荧光偏振分析的制作方法

专利名称：荧光偏振分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用荧光偏振的方法和系统来鉴定具有调节高级糖化终产物受体(RAGE)能力的化合物。
背景技术：
蛋白质或脂质与醛糖的温育导致了非酶促的蛋白质上氨基基团的糖化和氧化从而形成了阿马杜里加合物(Amadori adducts)。随着时间的流逝，该加合物历经了额外的重排，脱水，以及与其它蛋白质的交联从而形成了称为高级糖化终产物(AGEs)的复合物。那些促进AGEs形成的因素包括延迟的蛋白转换(例如，在淀粉样变(amyloidoses)中的情况)，具有较高赖氨酸含量的大分子的积累，以及较高的血糖水平(例如，在糖尿病中的情况)(Hori et al，J.Biol.Chem.27025752-761，(1995))。AGEs与多种失调相关，包括与糖尿病和自然老化相关的并发症。
AGEs表现出与单核细胞，巨噬细胞，微脉管系统的内皮细胞，平滑肌细胞，mesengial细胞，和神经元的细胞表面受体具有特异性和饱和性结合。高级糖化终产物受体(RAGE)是细胞表面分子的一个免疫球蛋白超家族的成员。RAGE的细胞外结构域(N-末端)包括三个免疫球蛋白类型的区域一个V(可变)型结构域紧接两个C-型(恒定)结构域(Neeper et al，J.Biol.Chem.，26714998-15004(1992)；Schmidt et al，Circ.(Suppl.)96#194(1997))。单个跨膜结构域和较短的，高度荷电的细胞质溶质尾部紧随细胞外结构域。可通过RAGE的蛋白质水解或分子生物学方法分离N-末端的细胞外结构域，从而生成包括V结构域和C结构域的可溶性RAGE(sRAGE)。
RAGE在大多数组织中都有表达，尤其是在胚胎形成过程中的皮质神经元中有发现(Hori et al.，J.Biol.Chem.，27025752-761(1995))。在衰老的组织(Schleicher et al，J.Clin.Invest，99(3)457-468(1997))，糖尿病患者的视网膜，脉管系统和肾脏中也发现有RAGE的水平有所升高(Schmidt et al，Nature Med.，11002-1004(1995))。在不同组织和器官中RAGE的活化产生了众多的病理生理性后果。RAGE与众多疾病有关，包括急性和慢性炎症(Hofmann et al.，Cell(Hofmann etal，Cell 97889-901(1999))，诸如血管通透性升高的糖尿病患者晚期并发症的发展(Wautier et al，J.Clin.Invest，97238-243(1995))，(Wautieret al，J.Clin.Invest，97238-243(1995)，肾病(Teillet et al，J.Am.Soc.Nephrol，111488-1497(2000))，动脉粥样硬化(Vlassara et al，TheFinnish Medical Society DUODECIM，Ann.Med.，28419-426(1996))，和视网膜病(Hammes et al，Diabetologia，42603-607(1999))。RAGE还与阿尔茨海默病(Yan et al，Nature，382685-691(1996))，Yan et al，Nature，382685-691(1996)，勃起功能障碍和肿瘤侵入和转移(Taguchi etal，Nature，405354-357(2000))相关。
除了AGEs之外，还有其它的化合物可以结合于RAGE并对其进行调节。在正常发育过程中，RAGE与amphoterin相互作用，其是在培养的胚胎神经元中介导轴突生长出来的多肽(Hori et al，1995)。RAGE还表现出与羧甲基赖氨酸(CML)，类钙粒蛋白配体和β-淀粉样蛋白相互作用(Yan et al，Nature，389589-595，(1997)；Yan et al，Nature，382685-691(1996)；Yan et al，Proc.Natl.Acad.ScL，945296-5301(1997。
已经显示，对于RAGE的结合配体，例如AGEs，s100b/钙粒蛋白，β-淀粉样蛋白，CML(Nε-羧甲基赖氨酸)，和amphoterin都可以对多种基因的表达进行修饰。例如，在许多细胞类型中，RAGE和其配体之间的相互作用产生了氧化胁迫，从而导致自由基敏感的转录因子NF-κB的活化，以及诸如细胞因子IL-1β，TNF-α等NF-κB调节基因的活化。此外，还发现那些包括p21ras，MAP激酶，ERK1和ERK2的若干其它调节途径可由AGEs和其他配体与RAGE的结合得到活化。实际上，RAGE本身的转录也至少由NF-κBκB部分调节的。因此，由配体结合启动的阳性反馈循环刺激了逐渐增加并且通常是有害的螺旋上升(spiral)。
生理性配体与RAGE结合的拮抗可以是由过量浓度的AGEs和其他RAGE配体所引起的病理生理性变化下调的逻辑目的。通过降低内源配体对RAGE的结合，可以减轻与RAGE介导的疾病相关的症状。因此，亟需发现调节生理性配体与RAGE受体结合的化合物的方法。
发明概述本发明的实施方案提供了使用了荧光偏振的方法和系统来鉴定具有调节高级糖化终产物受体(RAGE)能力的化合物。本发明可以包括发现能调节生理性配体与RAGE结合的化合物的分析方法与和/或系统。
在一个实施方案中，本发明包括检测RAGE调节物的方法，包括提供(i)含有RAGE配体结合结构域的RAGE多肽，(ii)荧光RAGE配体，和(iii)目的化合物。所述方法可以还包括向所述RAGE多肽中加入所述目的化合物和荧光RAGE配体，并测定所述荧光RAGE配体的偏振。
在另一个实施方案中，本发明包括检测RAGE调节物的系统。所述系统可以包括如下成分的单独包装的容器(a)荧光RAGE配体；(b)包括RAGE配体结合结构域的多肽；和(c)在目的化合物存在条件下用于稀释(a)和(b)的至少一种分析试剂，因此可以对所述荧光RAGE配体与含有RAGE配体结合结构域的多肽的结合进行定量。在一个实施方案中，所述系统可以还包括作为阳性对照的对RAGE配体结合结构域具有充分结合亲和性的未标记的RAGE配体。
有众多的优点与本发明的特殊实施方案有关。例如，本发明的方法和系统可以测定生理性配体与RAGE的结合以及对这种结合的修饰。同样，本发明的方法和系统可以允许对所述目的化合物与RAGE的结合能力，或所述目的化合物对生理性配体与RAGE结合的调节能力进行定量。
