专利名称：用于质谱仪离子源的多入口取样设备的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及质谱仪，更具体地，涉及质谱仪离子源的多入口取样设备，以及包括多入口取样设备的质谱仪离子源、质谱仪系统及其方法和配套工具。
背景技术：
质谱分析(MS)和液相色谱(LC)的组合是可用于化合物分析的最有力的方法之一，并且被广泛地用在化学、环境、制药和生物学研究中。在液相色谱中，含有化合物的混合物的样品在液体流动相中被抽吸通过分离柱。当样品混合物的成分穿过柱时，它们被分离，并且逐个从柱中脱出来。检测器在柱的出口端被连接到流体流，以在成分离开柱时检测它们。
在质谱仪中，化合物在电离源中被使得带正电或者负电。在真空中，所得离子的质量由测量离子质荷(m/z)比的质量分析器确定。当被用作液相色谱的检测器时，质谱仪可以提供关于被色谱分离的每种化合物的分子量和化学结构的信息，使得可以识别混合物的各种成分。
在许多例子中，希望能够使用单个质谱仪来分析来自多个LC柱或者其他液相样品源的多个入口流。具体地说，有时希望在进行分析之前，将已知分子质量的化合物(所谓的“标定标准”、“参考质量标准”或者“内部标准”)组合到所关心的样品中，以提供对样品中分析物的分子质量的更准确的测量。例如，可能希望同时分析来自色谱系统的主液流的构成和含有参考质量标准的区别液流的构成。但是，刚好在电离之前组合两种样品可能会有不理想的分析结果。例如，样品的一些成分可能与样品中的其他成分反应或者抑制其他成分的电离；由于样品可能不是同一类型，所以可能对样品输运和电离有无法预计的效应；以及，如果混合了不相容的样品，则某些成分可能会沉淀或者变得不能溶解。另外，进入电离源的液流可能具有显著不同的流率，并且液流的混合可能会降低色谱分离达到的分辨率。
因此，需要新的手段用于在样品被质谱仪分析之前将它们组合。
发明内容
本发明提供了一种用于质谱仪离子源的多入口取样设备。总的来说，取样设备包括流体上相连接的至少两个样品入口毛细管和单个出口毛细管。在某些实施例中，入口毛细管中的一个的内径大于另一个，并且入口毛细管中较大者可以与出口毛细管同轴对准。还提供了含有该多入口取样设备的质谱仪离子源和质谱仪系统。本发明还提供了用于同时将至少两个样品引入质量分析器的方法。本发明可用于各种分析方法。例如，本发明可用于化学、环境、法医、血液、制药和生物研究应用。具体地说，本发明例如可以被用于蛋白质消化物的质谱分析，包括肽质量指纹(PMF)和蛋白质序列应用、完整蛋白质分析、蛋白质-蛋白质或者蛋白质-配位体非共价络合分析、寡聚核苷酸核核酸分析。
图1A和图1B是根据本发明某些实施例的离子源的多入口取样设备和其他部件的横截面视图。
图2是根据本发明某些其他实施例的离子源的多入口取样设备和其他部件的横截面视图。
图3是根据本发明某些实施例的多入口取样设备的横截面视图。
图4是这里所描述的离子质量分析系统的实施例的示意表示。
图5是示出了使用这里所描述的发明得到的示例性结果的基峰色谱曲线(上部)、质谱(中部)和分子离子曲线(底部)。
图6示出了通过使用这里所描述的发明，通过纳电喷射(nanoelectrospray)LC/API-TOF，在多水平处被分析的牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)胰蛋白酶肽(tryptic peptide)A(437-451)的+3电荷状态的分子离子的第一四同位素峰的示例性质量测量误差结果。
图7示出了使用这里所描述的发明，BSA胰蛋白酶消化物(trypticdigest)的多水平的纳电喷射LC/API-TOF分析所获得的示例性肽质量测量结果。肽离子提取、识别和质量测量结果是使用可购买到的自动质谱数据处理工具和蛋白质数据库搜索软件获得的。
图8是分子离子曲线和表格，其示出了使用这里所描述的发明，在负离子模式中，胰岛素氧化B链的纳电喷射API-TOF分析的示例性结果。
具体实施例方式
本发明提供了一种用于离子源的多入口取样设备。通常，该取样设备包括流体上相连接的两个样品入口毛细管和单个出口毛细管。在某些实施例中，入口毛细管的其中一个的内径大于另一个，并且较大的入口毛细管可以与出口毛细管同轴对准，并且流体上连接到其上。在另一个实施例中，入口毛细管的内径和长度的尺寸被适当地选择，以便以相等或大约相等的速率，独立地取样两个或更多个样品流。还提供了含有多入口取样设备的质谱仪离子源和质谱仪系统。本发明还提供了同时将至少两个样品引入质量分析器中的方法。
这里所叙述的方法可以按照所叙述的事件顺序，以及所叙述的事件的逻辑上可能的任何顺序来进行。此外，在提供了值的范围的情况中，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值，以及在被陈述的范围中的任何其他被陈述的或者中间的值，都被包括在本发明内。
被引用的项目仅因为它们在本发明的申请日之前的公开而被提供。这里没有事物被解释为承认本发明没有资格早于这样的依赖于在先发明的材料。
对单数项目的提及包括这样的可能性，即可能有复数个相同项目出现。更具体地说，如这里以及所附权利要求中所使用的，单数形式“某个”、“一个”、“所述”和“该”包括复数个所指物，除非上下文中另行清楚地规定。还应该注意，权利要求可能被起草为排除任何可选元素。照此，该陈述被用来作为使用与权利要求元素的叙述相结合的诸如“仅”、“只”等的排他用语或者使用“否定”限定的前提基础。
