专利名称：分子间隔臂、其制备方法、以及在包含分子或生物分子的分析芯片上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子间隔臂、用于制备将分子单元连接到固相载体的间隔臂的方法、以及这种间隔臂在包含分子或生物分子的分析芯片上的应用。
在以下的披露内容中，方括号[]之间的标记指代在说明书末尾列出的参考文献。
本发明针对的分析芯片更具体地，但不是唯一地，为生物芯片和用于生物分析的微系统。可将它们分成三类DNA芯片、芯片实验室(lab-on-chip)以及细胞芯片(cell-on-chip)。
当前，出现了新型的芯片糖芯片(glycochip)。这种生物芯片或者是天然或合成物质沉积的结果，或者是各种寡糖序列的支持的多步平行合成(组合化学)的结果，寡糖表现了某些大类的内源性糖缀合物的分子多样性，例如硫酸乙酰肝素。本发明尤其适用于这种新型的生物芯片，因为其尤其允许利用化学方法将这些分子连接到生物芯片载体，与现有技术相比，该化学方法有效并且简单。
可通过本发明的间隔臂连接到固相载体的分子或生物分子(特此称为“分子单元”)可以为例如核酸(DNA或RNA)、糖、糖蛋白、糖脂等。其他的进一步实例在下面给出。
背景技术：
在大多数生物芯片中，间隔物(spacer)提供固相载体[2]和例如寡肽、寡核苷酸[3]或寡糖[4]探针之间的连接。这种间隔物可以同时起多种作用连接分子、空间隔开臂、探针断裂的部位等。
实际上，载体通过探针接近目标的识别部位可阻碍、或甚至阻止探针/目标识别，并因此损害生物芯片的分析精度和质量。当探针较小时，例如在糖芯片的情形中，尤其如此。
下面的原理公式表示间隔物的形成然后断裂的总图解，其中X’表示固相载体，而X”为分子单元。
到目前为止，已生产了许多间隔臂，但是它们具有某些未解决的缺点。具体地说，它们的结构对可用来将它们连接到固相载体的化学方法具有严格限制，和/或它们不可能容易地连接任何类型的生物分子，和/或它们是如此化学上稳定的，以至于一旦连接到固相载体，它们就不容易被断裂以便恢复生物分子，并且所述断裂可导致所述分子或载体的破坏。
文献[4](US-A-6,579,725)描述了用于连接寡糖的间隔臂。尽管比其他更早的现有技术的间隔臂更有效，但是这种间隔臂没有可能同时解决所有上述问题。还会注意到，不能一直如所希望的那样产生其长度、官能度、反应性以及阻碍性。
发明内容
准确地说，本发明通过提供下式(I)的分子间隔臂使得同时解决现有技术的所有上述问题成为可能 其中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、以及R3为如下X0和X4各自独立于其他取代基地选自C、O、N、S、Se、P、As以及Si；X1、X2和X3各自独立于其他取代基地选自C、O、N、S、Se、P、As和Si，以及选自各自含有例如2～20个碳原子的芳基或杂芳基；Z1和Z2各自独立于其他取代基地选自C-R、Si-R、C、N、P以及As，其中R为含有例如1～40个碳原子的烷基；
R1、R2和R3各自独立于其他取代基地选自H、烷基、芳基以及杂芳基，每个含有2～20个碳原子；[Gp]表示保护仲胺-N-的基团或参与间隔臂官能化的分子；其中，n、m和p各自为大于或等于1的整数并彼此独立地进行选择，优选地为1≤n、m和p≤40；其中，[Sup]表示H或所述间隔臂可共价连接的硅烷化固相载体；其中，[mo]表示H或用于通过所述间隔臂共价连接到所述硅烷化固相载体的分子单元。
当然，X0至X4为形成本发明的间隔臂主链的原子，例如选自H、O、各含有2～20个碳原子的烷基、芳基以及杂芳基的基团可能连接到这些原子。
这种间隔臂(I)可通常用于将分子单元[mo]连接到固相载体[Sup]，例如为了制造生物芯片，或者更有利地用于制造糖芯片，其中[mo]通常为使所述生物芯片官能化(功能化)的分子。