通过去除众多与传统结合分析相关的洗涤步骤，本发明的方法和系统可提供适于多种化合物的高通量，自动化筛选。因此，本发明的方法和系统可提供适于潜在RAGE调节物的快速分析。
同样，因为所述方法和系统包括表现出高亲合性，可定量结合于RAGE的分析试剂，所以该分析可提供敏感和高度特异性的分析系统来检测具有结合于RAGE，和/或对其进行调节的潜在的化合物。
同样，本发明的方法和系统可以提供一种安全和可靠的分析系统，其不会受到许多通常使用放射性标记试剂的系统安全和处置方面考虑的限制。所述分析使用的是对实验室人员或环境没有威胁的非放射性标记试剂。
所述方法可以利用全长RAGE蛋白，或含有RAGE配体结合结构域的RAGE多肽，作为敏感的体外试剂来对大量的潜在RAGE调节物进行筛选，从而鉴定出那些可以在体内调节由RAGE介导的生物活性的分子。通过改变所用荧光配体的性质，有可能鉴定出在结构和生理效果上有别的调节物。
当然，在下文中会对本发明的其他特征进行描述。应该理解本发明的应用并不局限于下述权利要求，说明内容和附图所示的细节。本发明还能够具有其它的实施方案并且可以多种方式实现或实施。


参考以下附图，本发明的许多特征，方面和优点会变得更加显而易见。
图1所示为使用荧光偏振测定RAGE-配体相互作用的示意图，其中图(A)所示为荧光配体(三角形)与RAGE的结合导致了所述荧光配体的较高的微偏振(mP)值，而图(B)所示为根据本发明其他实施方案，由未标记RAGE配体(矩形)伴随的微偏振(mP)值的降低所引起的荧光配体(三角形)与sRAGE结合的降低。
图2所示(A)SEQ ID NO1，GenBank/EMBL数据库中报道的，登录号为XM004205的人类RAGE的氨基酸序列；(B)SEQ ID NO2，人类sRAGE的氨基酸序列；(C)SEQ ID NO3，人类RAGE的V-结构域的氨基酸序列；(D)SEQ ID NO4，人类RAGE的V-结构域的N-末端片段；和(E)SEQ ID NO7，根据本发明的其他实施方案，人类sRAGE的其他的氨基酸序列。
图3所示为SEQ ID NO5，人淀粉样蛋白-β(1-40)的氨基酸序列；和SEQ ID NO6，人淀粉样蛋白β(1-42)的氨基酸序列。
图4所示为根据本发明的其他实施方案，可与荧光淀粉样蛋白β(F1-淀粉样蛋白β)竞争结合sRAGE的多种RAGE配体。
图5所示为根据本发明的一个实施方案，DMSO对荧光淀粉样蛋白β与sRAGE结合的影响。
图6所示为含有RAGE配体结合结构域的RAGE多肽(例如，sRAGE)和抗-RAGE抗体(例如，Ab)复合作为使游离荧光配体(三角形)的微偏振变化大于受体结合荧光配体的一种手段的示意图。
图7所示为根据本发明的其他实施方案，对RAGE和荧光淀粉样蛋白β(1-40)之间的相互作用进行抑制有机小分子拮抗剂的图。
发明详述本发明涉及使用高通量分析来发现可调节RAGE活性的化合物。在大体上保持RAGE配体结合结构域的生理和结构完整性的条件下，所述方法的实施方式测定了目的化合物调节荧光RAGE配体与RAGE蛋白的结合能力，或与包括配体结合结构域的RAGE片段的结合能力。随后可以对这些能够调节配体与RAGE结合的化合物的生理活性进行分析。
在一个实施方案中，本发明包括测定能够调节RAGE配体与RAGE配体结合结构域结合的化合物的方法。所述方法包括如下步骤(a)提供(i)含有RAGE配体结合结构域的RAGE多肽，(ii)荧光RAGE配体，和(iii)目的化合物；(b)向所述RAGE多肽中加入目的化合物和荧光RAGE配体；和(c)测定所述荧光RAGE配体的偏振。
所述方法还包括将所述荧光RAGE配体的偏振水平与结合于所述RAGE多肽的荧光RAGE配体的量进行相关分析。在一个实施方案中，当所述荧光RAGE配体结合于所述含有RAGE配体结合结构域的RAGE多肽时，所述荧光RAGE配体的偏振会增强。因此，溶液中游离荧光配体的微偏振值可以低于结合于第二分子(例如，RAGE多肽)的相同荧光配体的微偏振值。如果未标记的目的化合物能够有效地竞争与RAGE多肽的结合，那么就可以将所述荧光RAGE配体从RAGE多肽中置换出来，由此降低偏振的测定水平。在目的化合物完全置换了荧光RAGE配体的情况下，偏振可降低到游离(即，未结合)荧光RAGE配体的可见水平。
所述分析可提供结合亲合性的定量测定。例如，所述分析可以在存在变量目的化合物的前提下，测定结合于RAGE多肽的荧光RAGE配体的量。在一个实施方案中，可在将荧光RAGE配体与RAGE多肽的结合降低到预定量所需要的目的化合物的量的基础上，测定所述目的化合物对于RAGE配体结合结构域的亲和性的值。因此，所述系统可包括在不同量目的化合物存在的前提下，对结合于RAGE多肽的荧光RAGE配体量进行比较的步骤。如果目的化合物竞争性地从RAGE配体结合结构域替换了荧光RAGE配体，那么偏振水平就会随着未标记的目的化合物的增加而降低。
可以将所述目的化合物与对RAGE或含有RAGE配体结合结构域的多肽具有不同亲和性的其他化合物进行比较。因此，在一个实施方案中，可以将所述目的化合物降低荧光RAGE配体与RAGE多肽结合的能力与第二化合物降低荧光RAGE配体与RAGE多肽结合的能力进行比较。在一个实施方案中，第二化合物并未充分结合于RAGE配体结合结构域，因此第二化合物可用作测定与RAGE配体结合结构域结合的阴性对照。
例如，本发明的方法可包括将目的化合物与荧光RAGE配体竞争结合于RAGE配体结合结构域的能力与不结合于具有生理特异性的RAGE配体结合结构域的第二化合物的竞争能力进行比较。以这样的方式，可以对所述目的化合物的效果进行解释。因此，当所述目的化合物从RAGE多肽中置换出荧光配体时，却需要类似于阴性对照化合物的置换的浓度，这有可能是所述目的化合物并未以较高亲和性与RAGE配体结合结构域相结合。在其他实施方案中，阴性对照可以是与RAGE结合的解离常数(Kd)大于1mM，或者大于100μm，或者大于50μM，或者大于20μM，或者大于10μM，或者大于5μM的分子。
或者，第二化合物可具有对RAGE配体结合结构域的充分结合亲和性，因此第二化合物可作为测定与RAGE配体结合结构域相结合的阳性对照。以这种形式，可以分析与阳性对照相比所述目的化合物对RAGE结合的相对亲和性。因此，在类似于阳性对照化合物的替换浓度的条件下，当所述目的化合物从RAGE多肽中替换出了荧光配体时，目的化合物可以较高亲和性结合于RAGE配体结合结构域。在一个实施方案中，所述阳性对照可以包括以充分结合亲和性结合于RAGE的小分子RAGE拮抗剂。在其他实施方案，阳性对照可以是与RAGE结合的解离常数(Kd)小于1μM，或小于200nM，或小于50nM，或小于10nM的分子。
