专利名称：病人尿载脂蛋白b的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物技术领域，具体涉及病人尿中载脂蛋白B100(Apolipoprotein B100，简称Apo B100)超微量定量的酶免试剂盒。
背景技术：
当前临床对肾病综合症及糖尿病尿中Apo B100(正常人及他种疾病尿中无Apo B100)的检测还停留在检测血清等体液的酶免技术，检测Apo B100量是g/L水平。用这种酶免技术检测一些疾病的Apo B100超微量(μg/L)变化是不可能的。
研制肾病综合症及糖尿病尿中Apo B100超微量定量的高灵敏度和高特异性的诊断试剂盒尚无报道。
发明内容
本实用新型的发明目的在于创建病人尿中载脂蛋白B100超微量定量酶免试剂盒，既超越当前的检测技术g/L水平，又超越了微量的ng/L水平(1g＝1000ng)，而是超微量的μg/L(1ng＝1000μg)技术。
本实用新型提供一种病人尿载脂蛋白B100超微量定量酶免试剂盒，包括一个盒体，盒体内有一块48孔或96孔的载脂蛋白B100抗体IgG预包被板和12瓶试剂，12瓶试剂分别为载脂蛋白B100标准品6瓶、载脂蛋白B100抗体IgG酶标记工作液1瓶、阴性对照1瓶、10倍浓洗涤液1瓶、显色剂甲液1瓶、显色剂乙液1瓶和终止液1瓶。其配制如下一、载脂蛋白B100标准品6瓶分别为浓度为10000μg/ml、8000μg/ml、6000μg/ml、4000μg/ml、2000μg/ml、0μg/ml各1瓶。
二、预包被板的制备 48孔或96孔
(1)包被液Na2CO30.6gNaHCO31.58g重蒸水 500ml加入Apo B100抗体IgG，15μg/ml，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。
(2)洗涤液Tris2.42g重蒸水 1000ml加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗体。
(3)封闭液蔗糖100g羊血清 25ml0.1MPBS 1000ml加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。
三、阴性对照的制备正常人尿液用本实用新型试剂盒测定OD值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装，500ul/瓶。
四、酶标记抗体工作液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml调PH至7.2加入酶标记Apo B100抗体IgG为1∶2000分装3ml/瓶。
五、显色剂甲Na2HPO4.12H2O 1.7g柠檬酸.H2O 0.5g
3％H2O2200ul重蒸水100ml调PH至5.0 分装3ml/瓶六、显色剂乙EDTA 17.5mg柠檬酸.H2O0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul分装3ml/瓶七、10倍浓洗涤液Na2HPO4.12H2O 2.6gNaH2PO4.2H2O 0.4g20％Tween-202.5ml重蒸水 100ml调整PH至7.2 分装13ml/瓶八、终止液3M H2SO43ml/瓶本实用新型是用Apo B100纯品为标准品，用Apo B100抗体IgG包被，其最佳包被量为15μg/ml，Apo B100抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，其最佳酶标记抗体工作浓度为1∶2000。Apo B100超微量定量的夹心法，检测糖尿病及肾病综合症尿中的Apo B100含量。
本实用新型酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法的操作步骤如下取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。
↓反应孔中分别加各浓度Apo B100标准品每孔加10000μg/ml、8000μg/ml、6000μg/ml、4000μg/ml、2000μg/ml、0μg/ml各100μl待检尿液、阴性对照尿液各100μl。
↓去反应孔内液体在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次孔中加满洗涤液后停留30秒钟，甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(10倍浓洗涤液1ml+9ml蒸馏水即为工作洗涤液)↓各孔滴加显色剂甲、乙各1滴，37℃中反应10分钟后再各孔滴加终止液1滴，置酶标仪450nm波长读取各孔光密度(OD)值。
↓以标准品浓度为横座标，OD值为纵座标绘出标准曲线，以各待测尿液OD值在标准曲线上查出该尿液的Apo B100浓度。