多入口取样设备这里所描述的发明涉及可以在质谱仪的多喷射器离子源中采用的多入口取样设备。一般地说，该设备是离子源的一部分，并且作为处于或接近环境压力的电离源与低于环境压力的中间区域之间的界面。在某些实施例中，例如，多入口取样设备有助于在离子从离子源经由采集毛细管或者其他含管口元件被输运到质量分析器之前，组合离子。多入口取样设备含有多个(即，至少两个)样品入口毛细管，它们汇合在一起形成单个毛细管，这里被称作“样品出口毛细管”。如后面将更详细描述的，两个或更多个样品可以被引入入口毛细管(通常每个毛细管一个样品)，当样品被输运通过设备时，它们被混合，并且经由处在接近或者刚好低于环境压力的压力下的单个出口毛细管引出。出口毛细管的引出管口可以出现在离子源内，并且在离子源工作期间可以处于或者接近环境压力。
多入口取样设备使得可以实现这样的组合样品的方法，所述方法避免了被电离和/或未被电离的溶质和溶剂之间可能是抑制作用的分子相互作用和喷射干扰。在某些实施例中，该设备可以被用来组合样(例如，所关心的样品和含有参考质量标准的样品)，而在分析之前不显著增加所关心的样品的体积，不抑制所关心的离子，并且不显著稀释被电离的样品中所关心的离子。另外，该设备容易在环境压力下安装，而不用对质谱仪抽气。因此，本发明避免了与现有技术取样设备相关的许多问题，并且因此对分析领域作出显著的贡献。
参考附图可以最容易地描述多入口取样设备的各种特征。如本领域技术人员将清楚的，多入口取样设备可以含有多个(即，多于两个，例如三个、四个或者五个或更多)入口样品毛细管。但是，为了易于描述，图中所示的设备具有两个样品入口毛细管。图中所示的设备可以容易地适应更多的毛细管，以便适应更多样品。图中所示的设备还可以容易地适应微流(microflow)和纳流(nanoflow)电离设备(例如，喷射设备)。
图1A示出了用于质谱仪离子源的示例性多入口取样设备。图1A所示的设备含有第一和第二样品入口毛细管b和c，以及单个入口毛细管f。每个毛细管在设备的外表面上分别具有单个端口(即，开口或者管口)d、e和g，其中用于入口毛细管的端口(即，d和e)在这里被称作入口端口，用于出口毛细管的端口(即，g)在这里被称作出口端口。所有毛细管的内腔在区域h中接合，即汇合，以提供毛细管之间的流体连接。“流体连接”意思是气体或者流体(包括其中携带的任何组分，例如，离子或者诸如带电或者不带电液滴的微滴)可以进入两个样品入口毛细管的内腔，并通过两个样品入口毛细管的内腔被输运，并且在对样品出口毛细管的出口施加了真空或者局部真空时，就可以进入样品出口毛细管的内腔。
在许多实施例中，毛细管是直的(即，不是曲线、弯曲、成角度或者不规则的)，但是，在其他实施例中，毛细管是曲线的。在某些实施例中，第一样品入口毛细管d与样品出口毛细管f前后同轴对准，使得第一样品入口毛细管和样品出口毛细管形成连续的直线管(除了区域h之外，在该区域h中，第二样品入口毛细管与该管汇合)，该直线管将设备的一侧连通到另一侧。在第一样品入口毛细管与样品出口毛细管前后同轴的实施例中，第二样品入口毛细管一般以相对于毛细管纵轴的角度k与毛细管的接头汇合。角度k通常小于90°。例如，角度k可以是从15°到60°，或者在某些实施例中，从25°到50°。在某些实施例中，入口毛细管在多入口取样设备内部汇合，并且出口毛细管长度可以是0.1cm到10cm，例如，长度为0.2cm到3cm，或者0.3cm到2cm。在某些实施例中，入口毛细管可以在多入口取样设备的表面汇合。
在某些实施例中，第二样品入口毛细管具有比第一样品入口毛细管小的内腔直径，即内径，并且因此具有比第一样品入口毛细管低的气体流率(假设毛细管是等长的)。在这些实施例中，第二样品入口毛细管的内腔直径小于或者等于第一样品入口毛细管的内腔直径的约70％。例如第二样品入口毛细管的内腔直径可以小于第一样品入口毛细管的内腔直径的大约60％、50％、40％、30％、20％或者10％，并且一般大于第一样品入口毛细管的内腔直径的大约5％、10％或者20％。因此，在某些实施例中，如果第一样品入口毛细管内腔直径为0.5mm到0.8mm，则第二样品入口毛细管内腔直径可以为200μm到425μm，或者更小。在具体的实施例中，第一样品入口毛细管内腔直径大约0.8mm，第二样品入口毛细管内腔直径可以为大约330μm(22口径)或者410(23口径)。
第二样品入口毛细管长度可以长于、短于或者等于第一样品入口毛细管。在某些实施例中，第二毛细管的长度可以是第一入口毛细管长度的大约30％、50％、70％、80％、90％、100％或者150％。
使用中，第一和第二样品入口毛细管的内腔直径的差异提供了第二样品入口毛细管相比于第一样品入口毛细管的被降低的气体流率。在许多实施例中，第二样品入口毛细管的气体流率小于第一样品入口毛细管流率的大约20％，例如小于约15％、约10％、约5％、约3％、约2％并大于约1％。例如，当第一入口毛细管的长度是第二样品入口毛细管的两倍时，内腔直径330μm和410μm的第二样品入口毛细管的流率分别是内腔直径约0.8mm的第一样品入口毛细管流率的大约1/17和大约1/7。通常，第二样品入口毛细管的直径被最小化，但不将气流限制到使得通过毛细管的离子不可检测的程度。在某些实施例中，样品出口毛细管的气体流率可以在大约0.5升/分钟和大约3升/分钟之间，然而在某些应用中也通常使用更大或者更小的气体流率。换句话说，毛细管直径可以根据取样设备的希望的应用而被调整。由于被引入多入口取样设备的样品的流率可以不同，所以用于这些样品的入口毛细管的直径可以不同。例如，液体样品流中的一个的流率可以低至20纳升/分钟，而另一个液流的流率可以高很多，例如300纳升/分钟。换句话说，入口毛细管的内径和长度可以被选择以适应输入样品流的流率。
在某些实施例中，第一样品入口毛细管的内腔直径与第二样品入口毛细管的内腔直径相同，并且因此，假设这些毛细管的长度相同，则通过这些毛细管的气体流率将相同。