根据本发明，优选地，在上面定义的间隔臂[1]中X0和X4各自独立于其他取代基地选自C、O、N、S以及Si；和/或X1、X2和X3各自独立于其他取代基地选自C、O、N、S和Si，以及选自各含有例如2～10个碳原子的芳基或杂芳基；和/或
Z1和Z2各自可独立于其他取代基地选自C、N、C-R以及Si-R，其中R为含有1～30个碳原子，优选1～20个碳原子，更优选1～10个碳原子的烷基；和/或R1、R2和R3各自可独立于其他取代基地选自H，烷基、芳基以及杂芳基，每个含有2～10个碳原子；根据本发明，n、m和p也可彼此独立地进行选择，使得1≤n、m和p≤30，优选为1≤n、m和p≤20，并且更优选为1≤n、m和p≤10。
根据本发明，作为实例，在上面定义的间隔臂[1]中，X0和X4为C；X1、X2和X3为C；Z1和Z2为C；并且R1、R2和R3为H。
根据本发明，保护基团[Gp]可以为本领域技术人员已知的任何保护仲胺的基团。优选那些能够经受住用于合成间隔臂、用于将其连接到载体以及用于将其连接到分子单元[mo]的化学反应的基团。其可选自例如Ac、Bn(苄基)、C1～C40芳基(R)、Troc、z、TCA、BOC、Fmoc等，以便与间隔臂(I)的仲胺一起形成以下化学基团中的一种(＞N-表示受保护的仲胺)＞N-Ac乙酰胺(＞N-CO-Me)；＞N-Bn苯甲酰胺；＞N-RC1～C40芳酰胺；＞N-Troc氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(＞N-C(O)OCH2CCl3)；＞N-z氨基甲酸苄酯(＞N-C(O)OCH2Ph)；＞N-TCA三氯乙酰胺(＞N-CO-CCl3)；＞N-BOC氨基甲酸叔丁酯(＞N-C(O)OCMe3)；＞N-Fmoc氨基甲酸9-芴基甲酯 (Ph＝苯基并且Me＝甲基)。
根据本发明，优选地保护基团选自Ac、BOC或C1～C40芳基。
根据本发明，参与间隔臂官能化的分子[Gp]可以为例如C1～C40、例如C1～C30、例如C1～C20或C1～C10烷基或芳基。其可为任何取代基(不必需是保护性的)，当使用时，该取代基可参与间隔臂的官能化。其可以为例如疏水基，可以使得间隔臂相对于要进行连接的分子[mo]和/或其在间隔臂使用(例如，用在糖芯片或蛋白芯片上)过程中的作用变得更加特异的和/或更加有选择性的。
根据本发明，固相载体可以为例如任何可被硅烷化的载体。其可以是例如板、小珠(billes)或毛细管。其可以是例如基于硅土、玻璃或其他本领域技术人员已知的材料，例如用于制备生物芯片的载体或表面。载体的硅烷化可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
根据本发明，分子单元[mo]可为天然或合成的分子。例如由于分析的原因，其可为任何必须连接到载体的分子。其可以是小分子，例如具有在约180～400000g.mol-1范围内的分子量。当其是糖(sugar)时，[mo]可具有例如在180～10000g.mol-1范围内的分子量。当其是蛋白质或肽时，[mo]可具有例如在5500～400000g.mol-1范围内，通常在5500～220000g.mol-1范围内(大多数蛋白质的分子量)的分子量。
这种分子单元[mo]可为例如选自单糖、寡糖、多聚寡糖、糖缀合物、肽、蛋白质、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂、糖脂蛋白等。
在单糖之中，可以提到的是葡萄糖、葡萄糖胺、叠氮葡萄糖胺、D-核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、2-脱氧-D-核糖、L-岩藻糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-神经氨酸、D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-山梨醇、D-甘露醇等。
