专利名称：检测幽门螺杆菌抗原的免疫胶体金试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测抗原的免疫胶体金试剂及其检测方法，同时还涉及该试剂的制备方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)在全世界人群中的慢性感染率达50％以上，在我国普通人群的感染率约为50％--80％，并仍以每年1％--2％速度增加。Hp是B型胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的主要致病因素，并且与胃癌的发生密切相关，现已被WTO列入第一级生物致癌源。还可引起其他疾病如冠心病绞痛、儿童生长迟缓或消化不良、荨麻疹、免疫性血小板紫癜、肝昏迷、症状性低血糖、高血压、胆结石。
流行病学显示，人群中几乎一半人终生感染幽门螺杆菌，但只有10％的感染者发展为有明显症状的消化性溃疡、胃炎，甚至胃癌。在患慢性胃炎的病人中，证实有70~90％的幽门螺杆菌感染率，Hp感染的准确诊断有利于控制Hp传播与流行及根除Hp感染治疗的监测。
目前，国内外诊断幽门螺杆菌感染的方法从检测手段上分为侵入性和非侵入性两大类。其中，侵入性方法有通过胃镜取胃液或胃黏膜标本进行分离培养，直接涂片镜检；快速尿素酶试验，药敏试验；非侵入性方法中有13C和14C-尿素呼吸试验、PCR技术和血清学检测Hp的IgG抗体。根据患者的症状严重程度、危险因素、病史、用药情况、检测方法的特点和相关费用等，可以选择不同的方法。
内窥镜检查取活检标本进行组织学检查是侵袭性的，尽管检测结果比较准确，但由于Hp培养难度较大，活检组织Hp培养成功率仅仅在70％--80％，同时需要内窥专家和病理专家；快速尿素酶试验，市场上有试剂盒供应，但产品质量标准不统一，检测结果出入很大，因此在临床应用上造成了一些混乱。同时，消化道其他一些细菌如空肠螺杆菌、变形杆菌也产生尿素酶，使该法的特异性也受到影响。以上方法最大的缺点是必需通过胃镜取标本。除了会造成胃病患者额外增加一些损伤与痛苦，若消毒不严密，胃镜检查本身就是一种传播Hp感染的媒介。
非侵入性诊断方法中的使用同位素13C、14C和15N-尿氨示踪能即时检测全胃的感染情况，中国专利01809797.9和96119034.5中公开了该技术的应用与改进，但由于受设备限制而难于普遍推广。
PCR法对根除Hp治疗后的监测较为准确，但是对检测人员的专业知识及操作技术的要求比较高，不适合在基层医院的应用。
血清学的检测手段，如用全菌或粗制抗原检测患者血清中的Hp抗体，由于与空肠弯曲菌存在共同抗原，敏感性可能较高，但特异性较差。若用第三代精制抗原(测Hp的尿素酶或外膜蛋白等)特异性较高，但敏感性可能会削弱一些。在中国专利95108003.2、美国专利5262156和欧洲专利0329570中公开了此类技术。但是，血清学阳性只能说明患者必定感染过Hp，或者该患者目前还可能在感染中。但是由于胃中Hp经治疗后已被杀灭，血清中IgG不可能立即降下来，还可持续6～12个月，因此血清抗体测定一般不适宜用作对根除Hp治疗效果的监测。
中国专利01223042.1、02115746.4和97103112.6中公开了通过使用针对幽门螺杆菌的多克隆抗体直接从粪便中检测幽门螺杆菌的方法。然而，多克隆抗体通常具有交叉反应性，在特异性上较差，此外，多克隆抗体的滴度和特异性可以随抗血清的批次而变化，难于进行质量控制，造成假阳性和低特异性的问题(Medical Tribune，4-5，1999.6.3；Am JGastroenterol.941830～1833，1999)。但毫无疑问，直接检测Hp抗原，可以了解患者当前的感染状态。