在一个实施方案中，第二化合物可以包括所述目的化合物的化学和/或结构变体的实验分子。通过比较目的化合物与该目的化合物化学和/或结构变体的第二化合物的相对亲和性，可以确定特定的化学和/或结构变体对与RAGE多肽的结合亲和性的影响。以这种方式，所述分析可用来定义RAGE配体的结构-活性关系(SAR)。
本发明还可包括对具有调节配体与RAGE结合和/或RAGE活性能力的化合物进行检测的系统。在一个实施方案中，本发明包括对调节配体与RAGE的结合的化合物进行检测的系统，其包括如下成分的单独包装的容器(a)荧光RAGE配体；(b)包括RAGE配体结合结构域的RAGE多肽；和(c)在目的化合物存在条件下用于稀释(a)和(b)的至少一种分析试剂，因此可以对所述荧光RAGE配体与含有RAGE配体结合结构域的多肽的结合进行定量。
所述系统允许对配体与RAGE的结合进行定量分析。因此，在一个实施方案中，所述系统包括测定所述荧光配体偏振的装置。
使用本发明的系统，可以对目的化合物与对RAGE或含有RAGE配体结合结构域的多肽具有不同亲和性的化合物进行比较。因此，在一个实施方案中，可以将所述目的化合物降低荧光配体与RAGE多肽结合的能力与对RAGE配体结合结构域具有预定结合亲和力的化合物降低所述荧光配体与RAGE多肽结合的能力进行比较。在一个实施方案中，具有对RAGE配体结合结构域预定结合亲和性的化合物并未成分结合于RAGE结合结域，因此第二化合物可作为阴性对照来对RAGE配体结合结构域的结合进行测定。或者，第二化合物可以具有对RAGE结合结构域的预定结合亲和性，因此第二化合物可作为阳性对照来测定对RAGE配体结合结构域的结合。在一个实施方案中，所述阳性对照可以包括具有充分结合亲和性的结合于RAGE的小分子RAGE拮抗剂。
第二化合物可包括所述目的化合物的化学和/或结构变体的实验分子。通过比较目的化合物与该目的化合物化学和/或结构变体的第二化合物的相对亲和性，可以确定特定的化学和/或结构变体对于RAGE多肽的结合亲和性的作用。以这种方式，所述分析可用来定义RAGE配体的结构-活性关系(SAR)。在一个实施方案中，所述系统可以包括计算机系统和/或软件来分析多种目的化合物的SAR结果。
在一个实施方案中，含有RAGE配体结合结构域的RAGE多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO1的多肽，或与SEQ ID NO1具有90％同一性的序列，或SEQ ID NO1的片段。在一个实施方案中，与SEQ ID NO1具有至少90％同一性的序列可包括第一个氨基酸是甲硫氨酸(M)而不是甘氨酸(G)。
RAGE的片段可包括公知的以较高亲和性结合于RAGE配体的多肽。SEQ ID NO1的片段可包括如氨基酸序列SEQ ID NO2定义的人类sRAGE，或与SEQ ID NO2具有90％同一性的序列，或SEQ IDNO2的片段。在一个实施方案中，与SEQ ID NO2具有至少90％同一性的序列可以包括以甲硫氨酸(M)而不是甘氨酸(G)作为第一个氨基酸的重组sRAGE(例如，SEQ ID NO7)。
或者，SEQ ID NO1的片段可包括如氨基酸序列SEQ ID NO3，或与SEQ ID NO3具有90％同一性的序列，或SEQ ID NO3的片段序列定义的人类RAGE的V结构域。所述V结构域被鉴定为sRAGE和RAGE的配体结合区域(参见，例如WO99/18987)。
或者，可以使用V-结构域的片段。在一个示例实施方案中，SEQ IDNO1的片段可以包括如氨基酸序列SEQ ID NO4，或与SEQ ID NO4具有90％同一性的序列所定义的人类RAGE的V结构域。或者，SEQID NO4的片段可用作RAGE配体结合结构域。
本发明的方法和系统都可以包括多种荧光配体。在一个实施方案中，所述荧光RAGE配体可以包括淀粉样β多肽。例如，在其他实施方案中，所述荧光RAGE配体可以包括具有氨基酸序列SEQ ID NO5的人淀粉样蛋白β(1-40)，或包括具有氨基酸序列SEQ ID NO6的人淀粉样蛋白β(1-42)。在一个实施方案中，所述荧光团可附着于所述淀粉样β多肽的氨基末端从而产生荧光配体。或者，所述荧光团可附着于所述淀粉样β多肽的羧基末端从而产生荧光配体。在其他实施方案中，所述荧光团可附着于沿着所述多肽链长度的其它残基上。
在另一个实施方案中，所述荧光RAGE配体可以包括高级糖化终产物。例如，所述荧光RAGE配体可以包括荧光羧甲基赖氨酸或者荧光羧甲基赖氨酸修饰的AGE。或者，所述荧光RAGE配体可包括荧光基团或荧光S-100b标记的钙粒蛋白。或者，所述荧光RAGE配体可以包括amphoterin或者含有分子量低于1000道尔顿的有机小分子。
只要所述荧光团不能显著干扰配体与RAGE配体结合结构域的结合，就可使用多种荧光团来标记目的RAGE配体。在一个实施方案中，可使用荧光素标记RAGE配体。或者，还可以使用其他的荧光团，例如，但不限于，荧光黄，曙红，碘化丙啶(propidium iodide)，若丹明(即，四甲基若丹明或者丽丝胺若丹明B)，花青苷3(Cy3)，花青苷5(Cy5)，德克萨斯红(Texas Red)，或者别藻蓝素(allophycocyanin)。所述荧光团的优选激发/发射最大值依赖于个体荧光团和所述荧光团与RAGE配体偶联的性质。
可使用本领域公知的方法使用荧光团来标记RAGE配体。例如，标记核酸和肽的试剂盒都是商业可获得的(例如，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；EMP Biotech，GmbH)。可通过将荧光团和RAGE配体的化学偶联将所述荧光团整合在内。例如，在一个实施方案中，为了制备淀粉样蛋白β，使用5-羧基-荧光素在其N末端对所述多肽进行标记。荧光淀粉样β肽是商业可获得的(例如，rPeptide，Athens，GA；Biosource，Camarillo，CA)。
在本发明的方法或系统的选定实施方案中，包括RAGE结合结构域的多肽可连接于第二种非RAGE多肽，或可以与第二种非RAGE多肽复合。第二种多肽可包括免疫球蛋白结构域。在一个实施方案中，含有RAGE配体结合结构域的多肽可以与识别和结合于含有RAGE配体结合结构域的多肽的抗体复合。所述抗体可包括多克隆抗体。或者，所述抗体可以包括单克隆抗体。通过允许包括RAGE配体结合结构域的多肽与抗RAGE的抗体复合，含有RAGE结合位点的构建体的尺寸会增加，由此导致荧光配体与RAGE多肽结合后偏振极大地增加。
在一个实施方案中，可以使用针对sRAGE的抗体。例如，sRAGE可用作含有RAGE配体结合结构域的多肽，而抗-sRAGE抗体可允许与sRAGE复合。