在具体感兴趣的某些实施例中，多入口取样设备还包括至少一个逆流干燥气体喷嘴，即用于向离子源中的样品喷射区域输送干燥气体以帮助样品去溶剂化的元件，干燥气体通常是被加热的高纯度的氮气。如图2所示，这样的喷嘴通常将干燥气体26引导至样品入口毛细管的入口附近的位置。在某些实施例中，多入口取样设备含有用于设备的每个样品入口毛细管的逆流干燥气体喷嘴。但是，在某些实施例中，只有第一样品入口毛细管可以与逆流干燥气体喷嘴相关联。喷嘴通常包括围绕样品入口毛细管进口的内部元件或“锥”以及外部元件或“锥”。干燥气体通过喷嘴在入口毛细管中的离子流的逆向方向(即，反方向)上被输送，并在样品进入入口毛细管之前和在进入入口毛细管的期间，帮助样品的去溶剂化。在图2所示的实施例中，干燥气体被提供到刚好在两个入口毛细管外侧的区域中。由于不同的样品可能要求不同水平的干燥气体来帮助去溶剂化，所以可以使用气体调节元件(例如，限流器)来调节通过喷嘴的干燥气体的气流。在某些实施例中，气体调节元件可以是穿孔的项圈(例如，带膛孔(即孔)的环)，其配合到喷嘴中，以调节通过喷嘴的气流。例如通过用另一个具有更大、更小、更多或更少穿孔的项圈来替换项圈，通过喷嘴的干燥气体的量可以被改变。每个喷嘴都可以具有调节元件，多入口取样设备的每个喷嘴中的调节元件可以允许不同量的干燥气体从设备的各个喷嘴引出。如果使用大气压化学电离(APCI)、大气压光致电离(APPI)或者电子碰撞方法来产生样品电离，则相比于通过其他方法电离的样品，可以向被电离的样品提供较少的干燥气体。在某些实施例中，为了帮助去溶剂化，可以通过除了逆流干燥气体喷嘴之外的其他方式，向在多入口取样设备的一个或多个(或者全部)入口毛细管的进口附近的电离区域提供热量。相应地，可以通过除了逆流干燥气体之外的其他方式，将样品去溶剂化，而在多入口取样设备中不需要任何逆流干燥气体喷嘴。例如，在本发明的某些实施例中，经加热的干燥气体可以通过与样品设备分立的毛细管(例如，可以被加热的经加热陶瓷或者石英管)被提供给由喷射器产生的微滴，并瞄准含有样品微滴的区域。在这些实施例中，所采用的喷射器可以是电喷喷雾器，其利用经加热的氮气来使样品雾化。这样的喷雾器的流率可以到1毫升/分钟或者更大。在其他实施例中，热量可以被辐射到由喷雾器产生的微滴上(例如，使用石英红外线(IR)加热器)，这样，样品可以被去溶剂化，而不需要经由逆流喷嘴提供的干燥气体。相应地，虽然多入口取样设备的每个入口毛细管的管口可以与逆流干燥气体喷嘴相关联，但是具有不与逆流干燥气体喷嘴相关联的入口毛细管的设备是可行的，并且可以容易地用作离子源的部件。
在某些实施例中，多入口取样设备的样品出口毛细管可以适于连接到传输毛细管(图1B的元件4)的管口，使得传输毛细管的内腔与样品出口毛细管的内腔流体上相连接。传输毛细管的内腔直径通常等于或者小于多入口取样设备样品出口毛细管的内腔直径。在许多实施例中，传输毛细管的长度在5cm和30cm之间，例如大约18cm，并且用来输运离子，并辅助从出口毛细管在大约是或者刚低于环境压力6(近似500～760托)下被引出到例如1～10托的中间真空室2的离子簇的去溶剂化。因此，多入口取样设备通常不直接与真空区域物理连接。随着离子沿传输毛细管被输运，在被引出样品出口毛细管并进入传输毛细管时，它们经历从大约环境压力开始的压力下降，在它们被引出传输毛细管时，降到小于约10托，例如2～3托。被电离的样品在接近或者刚低于环境压力的压力下被组合，而不是在真空中。传输毛细管通常由例如玻璃的电介质材料制成，但是也可以预想到传输毛细管由例如金属的其他材料制成。随着样品穿过传输毛细管，样品可以进一步被去溶剂化。如图2中的元件27所指示的，在某些实施例中，传输毛细管的与多入口取样设备相耦合的一端可以被涂(电镀或者溅射)金、铂、铑或者适合的抗腐蚀金属或者合金。在某些实施例中，传输毛细管可以被加热。
在某些实施例中，多入口取样设备可以适于连接(即，可连接)到含管口元件(代替传输毛细管)，使得出口毛细管的内腔与管口在流体上连接，允许被电离的样品在被引出设备时通过该管口。多入口取样设备可以连接到质谱仪系统的离子源的壁中的管口。该管口可以是处在将离子源与质谱仪系统的第二室(例如，真空级)分开的壁中。在这些实施例中，离子可以经由设备的出口毛细管被引出多入口取样设备，穿过该管口，并进入第二室。第二室可以包括引起分析物离子(相对于较轻的溶剂离子和气体)浓缩的分离器(skimmer)，并提供离子输运手段(由于两个邻接区域之间的压差)和其他离子输运设备，例如多极离子导向器等，用于将离子输入穿过第二室。在这些实施例中，室壁可以是带双壁的室或者“带屏(curtained)”的室，并且干燥气体可以被抽入壁之间的空间中。
包括任何喷嘴的多入口取样设备的主体可以由任何适合的材料制成。适合的材料通常是耐腐蚀的，并且可以经受住适度热量而不放气。适合的材料可以用作电极，并且可以被制造(例如，机加工)为上述的规格。相应地，多入口取样设备的主体可以由诸如不锈钢或者超级合金(superalloy)之类的合金制成，但是也可以容易地使用其他材料。例如热塑性聚酰亚胺VESPELTM和聚醚醚酮(polyethereketone，PEEK)的高温绝缘体可以被用来隔离紧密接近的电压。样品入口和/或出口毛细管可以由诸如不锈钢之类的合金制造，但是，假设离子可以通过电势被吸入它们相应的入口，也可以使用玻璃衬里(石英)不锈钢、PEEK或者其他相容的材料。
