃唑酮残留的检测是非常必要的。
呋喃唑酮在动物体内很快代谢成AOZ，与组织蛋白结合的AOZ在体内滞留时间长，被视为呋喃唑酮的残留标示物，所以分析呋喃唑酮残留通常分析其代谢产物AOZ。目前检测AOZ残留的方法有高效液相色谱法(HPLC)，液质联用(LC-MS)，液质串联质谱法(LC-MS-MS)和免疫化学分析法(IA)。
常用的仪器法(HPLC、LC-MS、LC-MS-MS)所需仪器价格昂贵，对操作人员的要求较高，难于推广，不适合高通量的样品筛选。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选。近年来国外已开展呋喃唑酮ELISA方法的研究(Cooper KM，Elliott C T，Kennedy D G.Detection of 3-amino-2-oxazolidinone(AOZ)，a tissue-bound metabolite of thenitrofuran furazolidone，in prawn tissue by enzyme immunoassay.Food Additives and Contaminants，2004，21(9)841-848)，但国内外均未见呋喃唑酮ELISA试剂盒专利报道。因此研制呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，具有重要的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒。本试剂盒具有灵敏度高，结构简单，使用和携带方便，可用于动物检验检疫单位对动物源食品中呋喃唑酮残留的分析检测。
本发明通过以下技术方案实现一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的酶标板、试剂，其中的试剂包含洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗兔抗体、底物显色A液、底物显色B液、终止液、3-氨基-2-恶唑烷酮标准溶液和3-氨基-2-恶唑烷酮抗体，在酶标板的每孔内，有包被液包被的能与呋喃唑酮残留标示物3-氨基-2-恶唑烷酮特异性抗体结合的包被抗原，所说的3-氨基-2-恶唑烷酮抗体是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
所说的包被抗原是由3-氨基-2-恶唑烷酮与对醛基苯甲酸反应，再与卵清蛋白偶联的复合物。
所说的人工免疫原是由3-氨基-2-恶唑烷酮与对醛基苯甲酸反应，再与牛血清蛋白偶联的复合物。
所说的3-氨基-2-恶唑烷酮标准溶液为3-氨基-2-恶唑烷酮与苯甲醛衍生物N-苯亚甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(简称PAOZ，下同)。
在本发明的试剂盒中，所述的酶标板由塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成，酶标板用聚苯乙烯制成。
试剂盒中的试剂按照常规配制(朱立平，陈学清，免疫学常用实验方法.北京人民军医出版社，2000)，其中底物显色A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色B液为四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)，终止液为硫酸溶液或盐酸溶液，洗涤液为含0.05～0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液，样品稀释溶液为pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明还包括动物可食性组织如肝脏、肌肉样品预处理方法，将待检测动物组织经盐酸水解释放AOZ，苯甲醛衍生过夜(16h)，最后过MAX柱净化。
本发明试剂盒采用间接竞争ELISA法，用于检测动物可食性组织如肝脏、肌肉中AOZ的残留。其优点是样品处理简单，适合高通量的样品筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确度等特点，最低检测限达0.1μg/kg。
图1是本发明的检测试剂盒直观示意图，图中1--盒体；3--AOZ标准溶液；4--辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗兔抗体；5--AOZ抗体液；6--底物显色A液；7--底物显色B液；8--终止液；9--洗涤液；10--样品稀释液；11--泡沫托架；图2是本发明的检测试剂盒中的酶标板直观示意图，图中2--酶标板；图3是本发明的人工抗原合成路线；图4是本发明人工抗原紫外扫描图谱，图4显示BSA最大吸收波长为27gnm，CPAOZ-BSA最大吸收波长为292nm，BSA偶联半抗原后最大吸收波长发生明显改变；图5是本发明3-氨基-2-恶唑烷酮抗体与3-氨基-2-恶唑烷酮标准品的间接竞争反应曲线，图中X轴为3-氨基-2-恶唑烷酮标准品的浓度对数值，Y轴为3-氨基-2-恶唑烷酮标准品对光密度值的抑制百分率。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