含有RAGE配体结合结构域的多肽可以在与荧光配体和/或目的化合物结合之前与抗RAGE抗体复合。或者，含有RAGE配体结合结构域的多肽可以在与荧光配体和/或目的化合物结合的同时与抗RAGE抗体复合。在又一个实施方案中，含有RAGE配体结合结构域的多肽可以在RAGE多肽与荧光RAGE配体和/或目的化合物结合之后与抗RAGE抗体复合。
本发明涉及使用生理性相关结合分析来发现具有调节RAGE活性能力的化合物。因此，在另一实施方案中，本发明包括由本发明方法和/或系统鉴定的具有调节荧光配体与RAGE结合能力的化合物。在一个实施方案中，具有调节荧光配体和RAGE结合能力的通过本发明方法和/或系统鉴定的化合物可以结合于RAGE的配体结合结构域。或者，具有调节荧光配体和RAGE结合能力的通过本发明方法和/或系统鉴定的化合物可以与RAGE相互作用而不结合于配体结合结构域。同时，具有调节荧光配体和RAGE结合能力的通过本发明方法和/或系统鉴定的化合物可以用作RAGE激动剂。或者，具有调节荧光配体和RAGE结合能力的通过本发明方法和/或系统鉴定的化合物可以用作RAGE拮抗剂。
在一个实施方案中，目的化合物可以包括有机小分子。例如，所述化合物可以包括有机小分子RAGE拮抗剂。在一个实施方案中，所述有机小分子的分子量低于1000道尔顿子。在其他实施方案，所述有机小分子的分子量范围可从约400至900道尔顿，或者从约500至约800道尔顿。
使用本发明的方法和/或系统可对其他类型的潜在RAGE调节物进行鉴定。因此，目的化合物和潜在的RAGE调节物可以包括多肽。或者，目的化合物和潜在的RAGE调节物可以包括肽模拟物(peptidomimetic)。或者，目的化合物和潜在的RAGE调节物可以包括无机化合物。同样，目的化合物和潜在的RAGE调节物可以包括脂质。在其他实施方案中，目的化合物和潜在的RAGE调节物可以包括碳水化合物。同样，目的化合物和潜在的RAGE调节物可以包括核酸。
使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可配制成组合物对处于患有RAGE介导的疾病或综合症的危险中或者患有该疾病活综合症的患者进行给药。如本文所述，公知RAGE参与多种可介导各种疾病状态的细胞过程。经过与RAGE相互作用，并且对AGEs进行加工，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用作治疗剂。
例如，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗淀粉样变(amyloidoses)。在一个实施方案中，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗阿尔茨海默病。或者，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗糖尿病和/或糖尿病晚期并发症的症状。在另一个实施方案中，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗癌症。又或者，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗炎症。在另一个实施方案中，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗肾衰竭。或者，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗系统性狼疮肾炎或者炎症性的狼疮肾炎。同样，使用本发明方法和/或系统鉴定的化合物可用来治疗能勃起机能障碍。在又一个实施方案中，使用本发明方法和系统鉴定的化合物可用来治疗中风或者心脏病发作。
在一些实施方案中，用来治疗RAGE介导病症的组合物可包括至少一种其他的治疗剂。例如可以使用含有至少一种烷化剂，抗代谢物，植物碱，抗生素，激素，生物反应修饰剂，止痛剂，NSAID，DMARD，糖皮质激素，磺酰脲类，缩二胍，胰岛素，胆碱酯酶抑制剂，安定药，抗抑郁药，或者抗惊厥剂的其他治疗剂。
定义以下定义可以用来帮助理解对本文的描述。除非另有指出，在此使用的所有技术和科学术语都与本领域所属普通技术人员通常理解的意思相同。
除非在文中另有所指，在此使用的术语“a”或者“an”都是指超过一个的对象。除非在文中另有所指，在此使用的术语“或者”和“和/或”是可以相互替换的。
“配体”是结合于受体形成复合物的分子。
“调节物”是可与第二分子和/或分子复合物物理性相互作用，从而引起第二分子或复合物的至少一个特征发生变化的分子。所述改变可包括第二分子和/或复合物的化学改变(例如，化学键的形成；净电荷的改变)，物理改变(例如，三维结构的改变)，和/或生物活性改变(例如，催化活性的改变)。
“激动剂”包括与受体结合形成引发针对所涉及的受体的特异性药理学反应的复合物的化合物。
“拮抗剂”包括与激动剂或受体结合形成不能引起显著的药理学反应但是能够抑制由激动剂诱导的生物应答的复合物的化合物。
因此RAGE激动剂可以结合RAGE并刺激RAGE介导的细胞加工，并且RAGE拮抗剂可以抑制RAGE介导的有RAGE激动剂刺激的加工。例如，由RAGE刺激的细胞加工可以包括TNF-α基因转录或者NF-κB基因转录或者其他细胞加工的活化。
“多肽”和“蛋白质”在本文中是可以相互替换的，从而对包括部分或全长蛋白的蛋白质分子进行描述。
正如在本文中所使用的，“有机小分子”是分子量低于2,000道尔顿含有至少一个碳原子的分子。
“多肽结构域”包括具有独立单位的沿着多肽的结构域。可以使用结构，序列和/或生物活性的术语对结构域进行定义。在一个实施方案中，多肽结构域可以包括以显著独立于所述蛋白其他部分的方式进行折叠的蛋白结构域。可以使用例如，但不限于PFAM，PRODOM，PROSITE，BLOCK，PRINTS，SBASE，ISREC PROFILE，SAMRT，和PROCLASS的结构域数据库对结构域进行鉴定。“配体结合结构域”是结合于配体的多肽结构域。
“免疫球蛋白结构域”是与免疫球蛋白结构域结构同源，或同一的氨基酸序列。免疫球蛋白结构域的氨基酸序列长度可以是任意长度。在一个实施方案中，免疫球蛋白结构域可以小于250个氨基酸。在一个示例实施方案中，免疫球蛋白结构域的长度可以是约80-150氨基酸。