抗体IgG的鉴定经两次盐析纯化的Apo B100抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果，Apo B100为单一沉淀线。
标准曲线的制备倍比稀释的Apo B100(SigMA进口)标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图。标准曲线测定ApoB100含量范围为0-1000μg/ml。在ELISA双抗夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好。
精密度试验为了明确和证明本实用新型超微量定量Apo B100ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复性试验。批内及批间实验，在正常尿液中加Apo B100标准品做批内测定，结果见表1。在正常尿液中加Apo B100标准品做批间含量测定，结果见表2。所得变异系数(CV％)，说明本实用新型重复性良好。
表1 正常尿加标准品Apo B100之批内实验
表2 正常尿加标准品Apo B100之批间实验
特异性检定正常人尿液11份，分别加入IgA、IgM、IgG、C3、β2M、α巨球蛋白、转铁蛋白、白蛋白、纤维蛋白降解产物(FDP)、Apo B100及Apo AI各1000ng/ml尿，用Apo B100试剂盒检测只测出Apo B100的结果见表3表3 正常人尿中加不同蛋白的检出量
以上试验说明本ELISA试剂盒具有Apo B100的特异性。
稳定性试验将Apo B100ELISA试剂盒放置37℃0、1、2、3、4、5天，每天分别测定同一阳性尿样，活性下降很少，说明本试剂盒稳定性好，结果见表4表4 Apo B100试剂盒稳定性试验
注阳性尿液在4℃冰箱放置5天。
上海长海医院肾内科及内分泌科用本实用新型试剂盒进行尿载脂蛋白Apo B100测定的试验本文检测对象为21例正常人及原发性肾病综合症(肾病)24例(I型12例，II型12例)；另有8例重症糖尿病人，所有检测对象均留24小时尿，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定尿中(Apo AI)和(ApoB100)，以μg/L为单位。
方法用Apo AI及Apo B100超微量定量试剂盒，以ELISA法进行检测。
结果1.正常人21例对照尿中Apo AI和Apo B100均为“0”。
2.8例重症糖尿病人尿有Apo AI及Apo B100为6例。单有Apo AI为2例。
3.肾病综合症病人尿中Apo AI和Apo B100的含量见下表5表5 12例肾病综合症病人尿中Apo AI和Apo B100的含量(μg/L)
讨论正常人尿中未检测到Apo AI和Apo B100。
肾病综合症病人中I型者尿中Apo AI均阳性，而Apo B100均阴性。II型者尿中Apo AI及Apo B100均呈阳性，而且Apo AI含量＞Apo B100含量。因此作为肾病综合症I型与II型鉴别的指标。一般认为I型肾小球滤过膜损伤比II型较轻。
初步认为尿中载脂蛋白Apo AI和Apo B100测定可做为选择性载脂蛋白尿与非选择性载脂蛋白尿的鉴别指标之一。Apo B100在尿中出现对肾病综合症患者的保肾或换肾症以及重症糖尿病的微细小血管已有损伤，出现的严重併发症有预警价值。
初步认为糖尿病人有严重併发症者微细小血管已有损害，尿中出现Apo AI和Apo B100，有较大预警价值。
上海第二医科大学附属新华医院用ELISA法测定尿中载脂蛋白的试验在我院首次用于临床超微量定量检测20例肾病综合症尿中载脂蛋白AI(Apo AI)和载脂蛋白B100(Apo B100)，现将结果公布如下一、方法用Apo AI及Apo B100超微量定量试剂盒，以ELISA法进行检测。
二、结果1.Apo AI和Apo B100的标准曲线，可测范围在0～1000μg/ml之间。
2.正常人尿中脂蛋白含量检测正常人对照15例，尿中Apo AI及Apo B100均为阴性。检测肾病综合症20例，结果见表6。I型(10例)肾病综合症尿中Apo AI为阳性，Apo B100为阴性，II型(10例)肾病综合症尿中Apo AI和Apo B100均为阳性。
表6 肾病综合症尿中Apo AI及Apo B100含量(μg/L)
三、讨论根据我院试用ELISA方法结果，标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确性及重演性均较好。15例正常人尿中均未见Apo AI及Apo B100，而肾病综合症组患者，I型(轻型)尿中只出现Apo B100，而II型(重型)尿中出现Apo AI及Apo B100。由于呈球状的Apolipopretein分子颗粒大小不一样，Apo B100分子直径约为Apo AI数倍，因此尿中Apolipopretein出现的种类不同不仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感，而Apo AI经Apo B100又更敏感些。同时，又发现糖尿病患者(重症)尿中也有Apo AI经Apo B100。ELISA法简便、快速、特异性强、灵敏度高、超微量，用于临床有较大的社会效益和经济效益。
