专利名称：户尘螨的培养收集及其过敏原诊断和治疗制剂的制备方法
技术领域：
本发明属于变态反应药物制备领域，尤其是涉及户尘螨(Dermatophagoides pterronyssinus简称Der p)的培养、收集方法以及户尘螨过敏原的提取方法，本发明也公开了户尘螨提取液中Der p1含量的测定以及建立户尘螨过敏患者标准血清库的建立等。
背景技术：
过敏性疾病已成为影响人们身体健康的重要问题。其中尘螨为最重要的室内过敏原，其是一种普遍存在的生物，肉眼一般看不见，主要存在于居室内，如地毯、枕头、床垫、沙发、窗帘。尘螨生存能力强，主要以人体皮屑为食物，消除尘螨过敏原也因此非常困难。在全世界范围内，居室内最优势的螨是户尘螨和粉尘螨，主要致敏蛋白组分是第一组分(Der p1)。目前，在美国有约5000万人患尘螨过敏病，为第六大慢性病，发病率20-40％；在全世界范围内也呈逐年上升趋势，我国4.8亿人患病，发病率37％(80年代统计)。
过敏原制剂可用于过敏性疾病的体内、体外特异性诊断及脱敏治疗，是诊断和治疗过敏性疾病的基础，其质量的优劣直接影响亿万过敏性疾病患者的健康。1998年，WHO对脱敏治疗的疗效和安全性给予充分肯定，指出脱敏治疗是唯一影响过敏性疾病自然进程的治疗方法，能有效阻止过敏性鼻炎发展为过敏性哮喘。标准化过敏原制剂的研制和使用是过敏性疾病诊断和治疗的必然趋势。
目前，国外的过敏原粗制剂为过敏原原料经提取、透析和无菌过滤后制成的粗提液，包含全部过敏原组分，其具有如下缺点1)以W/V为单位，主要致敏成分含量不稳定，不能真实反应过敏原的生物效价和有效成分；2)批间有效成分变异可达1000倍，影响诊断和治疗的精确性和安全性；3)无质控标准，不利于药品监督管理，各国家、地区的产品之间的研究资料无法比较。同时，作为一个附加值较高的科技产品，标准化过敏原制剂拥有巨大的市场，前景看好。国外高质量产品的进入，将对我国民族过敏原生产工业带来巨大冲击1、增加国家医疗支出和人民负担，2、由于地区差异和地理环境不同，多数国外过敏原产品不适于我国过敏人群，过分依赖国外试剂，将使治疗和诊断局限，3、存在生物安全性的问题。
本发明人经过多年的研究形成了本发明。国内外对于尘螨的培养方法有多种有的使用虾皮或鱼粉；有的使用人皮屑；还有人使用奶粉。这些方法均含有大量的致敏物质。对于过敏患者有高度的危险性，并且容易形成假阳性反应。本发明的培养方法避免了上述缺点，降低了过敏患者皮试和脱敏治疗时的风险，大大提高了临床医疗的安全性。本发明在避免上述假阳性反应的同时也降低了户尘螨点刺试验的假阳性(即大大提高了对户尘螨过敏诊断的特异性)。国内外收集尘螨的方法有避光法、爬盘法和饱和盐水法。上述方法收集的尘螨纯度不高，本发明的饱和盐水结合过筛网方法，大大提高了尘螨收集的纯度。另外，本发明应用蛋白质提取及分析技术，确定了最佳的户尘螨过敏原提取过程；制备了多克隆抗体，然后采用交叉免疫电泳检测过敏原总组成成分；建立了户尘螨过敏患者特异性IgE抗体库；根据主要致敏组份(第一组分)的等电点和分子量，采用分子筛和离子交换技术进行初步分离，得到相对纯化的主要过敏原组份，采用高压液相色谱-质谱联用仪器，得到了纯化的主要过敏原组份；用质谱分析技术验证了主要致敏蛋白的氨基酸序列，用放射免疫吸附抑制实验及户尘螨过敏患者特异性IgE抗体库验证了纯化的主要过敏原组分免疫活性；用主要过敏原组分制备单克隆抗体以控制户尘螨过敏原制剂质量；另外，发明人利用自行制备的多抗和单抗控制户尘螨过敏原制剂质量，建立了标准化户尘螨过敏原制剂的内部参考品和内部参考标准。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种户尘螨的培养和收集方法。
本发明的另一个目的是提供一种户尘螨过敏原的提取方法。
本发明的再一个目的为提供一种测定户尘螨提取液中Der p1含量的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的1.户尘螨的培养和收集在20-25℃，70-75％相对湿度，用透气带盖的塑料培养瓶培养户尘螨。饲料为酵母粉30％，豆粉35.2％，玉米粉3.2％，糖35.2％，猪油3.7％，维生素和盐配方(/100g饲料)Vit A 904.579 IU，VitD 201.729 IU，Vit B12.001mg，Vit B27.525mg，Vit B61.189mg，Vit B120.945mg，Vit C60.519mg，Vit K310.490mg，Vit D30.755mg，烟酸9.888mg，生物素0.040mg，叶酸0.312mg，泛酸钙8.875mg，肌醇12.104mg，NaCl103.477mg，FeSO463.701mg，ZnSO44.711mg，MnSO41.705mg，Vit E10.11mg。不含鱼粉、虾皮、人皮屑等动物蛋白。收集方法利用饱和食盐水漂浮法及50-200目筛网收集或利用避光法收集，冻干收集的户尘螨，得到户尘螨过敏原标准化制剂的原料。