如上面所叙述的，许多多入口取样设备的特征在于它们被配置为可操作地连接到离子源的传输毛细管。因此，多入口取样设备可以包括匹配区域，其确保配合，即稳固地将取样设备结合到传输毛细管上，例如使得出口毛细管与传输毛细管对准，如上所述。需要的话，可以在将取样设备匹配到传输毛细管上时，采用密封元件。由于在其中采用多入口取样设备的质谱仪系统的工作期间，出口毛细管的引出管口接近或者刚好低于环境压力，所以多入口取样设备可以被分离和重新附接，或者用第二多入口取样设备或者其他取样设备替换，而不用对多入口取样设备(或者其他任何与其附接的传输毛细管)所馈入的设备附近的任何室进行抽气。
在代表性的实施例中并且在图3所示的方向上，多入口取样设备具有从约1cm到约5cm的总高度，例如从约2cm到约4cm；从约1cm到约约5cm的总宽度，例如从约2cm到约4cm；以及从约1cm到约5cm的总深度，例如从约2cm到约4cm。
质谱仪离子源本发明还提供了一种含有多入口取样设备的质谱仪离子源。通常，离子源包括用于上述取样设备的每个样品入口毛细管的喷射器。含有多入口取样设备的示例性离子源被示出在图1B中。图2示出了与图1B所示的相同的离子源，除了多入口取样设备含有逆流干燥气体喷嘴之外。
样品喷射器是本领域中常见的，并且通常包括纳喷射器(具有大约20～500纳升/分钟的流率，例如，20～80纳升/分钟，或者100～500纳升/分钟)、微喷射器(具有大约1～50微升/分钟的流率，例如，4～20微升/分钟)和其他流率在纳喷射器和微喷射器之间的喷射器。示例性喷射器设备(该术语包括喷雾器)可以在电喷电离(ESI)、APCI和APPI离子源以及各种其他类型的离子源中找到。在特定的实施例中，设备中所使用的样品喷射器可以具有280～320纳升/分钟的流率，尤其是如果采用内径75μm的LC柱。同样如本领域中所公知的，离子源可以包括电喷电离(ESI)设备、大气压化学电离(APCI)设备、大气压光致电离(APPI)设备，或者它们的任何组合(用于提供所谓的“多模式”电离源)。离子源可以包括任何一种类型的样品喷射器，或者不同类型的样品喷射器的混合。所感兴趣的喷射器包括PICOTIPTM喷射器、具有集成喷射嘴的微制造“芯片”设备以及微流喷射器。在某些其他实施例中，流率至20微升～5毫升/分钟(例如，大约1毫升/分钟)的较大流喷射器可以用在多入口取样设备中。
参考图1B，可以使用任何适合的电离方法来电离流体流中的样品，只要从每个流体流产生的离子能够进入入口11和12，并且不交叉污染，即，喷射物并不相交。因此，样品喷射器彼此间距开，以避免所产生的喷射物之间的交叉污染(即，由于喷射干涉造成的任何物理或者化学损害)。在某些实施例中，喷射器11和12是使用电喷方法进行电离的同轴气动喷雾器。在这些喷射器中，在空心针一端的高电场梯度在流体流被引出针的时候使流体流的表面带电，并且具有高流率的惰性气体通过围绕针的空心外管，以辅助液体的雾化。其他可能的电离方法包括大气压化学电离(APCI)、大气压光致电离(APPI)以及感应耦合等离子体(ICP)电离。
图1B所示的离子源示出了喷射器8和14被布置为与它们各自的入口毛细管的纵轴成近似90°角，即，与其垂直。但是，如本领域公知的，喷射器也可以以其他角度定位，例如包括180°，或者其间的任何角度(参见美国专利No.6,649,908)。喷射器可以围绕用于该喷射器的入口毛细管的纵轴旋转。在某些实施例中，喷射器可以直接瞄准样品入口毛细管的进口。
离子源也可以可选地含有一个或多个电极10，以帮助将离子输运到样品入口毛细管中。电极电压可以依赖于所使用的取样设备(以及对其施加的电压)以及所研究的离子的电荷(即，它们是带正电和是带负电)而很大程度地变化。这样的电极是本领域中常见的，这里不需要进一步详细地描述。
在上述的某些实施例中，多入口取样设备可以包括用于向一个或多个入口毛细管的(一个或多个)管口的附近区域提供干燥气体的喷嘴(如图2中的箭头所示)。在这样的实施例中，参考图2，多入口取样设备的外部元件28(“外锥”)可以处于与设备的内部元件29(“内锥”)的电压不同的电压。如果所研究的是带正电的离子，则内部元件可以具有幅度比外部元件电压大的电压(例如，比其大-400V到-600V，或者相对其约-500V)。类似地，如果所研究的是带负电的离子，则内部元件可以具有幅度比外部元件电压大的电压(例如，比其大+400V到+600V，或者相对其约+500V)。在某些实施例中，所采用的电压的幅度范围可以从1.3kV到3.0kV，例如1.7kV到2.5kV。内部和外部元件可以彼此电绝缘。如果在具有含有逆流干燥气体喷嘴的多入口取样设备的离子源中采用电极，则电极通常采用与喷嘴的外部元件电压相同或者近似的电压(即，依赖于所研究的离子的极性，内部喷嘴元件的正的或负的400V到600V的电压)。
如果感兴趣的是带正电的离子，则多入口取样设备的入口管口因此可以处于例如-1.7kV到-2.5kV，并且其相应的样品喷射器可以处于或者接近地电势。如果在多入口离子源中采用一个或多个附加的电极(例如，图1B所示的设备中的电极10)，则它们可以处于或者接近与外部元件相同的电压(例如，-1.3kV到-2.1kV，或者幅度比内部元件低约400～600伏特)。类似地，如果感兴趣的是带负电的离子，则多入口取样设备的入口管口可以处于例如+1.7kV到+2.5kV，并且其相应的样品喷射器可以处于或者接近地电势。如果在多入口离子源中采用一个或多个附加的电极(例如，图1B所示的设备中的电极10)，则它们可以处于或者接近与外锥相同的电压(例如，+1.3kV到+2.1kV)，或者幅度比锥的内部元件低约400～600伏特。或者，可以采用相反的电场几何构形，其中喷射器被保持在高电压(例如，幅度为1.5kV到6.0kV)，并且入口毛细管被保持在地电势或者接近地电势。两种几何构形都提供了将特定极性的带电离子朝向设备的入口管口移动的净电压电势。