尿素酶为Hp的特征酶，其主要活性部分位于菌体表面，可分解尿素产生大量的氨，对Hp的定植和生存起着重要的作用，但尿素酶在其它细菌中如空肠弯曲杆菌、结弯曲菌、变形杆菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌也有发现，故仅以尿素酶的单克隆抗体来检测Hp感染会存在假阳性；细胞空泡毒素(VacA)能使细胞产生空泡变性的蛋白，Mr87000，是Hp导致溃疡的毒力因子之一；细胞毒素相关蛋白(CagA)，Mr120000～140000，无致空泡变性的作用，但与VacA之间存在良好的相关性。研究表明，只有产生细胞毒素相关蛋白A(CagA)的Hp菌株才有致病性，而60％一80％的Hp表达CagA，CagA与慢性胃炎及消化性溃疡有密切关系，同时CagA可能是胃癌发生的一个重要因素(临床儿科杂志2003，21(12)779-801)。因此，本发明采用抗Hp尿素酶单克隆抗体与抗细胞空泡毒素或细胞毒素相关蛋白抗原的单克隆抗体其中两种组合，制备成免疫胶体金试纸，检测哺乳动物口腔唾液、胃液、返流呕吐、牙斑、粪便中存在的幽门螺杆菌抗原，从而监测患者幽门螺杆菌的感染状态，辅助医生对胃炎、消化性溃疡等疾病病因的诊断，提示胃癌发生的可能性。
本发明目的是为了克服现有技术在使用中存在的缺陷，提供一种不需要特定仪器设备并且有效、快速、准确测定人体中幽门螺杆菌及高毒力幽门螺杆菌感染的即时情况，同时能有效的降低检测成本，减轻病人的接受检查时的痛苦，并减小检测人员的工作量。
发明内容
本发明提供了一种检测唾液中幽门螺杆菌的免疫胶体金试纸及其制备方法。该试纸条包括吸水纸，玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜，吸水纤维及PVC底板组成。PVC背衬一端依次粘有吸水纸，玻璃纤维膜，中间黏附硝酸纤维素膜，另一端粘附有吸水纤维。其中玻璃纤维膜上吸附着金标尿素酶单克隆抗体1A及金标VacA或CagA单克隆抗体2A或3A混合物，硝酸纤维素膜上依次包被着尿素酶不同表位的单克隆抗体1B，及抗VacA或CagA不同表位的的单克隆抗体2B或3B和抗鼠的多克隆抗体。
该试纸的制备方法包括以下步骤(1)幽门螺杆菌单克隆抗体的制备用纯化的幽门螺杆菌抗原去多次免疫BALB/C小鼠，获得几株单克隆抗体。这几株单克隆抗体经过电泳分析，效价测定及特异性的比较，筛选出六株单克隆抗体1A、1B、2A、2B、3A、3B。即单克隆抗体1A、1B经鉴定分别为抗尿素酶的不同表位的单克隆抗体，2A、2B为抗不同表位的空泡细胞毒素A的单克隆抗体，单克隆抗体3A、3B为抗不同表位的空泡细胞毒素的单克隆抗体。
(2)单克隆抗体的大量制备及提纯将产生单克隆抗体的两株杂交瘤细胞注射于已致敏的小鼠腹腔，一周后收集腹水，离心，即可获取大量的单克隆抗体。大量的单克隆抗体须经硫酸铵分级抽提、PBS透析、离心、Sephedex G-200柱层析等步骤得以纯化。
(3)兔抗鼠或羊抗鼠多克隆抗体的制备提取鼠血清免疫家兔或山羊，纯化后得兔抗鼠或羊抗鼠的多克隆抗体。
(4)制备胶体金用柠檬酸三钠等还原剂并且通过微波炉将氯金酸还原成10-50nm左右的胶体金颗粒。