2.户尘螨过敏原的提取方法将冻干的户尘螨经过丙酮脱脂，用Coca’s液溶解，1∶10至1∶20比例(W/V)提取。提取的时候先4℃超声2-3次，每次2-3分钟，然后再4℃提取4-24小时，4℃，10000rpm离心15分钟，取上清液经过滤纸和0.2μm滤器过滤得到户尘螨提取液原液。
3.户尘螨提取液中Der p1含量的测定(双夹心单克隆抗体法)将经过HPLC纯化的抗Der P1单克隆抗体溶解在PBS溶液中。用NaHCO3缓冲液按比例稀释Der P1单克隆抗体至2μg/ml。包被聚乙烯板，孵育过夜。用含Tween-20，pH7.4的PBS缓冲液(PBS-T)洗板。
加入含BSA的PBS-T，室温孵育。PBS-T洗板。
加入稀释的过敏原标准品或样品。室温孵育。
使用过敏原标准品(ST-DP1)等比稀释制备Der P1标准曲线。在酶标板的A1和B1孔加入PBS-T，然后再加入Der P1标准品。混匀，然后转移若干液体进入下一个PBS-T，形成多个稀释梯度。A11、B11、A12、B12孔应该仅含有PBS-T作为空白对照。
尘土或过敏原样品常规稀释。用PBS-T洗板，然后加入稀释的生物素化抗Der P1的单克隆抗体。室温孵育。
用PBS-T洗板，然后加入稀释的链霉素卵蛋白-过氧化酶(SigMA公司S5512)。然后再使用PBS-T按比例稀释。室温孵育半小时。
用PBS-T洗板，然后加入用枸橼酸磷酸缓冲液溶解的ABTS显色，显色时还要加入按比例稀释的H2O2。当405nm光密度值在2.0-4.0时读板。
4.建立户尘螨过敏患者标准血清库户尘螨中度过敏患者的标准有过敏性鼻炎或/和过敏性哮喘症状，瑞典法马西亚公司immunoCAP的RAST试验(过敏原放射性吸附试验)检测户尘螨(d1)过敏等级为3-4级。RAST检测(RAST FEIA)的基本原理为将包被有变应原的固相载体与阳性血清反应，如血清中含有针对此种变应原的特异性IgE，则可形成抗原抗体复合物，孵育和冲洗后，加酶标抗IgE抗体，再进行孵育，即形成抗原-IgE-抗IgE复合物，冲洗后加底物，此复合物与底物作用产生荧光物质。特异性IgE的含量越高，荧光吸收值越高。
户尘螨中度过敏患者的采集根据户尘螨中度过敏患者的标准，在签署知情同意书后，收集20-30个户尘螨中度过敏患者血清，每例采集20ml血清，等量混合稀释后，用含0.5％牛血清白蛋白及0.05％叠氮钠溶液稀释至吸光值在10-30KU/L，2ml塑料离心管分装，冻干保存血清，即为户尘螨过敏患者标准血清库。
5.户尘螨提取液过敏原总生物活性测定通过RAST抑制试验检测提取液的过敏原总活性，采用冻干复溶法确保过敏原总活性的相对恒定，过敏原总生物活性的单位用过敏原单位(AU)表示。
采用Pharmacia的CAP系统，进行户尘螨过敏原放射性吸附抑制试验(RAST inhibition，简称RAST抑制试验)。RAST抑制试验是在上述RAST FEIA基础上加以改变而形成的。即先将一系列不同量的某种变应原与相应的阳性血清即过敏患者血清反应，再进行上述RAST步骤，由于变应原抑制了阳性血清中一定数量的特异性IgE，致使荧光吸收值下降。变应原含量越高，对特异性IgE的抑制作用越强，荧光吸收值越低。
RAST抑制试验是对户尘螨过敏原总体生物活性(即抗原性)的分析，它不能反映过敏原中单一组分的抗原性。在户尘螨的有关试验中，血清池一般由10个以上病人的血清等量组成。
RAST抑制试验可采用放免法、酶标法、荧光酶标法的各检测系统进行测定。由于CAP系统具有较高的灵敏度和特异度，操作简便，故本发明采用瑞典法马西亚公司的UniCAP体外过敏原检测系统进行。
6.户尘螨过敏原组分的测定采用SDS-PAGE检测户尘螨提取液的蛋白质成分，Western Blotting检测户尘螨的主要过敏原成分，其中，一抗为标准血清库中的标准血清，结果表明至少含有24KD和14KD两种蛋白质组分。