在寡糖之中，可以提到的是蔗糖，乳糖，硫酸乙酰肝素片段，肝素、软骨素、硫酸皮肤素的糖片段，刘易斯抗原等。
在多聚寡糖之中，可以提到的是硫酸乙酰肝素、肝素、软骨素、硫酸皮肤素等的糖部分。
在糖缀合物之中，可以提到的是硫酸乙酰肝素、肝素、软骨素、硫酸皮肤素等。
在肽和蛋白质之中，可以提到的是趋化因子、细胞因子(细胞活素)、胰岛素、纤维蛋白原、肌球蛋白、血红蛋白等。
在酶之中，可以提到的是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶。
在糖蛋白之中，可以提到的是免疫球蛋白G、透明质酸等。
在脂之中，可以提到的是水解类脂脂肪(甘油+3个脂肪酸)、蜡(脂肪酸+脂肪醇)、固醇酯(固醇+脂肪酸)、磷脂(磷脂酸(甘油、2脂肪酸+磷酸酯或磷酸盐))、磷脂质(甘油+2脂肪酸+磷酸酯或磷酸盐)、鞘脂(鞘氨醇+脂肪酸+磷酸酯或磷酸盐+氨基醇)；非水解类脂烷烃、类胡萝卜素、固醇(胆固醇)、类固醇(雌二醇、睾酮)、酸(脂肪酸)、二十酸等。
在脂肪酸之中，可以提到的是花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、月桂酸、神经酸、棕榈酸、油酸等。
在糖脂之中，可以提到的是半乳糖神经酰胺、葡(萄)糖神经酰胺、神经节苷脂、脑苷脂(脂肪酸+鞘氨醇+1糖)、神经节苷脂(脂肪酸+鞘氨醇+多个糖、神经氨酸)等。
在糖脂蛋白之中，提到的可以是MPB83(商标名)、GLP19(商标名)以及IRBP(商标名)。
本发明还涉及用于通过间隔臂(有利地为本发明的间隔臂)将分子单元[mo]共价连接到固相载体的方法。
该方法可包括以下步骤(i)还原下式的化合物的腈官能团 (ii)从下式的生物分子的烯丙基官能团形成醛官能团
(iii)在所述经还原的腈官能团和所述醛官能团之间，进行还原性胺化，接着对形成的仲胺进行保护，以便获得活化的生物分子，用于连接到载体，所述活化的生物分子为下式 (iv)固相载体硅烷化，以及具有下式的分子的硅烷化载体的官能化 (v)在使载体官能化的分子和活化的生物分子之间进行复分解反应，以便形成根据本发明的连接生物分子和载体的间隔臂。
在这个方法中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、R3以及[mo]为如上文所定义的。
根据本发明，下式的化合物
可以是例如烯丙基化的糖，[mo]为所述糖。这种烯丙基化的糖可通过本领域技术人员已知的任何方法获得，其中该方法不会损坏糖。其可以是例如在文献[5]中所描述的方法。
根据本发明，仲胺也可用保护基团进行保护。因此，本发明的方法还可包括将保护基团[Gp]连接到仲胺官能团上的步骤。保护基团可以是如上文所定义的。可通过本领域技术人员已知的任何化学方法将其连接到仲胺，例如根据在文献[7]中所描述的方法之一进行。
为了实现本发明这种方法的各个步骤，可使用本领域技术人员已知的常规的有机化学方法。这样，作为实例，对于腈还原的步骤，可使用在文献[6]中描述的方法。对于从生物分子的烯丙基官能团形成醛官能团的步骤，可使用在文献[5]中描述的臭氧分解方法。对于在经还原的腈官能团和所述醛官能团之间进行还原性胺化、接着对氮进行保护以便获得活化的生物分子的步骤，可使用在文献[7]中描述的方法。对于固相载体的硅烷化及其官能化的步骤，可使用在文献[8]中描述的方法。对于复分解反应，可使用在文献[10]中描述的方法。
因此，本发明的间隔臂可由相连的三个部分形成，首先，通过还原性胺化接着通过对在分子单元一侧的氮进行保护，其次，用格拉布斯(Grubbs)复分解反应。格拉布斯复分解是例如在文献[11]中所描述的。