术语“多克隆抗体”是指于使用目的抗原免疫动物血清得到的抗体分子的异源群。可以使用诸如弗氏(完全和不完全)佐剂，多肽，油乳剂，溶血卵磷脂，多元醇，聚聚阴离子等来增强免疫反应。例如，可以使用本领域公知的方法将添加有佐剂的sRAGE注射兔子来制备针对sRAGE的多克隆抗体(例如，Schmidt et al，J.Biol.Chem.，2Schmidt et al，J.Biol.Chem.，26714987-14997(1992))。
“单克隆抗体”是指针对特定抗原的同源抗体群，其通常是由提供培养中的连续细胞系产生抗体的任一技术得到的(参见，例如美国专利第4,873,313号)。例如，使用本领域公知的方法可使用sRAGE蛋白生产单克隆抗体(Zymed Laboratories，San Francisco，CA)。
“核酸”是例如脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)的多核苷酸。该术语包括单链核酸，双链核酸，以及从核苷酸或核苷酸类似物制备的DNA和RNA。
那术语“载体“是指可用来将第二核酸分子转入细胞的核酸分子。在一个实施方案中，载体允许对插入所述载体的DNA序列进行复制。载体可包括至少在某些宿主细胞中增强核酸分子表达的启动子。载体可以自主复制(染色体外)或者可以整合入宿主细胞的染色体中。在一个实施方案中，载体可包括表达载体，其能够从插入所述载体的至少部分核酸序列产生蛋白。
术语“百分比同一性”是指两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的序列同一性。百分比同一性可以通过对两条序列进行比对进行确定并且是指所比较的序列相同位置上相同残基(即，氨基酸或核苷酸)的数量。可以使用本领域中的标准算法(例如，Smith and Waterman，Adv.Appl Math.2482(1981)；Needleman and Wunsch，J.MoI.Biol.48443(1970)；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，852444(1988))，或公众可获得的诸如BLAST和FASTA的这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，WIWisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，WI)进行序列比对和比较。同样，从National Institutes ofHealth，Bethesda MD获得的ENTREZ也可以用来进行序列比较。在一个实施方案中，可使用缺口权重(gap weight)为1的GCG测定两条序列的百分比同一性，因此每一个氨基酸缺口被加权，就像两条序列中单个氨基酸或核苷酸的错配。
正如在本领域技术中公知的那样，可以从低到高的严谨程度对核酸序列相互杂交的条件进行描述。一般地，高严谨杂交条件是指在低盐缓冲液在高温条件下对杂交物进行洗涤的条件。可以使用本领域中的标准杂交液，例如0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，在65℃，并且在0.25M NaHPO4，3.5％SDS中洗涤之后，再根据探针的长度在从室温至68℃的温度范围使用0.1×SSC/0.1％SDS进行洗涤，过滤所结合的DNA来进行杂交(参见，例如，Ausubel，F.M.et al，Short Protocolsin Molecular Biology，4thEd.，Chapter 2，John Wiley & Sons，N.Y)。例如，高严谨的洗涤包括在6x SSC/0.05％焦磷酸钠中在37℃对14碱基的寡核苷酸探针，或在48℃对17碱基的寡核苷酸探针，或在55℃对20碱基的寡核苷酸探针，或在60℃对25碱基的寡核苷酸探针，或在65℃对长度约为250核苷酸长度的寡核苷酸探针进行洗涤。可以通过使用例如[γ-32p]ATP末端标记的放射性核苷酸，或通过随机引物标记将诸如[α-32P]dCTP的放射性标记的核苷酸掺入来对核酸探针进行标记。或者，可通过生物素酰化或荧光素标记的核苷酸的整合对探针进行标记，并使用链霉亲和素或者抗荧光素抗体对所述探针进行检测。
正如在本文中所使用的，术语“EC50”定义为达到50％预期效果的制剂浓度。例如，具有可测定生物效果的治疗剂的EC50可包括所述制剂表现出50％生物效果的值。
正如在本文中所使用的，术语“IC50”定义为达到测定效果50％抑制的制剂浓度。例如，RAGE结合拮抗剂的IC50可包括所述拮抗剂将配体与RAGE配体结合结构域的结合降低50％的值。
正如在本文中所使用的，目的化合物的“化学变体”包括在所述目的化合物中至少取代了一个原子团的分子。正如在本文中所使用的，目的化合物的“结构变体”与所述目的化合物具有相同的经验式，但却具有不同三维构象的分子。
使用荧光偏振来鉴定调节RAGE配体相互作用的化合物因此，本发明包括使用含有RAGE配体结合结构域的多肽对具有调节生理配体和RAGE结合能力的化合物进行检测的方法和系统。含有RAGE配体结合结构域的多肽可以包括RAGE蛋白，或RAGE的片段。在一个实施方案中，所述方法可以包括测定由目的化合物引起的从含有RAGE配体结合结构域的多肽置换荧光RAGE配体。如果所述目的化合物具有置换荧光配体的能力，那么所述目的化合物可包括潜在的RAGE，和/或RAGE介导生物活性的调节物。
本发明方法和/或系统的示意图如图1所示。荧光偏振测定方法允许对受体/配体相互作用的程度进行定量。允许对结合进行荧光偏振检测的物理方法是基于在溶液中越小的分子比越大的分子旋转得越快这一原理。在相同的溶液相中，与较大的分子相比，越小分子的越快转动产生了越小的荧光偏振。因此，当与结合于其关联(cognate)受体(例如，sRAGE，图1A)的荧光配体的微偏振值相比时，相对较小的配体，例如在图1中由三角形结构示意的淀粉样蛋白β1-40的荧光衍生物当在溶液中是游离时，会具有较低的微偏振(mP)值。在一个实施方案中，偏振的程度可以作为配体和受体之间结合程度的函数，以基本上线性的关系增加(Allen et al.，J.Biomol Screen，263-69(2000))。
如图1B所示，所述分析可允许对非标记目的化合物(例如，矩形)对RAGE配体结合位点的荧光配体(三角形)进行替换的能力进行评估。由于荧光配体的替换，微偏振(mP)值也会随着含有荧光标记的结构的平均尺寸的降低而降低，因为越小的未结合的荧光配体会比结合于RAGE多肽(例如，sRAGE)的荧光配体旋转得越快。
在一个实施方案中，为了进行分析需要进行最小限度的过滤，洗涤或转移步骤。例如，为了进行所述分析，可以向微孔板的小孔中加入试剂(即，荧光RAGE配体；RAGE多肽；目的化合物；以及分析缓冲液)。在完成温育步骤之后，可使用荧光偏振读数器测定荧光。因此，该简单的方法学可为高通量的药物筛选提供有用的方式。