图3示出了根据本发明的多入口取样设备的代表性实施例。图3所示的设备包括如上所述的第一入口毛细管102、第二入口毛细管104和出口毛细管106，并适于通过元件107连接到另一含管口的元件，例如传输毛细管。图3所示的设备包括内部元件108(也被称为“内锥”)和外部元件110(也被称为“外锥”)，它们通过绝缘体元件111和120彼此电绝缘(并互相保持相对位置)。第二入口毛细管与内部元件108电连接，并与外部元件110绝缘。第二入口毛细管104可以通过护套114保持在设备中的位置。元件111和120可以是围绕元件108和114并将它们保持到位的项圈。如参考标号118所指示的，护套114可以包括至少一个缝隙(例如，孔)，以允许干燥气体从中通过。护套114可以经由附接元件112被附接到设备上，在某些实施例中，附接元件112可以是螺纹等。护套元件114是可以从多入口取样设备拆卸的，并且可以经由附接元件112重新附接到设备上。包含不同口径入口毛细管的护套元件可以使用附接元件112在多入口取样设备中互换。护套元件112可以通过例如摩擦配合的任何类型的配合被连接到入口毛细管104。在具体的实施例中，护套114可以是金属的，并且可以电连接到外部元件110。在这些实施例中，第二入口毛细管104可以电连接到内部元件108，并与护套114绝缘。但是在另外的实施例中，元件114和108可以彼此电连接。
使用中并且如上所述，多入口取样设备的外部元件110可以被维持在比内部元件108的电压高或者低(依赖于所研究的离子)的电压(例如，高出或者低出400V到600V)，以便优先地将离子吸向入口毛细管。如箭头所示，干燥气体116进入设备，并移动通过传导元件，以在正好与入口毛细管的管口相邻的位置从设备引出。在某些实施例中，绝缘体元件111含有膛孔(即，从元件的一侧到另一侧的孔或者缝隙)，以允许(和调节)到第一入口毛细管管口的气流。干燥气体116经由一个或多个膛孔(即，孔)118进入毛细管104与护套114之间的空隙，并在入口毛细管104的管口处被引出。
质谱仪系统本发明还提供了一种含有上述离子源的质谱仪系统。示例性的质谱仪系统示出在图4中。通常，质谱仪系统包括如上所述的含有至少两个电离设备42和46以及多入口取样器50的离子源44，和质量分析器58。如本领域中常见的，离子源与质量分析器通过一个或多个中间真空室54被分开，离子经由上述传输毛细管52(或者在另外的实施例中，经由分隔室的壁中的管口)从离子源44进入这些中间真空室54。同样如本领域中常见的，中间真空室还可以包括分离器56，以在从传输毛细管引出的离子束进入离子传输光学器件(例如，离子导向器等)之前，浓缩离子束中所含的分析物离子(相对于溶剂离子和气体)，其中离子传输光学器件通向高真空中的质量分析器58。
各种不同的质量分析器可以作为上述系统的一部分，包括飞行时间(TOF)、傅立叶变换离子回旋加速器谐振(FTICR)、离子阱、四极或者双聚焦磁电扇形区质量分析器或者它们的任何混合。
在某些实施例中，质谱仪系统的离子源可以连接到用于向样品喷射器提供液流的设备40和48。在许多实施例中，这些设备中的至少一个是分析分离设备，例如包括高性能液相色谱(HPLC)、微液相色谱或纳液相色谱和超高压液相色谱(UHPLC)设备的液相色谱(LC)、毛细管电泳(CE)或者毛细管电泳色谱(CEC)设备，但是，也可以使用任何手动或自动注入或分配泵系统。在具体的实施例中，液流可以例如通过纳泵或者微泵提供。
使用中，离子源44被保持在环境压力，中间室54被保持在比环境压力低两个数量级的压力处，并且质量分析器58被保持在比中间室的压力低两到四个数量级的压力处。离开第一和第二样品喷射器42和46的离子分别被引导向或者吸向多入口取样设备的第一和第二样品入口毛细管61和63，在此它们进入各自的毛细管，并且在处于或者接近环境压力的压力下在多入口取样设备中被组合，并经由样品出口毛细管65从设备中引出(接近或者刚低于环境压力)。被组合的离子进入传输毛细管52，并由于离子源44与室54之间的压差，在气体流中被带入第一真空室54。离子从传输毛细管52引出，并经过分离器56(以及存在的任何离子导向器、离子束成形或者聚焦透镜)，以将离子聚焦并引导到质量分析器58中。质量分析器58确定离子的m/z比，这对确定样品中的分析物的分子量是有用的。
在示例性的实施例中，含有感兴趣样品的第一液体通过诸如LC之类的分析分离设备被提供到离子源的第一样品喷射器42。含有溶解在例如有机溶剂的适当溶剂中的参考质量标准的第二液体被连续抽入第二样品喷射器46。两种液体作为连续的流被供给它们各自的样品喷射器，并从而被电离。第一和第二被电离的样品分别流入第一和第二样品入口毛细管61和63，并且在多入口取样设备50中被组合在一起，经由传输毛细管52和分离器56被带入第一真空室54，通过可能存在的离子导向器和/或任何束成形光学器件被输运，然后被上述质量分析器58分析。如果使用了含有不同大小样品入口毛细管的多入口取样设备，则含有参考质量标准的样品通常进入两个毛细管中的较小的那个。
本发明在样品质量分析的方法中有用，其中样品可以是任何液体材料(包括被溶液化或者被溶解的固体)或者是通常但非必须地溶解在溶剂中的多种材料的混合物。样品通常含有一种或多种感兴趣的成分。样品可以取自多种来源，例如食品、环境材料、诸如从对象(例如，植物或者动物对象)分离出的组织或流体之类的生物样品，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、精子、淋巴液、外表皮、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼泪、唾液、奶水、血细胞、肿瘤、器官，以及体外细胞培养物的样品(包括但不限于细胞培养基中细胞生长得到的条件基、推定被病毒感染的细胞、重组细胞以及细胞成分)，或者其任何生化物碎片。术语“样品”还包括含有标定标准或者参考质量标准的样品。