插入碳链的氮原子具有若干优点在两个链段的连接过程中获得，其为可用各种方式进行保护的仲胺形式，以便赋予间隔物特定的反应性。该官能团可有利地按情况通过用各种保护基团或用参与间隔臂的官能化的分子进行调节，使得可以改变和控制间隔臂的亲水性或疏水性，并且控制其空间位阻。还有利地有可能调节间隔臂该部分的亲电/亲核或酸/碱性因此氮原子保护基团的性质优选为了优化反应、相互作用、包括表征或分析的操作的条件进行选择，无论在间隔区断裂以便释放分子单元之前或之后。例如，利用乙酰基基团，由于其小尺寸，所以获得较小的空间位阻，这在使用间隔臂，例如在分子芯片上使用时可使分子识别最优化。又例如，利用丁基基团，获得疏水碳基取代基，其使间隔臂的该部分具有疏水性，这使得例如亲水蛋白质对间隔臂的亲水部分的识别更具特定性和更具选择性([mo])。
因此，本发明提供了可调节的间隔臂(或“间隔物”)，其不同的结构影响臂的反应性，即，其化学和/或电化学和/或空间行为。
本发明可简单并有效地加以实现，并且间隔物有利地具有以下三种性能，尤其是当其用于糖芯片的制造时首先，间隔物成功地执行臂的功能，以将糖链与支撑该链的固体表面隔开；接着，隔离物是可断裂的臂这就有可能容易地并以靶向的方式打开间隔物，以便将糖从支撑相分离出来；最后，借助间隔物的较低程度的化学官能度，在用于例如糖单元上的有机合成过程中进行的反应的许多条件下和当使用糖芯片时，间隔物保持惰性。
除了本发明的上述优点外，发明人在进行各种实验过程中还注意到以下几方面由于存在固相载体，所以间隔臂使克服空间问题成为可能。其使得可以在良好空间条件下，研究蛋白质/糖在获得的糖芯片上的相互作用。其解决了空间位阻问题，该空间位阻问题是当蛋白质靠近糖配体时在现有技术中表现出来并且对后面潜在的相互作用有害。
可调节臂的长度不同大小的功能性同系物的一种明智的选择，尤其通过起始反应物的选择，使得制备不同大小的间隔物成为可能。
不仅有可能选择在糖链和固相载体之间的距离，而且有可能通过保护基团控制间隔物的这个部分的亲水或疏水性。
间隔物化学结构的简化，在制造它时和当使用糖芯片时，赋予间隔物在许多有机反应过程中的无化学活性的性能。
由于间隔物缺少相互作用的化学官能团，所以当系统用于糖芯片或更一般性地在小分子芯片的方面，间隔区对与其他分子的可能相互作用没有影响。
在不损坏生物分子、例如寡糖分子的反应条件下，可将间隔物在其C＝C双键处精确并选择性地断裂。实际上，可方便地使用例如臭氧(O3)分解、格拉布斯复分解(格拉布斯催化剂)、或二羟基化接着进行二醇锇化(diolosmylation)氧化断裂(OsO4、NaIO4)、以及本领域技术人员已知的其他温和化学反应用于所述断裂。
间隔区易于断裂并且这种断裂不会改变糖的结构的事实，使得可以对分离出来的寡糖链进行结构和构象的分析控制。还易于计算在糖合成过程中连接(“加载”)到固相载体的糖探针的数量。
相比于在文献[1]中描述的间隔物(例如，辛二醇)，这种间隔区的优点之一在于其长度、官能度、反应性以及空间位阻的适应性可如所希望的产生。
发明人还注意到，本发明的间隔物允许结合极大范围的糖、寡糖或多糖，该糖、寡糖或多糖非常普遍地被预先合成并在相对于它们还原部分的异头(anomerique)位置用烯丙基基团加以保护。实际上，这些糖单元可通过一个步骤进行转化，以便直接连接到间隔物上。因此，这种间隔物有利地与许多糖分子相容，如在文献例如在文献[7]、[12]以及[13]中已经合成并描述的。
本发明可用于例如糖芯片、例如能够通过筛选确定那些识别特定蛋白质的寡糖序列(例如根据在文献[1]中描述的技术)的芯片的制造。在这种应用中，本发明可以优化筛选方法，并因此更有效地和更快速地具有(disposer)用于治疗或生物技术用途的分子。可以预计，在本发明的其他应用中也存在这种能力。
本发明还可用到生物芯片上，在生物芯片中间隔臂必须形成固相载体和寡肽探针、寡核苷酸探针和/或寡糖探针之间的连接。尤其，本发明的间隔臂可用到寡肽芯片如在文献[3]中描述的芯片上，或用到寡糖芯片如在文献[4]中描述的芯片上。
通过阅读作为说明性的以下实施例，其他特征和优点对本领域的技术人员来说也将显而易见。
