专利名称：乙丙型肝炎与多种肿瘤标志物蛋白芯片检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于体外临床检验和生物芯片技术领域，确切地说，是一种适于乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断，预测和预后的八项指标(HBsAg，HCVAb，AFP，CEA，CA199，CA125，PSA和fPSA)集成检测的反应板和试剂盒背景技术肝炎是在世界范围内广泛流行的严重危害人体健康甚至生命的严重疾病，其中乙肝、丙肝的流行性和对人类的危害最为严重。我国是世界上乙肝病毒感染最严重的国家，约有1.2亿人为乙肝病毒携带者，占世界的三分之一，其中3000万为慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌，每年有30万人死于慢性肝病，其中约13万人为原发性肝癌患者。我国每年用于治疗乙肝引起的慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接医疗耗费高达300亿元人民币。丙型肝炎是一种主要经血液传播、由丙型肝炎病毒引起的严重肝脏疾病。全世界目前有1亿丙型肝炎病毒携带者，中国约占四千万人。80％的丙型肝炎病毒携带者会患上慢性肝炎，其中约10-30％的病人将发展为肝硬化，5-10％的肝硬化患者可发展成肝癌。每年用于丙肝的医疗费加上病人工作丧失的造成的损失超过6亿美元。预计，2010年到2019年治疗丙肝相关疾病的直接医疗费用将超过130亿美元。
癌症对人类健康和生命的威胁很大。它和心血管疾患已成为医学上的两大难关，是全世界构成死亡原因的头两位。据1997年世界卫生组织(WHO)报告，全世界58亿人口中，每年约有1000多万人新患癌症，每年约有630万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。我国目前每年平均约有170万人新患癌症，约有130万人死于癌症。恶性肿瘤已成为中国居民死亡的首要原因。
肿瘤标志物是指肿瘤细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，或是宿主对体内寄生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。目前临床上常用的肿瘤标志物大多是肿瘤相关抗原，这些肿瘤标志物并非肿瘤细胞所特有，而是肿瘤细胞的表达量明显增加，与正常细胞存在量的差异。肿瘤标志物大多无器官特异性(广谱标志物)，因此基本上不可以定位。同一种肿瘤可以有几种不同的肿瘤标志物，不同肿瘤可能有相同的肿瘤标志物。如CA125不仅是卵巢癌相关抗原，也是其他肿瘤(肺癌、肝癌、胰腺癌、胃肠道癌等)的相关抗原。肿瘤标志物在一些良性疾病和炎症时也会有不同程度升高。一般表现为中等程度升高。此时，仅仅根据肿瘤标志物一次检测是很难定性的，而应连续监测，通过动态观察可以判断肿瘤的消退、疗效及预后复发。胎儿血浆中的AFP值可达到3000μg/L，随后即逐渐降低，出生后，AFP合成很快受抑制，其含量降至50μg/L，周岁婴儿的浓度接近成人水平，一般健康成人血浆AFP浓度低于20μg/L。原发性肝细胞癌患者血清中AFP浓度明显升高，约77.1％的患者AFP＞500μg/L，但也有18％的病人AFP并不升高。病毒性肝炎、肝硬化患者AFP浓度有不同程度的升高，但其水平通常低于100μg/L。其升高原因主要是由于受损伤的肝细胞再生而幼稚化时，肝细胞便重新具有产生AFP的能力，随着受损肝细胞的修复，AFP逐渐恢复正常。最初认为CEA是结、直肠癌的特异性标志物，其后发现在由内胚层细胞分化而来的其它恶性肿瘤也可呈阳性。进一步研究发现，在一些良性肿瘤和一些非肿瘤性疾病，血液中CEA浓度也会增高。因此，CEA是一种广谱肿瘤标志物。胚胎期间胎儿的胰腺、胆囊、肝、肠等组织也存在这种抗原，但正常人体组织中含量甚微。消化道恶性肿瘤，特别是胰腺癌、胆囊癌患者血清中CA19-9含量明显升高。胰腺癌、胆囊癌、胆管壶腹癌患者血清CA19-9水平明显升高，尤其是胰腺癌晚期患者，血清CA19-9浓度可达40万kU/L，阳性率约为74.9％，是重要的辅助诊断指标。胃癌阳性率约为50％，结肠癌阳性率约为60％，肝癌阳性率约为64.6％。卵巢癌患者血清中CA125水平明显升高。手术和化疗后期水平很快下降。当复发时，在临床确诊前几个月便可呈现CA125增高，尤其卵巢癌转移患者的血清CA125更明显高于正常参考值。其它非卵巢恶性肿瘤也有一定阳性率，如乳腺癌40％，胰腺癌50％，胃癌47％，肺癌41.4％，结肠直肠癌34.2％，其它妇科肿瘤43％。前列腺癌患者可见血清PSA浓度升高。以血清t-PSA＞5μg/L判断阳性，则阳性率可达50％～80％。t-PSA的血清浓度和阳性率随着病程的进展而增高。前列腺癌手术后，t-PSA浓度可逐渐降至正常，若手术后其浓度不降或下降后再次升高，应考虑肿瘤转移或复发，因此PSA可作为监测前列腺癌病情变化和疗效的重要指标。前列腺肥大、前列腺炎、肾脏和泌尿生殖系统的疾病患者，也可见t-PSA和f-PSA水平轻度升高，必须结合其它检查进行鉴别。单独使用t-PSA和f-PSA升高来诊断前列腺癌时很难排除前列腺增生症，特别是当t-PSA在5μg/L～20μg/L时。此时应用f-PSA/t-PSA来判断。根据文献报道f-PSA/t-PSA＜10％提示前列腺癌，f-PSA/t-PSA比值＞25％时提示前列腺增生症。其特异性达90％，正确率＞80％。
因为血清学指标比明显的临床症状出现早，在健康人群中定期或不定期的进行肝炎、肿瘤相关血清指标的检测，对于这些疾病的早发现、早治疗有着重要意义，有利于疾病的预防，改善预后状况。另一方面，由于乙肝、丙肝容易诱发肝癌，在对肝炎患者检测肝炎指标的同时检测肝癌相关指标也有重要意义。