实施例1、抗原、抗体的制备1.1人工抗原(免疫原、包被原)的合成在有磁力搅拌器装置的100mL烧杯中加入蒸馏水10mL，对醛基苯甲酸3.0g，缓慢滴加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)至对醛基苯甲酸完全溶解，搅拌中加入AOZ 1.0g，反应2h后过滤，水洗3次得到AOZ与对醛基苯甲酸的反应物3-(4羧基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(简称CPAOZ，下同)。取CPAOZ 23.4mg溶于DMF 2mL中，搅拌中加入二环己基碳二亚胺(DCC)27.5mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)14.4mg，4℃下磁力搅拌反应过夜。离心后，上清液为A液。称取牛血清蛋白(BSA)170mg溶于0.1mol/L PBS(pH 8.0)10mL中，加入DMF 1mL，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，A液逐滴加入到B液中，密封烧杯，4℃下搅拌反应4h。离心后，取上清液，4℃下用PBS(pH7.4)透析3d，每天更换2次PBS，以除去未反应的DMF、DCC、NHS和CPAOZ小分子物质。最后得到无色CPAOZ-BSA(CPAOZ与牛血清蛋白偶联复合物)溶液，分装保存于-20℃冰箱中，供免疫用。
在上述步骤中，称取卵清蛋白(OVA)150mg与CPAOZ 23.4mg反应即得CPAOZ-OVA(CPAOZ与卵清蛋白偶联复合物)，供包被用。
1.2抗体的制备采用健康雄性体重1.5kg左右的家兔作为免疫动物，以CPAOZ-BSA为免疫原，免疫剂量为0.5～1mg/只。首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫，共免疫6次，免疫期间监测血清抗体效价及特异性。最后一次免疫不加佐剂。在最后一次免疫7～10天后颈动脉放血，收集兔血清，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的AOZ多克隆抗体。
实施例2、呋喃唑酮间接竞争检测方法的建立2.1抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度的确定通过方阵滴定试验确定，以吸光度值约1.0且左右相邻吸光度差值最大的点为参照点。操作步骤在96孔酶标板上的第1行包被2000μg/L的包被原，第2至第8行依次包被1000、500、250、120、60、30、15μg/L的包被原。4℃过夜，1％卵清白蛋白37℃封闭1小时，洗涤2次，拍干，在酶标板的第1列至第9列依次加入100μL稀释倍数为10000、20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000、25600003-氨基-2-恶唑烷酮抗体，第10列加入样本稀释液做空白对照，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干，各孔加入100μL底物显色液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪于450nm波长下测定光密度值(OD值)，结果见表1。
表1本发明试剂盒中抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度的确定
结果表明，抗原最佳包被浓度为250μg/L，抗体最佳上作浓度为1∶320000。
2.2抗体最佳反应体积的确定设置4个抗体与药物的反应体积比(60μL∶40μL、50μL∶50μL、40μL∶60μL、30μL∶70μL)，作间接竞争ELISA，结果见表2。
表2本发明试剂盒中抗体最佳反应体积的确定
结果表明，抗体与药物的反应体积比为40μL∶60μL时，抗体反应最灵敏。
2.3最佳竞争时间的确定间接竞争ELISA法确定最佳竞争时间。设置0.5μg/L、5μg/L、50μg/L 3个药物浓度，竞争反应这一步中，将5块板置于37℃下孵育，经0.5、1、1.5、2、3h分别各取出1块扳，测其OD值，结果见表3。
表3本发明试剂盒最佳竞争时间的确定(n＝5)
结果表明，不同浓度的药物经过1h的竞争反应后，OD值不再上升，说明经过1h竞争反应达到平衡状态，因此最佳竞争时间为1h。
实施例3、本发明呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒的制备3.1本发明酶联免疫检测试剂盒的组成本发明的试剂盒主要由盒体(1)、酶标板(2)、6瓶AOZ标准溶液(3)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体(4)、AOZ抗体液(5)、底物显色A液(6)、底物显色B液(7)、终止液(8)、洗涤液(9)、样品稀释液(10)和泡沫托架(11)组成。
3.2试剂的配制按常规方法制备其中包被稀释液Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000mL，调至pH9.6；封闭液卵清蛋白0.1g溶于pH7.4PBS 100mL；洗涤液NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，KCl 0.2g，吐温200.5mL，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL，调至pH 7.4；样本稀释液NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL，调至pH 7.4；底物显色液(TMB-过氧化氢尿素溶液)其中①底物液A四甲基联苯胺(TMB)200mg，无水乙醇或二甲亚砜100mL，加双蒸水至1000mL；②底物液B缓冲液Na2HPO414.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调至pH5.0～5.4；③将底物液A和底物液B按1∶1混合即成TMB-过氧化氢尿素溶液；终止液18mol/L浓硫酸100mL，缓慢滴加到双蒸水至900mL。