具体实施例方式
1)通过实施例，以下披露了利用那些选自本领域技术人员易得到的那些方法进行的间隔物的合成，该间隔物具有相应于十四个碳的链的长度。以下用黑体字的标记对应反应图解。
所选化合物为构成分子单元[mo]的葡萄糖型(1)的单糖(1)(N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNac)在1-位烯丙基化的糖)；带有待还原的腈官能团的4-戊烯腈(3)；以及用于载体官能化的7-辛烯基三甲氧基硅烷(8)。固相载体由基于二氧化硅的可控孔度玻璃珠(CPG)(商标名)(6)构成。
以下的反应图解概括了在这些实施例中采用的借助根据本发明的间隔臂用来将寡糖(1)连接到载体(6)的所有化学反应。这些化学反应用字母A到F表示。包括间隔臂断裂的反应的实例在以下的实施例G中提出。
对于这个反应图解，在糖上表示的基团“R”并没有有意地进行区分以便简化表述。这些“R”基团表示在形成糖的环上的各个位置的取代基，其可以彼此相同或不相同，并且其可以是通常在糖上遇到的取代基。在本文提出的具体实施例中，使用的糖为N-乙酰基葡萄糖胺，本领域技术人员可以毫无困难地确定在化合物(1)、(2)、(5)以及(10)的不同位置上的取代基“R”。
实施例A寡糖的活化(反应A)在这个实施例中使用了臭氧分解反应。在文献[5]中描述了所使用的该方法。
将在异头位置烯丙基化的糖(1)(0.93mmol)溶解在5ml的二氯甲烷和甲醇(1/1)的混合物中将介质侵入温度为-78℃的冷浴(丙酮+干冰)中。然后必须将臭氧O3鼓泡通入溶液中一出现蓝色(臭氧过量的特征)，就用氩气(或氮气)代替臭氧。反应完成时，通过加入二甲基硫Me2S(4.65mmol，5eq)对介质进行还原然后形成二甲基亚砜DMSO。过了整夜，介质慢慢地回复到环境温度，然后在真空下加以蒸发有机残留物用二乙醚Et2O进行提取，然后用水洗涤。将有机相在真空下蒸发，然后与甲苯一起共蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱(洗提液石油醚/乙酸乙酯8/2)加以纯化。
这样，以75％的产率获得醛(2)。
实施例B腈的还原(反应B)在文献[6]中描述了所使用的方法。
将氢化铝锂LiAlH4(381mg，10.03mmol，1eq)加入到新蒸馏的二乙醚(20ml)中。
将4-戊烯腈(3)(814mg，1ml，10.03mmol)慢慢加入到温度为0℃(冰浴)、氮气氛下进行搅拌的反应介质中。搅拌在环境温度下必须连续进行大约20分钟。
接着，将水(0.4ml)、然后是20％的氢氧化钠水溶液(0.3ml)、以及最后另一量的水(1.4ml)加入这些加入的进行必须十分小心，因为中和作用可能剧烈。当通过沉淀将二乙醚溶液与无机白色残留物分离时，萃取上清液。
用二乙醚洗涤白色固体(残留物)两次，并将有机相合并。将3M的盐酸HCl溶液加入到该有机相中，以便获得酸性pH(pH＜7)没有进行反应的4-戊烯腈保留在醚相中，而胺进入到水相中。
因此在萃取之后，保存水相并将3M的氢氧化钠NaOH溶液加入其中，以使pH变为碱性pH(pH＞7)然后胺化的产物在这次新的萃取中将进入醚相中。因此将萃取的醚相用硫酸镁(MgSO4)进行干燥，然后在真空下蒸发(旋转蒸发器)。
然后通过分馏(球炉，T≈96℃±9℃)将粗胺(4)纯化。
1H NMR分析(Brücker AM 250)
5.82(ddt，3Jtrans＝18Hz，3Jcis＝13Hz，3J(H1)＝6.5Hz，1H，CH＝)，5.00(m，2H，CH2＝)，2.70(t，3JII)＝6.5Hz，2H，CHIII)，2.10(ttd，3J(HII)＝6.5Hz，3J(HC)＝6.5Hz，3J(H2C-)＝1.5Hz，2H，CHI)，1.70(s，2H，NH2)，1.56(quint.，3J(HII)＝3J(HIII)＝6.5Hz，2H，CHII)。