7.户尘螨过敏原点刺液的制备在得到合格的户尘螨提取液后，按1∶1的比例加入等量的甘油，0.4％的苯酚，采用冻干复溶法确保提取液中Der p1的含量在100-200μg/ml，然后分装在点刺液小瓶内即制得户尘螨点刺液。
8.户尘螨过敏原脱敏制剂的制备在得到合格的户尘螨提取液后，按不同的稀释比例加入Coca’s液和0.4％的苯酚，制备成一系列不同浓度的户尘螨脱敏制剂。每瓶户尘螨脱敏制剂的总容量可不一样，以达到方便病人和节约的目的。户尘螨脱敏制剂中，Der p 1的最高浓度含量为20μg/ml。
9.户尘螨过敏原点刺液急性毒性试验在加甘油前进行户尘螨过敏原点刺液的急性毒性试验，取5只6周-8周，体重在17-22克的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔内注射0.5ml户尘螨过敏原点刺液原液，观察1周，根据是否有小鼠死亡来判断过敏原点刺液的毒性。
图1酶标板示意图，其中的A11、B11、A12、B12孔仅含有1％BSA PBS-T作为空白对照。A1至A10、B1至B10孔为Der p1标准品的标准曲线测定复孔，其含量从250至0.5ng/ml等比稀释。
实施例1户尘螨过敏原提取液中Der p1含量的测定经过HPLC纯化的抗Der P1单克隆抗体5H8是以2mg/ml储备液的浓度溶解在PBS溶液中。用50mM pH9.6的NaHCO3缓冲液，按1∶1000比例稀释抗Der P1单克隆抗体5H8(即10μl/10ml)Der P1单克隆抗体至2μg/ml。包被聚乙烯板，4℃孵育过夜。用含0.05％Tween-20，pH7.4的PBS缓冲液(PBS-T)洗板3次。
加入含1％BSA的PBS-T 100μl/孔，室温孵育半小时。PBST洗板3次。
加入100μl/孔稀释的过敏原标准品或样品。室温孵育1小时。
使用过敏原标准品(ST-DP1)等比稀释制备Der P1标准曲线。Der P1标准品的稀释范围为0.5-250ng/ml。在酶标板的A1和B1孔加入180μl 1％BSA的PBS-T，然后再加入20μl Der P1标准品。混匀，然后转移100μl液体进入下一个含有100μl 1％BSA的PBS-T，形成10个稀释梯度。A11、B11、A12、B12孔应该仅含有1％BSA PBS-T作为空白对照。
尘土或过敏原样品常规2倍稀释，从1∶10到1∶80。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl稀释的生物素化抗Der P1的单克隆抗体4C1(BI-4C1)。此抗体溶液含有50％甘油，应该使用1％BSA PBS-T按1∶1000比例稀释(即10μl/10ml)。室温孵育1小时。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl稀释的链霉素卵蛋白-过氧化酶(Sig MA公司S5512，使用1ml双蒸水复溶0.25mg粉末)。然后再使用1％BSA PBS-T按1∶1000比例稀释(即10μl/10ml)。室温孵育半小时。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl用70m MpH7.4枸橼酸磷酸缓冲液溶解的1m MAB T S显色，显色时还要加入按1∶1000比例稀释的30％H2O2(即10μl/10ml AB T S)。当405nm光密度值在2.0-4.0时读板。
Der P1标准品含有2500ng/ml Der P1，并且已经经过与WHO/IUIS的户尘螨参考标准品(NIBSC 82/518)的对比标准化。WHO/IUIS的户尘螨参考标准品(NIBSC 82/518)含有的Der P1含量为12.5μg/ml。
实施例2户尘螨过敏原提取液中过敏原总生物活性的测定1).户尘螨过敏原血清池的建立根据户尘螨中度过敏患者的标准，在签署知情同意书后，收集30个户尘螨中度过敏患者血清，每例采集20ml血清，等量混合稀释后，用含0.5％牛血清白蛋白及0.05％叠氮钠溶液稀释至吸光值在10-30KU/L，2ml塑料离心管分装，冻干保存血清，即为户尘螨过敏患者标准血清库。
2).试剂1×PBS