由于传统的血清检测方法(现在市场上占主流地位的是ELISA方法)每次只能检测一个指标，在进行多指标检测上费时、费力、费钱，难以满足人数众多的体检市场，不利于体检的日常化、平民化普及。蛋白芯片技术与免疫诊断技术相结合产生的诊断用蛋白芯片技术是最近几年来新兴的高科技技术，在多指标并行快速检测方面有着无可比拟的优势，具有集成化、高通量、自动化、微型化、信息化等特点，是免疫诊断的发展方向。本实用新型通过对八个指标的快速检测实现对乙丙型肝炎与多种肿瘤标志物的诊断，预测和预后，对疾病的预防和治疗有着重要的指导意义。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种可同时对乙丙型肝炎与多种肿瘤标志物进行预测，诊断和预后判断的方法。我们的试剂盒通过检测血清或血浆中的HBsAg，HCVAb，AFP，CEA，CA199，CA125，PSA和fPSA这八项指标，来达到这一目的。
在本实用新型的第一方面，提供了一种乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断和预测八项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12-200个样本孔，5-8个标准品孔，其中，其特征在于每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等八种抗原或抗体的微点阵。在每一反应孔内还设有一定位基准点。
在一优选例中，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。
在另一优选例中，所述样本孔的数量为4-195个。
在另一优选例中，所述的抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等八种抗原或抗体在固相载体上各有2个点样点。
在另一优选例中，所述反应孔每孔设有一个定位基准点。
在本实用新型的第二方面，提供了一种乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断和预测八项指标集成检测试剂盒，它包括本实用新型上述的乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断和预测八项指标集成检测反应板。
在另一优选例中，还包括酶标工作液、检测液和标准品。
在另一优选例中，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。
在另一优选例中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
图1是本实用新型一种固相载体上乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病检测的六项指标的点样示意图图2是本实用新型的反应孔中进行的各抗原——抗体反应的示意图具体实施方式
乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项指标集成检测的关键是要使·八项指标检测的灵敏度和特异性均达到要求以保证结果的准确可靠，而相应的难点是如何将浓度差高达10000倍的各检测指标整合到一个孔里来检测。经过深入而广泛的研究，本实用新型采用两种不同的反应方式进行检测，并对检测反应板作了改进，同时本实用新型采用的微点阵检测技术，酶免疫夹心法和化学发光检测技术，大大提高了检测的灵敏度和特异性，从而解决了上述问题。
具体而言，为提高乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项指标(HBsAg，HCVAb，AFP，CEA，CA199，CA125，PSA和fPSA)的检测效率，本实用新型应用微点阵检测技术，结合酶免疫夹心法和化学发光检测技术设计了一种乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12-200个样本孔，5-8个标准品孔，其中，其特征在于每一反应孔的底部平面上有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等八种抗原或抗体的微点阵。
各反应孔的数量没有特别限制，通常样本孔为12-200个，较佳地5-50个。标准品孔3-10个，较佳地5-8个。
在本实用新型中，反应孔的形状和大小没有特别限制，可以是圆形、方形、六角形、椭圆形、或其他形状。大小通常为直径0.5-5cm，深度为0.5-2cm。
在本实用新型中，反应板基板的材料可以选用本领域常用的各种材料，较佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本实用新型中，包被乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病抗原或抗体的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)玻璃片、塑料、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，较佳的固相载体包括NC膜、PDVF膜。
在固相载体上，各有抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等八种抗原或抗体1-3个点样点，较佳地2个点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。各点样点之间的距离通常为0.1-5mm。
另一方面，本实用新型还提供了一种乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项指标集成检测蛋白芯片试剂盒，该试剂盒可实现多指标并行化、微型化、高通量检测。它包括本实用新型的反应孔板、洗涤液、酶标工作液、检测液(A、B)、标准品等。其中，酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，使用前混合。
在本实用新型中，各指标的检测采用酶免夹心法或竞争法，检测原理如图2所示。详细叙述如下1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。封闭，除去未结合的位点。
2)加受检血清和酶标溶液，酶标溶液包含八项检测指标的相应的酶标抗体(夹心法)。采用夹心法检测的指标，特异的酶标抗体与血清中的抗原形成复合物，并进一步与固相抗体形成双抗夹心复合物。