如本文所述，全长RAGE蛋白或全长RAGE蛋白的片段都可包括可用于所述分析的RAGE多肽。因此，含有RAGE配体结合结构域的RAGE蛋白或多肽可以是如SEQ ID NO1(图2A)所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一部分(Neeper et al，J.Biol.Chem.26714998-15004，(1992。RAGE配体结合结构域包括生理特异性结合于配体的蛋白区域。正如在本文中所使用的，全长RAGE蛋白的片段为至少5个氨基酸长度，并可以大于30个氨基酸的长度，但短于该全长氨基酸序列。在一个实施方案中，所述RAGE多肽包括sRAGE(SEQ ID NO2；图2B)，或其片段，其中sRAGE是游离于细胞膜之外的RAGE蛋白(Park et al，Nature Med.，41025-1031(1998))。在一个实施方案中，可以使用与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的具有至少90％同一性的序列。例如，所述RAGE多肽可包括第一个氨基酸为甲硫氨酸(M)而不是甘氨酸(G)的SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。例如，可以使用含有第一个残基为甲硫氨酸(M)(例如，SEQ ID NO7；图2E)的sRAGE的重组形式。在另一个实施方案中，所述RAGE蛋白包括V结构域(SEQ ID NO3；图2C)(Neeper et al，J.Biol.Chem.26714998-15004(1992))，或其片段(例如，SEQ ID NO4，图2D)。在另一个的实施方案中，所述RAGE多肽是合成肽。
可对所述分析进行设计从而允许对含有与荧光配体结合的RAGE的线性区域的RAGE多肽的量进行选择。例如，如果使用了太低浓度的RAGE多肽，就会由于低信号水平难以检测结合。如果使用了过量的RAGE多肽，那么，目的化合物与荧光配体竞争的能力就会由于结合于配体和目的化合物的过量RAGE多肽而减少。在其他实施方案中，含有RAGE配体结合位点的多肽可以从约0.001nM至约50μM，或从约0.01nM至约5μM终分析浓度(FAC)，或从约0.1nM至约500nM FAC，或从1nM至约100nM FAC。对每一个和每一种在此所述的范围，包括于所述范围内的任意范围都可以使用。因此，包括1nM至约100nM的范围包括了诸如，但不限于2nM至约99nM，或3nM至约98nM以及每个和每一种范围之间的范围。
同样在一个实施方案中，所述分析设计为允许对荧光配体进行优化。因此，在一个实施方案中，可对所使用的荧光配体的量进行滴定从而允许最大信号，但并未高至含有较高水平的背景结合。更优选地，允许最大信号的荧光配体的量具有与竞争化合物浓度无关的类似范围。在其他实施方案中，荧光配体(例如，荧光淀粉样蛋白β)的最终分析浓度可从约1pM至约50μM，或从约0.005nM至约5μM，或从约0.05nM至约500nM，或从约0.5nM至约50nM。再一次地，对每一个和每一种在此所述的范围，只要包括于所述范围内的任意范围都可以使用。
在一个实施方案中，所述荧光配体可以包括淀粉样β多肽。例如，在其他实施方案中，所述荧光配体可以包括含有SEQ ID NO5的氨基酸序列的淀粉样蛋白β(1-40)或者含有SEQ ID NO6序列的淀粉样蛋白β(1-42)(图3)。在一个实施方案中，所述荧光素可以附着于淀粉样β多肽的氨基末端。当淀粉样蛋白β被用作标记的配体时，有必要在向所述分析加入配体之前对荧光淀粉样蛋白β进行预温育，因为这样的预温育可以允许淀粉样蛋白β自我聚集成折叠片层形式。在一个实施方案中，淀粉样蛋白β可优选地以折叠的形式结合于RAGE。
可对所述分析进行优化从而对超出浓度范围的目的化合物进行测定。在其他实施方案中，第二化合物可以从约1pM至约500μM，或从约0.010nM至约200μM，或从约0.1nM至约50μM，或从约1nM至约40μM，或从约10nM至约30μM的浓度存在于所述分析中。
可对本发明的方法和系统进行设计来最大化分析灵敏度。例如，当sRAGE在40nM的终分析浓度被用作含有RAGE结合位点的多肽，且所述荧光配体是淀粉样蛋白β(1-40)时，几乎所有的最大信号都可以用50nM的淀粉样蛋白β(1-40)看到。在竞争性分析的实施方案中，在每个结合反应小孔(40μl分析体积)中浓度介于10nM至30μM的未标记配体(即，目的化合物)可包括所述荧光配体对sRAGE结合的线性降低。
所述分析可用来对多种潜在RAGE调节物对RAGE结合结构域的荧光素化的配体(fluroceinated ligand)的置换能力进行检测和定量。如图4所示，未标记的RAGE配体可与生理范围内有效浓度(EC50)的未标记配体竞争与sRAGE的结合。例如，未标记的淀粉样蛋白β(1-40)可以约62nM的EC50值与荧光素化的淀粉样蛋白β(1-40)竞争与sRAGE的结合。同样，未标记的s100b可以约43nM的EC50值与荧光素化的淀粉样蛋白β(1-40)竞争与sRAGE的结合。同样，未标记的CML(羧甲基赖氨酸)可与约79nM的EC50值与荧光素化的淀粉样蛋白β(1-40)竞争与sRAGE的结合。对图4的数据而言，EC50值是在从导致最大偏振(“底部”)的浓度到导致最低偏振(“顶部”)的过程中，导致一半荧光配体置换的未标记配体的浓度。
所述分析的优化与需要溶解待测化合物的任意溶剂无关。例如，在某些情况下，可使用诸如二甲基亚砜(DMSO)的有机溶剂来溶解作为RAGE潜在调节物的待测有机化合物。例如，在一般分析中用来溶解目的有机化合物的1.5％DMSO的终分析浓度(FAC)的DMSO浓度时，所述分析通常提供最大信号(图5)。甚至在高达10％DMSO的浓度时，所述分析都能为检测荧光素化淀粉样蛋白β(1-40)与sRAGE的结合，以及由目的化合物引起的对这些结合的置换提供足够的窗口(window)。
因此，所述分析允许对各个成分进行优化，因此使得由于任一实验的变化的分析结果的变异最小化。一旦对特异性的荧光配体和RAGE多肽进行了优化，所述分析就可以提供样本结合亲和性的可靠分析，而不管被测试的特异性的竞争性目的化合物(即，推测性的调节物)如何。同样，在一个实施方案中，所述分析包括重复性和准确的高通量分析。在一个实施方案中，所述分析包括低于20％的差异。在其他实施方案中，所述分析可以包括低于10％或低于5％的差异。