(5)制备幽门螺杆菌单克隆抗体胶体金标记物胶体金与幽门螺杆菌单克隆抗体1A，2A或3A分别按一定比例混匀，使胶体金与抗体形成单克隆抗体1A，2A或3A胶体金标记物。
(6)单克隆抗体1A和2A或3A胶体金标记物混合后包被在玻璃纤维膜上，将单克隆抗体1B、2B或3B和抗鼠多克隆抗体分别包被在硝酸纤维素膜上的检测区1、2和质控区，充分干燥。
检测结果
第一条检测带尿素酶抗原阳性表明患者体内存在幽门螺杆菌或其它有尿素酶抗原菌的感染，如为流行病普查，则要警剔；如为Hp根除治疗监测，提示医生Hp感染的存在；第二条检测带同时呈现阳性，说明患者感染了高毒力的Hp。
具体实施例方式
实施例一幽门螺杆菌抗原制备Hp国际标准株NCTC11637，经系统鉴定后接种于含10％脱纤维羊血的Skirrow琼脂中，置于5％O2、10％CO2、和85％的N2的环境条件下，37℃培养3d后收菌。4000转/分离心10分钟，弃上清，沉淀加1×PBS缓冲液，吹散，用超声波粉碎、浓缩，即为抗原，蛋白浓度为5mg/ml。
实施例二免疫胶体金试纸1的制备将PVC背衬一端依次粘有吸水纸，玻璃纤维膜，中间黏附硝酸纤维素膜，另一端粘附有吸水纤维。其中玻璃纤维膜上吸附着金标尿素酶与空泡毒素A的单克隆抗体混合物，硝酸纤维素膜上检测区1、2分别包被有相应的抗尿素酶及抗空泡毒素A不同表位的单克隆抗体，羊抗鼠的多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上作为质控区。
按以下步骤制备(1)幽门螺杆菌单克隆抗体的制备用幽门螺杆菌抗原去多次免疫BALB/C小鼠，获得十株单克隆抗体。这十株单克隆抗体经过电泳分析，效价测定及特异性的比较，筛选出来四株单克隆抗体1A、1B、2A、2B，这四株单克隆抗体经蛋白质大小的鉴定分别为抗尿素酶的单克隆抗体和抗空泡细胞毒素A单克隆抗体。
(2)单克隆抗体的大量制备及提纯将产生单克隆抗体的两株杂交瘤细胞注射于已致敏的小鼠腹腔，一周后收集腹水，离心，即可获取大量的单克隆抗体。大量的单克隆抗体须经硫酸铵分级抽提、PBS透析、离心、Sephedex G-200柱层析等步骤得以纯化。
(3)羊抗鼠多克隆抗体的制备提取鼠抗血清免疫家兔，纯化后得兔抗鼠的多克隆抗体。
(4)制备胶体金将100ml0.01％氯金酸(HAuCL4)放于微波炉中，在高档沸腾2分钟，迅速一次加入40ml的柠檬酸三钠水溶液，放于微波炉中在中档保持3分钟，出现透明的橙红色。
(5)制备幽门螺杆菌单克隆抗体1A和2A胶体金标记物用0.1M K2CO3调胶体金溶液PH至等电点8.2左右；将胶体金与幽门螺杆菌单克隆抗体1A或2A按一定比例混匀，使胶体金与抗体形成单克隆抗体1A、2A胶体金标记物。再通过多次离心，弃上清，清洗，浓缩形成门螺杆菌单克隆抗体1A或2A胶体金标记物，冷藏备用。
(6)单克隆抗体1A和2A胶体金标记物混合包被在玻璃纤维膜上，将单克隆抗体1B，2B和羊抗鼠多克隆抗体分别包被在硝酸纤维素膜上的检测区1、2和质控区，充分干燥。
(7)将PVC背衬一端依次粘有吸水纸，玻璃纤维膜，中间黏附硝酸纤维素膜，另一端粘附有吸水纤维。
(8)将粘好的PVC材料切成一定宽度的试纸条，即制成检测口腔唾液中幽门螺杆菌抗原的免疫胶体金试纸。
实施例三免疫胶体金试纸2的制备将PVC背衬一端依次粘有吸水纸，玻璃纤维膜，中间黏附硝酸纤维素膜，另一端粘附有吸水纤维。其中玻璃纤维膜上吸附着金标尿素酶与细胞相关毒素A的单克隆抗体混合物，硝酸纤维素膜上检测区1、2分别包被有相应的抗尿素酶及抗细胞相关毒素A不同表位的单克隆抗体，兔抗鼠的多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上作为质控区，其它操作与实施例二相同。