3).材料a).待检变应原为Trizol提取的户尘螨过敏原，与无水乙醇混合后置于-40℃冰箱保存，10000g×10min，取沉淀用1×PBS原体积复溶b).户尘螨变应原CAP，粉尘螨变应原CAPc).抗IgE CAP与上述CAP完全相同，但纤维素颗粒结合的不是变应原，而是羊抗人IgE，供绘制标准曲线d).IgE标准品共有6个浓度，分别为0.35、0.7、3.5、17.5、50和100KUa/L。
e).酶标记的鼠抗人IgE(酶标二抗)，所用酶为β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)f).底物为4-甲基伞桂-β-半乳糖苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-galactoside)g).终止液为碳酸钠溶液、冲洗液为PBS溶液4).仪器采用Pharmacia的全自动UniCAP 100 System，操作软件为UniCAP100versionl.61/009。
5).操作方法a).户尘螨浸液的稀释原液浓度为8.9mg/ml，用1×PBS分别稀释为0.0089mg/ml，0.089mg/ml，0.89mg/ml和8.9mg/ml，即10-3，10-2，10-1和原液。
b).阳性血清的抑制取Eppendoff管7支，每管均加入复溶后的阳性血清20μl分别加入户尘螨浸液160μl，，在4℃的条件下孵育12小时c).同时取阴性血清20μl，加入1×PBS160μl，按上述同样处理，作为阴性对照d).输入测试样本项目包括用于制作标准曲线的12个抗IgECAP和户尘螨及粉尘螨sIgECAP。
e).加入血清样本及IgE标准品(每种浓度皆为双份)。
f).加入试剂酶标记的羊抗人IgE(酶标二抗)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，底物4-甲基伞桂-β-半乳糖苷(4-Methylunbelliferryl-β-galactosidase)，终止液，冲洗液及其附属液。
g).计算机自动测试各测试样本的荧光吸光度值。
h).将IgE标准品的吸光度和相应的浓度在半对数纸上绘制成标准曲线。
i).根据测得的血清荧光吸光度值在标准曲线上读出相应的sIgE含量，上述两个步骤由计算机完成。
j).按CAP System提供的RAST的方法对阳性血清，抑制后的阳性血清，阴性血清进行户尘螨sIgE测定，记录其吸光值。
k).同时用IgE标准品制备标准曲线6.数据处理a).用阳性血清(阳性血清OD值是阳性血清20μl+PBS60μl混合液的OD值)和抑制后的阳性血清吸光度值分别减去阴性对照的吸光度值b).用a).所得值除以未用变应原抑制的血清吸光度值即最大吸光度值
c).用100％减去b).所得比值即为过敏原放射性吸附抑制的百分率(简称RAST抑制试验百分率)d).以血清样本处理时所用的变应原量的对数作自变量，RAST抑制试验百分率为因变量，在半对数纸上作直线回归，并对RAST抑制曲线进行t检验分析。
RAST抑制试验百分率要达到50％以上。
实施例3户尘螨过敏原点刺液急性毒性试验在加甘油前后分别进行户尘螨过敏原点刺液的急性毒性试验，取5只6周-8周，体重在17-22克的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔内注射0.5ml户尘螨过敏原点刺液原液，观察1周，根据是否有小鼠死亡来判断过敏原点刺液的毒性。户尘螨过敏原点刺液急性毒性试验表明如果合格的户尘螨点刺液在加入甘油后进行急性毒性试验则所有的小鼠均死亡；其原因可能为甘油导致小鼠腹腔内出现高渗环境，导致小鼠血容量降低、脱水，产生低血容量休克而死亡。这些小鼠腹腔的病理活检及病理切片未发现其它器质性病变。如果加入甘油前进行急性毒性试验则合格的户尘螨点刺液无小鼠死亡。
实施例4户尘螨过敏原标准化点刺液的灵敏度和特异度。
在北京协和医院变态反应科进行1000例的户尘螨过敏原标准化点刺液的临床点刺试验。每例患者在签署知情同意书后，接受点刺试验以诊断是否存在户尘螨过敏。所用点刺针为清华大学生产的点刺针(医疗器材准字号苏盐药管械(准)字2004第1010015号)。经过500例的户尘螨过敏原标准化点刺液的临床点刺试验表明与目前，国际公认的户尘螨过敏的体外检测方法比较，该标准化点刺液的灵敏度为91％，特异度度为92％。
权利要求