3)洗涤除去未结合的抗体，抗原及杂质。
4)加底物固相上的酶催化底物，化学发光，CCD检测，光强度与标本中受检抗原的量呈正相关。
本实用新型巧妙地综合利用了蛋白质微点阵检测技术，酶免疫夹心法和竞争法，以及化学发光检测技术，实现了乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项指标的同时检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1检测反应板的制备取48孔板，设置42个样本孔，6个标准品孔。在每个反应孔的底部放置一固相载体(NC膜或PDVF膜)，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等八种抗原或抗体的蛋白质微列阵(图1)。
实施例2试剂盒制备制备含一乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项指标集成检测的试剂盒，它含有实施例1的反应孔板一块(24-48人份)，洗涤浓缩液1瓶，酶标工作液1瓶，检测液A一瓶，检测液B一瓶，标准品瓶。
洗涤浓缩液、酶标工作液、检测液A、检测液B实施例3乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项指标集成检测按以下方法对各测试血请样品进行检测1.加检测血请或标准品于相应反应孔内，75ul/孔。
2.加酶标工作液，75ul/孔。
3.37℃保温振荡反应60分钟。
4.用洗液洗涤4-6次，每次2分钟，振动。
5.加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于孔的底部。
6.CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。
结果判定依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样品血清的阴阳性。
与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本实用新型的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。
在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。
权利要求1.一种乙丙型乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断和预测八项指标集成检测反应板，其特征在于，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12-380个样本孔，4-8个标准品孔，其中，其特征在于每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAb，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等抗原或抗体的微点阵，在每一反应孔内还设有一定位基准点。
2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。
3.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述样本孔的数量为12-380个。
4.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等抗原或抗体在固相载体上各有2-4个点样点。
5.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，在每一反应孔内还设有一定位基准点。
6.一种乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病八项集成检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断和预测八项指标集成检测反应板。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标工作液，检测液和标准品。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
专利摘要本实用新型涉及乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断，预测和预后的八项指标(乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg，丙型肝炎病毒抗体HCVAb，甲胎蛋白(alpha－fetoprotein，AFP)，癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)，糖链抗原19－9(Carbohydrate antigen 19－9，CA19－9)，癌抗原125(Cancer antigen 125，CA125)，前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)和游离型前列腺特异性抗原(Free－PSA))集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒。所述的反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12－200个样本孔，5－8个标准品孔，其中，每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗CEA，抗CA199，抗CA125，抗PSA和抗fPSA等八种抗原或抗体的微点阵。本实用新型的反应板和试剂盒可简便、快速、准确地实现多个人份的乙丙型肝炎与多种肿瘤疾病的诊断，预测和预后的八项指标的同时检测。
文档编号G01N33/52GK2804865SQ200520041210
公开日2006年8月9日 申请日期2006年3月16日 优先权日2006年3月16日
发明者穆海东 申请人:穆海东