实施例四试纸条检测待检样品处理唾液、胃液、返流呕吐物、牙菌斑、粪便待检样品的处理取一定量的样品，按1∶10稀释于样品缓冲液1×PBS中，充分搅拌混匀，200转/分离心2分钟，取上清液，7000转/分钟离心5分钟，弃上清，沉淀重悬于样品缓冲液中，600W超声10次，待检。
将试纸条在室温条件下放置30分钟，使其恢复至室温；从铝箔袋中取出检测试剂条，按MARK线下箭头所示的方向将试剂条浸入样本溶液中，3-15分钟即可判断检测结果。
结果判断阳性结果，质控线上呈现红色条带，一条检测线呈现红色，说明有幽门螺杆菌感染，强毒株幽门螺杆菌感染质控线上呈现红色条带，同时会有两条检测线呈现红色；阴性结果，无检测线呈现红色，但质控线上呈现红色条带，说明样本中没有幽门螺杆菌的存在；如果质控线上不出现红色条带，则产品失效。
实施例五免疫胶体金试纸临床应用结果应用“细菌培养法”金标准与本发明试纸检验100位疑似幽门螺杆菌感染者，“细菌培养法”金标准，尿素酶阳性率为86％；用本发明试纸条检测唾液样品，阳性率88％，强毒株感染阳性率为41％；胃液样品阳性率90％，强毒株感染阳性率为45％；粪便样品阳性率92％，强毒株感染阳性率为44％。共同检为阴性者做PCR扩增，均未出现幽门螺杆菌特异性条带，与金标准检测不符者，均有幽门螺杆菌特异性条带。
说明书附
图1为试纸条正视图及正面各区段说明，说明书附图2为试纸条检测结果说明。
权利要求
1.一种测定样品中幽门螺杆菌抗原的免疫胶体金试纸，包括吸水纸、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纤维及PVC底板，其特征在于1)在玻璃纤维膜上包被抗幽门螺杆菌抗原的金标单克隆抗体1A和2A或3A的混合物，在硝酸纤维膜上检测区依次包被幽门螺杆菌抗原单克隆抗体1B和2B或3B；2)在硝酸纤维膜上的质控区包被抗IgG的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌抗原的免疫胶体金试纸，其特征在于金标单克隆抗体1A为抗尿素酶单克隆抗体，金标单克隆抗体2A为抗空泡毒素A抗原，3A为抗细胞毒素相关蛋白A抗原，单克隆抗体2B为抗尿素酶抗原，单克隆抗体2B为抗空泡毒素A抗原，3B为抗细胞毒素相关蛋白A抗原。
3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌抗原的免疫胶体金试纸，其特征在于可以用于检测口腔唾液、胃液、返流呕吐物、牙斑、粪便样品。
全文摘要
本发明涉及一种检测幽门螺杆菌抗原的免疫胶体金试纸及其制备方法。该试纸包被了尿素酶单克隆抗体、CagA或VacA单克隆抗体和抗鼠的多克隆抗体，用以检测哺乳动物口腔唾液、胃液、返流呕吐、牙斑、粪便中存在的幽门螺杆菌相关抗原，从而监测患者幽门螺杆菌的感染状态，辅助医生对胃炎、消化性溃疡等疾病病因的诊断，提示胃癌发生的可能性。本发明具有取样简便，特异性强，敏感性高，几分钟即可肉眼观测结果等特点。
文档编号G01N33/543GK1847854SQ200510200228
公开日2006年10月18日 申请日期2005年4月11日 优先权日2005年4月11日
发明者李红玉, 肖曼, 李静贤 申请人:兰州大学