3.3酶标板的制备用包被缓冲液将CPAOZ-OVA稀释成0.5μg/mL，每孔加入100μL，室温过夜或37℃孵育4h，倾去包被液，洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用铝膜真空密封保存、备用。
实施例4、本发明的酶联免疫检测试剂盒的测定程序4.1测定之前注意事项①使用之前将所有试剂回升至室温20～24℃；②使用之后立即将所有试剂放回4℃冰箱；③在使用中不要让微孔干燥；④在免疫分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的冼板顺序操作是免疫测定操作程序的要点；⑤在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。
4.2样品提取净化①取组织均质物1g，分别加入蒸馏水5mL，1mol/L HCl 0.5mL和10mmol/L苯甲醛(甲醇溶液)100μL，充分振荡；②置37℃水浴孵育(大约16小时)③分别加入0.1mol/L K2HPO45mL，高氯酸200μL，剧烈振荡30s，室温4000r/min离心10min；④取出上清液到另一容器，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，准备过MAX柱，分别用甲醇3mL和蒸馏水3mL活化MAX柱，流速控制在1滴/秒，加入上述样品；⑤用2％的氨水溶液3mL洗涤MAX柱，正压吹干，用甲醇溶液3mL洗脱并收集洗脱液，正压吹干以便收集完全；⑥40℃氮气吹干，向吹干后的收集瓶中加入样本稀释液1mL，涡动30s，作为试样溶液，供ELISA方法测定。
4.3试剂配制①酶标二抗工作液配制根据每次所需用量，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体(4)和样品稀释溶液(10)按1∶10的比例稀释，混匀；②AOZ抗体工作液配制根据每次所需用量，AOZ抗体液(5)和样品稀释液(10)按1∶10的比例稀释，混匀；③底物混合液配制根据每次所需用量，显色液A液(6)和显色液B液(7)按1∶1的比例稀释，混匀，现配现用；④洗涤液配制；洗涤液(9)和蒸馏水按1∶10的比例稀释，混匀，置4℃冰箱可保存1月。
4.4测定步骤①取微孔条将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准品和样品做两个平行试验，记下标准品和样品的位置；②加标准液或待测样品加入标准品或处理好的样品液60μL到微孔中，每孔加入样品或标准品时注意更换移液器的吸头；③加抗体加入AOZ抗体工作液40μL到每一个微孔中充分混合，在培养箱孵育1.5小时(37℃)，覆盖上薄膜(防止蒸发)；④洗涤倒出孔中的液体，洗涤3次并拍干；⑤加酶标二抗加入酶标二抗工作液100μL到每一微孔中充分混合，在培养箱孵育1小时(37℃)，覆盖上薄膜(防止蒸发)；⑥洗涤倒出孔中的液体，洗涤4次并拍干；⑦加底物加入底物混合液100μL到每一微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15分钟；⑧终止加入反应终止液50μL到每一微孔中；⑨测定在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，必须在加入终止液后60分钟内读取吸光值。
4.5结果判断所获得的标准品和样品吸光值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光值再乘以100，以抑制率为纵坐标，AOZ浓度的对数为横坐标作标准曲线，曲线在0.1～25μg/L范围内趋近直线，每一个样品的浓度(μg/kg)可以从校正曲线上读出。
实施例5、本发明试剂盒的灵敏度、特异性、准确度、精密度、稳定性试验5.1本发明试剂盒的灵敏度试验以IC50(抑制率为50％对应的药物浓度)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。测定20次标准曲线的IC50值，本发明试剂盒的IC50值为1.26μg/L(表4)。计算20个0μg/L标准液OD值的平均值(X)和标准差(SD)，根据最低检测限公式Z＝X-3SD，在标准曲线上查出标准品最低检测限为0.1μg/L。
表4本发明试剂盒的灵敏度试验
5.2本发明试剂盒的特异性试验以交叉反应率为指标判定试剂盒的特异性。将AOZ与邻硝基苯甲醛衍生物3-(2-硝基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(简称NPAOZ，下同)、AOZ、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、苯甲醛、四环素、磺胺二甲嘧啶、青霉素、链雷素、红霉素、恩诺沙星、克伦特罗等药物配成不同的浓度，用试剂盒测定各药物的IC50值，每个药物3个复孔，计算其交叉反应率(表5)。