在许多实施例中，这些方法涉及a)如上所述，在含有多入口取样设备和用于每个入口的样品喷射器的离子源中电离至少两种样品，b)将被电离的样品引入入口毛细管，c)在大约环境压力下在所述取样设备中组合被电离样品，以及d)经由传输毛细管或者诸如室壁中的管口之类的其他手段，将组合后的被电离的样品同时引入第二室，例如中间真空的室。
本发明使得能够直接将参考质量标准添加到感兴趣的样品中，使得感兴趣的样品中的成分的分子质量和碎片可以以高的质量精度被确定。因此，本发明可以应用于各种质量分析确定，包括肽或者蛋白质消化物的络合混合物的分析、完整蛋白质或者其络合物的分析，以及核酸分析等。在某些实施例中，参考质量标准可以采用可购买到的纳流输送组件(例如，注射泵)，单独地或者以范围大约0.1～1微摩尔的浓度以混合物提供(例如，输送或者喷射)。
在一个实施例中，Zorbax 300SB-C18，3.5μm，50×0.075mm内径毛细管柱，可以被用于流率300纳升/分钟的蛋白质消化物的纳喷分析，Zorbax 300SB-C18，5μm，250×0.3mm内径毛细管柱，可以被用于流率4.5微升/分钟(微流)流率的蛋白质消化物的分析。
配套工具还提供了与本发明一起使用的配套工具。这些配套工具含有多种组成(包括上述的多入口取样设备)中的任何组成。配套工具还可以包含用于在多喷射器离子源中安装多入口取样设备的操作说明、用于改型具有多入口取样设备的多喷射器离子源的操作说明，或者用于执行上述方法中的任何方法的操作说明，其中，操作说明通常存在于与配套工具相关的载体上，例如一张或多张纸。配套工具还可以包括一个或多个参考质量标准，其在某些实施例中可以作为混合物存在或者存在于分别的瓶子中。
除了上述组成之外，配套工具还可以包括用于使用配套工具的组成以执行方法的操作说明。例如，还可以包括关于参考质量标准的信息(例如，化合物的分子量或者化合物的特性)。
用于执行方法的操作说明通常被记录在适当的记录介质上。例如，操作说明可以被打印在载体上，诸如纸张或者塑料等。这样，操作说明可以作为在对配套工具或其组成的容器等贴标签时(即，与包装或者子包装有关)的包装插入物呈现在配套工具中。在其他实施例中，操作说明呈现为存在于适当的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件，这些介质例如是CD-ROM、磁盘等。在另一些实施例中，实际操作说明没有存在于配套工具中，而是提供用于例如经由因特网从远程源获得操作说明的手段。该实施例的一个示例是包括网络地址的配套工具，从该网络地址可以查看操作说明和/或从该网络地址可以下载操作说明。如操作说明一样，用于获得操作说明的这种手段可以被记录在适当的载体上。
实验下面例子被提出，以向本领域普通技术人员提供关于如何实现和利用本发明的某些实施例的说明，而不是意图限制发明人所认为的他们的发明的范围。
例1图5示出了结合大气压纳电喷电离源(改进的Agilent G1982B)以及飞行时间质量分析器(Agilent G1969API-TOF)一起使用多入口取样设备所获得的示例性的正离子模式结果。上部的曲线是基峰色谱图，其标识了多种从50飞摩尔牛血清白蛋白(BSA)胰蛋白酶消化物(MichromBioresources，Aubum，CA)的分析中获得的提取的肽离子。冻干的消化物在使用前在具有1％甲酸的95∶5(体积/体积)水/乙腈中复原。
Agilent Technologies 1100系列纳流LC系统(Agilent，Little Falls，DE)提供溶剂输送和分离。50飞摩尔的BSA消化物被加载到Zorbax300SB-C18柱(Agilent)，内径50mm×0.075mm，粒子直径3.5μm，孔径300埃，保持在30℃。在以300纳升/分钟流动的流动相A(具有0.1％(体积/体积)甲酸的水)平衡之后，由具有1％(体积/体积)甲酸的乙腈构成的流动相B被用于通过流动梯度从柱洗脱肽以5％B洗涤和平衡6分钟，递进到20％B，19分钟内上升到65％B，保持10分钟，然后10分钟内上升到80％B。柱然后以5％流动相B重新平衡。
LC洗脱物经由喷射器1被引入到主入口附近。喷射器1和主入口对应于图1A和图1B所示的设备中的第一样品喷射器和第一入口毛细管。在95∶5(体积/体积)乙腈/水中含有两种参考质量标准(浓度0.1～1.0微摩尔)的溶液经由喷射器2被引入到第二入口附近。喷射器2和第二入口对应于图1A和图1B所示的设备中的第二样品喷射器和第二入口毛细管。Cole-Parmer 74900系列注射泵(Vernon Hills，IL)被用于以100纳升/分钟的流率注入参考质量溶液。喷射器1和2使用具有8μm尖端内径的熔融石英PicotipTM发射器，设备号FS360-50-8-D-5(New Objective，Woburn，MA)。
居中的曲线是在16.75分钟处洗脱的BSA胰蛋白酶肽，即具有氨基酸序列KVPQVSTPTLVEVSR的残留物A(437-451)的质谱。547.3183处示出的峰代表肽的单同位素分子离子的测得(即，观察到的)质量。括号中示出了理论(即，计算的)值。质谱中另外两个示出的峰对应于参考质量离子，它们分别具有质荷比1221.9906和质荷比2421.9140的理论质量。由数据系统使用参考离子质量测量，以通常实时地调整质量轴的标度。底部的曲线示出了分辩力10,000的相同BSA胰蛋白酶肽A(437-451)的+3电荷状态的分子离子曲线。