可对本发明的方法和系统进行设计，由此使得RAGE多肽与荧光配体的结合反映体内RAGE与配体结合的本质。例如，所述荧光配体可与RAGE多肽以特异和饱和的方式结合。在一个实施方案中，可对所述分析进行设计，从而使得浓度范围从约0.1nM至约500nM的sRAGE多肽可以饱和的方式结合于荧光淀粉样蛋白β(1-40)。可对本发明的方法和系统进行设计，从而检测在较低和较高亲和性结合位点拮抗的化合物。例如，使用含有配体结合结构域的RAGE多肽，其中所述RAGE多肽的浓度范围从约0.1nM至约10nM，可以为使用未标记淀粉样蛋白β(1-40)作为竞争性配体的Kd低于10nM的高亲和性结合位点进行表征。同样，在从约20nM至约500nM的浓度使用含有配体结合结构域的RAGE多肽可以为较低亲和性结合位点进行表征。通过转化方式对数据进行的分析可以用来显示高亲和性和低亲和性位点(Hofmann et ah，Cell，97889-901(1999)；Hori et al，J.Biol.Chem.，27025752-25761(1995))。
所述分析的前提是较小的分子旋转得比较大的分子快，而且分子的尺寸是由荧光偏振的水平反映的(即，mP值)。通过增加含有RAGE配体结合结构域的复合物的尺寸，偏振会有较大的改变，因为所述荧光配体从溶液中的自由旋转状态变成了所述荧光配体结合于RAGE配体结合结构域的状态。因此，在一个实施方案中，含有RAGE配体结合结构域的多肽可与第二多肽或蛋白复合成为增加受体尺寸的方式。例如，虽然荧光RAGE配体与sRAGE的结合可以增加微偏振(mP)值(例如，从330-430)，所述荧光RAGE配体与和第二多肽复合的sRAGE的结合可以使偏振值增加更大。
如图6所示，含有RAGE配体结合结构域的多肽可与抗RAGE抗体复合。例如，sRAGE可用作含有RAGE配体结合结构域的多肽，而抗sRAGE抗体可与所述sRAGE复合。可用于检测sRAGE的抗体包括商业可获得的抗RAGE多克隆抗体(山羊抗RAGE多克隆抗体，Cat.No.ab7714，Novus Biologicals，Littleton，CO；山羊抗人RAGE多克隆抗体，Cat.No.ST1025，CalBiochem，San Diego，CA)和单克隆抗体(抗人RAGE单克隆抗体，Cat.No.R1031，United States Biological，Swampscott，MA)。同样，也可以根据本领域公知的技术生产客户定制的抗RAGE抗体。
用来在含有RAGE配体结合结构域的多肽和抗体之间形成复合物的方法可随着所使用的抗体的不同而不同。优选的抗体不会对荧光RAGE配体与RAGE结合结构域的结合进行干扰或修饰。
分析缓冲液可包括降低第二多肽(例如，sRAGE抗体)与所述小孔背景结合的成分。例如，可使用包括BSA(例如，0.5％-0.5％)，和/或TWEEN20(例如，0.01-0.1％)的缓冲液制备所述分析成分。或者，可用封闭缓冲液(例如，50mM咪唑，pH7.2，1-5％牛血清白蛋白(BSA)，0.01-0.1％TWEEN 20)对分析小孔进行处理从而降低抗体与分析小孔的背景结合。随后可将封闭缓冲液从小孔中吸出，并洗涤分析小孔。例如，在用封闭缓冲液对分析小孔进行处理后，可使用洗涤缓冲液(例如，20mM咪唑，pH7.2，150mM NaCl)以400μl/孔洗涤分析小孔三次，在每次洗涤之间用洗涤缓冲液进行任选的浸泡。
为了进行所述分析，可将单独的成分(例如，5-10μl溶解于DMSO的目的化合物)，sRAGE(例如，10μlsRAGE，40nM FAC)，荧光配体(例如，5-10μl荧光淀粉样蛋白β，50nM FAC)和抗体(例如，10μl针对sRAGE的单克隆抗体)同时加入每个小孔中，在37℃进行温育1小时。或者，在将其加入分析小孔之前，允许将抗体和RAGE多肽温育形成复合物。所述复合物可在4℃-37℃从30分钟至24小时之间得以形成。一般而言，较温暖的温育温度只需较短的温育时间。在另一个的实施方案中，在允许RAGE多肽与荧光RAGE配体和/或目的化合物结合之后，含有RAGE结合结构域的多肽可与抗RAGE抗体复合。当希望使由荧光配体和目的化合物与RAGE多肽结合的抗体的任意潜在的干扰最小化时，本方法是优选地。
可对所述分析进行设计来优化所用的抗RAGE抗体的量。因此，在一个实施方案中，可对所用荧光配体的量进行滴定从而允许最大信号，但并未高至产生较高水平的背景结合。抗体的优选量是基于用于分析的RAGE多肽的量和抗体对于RAGE的亲和性。在一个实施方案中，允许获得最大信号的抗体量可具有类似的范围，而不管目的化合物或荧光RAGE配体的浓度如何。
可以使用重组技术制备含有RAGE配体结合结构域的多肽。如本领域中所公知的，用于本发明方法和系统中用来表达RAGE多肽的核酸构建体，可以通过突变，例如，通过对含有目的突变的引物对核酸模板进行PCR扩增来进行修饰。以这种方式，可以设计含有对RAGE具有不同亲和性的多肽。在一个实施方案中，所突变的序列可以与起始DNA具有90％或更高的同一性。或者，所突变的序列可以与起始DNA具有80％，或70％或更高的同一性。因此，变体可包括在严谨条件(例如，相当于在1摩尔盐中，比DNA双链的溶解温度(TM)低20-27℃)下杂交的核苷酸序列。
可以对用于本发明方法和系统中的RAGE多肽和蛋白进一步修饰以增加效率。因此，可通过翻译后加工或通过化学修饰对用于本发明方法和系统中的RAGE多肽进行修饰。例如可对RAGE多肽合成制备从而包括L-，D-，或非天然氨基酸，α-双取代的氨基酸，或N-烷基氨基酸。或者，可通过乙酰化，酰化，ADP-核糖化，酰胺化，例如磷脂酰肌醇的脂质的结合，二硫键的形成等等对RAGE多肽进行修饰。
本发明的方法和系统提供了结合分析从而对在生理结合条件下与RAGE相互作用的化合物进行鉴定。在这一方面，生理结合条件包括了那些产生与在体内所看到的结合亲和性相类似的条件。
因此，在另一个实施方案中，本发明包括由本发明的方法和/或系统鉴定的，具有调节配体与RAGE结合能力的化合物。由本发明的方法和/或系统鉴定的化合物可包括若干不同的化学类型。例如，在一个实施方案中，RAGE调节化合物可包括多肽。在另一个实施方案中，RAGE调节化合物可包括肽模拟物。在另一个实施方案中，RAGE调节化合物可包括有机分子。在又一个实施方案中，RAGE调节化合物可包括无机分子。在一些情况中，可对RAGE调节化合物进行衍生从而增加其半衰期。