表5本发明试剂盒的特异性试验
本发明试剂盒除与NPAOZ(5.73％)、呋喃唑酮(6.13％)有交叉反应，与其他药物无交叉反应，说明本发明试剂盒对PAOZ特异性高，专一性好。
5.3本发明试剂盒的准确度试验将配制好的AOZ母液(1mg/mL)稀释成100μg/L，添加到1g组织(猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝)中使其终浓度为0.4μg/kg、1μg/kg、5μg/kg，每个浓度3个重复，重复5天，按照试剂盒的测定程序，测定各组织中AOZ浓度，并计算回收率和变异系数(表6)。
表6本发明试剂盒的准确度和重复性试验
猪肝、猪肉、鸡肝、鸡肉组织中回收率均在55.8％～96.6％，批间变异系数＜20％，表明本发明试剂盒测定结果准确、可靠，重复性好。
5.4本发明试剂盒的精密度试验按照本试剂盒的操作说明测定标准溶液，每个标准溶液5个复孔，以浓度的抑制率计算变异系数，结果见表7。
表7本发明试剂盒精密度试验
结果表明，本发明试剂盒的板内变异系数＜5％，板内测定结果稳定，精密度高。
5.5本发明试剂盒的稳定性试验将本发明试剂盒放置4℃和20℃条件下保存，于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9月后分别取试剂盒，测定IC50值和最大吸光值，结果见表8。
表8本发明试剂盒的稳定性试验
注“-”表示未测定表8结果显示，本发明试剂盒在4℃保存下，最大吸光值和IC50值均在正常波动范围内。20℃保存下，1个月后，最大吸光值下降到0.6，说明试剂盒中的部分试剂已变质。稳定性试验表明本发明试剂盒在4℃条件下可保存6个月以上。
实施例5、动物喂养试验取15头，45日龄，体重为15.0±2.0kg的品种为“长大”的二元杂交去势健康仔猪，随机分为5组。第1组为空白对照组，其余4组饲喂含100mg/kg的呋喃唑酮7天，于停药0天、7天、14天、28天分别屠宰3头，空白对照组分别在停药0天、7天、28天屠宰1头，取肝脏、肌肉组织。同一份样品分别采用本发明试剂盒和高效液相色谱法(HPLC)测定，结果见表9。
表9本发明试剂盒的适用性试验
停约0天，肌肉和肝脏中AOZ含重为116.9μg/kg、402.2μg/kg，28天后，肌肉和肝脏中AOZ含量为3.6μg/kg、29.2μg/kg，空白肌肉和肝脏的测定值为0.2μg/kg、0.16μg/kg，与仪器方法测定结果一致。测定结果证明了AOZ在体内滞留时间长(超过28天)，并且随时间的变化AOZ浓度逐渐下降。本发明试剂盒能区分加药组和空白对照组，说明本发明试剂盒具有测定实际样品的能力，适用性强，满足呋喃唑酮零残留检测的要求。
权利要求
1.一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的酶标板、试剂，其中的试剂包含洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体、底物显色A液、底物显色B液、终止液，其特征在于，酶标板的每孔内有包被液包被的能与呋喃唑酮残留标示物3-氨基-2-恶唑烷酮特异性抗体结合的包被抗原，试剂还包含3-氨基-2-恶唑烷酮标准溶液和3-氨基-2-恶唑烷酮抗体液，所说的3-氨基-2-恶唑烷酮抗体液是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
2.根据权利要求1所述的一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的包被抗原是由3-氨基-2-恶唑烷酮与对醛基苯甲酸反应，再与卵清蛋白偶联的复合物。
3.根据权利要求1所述的一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的人工免疫原是由3-氨基-2-恶唑烷酮与对醛基苯甲酸反应，再与牛血清蛋白偶联的复合物。
4.根据权利要求1所述的一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的3-氨基-2-恶唑烷酮标准溶液为3-氨基-2-恶唑烷酮与苯甲醛的衍生物。
5.权利要求1所述的试剂盒在呋喃唑酮残留分析中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种适用于呋喃唑酮残留分析的酶联免疫检测试剂盒及其应用，属于免疫化学分析技术领域。本发明所提供的试剂盒主要由3－氨基－2－恶唑烷酮(AOZ)特异性抗体、AOZ标准溶液、包被有AOZ与卵清蛋白复合物的酶标板组成。样品处理经盐酸水解，释放AOZ，苯甲醛衍生过夜，MAX柱净化，采用间接竞争ELISA方法检测动物可食性组织如肝脏、肌肉中AOZ残留。本发明的核心技术包括人工抗原的合成、抗体的制备、ELISA方法的建立、ELISA试剂盒的组装等。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确、廉价的优点，能同时快速检测大批样品，最低检测限0.1μg/kg。
文档编号G01N33/531GK1731185SQ20051008634
公开日2006年2月8日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者袁宗辉, 常超, 王玉莲, 赵春保, 王帅兵, 高爱中, 陈冬梅, 陶燕飞, 伍金娥, 彭大鹏 申请人:华中农业大学