专利名称：Φc31整合酶多克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术与基因治疗技术领域，具体涉及一种ΦC31整合酶的功能性表达、纯化方法和相应的多克隆抗体及其应用。
背景技术：
噬菌体ΦC31整合酶作为丝氨酸重组酶家族的一员，在哺乳动物细胞中，ΦC31整合酶可将外源核苷酸序列定点整合到基因组的特异性位点上，近年来已成为在哺乳动物细胞中进行转基因位点特异性重组操作和基因治疗的有用工具。
1998年，Smith等用硫酸胺沉淀法首次纯化出约68KD的原核表达的ΦC31整合酶，其可以与特异性的核苷酸序列attP，attB，attL，attR结合。凝胶漂移实验证明ΦC31整合酶可以介导不可逆的重组反应。突变分析表明，ΦC31整合酶的12位的丝氨酸突变会失活其催化重组反应的能力，但并不改变其体外结合特异性DNA序列的能力。
Calos等人使用噬菌体ΦC31整合酶的真核表达质粒应用于哺乳动物细胞，表现了长期的目的基因的表达和特异性定点的整合在染色体上。说明其应用于基因治疗和转基因动物方面的可行性前景。Kuhn等加SV40的带有核定位信号的11氨基酸的多肽到噬菌体ΦC31整合酶的C端，融合蛋白的整合效率提高了大约40％。ΦC31整合酶在哺乳动物细胞内的整合机理，细胞定位和毒性等目前还没有说明。
本发明以原核表达系统表达了ΦC31整合酶，经体外检测其的活性，并以纯化的ΦC31整合酶蛋白为抗原，制备了抗ΦC31整合酶的多克隆抗体。该多克隆抗体经证明其可以特异性识别并结合ΦC31，可以用于检测ΦC31蛋白和封闭ΦC31整合酶的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ΦC31整合酶多克隆抗体及其制备方法和应用。
本发明提出的ΦC31整合酶多克隆抗体的制备方法如下使用常规方法(分子克隆指南，1998年第二版，萨姆布鲁克等著，科学出版社)制备ΦC31蛋白的多克隆抗体。基本过程为(1)首先表达和纯化ΦC31蛋白。链霉菌噬菌体ΦC31的cDNA(Genbank NoX59938)的质粒pCMVint(Calos等构建)为模板，用Spel和Xhol酶切质粒pCMVint，回收1.8kb的DNA片断，然后连接到经Xbal和Sall酶切回收原核表达载体pMAL-p2X(New England公司)上，连接液转化大肠杆菌TOP10(Novagen公司)中，经测序鉴定正确后，将质粒p2X-ΦC31转化到TB1菌株(New England公司)中，进行大量诱导表达。为保证其活性，条件为37℃，4-6小时，IPTG 0.1-0.5mM。对大量诱导表达的菌体经超声破菌后，用Amylose亲和柱(New England公司)纯化出MBP-ΦC31蛋白，如图1的SDS-PAGE检测所示，细菌裂解液中有116kDa处有预期的条带。用Micon Ultrafiltration-15(Millipore公司)浓缩纯化的蛋白。对浓缩后纯化的融合蛋白用Xa Factor(New England公司)进行蛋白酶切，在约68kDa处出现预期的条带；对经Xa Factor蛋白酶切纯化的MBP-ΦC31蛋白后的产物，用过量的Amylose亲和柱过柱，流出液即为纯化的约68kDa的ΦC31蛋白(见图1)。
(2)制备链霉菌噬菌体ΦC31的多克隆抗体。用纯化的约68kDa的ΦC31蛋白直接与佐剂相混合，免疫动物注射(家兔，小鼠，大鼠等)，制得链霉菌噬菌体ΦC31多克隆抗体。例如，每次用0.1mg纯化的ΦC31蛋白加上弗氏佐剂(Sigma公司)免疫家兔，每隔10天加强免疫共4次，用颈动脉取血法接取兔血清，沉淀离心后得到兔血清。采用10ug/ml的ΦC31蛋白包被滴定板进行ELISA测定抗体的滴度，抗体效价分析表明抗体效价达到1∶5000(见图2)。
ΦC31整合酶的多克隆抗体的应用。(1)蛋白免疫印记实验证明多克隆抗体可以特异性的与ΦC31蛋白结合(见图3)。制备的多克隆抗体可以特异性的识别人类胚肿胃细胞系293细胞经质粒转染表达的ΦC31整合酶的蛋白。(2)利用免疫荧光组织化学技术，ΦC31的多克隆抗体可以检测标本中的ΦC31蛋白的分布，用罗丹明标记的羊抗兔抗体显色表现为红色(见图4(c)，图中为灰色部分)。(3)ΦC31的多克隆抗体在体外封闭ΦC31整合酶的作用。活性的ΦC31整合酶蛋白可以在体外结合并催化DNA的重组反应，利用ΦC31的多克隆抗体和活性ΦC31整合酶混合后，检测ΦC31整合酶的活性，经琼脂糖凝胶电泳检测证明封闭后的ΦC31整合酶失去活性(见图5)。
图1.噬菌体整合酶ΦC31的表达与纯化(SDS-PAGE检测，考马斯亮兰染色)条带1是未诱导的重组菌，条带2.诱导后重组菌，条带3.超声后上清，条带4.超声后沉淀，条带5.经Amyrose纯化后的产物，主要是MBP-ΦC31融合蛋白；条带6.经Xa Factor因子酶切，亲和层析后的最终产物，主要为ΦC31融合蛋白。条带7是蛋白分子量Markers。