同济大学上海放射免疫研究所用ELISA法测定人尿中载脂蛋白的试验在某些肾脏疾病中，尿中可出现不同类型的载脂蛋白，但以往没有见过这方面的报导。我所首先运用杜凤鸣教授创立的超微量定量酶联免疫吸附试验(简称ELISA)法检测人尿中载脂蛋白Apo AI和载脂蛋白Apo B100。
现将结果公布如下
一、方法用Apo AI及Apo B100超微量定量试剂盒，以ELISA法进行检测。
二、对象(1)选正常健康人3个年龄组，4～16岁组(男20人，女30人)，17～23岁组(男25人，女20人)，45～60岁组(男35人，女30人)共160人。测定血中载脂蛋白AI(Apo AI)及载脂蛋白B100(ApoB100)含量。
(2)选肾病综合症I型及II型各13例，测定其尿中Apo AI及ApoB100含量。
三、结果(1)Apo AI及Apo B100的标准曲线，可测范围在0～1000μg/ml之间。
(2)检测正常健康人尿中脂蛋白组分含量尿中Apo AI及Apo B100均为“0”。检测肾病综合症26例，其中I型13例，II型13例，尿中载脂蛋白含量见表7。
表7 肾病综合症病人尿中载脂蛋白含量(μg/L)
四、讨论根据我所试用ELISA方法结果，标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确及重演性均好。健康人尿中均未见Apo AI和Apo B100。
有意义的是肾病综合症，I型(轻型)尿中只出现Apo B100，而II型(重型)尿中出现Apo AI和Apo B100。由于呈球状的Apo分子颗粒大小不一样，Apo AI分子直径约比Apo B100大，因此尿中Apo Lipoprotein出现的种类不同不仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感。来判断病人的病情轻重，以及预后。该ELISA法简便快速，超微量特异性强，灵敏度高，用于临床有较大的社会效益和经济效益。
用本实用新型检测血清及其他体液Apo B100，需多倍稀释样品误差大，难以区别正常与异常含量差别。我们也曾用临床常用检测血清等体液酶免盒检测肾综合症及重症糖尿病尿中Apo B100含量，几乎全部是“0”。因此两者不能相互扩展使用。
综合以上多家医院的使用情况，用本实用新型检测肾病综合症及重症糖尿病尿中发现Apo AI及Apo B100。用本实用新型的Apo AI及Apo B100试剂盒联合使用，可明确区分肾病综合症的I型或II型及重症糖尿病的微细小血管损伤的预警。可向临床提供上述两种疾病的预后。对肾疾综合症的保肾或换肾以及糖尿病的严重併发的下肢坏疽、视网膜病变，糖尿病的肾病及糖尿病的心脑血管病变有预警价值。
本实用新型具有较好的社会效益和经济效益。
图1本实用新型的结构示意图具体实施方式
实施例1如图1所示，一种病人尿中载脂蛋白B100超微量定量酶联免疫吸附试验试剂盒，包括一个盒体1，盒体1内有一块96孔的载脂蛋白B100抗体IgG预包被板2和12瓶试剂。12瓶试剂分别为载脂蛋白B100标准品6瓶3、载脂蛋白B100抗体IgG酶标记液1瓶4、阴性对照1瓶5、10倍浓洗涤液1瓶6、显色剂甲液1瓶7、显色剂乙液1瓶8、终止液1瓶9。其中的载脂蛋白B100标准品3分别为浓度为10000μg/ml、8000μg/ml、6000μg/ml、4000μg/ml、2000μg/ml、0μg/ml各1瓶；其中的载脂蛋白B100抗体IgG酶标记液4、显色剂甲液7、显色剂乙液8和终止液9均为3ml；阴性对照5为500μl；10倍浓洗涤液6为13ml。
权利要求1.一种病人尿中载脂蛋白B100超微量定量酶联免疫吸附试验试剂盒，包括一个盒体(1)，其特征在于盒体(1)内有一块48孔或96孔的载脂蛋白B100抗体IgG预包被板(2)和12瓶试剂，12瓶试剂分别为载脂蛋白B100标准品6瓶(3)、载脂蛋白B100抗体IgG酶标记液1瓶(4)、阴性对照1瓶(5)、10倍浓洗涤液1瓶(6)、显色剂甲液1瓶(7)、显色剂乙液1瓶(8)和终止液1瓶(9)。
2.根据权利要求1所述的一种病人尿中载脂蛋白B100超微量定量酶联免疫吸附试验试剂盒，其特征在于其中的载脂蛋白B100抗体IgG酶标记液(4)、显色剂甲液(7)、显色剂乙液(8)和终止液(9)均为3ml；阴性对照(5)为500ul；10倍浓洗涤液(6)为13ml。
专利摘要本实用新型属于生物技术领域，具体涉及病人尿中载脂蛋白B
文档编号G01N33/531GK2881633SQ20052004193
公开日2007年3月21日 申请日期2005年5月27日 优先权日2005年5月27日
发明者杜凤鸣 申请人:杜凤鸣