图6包含在多水平(柱上5-250飞摩尔)处被分析的BSA胰蛋白酶肽A(437-451)的+3电荷状态的第一四同位素峰的质量测量误差(单位ppm)的表格。结合大气压纳电喷电离源(改进的Agilent G1982B)以及飞行时间质量分析器(Agilent G1969 API-TOF)一起使用的多入口取样设备被用于分析上述样品。
图7示出了使用结合大气压纳电喷电离源以及飞行时间质量分析器一起使用的多入口取样设备，在多浓度水平对BSA消化物分析所获得的示例性结果。BSA消化物以250、100、50、20、10和5飞摩尔的水平被分析，并且在表格中报告了多种胰蛋白酶肽的质量测量误差(单位ppm)，其中胰蛋白酶肽通过可从Millenium Pharmaceuticals，Cambridge，MA得到的自动谱数据提取软件和蛋白质数据库搜索工具(SPECTRUMMILLTM)被标识出。
注意，对于250飞摩尔水平的BSA胰蛋白酶消化物分析，三种肽的质量测量误差值没有被SPECTRUMMILLTM软件报告，但是，这些肽在样品处于可检测的水平。丢失的肽分子离子被手动提取，并报告如下对在250飞摩尔水平被分析的未报告的BSA胰蛋白酶肽的手动确定的质量测量误差(单位ppm)
*该分子离子物的大的质量测量误差很可能是由于两个因素造成的在低m/z处较差的质量轴校正，和较高的电荷状态(+4)。
聚二甲基环硅氧烷(Polydimethylcyclosiloxane)(5元)是常见的系统背景致染物，其离子(质荷比371.101233)与两种参考质量标准一起使用(经由喷射器2共同引入第二入口毛细管)，以在数据采集期间调整质量轴。在该情况中，由于致染物导致的弱的信号有时造成在低质荷比处的低精度质量测量。如这里所描述的，低质量参考质量标准与一种或多种中到高质量参考质量标准的共同引入通常将在全部质量范围上产生具有改善的质量精度的测量。
参考图7，肽分子离子的在50飞摩尔或者低于50飞摩尔水平的其他未报告的质量测量值可能归因于它们的在实际检测限值以下信号。
图8示出了使用结合大气压纳电喷电离源(改进的Agilent G1982B)以及飞行时间质量分析器(Agilent G1969 API-TOF)一起使用的多入口取样设备，所获得的示例性负离子模式结果。100微克的冻干的牛胰岛素氧化B链得自Sigma-Aldrich Fine Chemicals(St.Louis，MO)，并且在具有1％甲酸的95∶5(体积/体积)水/乙腈中复原。Agilent Technologies 1100系列纳流LC系统(Agilent，Little Falls，DE)提供溶剂输送和分离。1.0皮摩尔的肽被加载到Zorbax 300SB-C18柱(Agilent，Little Falls，DE)，内径50mm×0.075mm，粒子直径3.5μm，孔径300埃，保持在30℃。在以300纳升/分钟流动的流动相A(具有0.1％(体积/体积)甲酸的水)平衡之后，由具有1％(体积/体积)甲酸的乙腈构成的流动相B被用于通过流动梯度从柱洗脱肽以10％B洗涤并和平衡5分钟，15分钟内上升到65％ B，保持5分钟，然后上升到80％ B，并保持10分钟。柱然后以10％流动相B重新平衡。LC洗脱物和参考质量溶液以上述相同的方式被引入。
上部的图线是分辩力12,500下的肽-2电荷状态的分子离子曲线。下面的图由分子离子的-2和-3电荷状态的第一四同位素峰的肽质量测量误差(单位ppm)的表格构成。
如先前所述，(由到达相应的中性参考质量标准的甲酸脂加合所形成的)两种参考质量阴离子(理论质量为质荷比1265.9816和质荷比2465.9049)被数据系统利用，以实时调整质量轴标度。
从上述结果和讨论来看明显的，本发明提供了用于为质量分析组合样品的重要手段。因此，本发明对现有技术作出了显著贡献。
本发明说明书中所引述的全部公开和专利通过引用结合于此，就如同每个单独的公开或者专利被具体和单独地指示为通过引用被结合。对任何公开的引述都是对于其在申请日之前的公开而言，而不作为承认本发明没有资格先于依赖在先发明的这样的公开。
虽然已经参考本发明特定的实施例描述了本发明，但是本领域的技术人员应当理解，可以作出各种改变，并且可以用等同物替换，而不脱离本发明的真实精神和范围。此外，可以作出许多修改，以使特定的情形、材料、物质组成、工艺、工艺步骤或者多个步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这样的修改都将落入所附权利要求的范围内。
权利要求
1.一种用于环境压力离子源的多入口取样设备，包括具有第一离子进入端口的第一样品入口毛细管；具有第二离子进入端口的第二样品入口毛细管；和具有离子引出端口的单个的样品出口毛细管；其中，所述毛细管流体上相连接，并且所述端口在所述环境压力离子源的操作期间处于或者接近环境压力。
2.根据权利要求1所述的多入口取样设备，其中，所述多入口取样设备适于连接到传输毛细管。
3.根据权利要求1所述的多入口取样设备，其中，所述多入口取样设备适于连接到所述离子源的壁中的管口。
4.根据权利要求1所述的多入口取样设备，其中，所述第二样品入口毛细管的内径小于所述第一样品入口毛细管的内径。
5.根据权利要求1所述的多入口取样设备，其中，所述第二样品入口毛细管具有比所述第一样品入口毛细管的样品流率至少低10倍的样品流率。
6.根据权利要求1所述的多入口取样设备，其中，所述第二入口毛细管的内径是所述第一样品入口毛细管的内径的至少一半。
7.根据权利要求1所述的多入口取样设备，其中，所述第二样品入口毛细管具有约0.2毫米到约0.4毫米的直径，并且所述第一样品入口毛细管具有约0.6到约0.8毫米的直径。