图2.噬菌体整合酶ΦC31的多克隆抗体效价测定整合酶ΦC31兔多克隆抗体的效价为1∶5000。
图3.兔多克隆抗体特异性识别人293细胞表达的整合酶ΦC31。
图4.整合酶ΦC31多克隆抗体检测COS-7细胞表达的ΦC31分布，图4(c)中灰色表示ΦC31主要分布在COS-7细胞的细胞质中。图4(B)中灰色表示DAPI染色所示的细胞核。
图5.ΦC31多克隆抗体封闭体外ΦC31活性图示。其中，A为整合酶ΦC31检测活性的策略。B为活性的ΦC31作用琼脂糖电泳的结果。C为活性ΦC31作用后转化细菌和蓝白斑检测结果。D为ΦC31抗体封闭其活性后的玉脂糖电泳的检测结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例子仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆指南(1998年第二版，萨姆布鲁克等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1.噬菌体整合酶ΦC31蛋白的构建，表达，纯化噬菌体整合酶ΦC31的表达质粒的构建用SpeI和XhoI酶切质粒pCMVint，回收1.8kb的片断，用博大泰克公司的试剂盒纯化.XbaI和SalI双酶切并回收7.3kb的表达载体pMAL-p2X(New England公司产品)。用连接试剂盒(TAKARA公司)连接上述两个DNA片断。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌TOP10，在含氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。DNA序列分析结果表明DNA序列与链霉菌噬菌体ΦC31的cDNA(Genbank NoX59938)序列完全相同。
噬菌体整合酶ΦC31的表达纯化然后用氯化钙法将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。宿主菌BL21(p2X-ΦC31)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG为0.1-0.3mmol/L，37℃继续培养4-6小时。离心收集菌体，经超声波破碎菌体，离心收集上清，用能与麦芽糖结合蛋白(MBP)结合的亲和层析柱Amyrose(New England公司产品)进行层析，得到了纯化的MBP-ΦC31融合蛋白。融合蛋白被Factor Xa酶切后，用过量的Amylose亲和柱层析，流出液主要为ΦC31蛋白，经SDS-PAGE电泳，在68kDa处得到一单一的条带。
2.噬菌体整合酶ΦC31蛋白的多克隆抗体制备及其效价测定多克隆抗体的生产可用纯化的ΦC31蛋白直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
用0.1mg上述ΦC31蛋白加上完全弗氏佐剂免疫家兔，每隔10天后再用ΦC31蛋白加不完全弗氏佐剂加强免疫四次。采用经10μg/ml的ΦC31蛋白包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharosc从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离多克隆抗体。ELISA实验的抗体效价分析表明，抗体效价达到5000∶1。
3.噬菌体整合酶ΦC31蛋白的多克隆抗体的特异性检测制备表达ΦC31蛋白的293细胞裂解液105的293细胞(ATCC细胞库)，接种培养在25cm2的培养板上，细胞培养基为DMEM(Gibco公司产品)，含氨苄青霉素50ug/ml，链霉素25ug/ml，小牛血清10％，5％CO2，37℃培养。当细胞铺板率达到90％时，利用脂质体试剂(Invitrogen公司产品)混合5ug的pCMVint质粒转染细胞，7-10小时后换新的细胞培养液，培养48-60小时后，收获细胞。加蛋白质电泳上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，离心后进行SDS-PAGE。
蛋白免疫印记检测上述制备的细胞裂解液按照常规方法的SDS-PAGE以后，电转印制备印记膜。10％小牛血清封闭非特异性结合位点，加入ΦC31的多克隆抗体(1∶500)，在37℃放置1小时，PBS溶液清洗后，常规DAB试剂显色(Tiangen公司)。Western blot实验证明多克隆抗体可特异性地与ΦC31结合。