13C NMR分析(Brücker AM 250)138.6(CH＝)，114.6(CH2＝)，42.0(CH2-N)，33.1(CH2)，31.4(CH2)。
实施例C还原性胺化(反应C)在文献[7]中描述了所使用的化学方法。
将醛(2)(20.87mmol)溶解到通过氢化钙(CaH2)新蒸馏的二甲基甲酰胺(1.2ml)中搅拌介质并加入胺(4)(31.30mmol，2eq)。在约20分钟后，将氰基硼氢化钠NaBH3CN(83.47mmol，4eq)加入到混合物中，将该混合物在环境温度下持续搅拌整夜。
如果反应没有完成，则可以再加入NaBH3CN(1eq)。接着，当反应完成时，将吡啶(2.4ml)和乙酸酐(83.47mmol，2eq/胺)加入到混合物中。
当反应完成(在加入之后约1小时)时，用二乙醚和水萃取粗化合物。将合并的有机相用硫酸镁(MgSO4)干燥，然后进行过滤、在真空下蒸发，然后与甲苯一起共蒸发。
然后通过硅胶色谱(洗提液环己烷/乙酸乙酯的梯度从7/3到5/5)纯化化合物(5)。
实施例D载体的官能化(反应D和E)在文献[7]中描述了所使用的化学方法。
在环境温度下，在去离子水(6ml)和99％的乙醇EtOH(8ml)的氢氧化钠NaOH溶液(700mg)中，将可控孔度玻璃珠(6)(CPG，500，2g)非常缓和地搅拌2小时。然后离心分离小珠(billes)，提取上清液，并用去离子水充分地洗涤小珠以便达到中性pH。
然后在真空(旋转蒸发器)下干燥小珠，并在用水洗涤、离心、干燥之前在环境温度下保持在盐酸溶液(0.2N HCl)中1小时，然后在80℃的保温箱中放置15分钟。然后用乙醇接着用甲苯(离心机)进行洗涤。
然后在参与随后的硅烷化步骤之前将它们进行干燥，反应混合物在使用之前已经制备了。
将CPG珠(7)引入到甲苯(45ml)、三乙胺Et3N(1.35ml)和7-辛烯基三甲氧基硅烷(8)(C11H24O3Si，M 232.39，100μl)的混合物中将反应介质在80℃(保温箱)放置16小时。
将小珠通过离心从混合物中提取出来，并用乙醇漂洗多次然后进行干燥(旋转蒸发器)。然后将它们在110℃的温度(保温箱)下放置3小时，以便实施交联步骤。
这样实现了硅烷化和交联步骤，必需中和在硅烷化步骤(“封端”)中还没有反应的表面硅烷醇的残余酸性和亲水性。将氯化三甲基硅烷TMSCl(109mg，130μl)和在二氯甲烷DCM(10ml)中的三乙胺(506mg，700μl)溶液加入到硅烷化的CPG珠中，并且将混合物在25℃下保持温和地搅拌2小时。
然后用二氯甲烷(离心机)、接着用乙腈(离心机)充分漂洗小珠。然后在真空(旋转蒸发器)下将它们加以干燥，并放置在保温箱(80℃)中以便完成干燥。
从而获得硅烷化的小珠(9)。
实施例F复分解反应(反应F)在文献[9]中描述了所使用的化学方法。
在氮气氛下，将硅烷化的CPG珠(9)(2g，30μmol/g)在二氯甲烷(20ml)中搅拌。然后将糖-间隔物体系(5)(300μmol，＞5eq)和格拉布斯催化剂(6μmol，5mg，0.1eq)加入到介质中。然后使反应介质发生回流，即，44℃的温度。
在6小时后，加入另一部分格拉布斯催化剂(6μmol，5mg，0.1eq)。将混合物在44℃下保持又一个6小时，然后回复到环境温度。
将小珠滤出，并用二氯甲烷和用乙醇(离心机)充分洗涤。然后将小珠在真空下加以蒸发以便干燥。
从而获得了糖珠(billes sucrées)(10)。
实施例A到F的反应图解 实施例G探针的断裂(反应G)在文献[10]中描述了所使用的化学方法。
当已获得体系(10)(本发明的固相载体-隔离区-寡糖链)时，可以断裂隔离物，而不使糖链变性。
在文献[5]中描述了实验方案。化学反应式如下 将含糖的CPG珠(10)在1/1的二氯甲烷/甲醇混合物中慢慢地搅拌。使介质达到-78℃的温度(丙酮+液氮)。
然后将臭氧O3鼓泡通入反应介质中直至出现蓝色。