8.根据权利要求1所述的多入口取样设备，其中，所述第一样品入口毛细管和所述单个出口毛细管同轴直通串联，并且所述第二样品入口毛细管与其成角度。
9.根据权利要求1所述的多入口取样设备，还包括用于至少一个所述样品入口毛细管的逆流干燥气体喷嘴。
10.一种质谱仪环境压力离子源，包括多入口取样设备，包括具有第一离子进入端口的第一样品入口毛细管；具有第二离子进入端口的第二样品入口毛细管；和具有离子引出端口的单个的样品出口毛细管；其中，所述毛细管流体上相连接，并且所述端口在所述离子源的操作期间处于或者接近环境压力；和在所述第一和第二离子进入端口附近位置的第一和第二喷射设备，用于将样品输送到所述离子源中。
11.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，其中，所述喷射设备被定向为与所述入口毛细管垂直。
12.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，其中，至少一个所述喷射设备是纳喷设备。
13.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，其中，至少一个所述喷射设备是微喷设备。
14.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，还包括电极，所述电极被定位成使得所述第一和第二喷射设备分别紧密接近所述第一和第二样品入口毛细管的入口端口。
15.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，其中，所述离子源是电喷电离离子源、大气压化学电离离子源、大气压光致电离离子源或者感应耦合等离子体离子源。
16.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，其中，所述离子源是多模式离子源。
17.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，其中，至少一个所述喷射设备具有20纳升/分钟～5毫升/分钟范围内的流率。
18.根据权利要求10所述的质谱仪离子源，其中，至少一个所述喷射设备具有100纳升/分钟～1毫升/分钟范围内的流率。
19.一种质谱仪系统，包括a)离子源，包括多入口取样设备，所述多入口取样设备包括具有第一离子进入端口的第一样品入口毛细管；具有第二离子进入端口的第二样品入口毛细管；和具有离子引出端口的单个的样品出口毛细管；其中，所述毛细管流体上相连接，并且所述端口在所述离子源的操作期间处于或者接近环境压力；和在所述第一和第二离子进入端口附近位置的第一和第二喷射设备，用于将样品输送到所述离子源中；b)与所述出口毛细管流体连通的管口；和c)质量分析器。
20.根据权利要求19所述的质谱仪系统，其中，所述管口是传输毛细管的管口或者所述离子源的壁中的管口。
21.根据权利要求19所述的质谱仪系统，其中，所述质量分析器是飞行时间质量分析器、傅立叶变换离子回旋加速器谐振质量分析器、离子阱质量分析器、四极质量过滤器或者它们的组合。
22.一种用于将至少两个样品引入质量分析器的方法，包括a)在离子源中电离至少两个样品；b)将所述被电离的样品引入多入口取样设备；c)在所述取样设备中在环境压力或者接近环境压力的压力下组合所述被电离的样品，以提供被组合的样品，以及d)在环境压力或者接近环境压力下将所述被组合的样品从所述多入口取样设备引出；e)将所述被组合的样品引入到质量分析器中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述样品中的一个是参考样品。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述样品是液相色谱系统的输出。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，所述样品通过分配泵被输入到所述离子源中。
26.根据权利要求22所述的方法，其中，所述系统是高性能液相色谱、微液相色谱、超高压液相色谱、微或纳液相色谱或者毛细管电泳仪。
27.根据权利要求22所述的方法，其中，所述样品在它们被引入所述入口毛细管之后并在从所述取样设备引出之前被组合。
28.根据权利要求22所述的方法，其中，所述出口毛细管的气体流率是0.05升/分钟～10升/分钟。
29.根据权利要求22所述的方法，其中，所述出口毛细管的气体流率是0.5升/分钟～2.5升/分钟。
30.根据权利要求22所述的方法，其中，所述第一喷射器的液体流率是280纳升/分钟～320纳升/分钟，所述第二喷射器的液体流率是20纳升/分钟～300纳升/分钟。
31.一种配套工具，包括用于环境压力离子源的多入口取样设备，包括具有第一离子进入端口的第一样品入口毛细管；具有第二离子进入端口的第二样品入口毛细管；和具有离子引出端口的单个的样品出口毛细管；和用于将所述取样设备配合到离子源中的操作说明。
全文摘要
本发明提供了一种用于质谱仪离子源的多入口取样设备。总的来说，取样设备包括全部流体上连接的至少两个样品入口毛细管和单个出口毛细管。还提供了含有该多入口取样设备的质谱仪离子源和质谱仪系统。该设备易于在环境压力下安装和拆除，而不用对质谱仪抽气。本发明还提供了用于同时将至少两个样品引入质量分析器的方法。
文档编号G01N1/00GK1749749SQ20051009084
公开日2006年3月22日 申请日期2005年8月16日 优先权日2004年9月13日
发明者迈克尔·J·福兰纳甘, 哈维·D·鲁克斯·伊尔 申请人:安捷伦科技有限公司