4.利用ΦC31多克隆抗体检测ΦC31的细胞内位置和分布对表达ΦC31蛋白的哺乳动物细胞标本，经PBS清洗，多聚甲醛固定后，使用ΦC31的多克隆抗体包被，罗丹明标记的第二抗体作用和DAPI对细胞核染色。标本利用蔡司公司的双光子激光共聚焦显微镜检测细胞图像表明ΦC31多克隆抗体能够用免疫细胞组织化学的方法，很好的定位和跟踪各种途径表达的ΦC31整合酶。抗ΦC31蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术以及免疫学的试验中，也可以用于检测跟踪活体标本中的ΦC31蛋白和突变修饰的ΦC31蛋白的位置和分布。
5.ΦC31多克隆抗体体外封闭ΦC31活性的方法噬菌体整合酶ΦC31蛋白具有重组酶的功能，在体外和体内试验中能够识别特异性的DNA序列(attP 34bp和attB 39bp)，重组形成不能被整合酶ΦC31识别的attL和attR序列(各包含attP和attB序列的一半组成)。整合酶ΦC31介导的重组反应受识别特异性的DNA序列的方向的影响，当attP和attB在两个DNA分子上时，重组整合成为一个分子。当attP和attB同在一个DNA分子上时，依赖他们序列中的TTG为方向，同向重组删除，反向颠倒attP和attB之间的DNA序列。根据整合酶ΦC31介导同在一个DNA分子同向的attP和attB重组的原理，我们用pBCBP+分子(Calos等构建)作底物，由整合酶ΦC31介导重组删除反应，形成两个小的DNA分子，pBC-attL和pBC-attR(见图5-A)。探索的条件为20mmol/L HEPES(PH8.5)，0100mmol/L KCl，10mM Dithiothreitol，0.01％BSA)在30℃孵育20小时后，经转化细菌后的蓝白斑鉴定，白斑代表重组的产物pBC-attL的细菌(见图5-C)。另外还可以对体外重组产物在进行过量的限制性内切酶的作用，使得产物线性化，进行琼脂糖电泳鉴定结果(见图5-B)
ΦC31多克隆抗体可以特异性与ΦC31蛋白结合，从而可以封闭ΦC31活性。利用体外将ΦC31多克隆抗体与纯化的活性ΦC31蛋白共孵育后，再进行整合酶ΦC31蛋白介导DNA体外重组实验(实施步骤见上述)，结果表明抗体在体外完全封闭了ΦC31活性，使其失去介导DNA重组反应的能力(见图5-D)。
权利要求
1.一种ФC31整合酶多克隆抗体，其特征在于由纯化的约68Kda的ФC31蛋白直接与佐剂相混合后注射免疫动物而制备获得。
2.一种ФC31整合酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤如下用纯化的约68Kda的ФC31蛋白直接与佐剂相混合，然后注射免疫动物，制得所需多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述纯化的约68Kda的ФC31蛋白的制备步骤如下链霉菌噬菌体ФC31的cDNA的质粒pCMVint为模板，用SpeI和XhoI酶切质粒pCMVint，回收1.8kb的DNA片断，然后连接到经XbaI和SalI酶切回收原核表达载体pMAL-p2X上，连接液转化大肠杆菌TOP10中，经测序鉴定正确后，将质粒p2X-ФC31转化到TB1菌株中，进行大量诱导表达；对大量诱导表达的菌体经超声破菌后，用Amylose亲和柱纯化出MBP-ФC31蛋白，用Micon Ultrafiltration-15浓缩纯化的蛋白；对浓缩后纯化的融合蛋白用Xa Factor进行蛋白酶切，在约68kDa处出现预期的条带；对经Xa Factor蛋白酶切纯化的MBP-ФC31蛋白后的产物，用过量的Amylose亲和柱过柱，流出液即为纯化的约68kDa的ФC31蛋白。
4.根据权利要求1所述的ФC31整合酶多克隆抗体用于特异性识别人胚胎胃细胞系293细胞经质粒转染表达的ФC31整合酶蛋白，或者用于检测标本中的ФC31蛋白的分布，或者用于封闭ФC31整合酶的体外活性。
全文摘要
本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体为一种ΦC31整合酶的多克隆抗体及其制备方法和应用。首先表达和纯化ΦC31蛋白，然后由纯化的ΦC31蛋白直接与佐剂相混合，注射免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等，即制得ΦC31多克隆抗体。该多克隆抗体可用于特异性的识别人类293细胞经质粒转染表达的ΦC31整合酶的蛋白，也可用于检测标本中的ΦC31蛋白的分布，或用于封闭ΦC31整合酶的体外活性。
文档编号G01N33/53GK1827648SQ200510112199
公开日2006年9月6日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者张茂祥, 陈金中, 朱焕章, 薛京伦, 贾韦国 申请人:复旦大学