接着，在用二甲基硫中和介质之前，将氩气鼓泡通入混合物中几分钟，然后留置反应介质整夜以回复到环境温度。
用二乙醚提取小珠，过滤，并用二乙醚和用水漂洗多次。
然后将小珠(12)放到一边，萃取(二乙醚/水)上清液，并且将有机相用硫酸镁(MgSO4)干燥、在真空下蒸发和与甲苯一起共蒸发。
从而获得产物(11)。
2)根据本发明的其他分子已利用上面披露的方法(实施例A到F)加以制备。在下面的实施例中将详细描述这些分子。
实施例H在这个实施例中，[mo]为通过其C-末端连接到本发明的间隔臂的RGD(Arg-Gly-Asp)肽。载体为如上面所披露的相同的载体。因此，在这个实施例中，用RGD代替了实施例A到F的反应图解的分子(1)。
由此获得RGD肽连接到其上的小珠。它们具有下式 [mo]通过C-末端连接的RGD肽(Arg-Gly-Asp)实施例I这个实施例使用如在实施例H中的相同的[mo]，但通过其N-末端连接到本发明的间隔臂。此外，在本发明的间隔臂的 中，X1为C并且n＝20。术语“C”当然是用来表示氢化的碳。
获得的小珠具有下式
[mo]通过N-末端连接的RGD肽实施例J在这个实施例中，[mo]为“唾液酸化的路易斯a因子(sialyl-Lewis a)”。载体与上面披露的方法中的载体一样。保护基团为Boc。其连接的化学方法是本领域技术人员已知的。
由此获得唾液酸化的路易斯a连接到其上的小珠。它们具有下式 [mo]为唾液酸化的路易斯a因子，其中“1”＝H和CH3实施例K在这个实施例中，[mo]为含硫酸盐的化合物。载体与上面披露的方法中的载体相同。
由此获得含硫酸盐的化合物连接到其上的小珠。它们具有下式
[mo]为含硫酸盐的化合物，Z为保护基团(例如在“发明内容”部分定义的Gp)在另一种方案中，碳X4用硫原子代替。获得相应的小珠。
实施例L在这个实施例中，[mo]为受保护的糖。载体与上面披露的方法中的载体相同。
由此获得受保护的糖连接到其上的小珠。它们具有下式 受保护的糖实施例M在这个实施例中，[mo]为唾液酸。载体与上面披露的方法中的载体相同。
由此获得唾液酸连接到其上的小珠。它们具有下式
唾液酸参考文献[1]WO-A-03/008927Dukler，N.Dotan，A.Shtavi，A.Gargir. H.M.I.Osborn，T.H.Khan，Tetrahedron，1999，55，1807-1850. D.A.Stetsenko，M.J.Gai，Bioconjugate Chemistry，2001，12，576-586. US-A-6,579,725P.H.Seeberger，R.B.Andrade. R.Roy，C.A.Laferriere，Canadian Journal of Chemistry，1990，68，2045-2054. L.H.Amundsen，L.S.Nelson，Journal of the American ChemicalSociety，1951，73，242-244. J.F.Tolborg，K.J.Jenson，Chemical Communication，2000，147-148. F.Vinet，A.Hoang，EN 00 16940. K.Biswas，D.M.Coltart，S.J.Danishefsky，Tetrahedron Letters，2002，43，6107-6110. C.Sylvain，A.Wagner，C.Miokowski，Tetrahedron Letters，1997，38，1043-1044. Q.J.Plante，E.R.Palmacci，P.H.Seeberger，Science，2001，291，1523-1527. P.H.Seeberger，Chem.Com.，2003，1115-1121. D.M.Ratner，E.R.Swanson，P.H.Seeberger，Org.Lett.2003，4717-4720.