1.一种培养和收集户尘螨(Dermatophagoides pterronyssinus简称Derp)的方法，其包括a).在20-25℃，70-75％相对湿度条件下，用透气带盖的塑料培养瓶培养户尘螨；b)利用饱和食盐水漂浮法及50-200目筛网收集。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于培养户尘螨的饲料含有酵母粉30％，豆粉35.2％，玉米粉3.2％，糖35.2％，猪油3.7％，不含鱼粉、虾皮、人皮屑等动物蛋白，其中每100g饲料含Vit A 904.579 IU，VitD 201.729 IU，Vit B1 2.001mg，Vit B2 7.525mg，Vit B6 1.189mg，Vit B12 0.945mg，Vit C 60.519mg，Vit K3 10.490mg，Vit D3 0.755mg，烟酸9.888mg，生物素0.040mg，叶酸0.312mg，泛酸钙8.875mg，肌醇12.104mg，NaCl 103.477mg，FeSO463.701mg，ZnSO44.711mg，MnSO41.705mg，Vit E 10.11mg。
3.一种提取户尘螨过敏原的方法，包括步骤将由权利要求1或2获得的冻干户尘螨进行丙酮脱脂，用Coca’s液溶解，1∶10至1∶20比例(W/V)提取。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于提取时先4℃超声2-3次，每次2-3分钟，然后再4℃提取4-24小时，4℃下10000rpm离心15分钟，取上清液经过滤纸和0.2μm滤器过滤。
5.一种采用双夹心单克隆抗体法测定户尘螨提取液中户尘螨过敏原第一组分(Der p1)含量的方法，其包括步骤a).将经过HPLC纯化的抗Der P1单克隆抗体溶解在PBS溶液中；b).用NaHCO3缓冲液稀释Der P1单克隆抗体，包被聚乙烯板，孵育过夜，用含Tween-20，pH7.4的PBS缓冲液(PBS-T)洗板；c).加入含BSA的PBS-T，室温孵育，用PBS-T洗板。d).加入稀释的过敏原标准品或样品，室温孵育；e).使用过敏原标准品等比稀释制备Der P1标准曲线，其中空白对照仅含有PBS-T；f).尘土或过敏原样品常规稀释，用PBS-T洗板，然后加入稀释的生物素化抗Der P1的单克隆抗体，室温孵育；g).用PBS-T洗板，加入稀释的链霉素卵蛋白-过氧化酶，然后再使用PBS-T按比例稀释，室温孵育半小时；h).用PBS-T洗板，然后加入用枸橼酸磷酸缓冲液溶解的AB T S显色，显色时还要加入按比例稀释的H2O2；i).读板。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于步骤b)中用NaHCO3缓冲液，按1∶1000比例稀释Der P1单克隆抗体，用含0.05％Tween-20，pH7.4的PBS缓冲液洗板3次。
7.根据权利要求5或6的方法，其特征在于步骤f)中尘土或过敏原样品常规2倍稀释1∶10-1∶80。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于当405nm光密度值在2.0-4.0时读板。
9.根据权利要求5或6的方法，其特征在于单克隆抗体溶液含有50％甘油。
10.一种测定在加入甘油之前的户尘螨过敏原点刺液急性毒性的方法，包括步骤取6周-8周龄体重为17-22克的BALB/c小鼠，在每只小鼠腹腔内注射0.5ml户尘螨过敏原点刺液原液，观察1周，根据是否有小鼠死亡来判断过敏原点刺液的毒性。
全文摘要
本发明公开了户尘螨(Dermatophagoidespterronyssinus简称Der p)的培养和收集、户尘螨过敏原提取以及测定户尘螨提取液中户尘螨过敏原第一组分(Der pl)含量的方法。其中户尘螨提取液中Der pl含量的测定采用双夹心单克隆抗体法。另外，本发明还公开了户尘螨过敏患者标准血清库的建立以及户尘螨提取液过敏原总生物活性的测定。本发明的户尘螨的培养和收集以及户尘螨过敏原提取的方法与测定户尘螨提取液中Der pl含量的方法均具有操作方便、快速的特点。
文档编号G01N33/53GK1763174SQ20051009335
公开日2006年4月26日 申请日期2005年8月26日 优先权日2005年8月26日
发明者孙劲旅, 张宏誉, 尹佳, 黎明 申请人:中国医学科学院北京协和医院