权利要求
1.下式(I)的分子间隔臂 -其中X0和X4为可进行调节的取代基以便使[mo]和[Sup]通过所述间隔臂进行连接，X0和X4不同于H并且各自独立于间隔臂的其他取代基地选自C、O、N、S、Se、P、As和Si；以及-其中，取代基X1、X2、X3、Z1、Z2、R1、R2和R3为如下X1、X2和X3各自独立于其他取代基地选自C、O、N、S、Se、P、As和Si，以及选自各含有2至20个碳原子的芳基和杂芳基；Z1和Z2各自独立于其他取代基地选自C-R、Si-R、C、N、P以及As，其中R为含有1至40个碳原子的烷基；R1、R2和R3各自独立于其他取代基地选自H、烷基、芳基以及杂芳基，每个含有2至20个碳原子；[Gp]表示保护仲胺-N-的基团或参与间隔臂官能化的分子；-其中，n、m以及p各自为大于或等于1的整数并彼此独立地进行选择，优选地使得1≤n、m和p≤40；-其中，[Sup]表示H或硅烷化固相载体，所述间隔臂可共价连接到所述载体上；以及-其中，[mo]表示H或用于通过所述间隔臂共价连接到所述硅烷化固相载体的分子单元。
2.根据权利要求1所述的间隔臂，其中，X0和X4独立于其他取代基地选自C、O、N、S及Si；和/或X1、X2和X3独立于其他取代基地选自C、O、N、S和Si，以及选自各含有2至10个碳原子的芳基和杂芳基；和/或Z1和Z2独立于其他取代基地选自C、N、C-R及Si-R，其中R为含有1至30个碳原子的烷基；和/或R1、R2和R3独立于其他取代基地选自H、烷基、芳基以及杂芳基，每个含有2至10个碳原子。
3.根据权利要求1所述的间隔臂，其中，所述保护基团[Gp]选自Ac、苄基、C1～C40芳基、Troc、z、TCA、BOC以及Fmoc。
4.根据权利要求1所述的间隔臂，其中，所述固相载体[Sup]，当其存在时，选自板、小珠和毛细管。
5.根据权利要求1或4所述的间隔臂，其中，所述[Sup]是基于二氧化硅或玻璃的。
6.根据权利要求1所述的间隔臂，其中，所述[mo]，当其存在时，为分子量在180～400000g.mol-1范围内的分子。
7.根据权利要求1所述的间隔臂，其中，所述[mo]，当其存在时，选自单糖、寡糖、多聚寡糖、糖缀合物、肽、蛋白质、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂以及糖脂蛋白。
8.根据权利要求1所述的间隔臂，其中，所述[mo]，当其存在时，为糖。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的间隔臂的应用，用于将分子单元[mo]连接到硅烷化的固相载体[Sup]上。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述[mo]为分子量在180～400000g.mol-1范围内的分子。
11.根据权利要求9所述的应用，其中，所述[mo]选自单糖、寡糖、多聚寡糖、糖缀合物以及天然或合成的小分子；并且所述[Sup]表示所述间隔臂可连接到其上的硅烷化固相载体。
12.根据权利要求9所述的应用，其中，所述[Sup]选自板、小珠或毛细管。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述[Sup]是基于二氧化硅或玻璃的。
14.根据权利要求9到13中任一项所述的应用，用于制备生物芯片。
15.根据权利要求9到13中任一项所述的应用，用于制备糖芯片。
16.用于通过间隔臂将分子单元[mo]共价连接到载体的方法，所述方法包括以下步骤(i)还原下式化合物的腈官能团 (ii)从下式的生物分子的烯丙基官能团形成醛官能团 (iii)在所述经还原的腈官能团和所述醛官能团之间，进行还原性胺化，接着对形成的仲胺进行保护，以便获得用于连接到载体上的活化的生物分子，所述活化的生物分子为下式 (iv)使固相载体硅烷化，以及使具有下式的分子的所述硅烷化的固相载体官能化 (v)在使载体官能化的所述分子和所述活化的生物分子之间进行复分解反应，以便形成根据本发明的连接所述生物分子和所述载体的间隔臂；在所述方法中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、R3以及[mo]为根据权利要求1所定义的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，下式的化合物为烯丙基化的糖，所述[mo]为所述糖，
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述[Sup]选自板、小珠或毛细管。
19.根据权利要求16或18所述的方法，其中，所述[Sup]为基于二氧化硅或玻璃的。
20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述[mo]为分子量在180至400 000g.mol-1范围内的分子。
21.根据权利要求16所述的方法，其中，所述[mo]选自单糖、寡糖、多聚寡糖、糖缀合物、肽、蛋白质、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂以及糖脂蛋白。
22.根据权利要求16所述的方法，其中，所述[mo]为糖。
23.根据权利要求16所述的方法，还包括由将保护基团[Gp]连接到所述仲胺官能团上构成的步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述[Gp]选自Ac、苄基、C1～C40芳基、Troc、z、TCA、BOC以及Fmoc。
25.根据权利要求16到24中任一项所述的方法在制备生物芯片中应用。
26.根据权利要求16到24中任一项所述的方法在制备糖芯片中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子间隔臂、用于将分子单元连接到固相载体的方法、以及该间隔臂在包含分子或生物分子的分析芯片上的应用。所述间隔臂具有以上化学式(I)，其中，X
文档编号G01N33/543GK1922195SQ200580005558
公开日2007年2月28日 申请日期2005年2月22日 优先权日2004年2月25日
发明者韦罗妮克·佩雷蒂, 弗朗索瓦丝·维内, 达维德·博纳夫 申请人:法国原子能委员会