如上所述，有调节RAGE能力的所鉴定的化合物可包括肽模拟物。在一个实施方案中，所述肽模拟物至少部分是非天然的。优选地，可对目的化合物进行修饰，从而增加其稳定性，效率，效力和生物利用率。例如，在一个实施方案中，可被合成地制备所述化合物从而包括L-，D-，或非天然氨基酸，α-二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸或乳酸。在一个实施方案中，所述化合物可包括具有多肽骨架或被适当模拟物取代的氨基酸的肽模拟物。
同样，具有调节RAGE能力的所鉴定的化合物可包括有机小分子。在一个实施方案中，所述有机分子包括低于1000道尔顿的分子量的分子。例如，如图7所示，TTP-A，TTP-B，TTP-C，TTP-D和TTP-E表现出对sRAGE与荧光淀粉样蛋白β(1-40)结合抑制的IC50值分别为约259nM，376nM，367nM，749nM和2.04μM。诸如且包括TTP-A，TTP-B，TTP-C，TTP-D和TTP-E的目的有机小分子化合物的结构由共有的公开号为2002/0006957，2003/0032663，2002/0193432和2004/0082542的美国专利所提供，在此将每一个专利全文引用作为参考。
在一个实施方案中，由于其具有调节RAGE生物活性的能力，可对由结合分析鉴定的化合物进一步进行测定。例如，可对所述化合物能够在基因表达或其他细胞过程中调节RAGE-诱导的升高的能力进行测定。因此，在一个实施方案中，由结合分析鉴定的化合物可用来调节NF-κBκB介导的转录的RAGE活化。可使用NF-κB启动子的下游的报道基因对潜在调节化合物对NF-κB介导的转录的RAGE活化进行调节的能力进行分析。或者，由结合分析鉴定的化合物可用来调节TNF-α介导的转录的RAGE活化，其中可以使用TNF-α启动子的下游的报道基因对潜在调节化合物对TNF-α介导的转录的RAGE活化进行调节的能力进行分析。在一个实施方案中，由于RAGE对其他细胞过程的调节，可将调节配体与RAGE结合的化合物鉴定出来。
实施例在以下实施例中对本发明所包括的创造性的特点和优点进行进一步说明。
实施例1荧光偏振分析方法简言之，本方法涉及将10μL的重组人sRAGE(终浓度40nM具有氨基酸序列SEQ ID NO7)加入10μL磷酸缓冲盐水pH7.4(Sigma，St.Louis，MO)中，然后在存在10μL的RAGE拮抗剂(终分析浓度为10nM-30μM)的情况下，再加入10μL(终分析浓度50nM)的荧光淀粉样蛋白β(1-40)肽(Biosource，Camarillo，CA)。有必要对荧光淀粉样蛋白β配体进行预温育，使得所述淀粉样蛋白β形成折叠的片层结构，因为不是折叠片层结构的淀粉样蛋白β不能以较高的亲和性与sRAGE结合。为了形成折叠片层结构，可在用于分析之前，将淀粉样蛋白β温育至少24小时。为了预温育淀粉样蛋白β，以6mg/ml的浓度将冷冻干燥的肽溶解于高压液相色谱(HPLC)级水中。一旦溶解之后，用磷酸缓冲盐水(不含钙的)将所述肽稀释成1mg/ml的浓度，并在37℃温育24-48小时。
在37℃对复合物温育1小时，然后使用Envision平板读数器(Perkin Elmer)对微偏振(mP)数据进行读取。在某些情况下，根据人sRAGE的纯度，可以向磷酸缓冲盐水中加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)或0.05％去污剂TWEEN-20，从而降低sRAGE与分析小孔的背景结合。
实施例2分析条件的优化进行了对分析条件进行优化的实验。例如，在终分析浓度40nM使用重组sRAGE，可以发现浓度介于4-400ng每毫升每40μL反应体积的所述荧光淀粉样蛋白β导致了sRAGE结合的线性增加。
接下来，对在不同sRAGE浓度的分析优化进行了评估。使用的是50nM荧光标记的淀粉样蛋白β(1-40)，发现在0.6-600ng每毫升sRAGE每40μL分析体积中，sRAGE的结合呈线性增加，可见的最大信号约为40nM sRAGE。
图4所示为显示DMSO浓度增加对荧光素化淀粉样蛋白β1-40配体与sRAGE相互作用的微偏振(mP)值的影响的代表性实验。高至2％终体积的DMSO浓度对所得的微偏振值没有显著性影响。尽管在DMSO浓度高于2％FAC(终分析浓度)的情况下对微偏振值有一些影响，但由于mP值(荧光素化淀粉样蛋白β1-40配体，无sRAGE存在)的基线为约470±5mP用高于2％的DMSO的浓度实现了该范围，给出了充分的测定范围。每一个横杠代表具有计算出的标准离差的四次测定的平均值。
一般地，所述分析使用0.5nM-50nM荧光淀粉样蛋白β和1-100nMsRAGE。目的化合物的范围从1nM-30μM。
还进行了多次实验来对分析的变异性进行定量。发现一般的分析变异性低于10％。
实施例3配体与sRAGE结合的检测图3所示为说明RAGE特异性配体与荧光素化的淀粉样蛋白β1-40竞争与sRAGE结合的代表性实验。所述竞争以剂量依赖的方式产生，其中增加替换荧光淀粉样蛋白β1-40配体的未标记配体的量导致较低的微偏振(mP)值。
对于未标记淀粉样β(1-40)(正方形)的62nM，对于未标记S100b(三角形)的43nM，和对于未标记羧甲基赖氨酸(倒三角)的79nM的EC50值与结合于sRAGE的理论值相符(Yan et al，Nature，382685-691(1996)，Kislinger et al，J.Biol.Chem.27431740-31749(1999))。需要注意的是每一个点都代表具有计算的标准偏差的四次测定的平均值。
实施例4由有机小调节物抑制sRAGE结合图7所示为说明较有机小分子能够与荧光素化的淀粉样β1-40竞争与sRAGE结合的代表性实验。例如，TTP-A，TTP-B，TTP-C，TTP-D和TTP-E分别以约259nM，376nM，367nM，749nM和2.04μM的IC50值抑制sRAGE与荧光淀粉样蛋白β(1-40)的结合。所述竞争以剂量依赖的方式产生，其中增加未标记配体的量替换荧光淀粉样蛋白β1-40配体的量增加，导致较低的微偏振(mP)值。产生荧光淀粉样蛋白β50％替换的未标记配体的浓度就是IC50值。该数据说明本发明的分析方法可用来对具有RAGE拮抗剂活性的有机小分子进行筛选。在图7中，每一个点都代表具有计算的标准偏差的四次测定的平均值。
参考以上描述，本发明各部分的最佳量纲关系(包括特定组分和使用方式的差异)对本领域所属技术人员而言是显而易见的，所有在

和在说明书中描述的等价关系都包括在本发明的范围之内。以上内容仅对本发明的原理进行了说明。因为本领域所属技术人员可以容易地进行多种修饰和改变，所以不应将本发明局限于所描述和描述的具体实施方案之内，在所附权利要求范围之内的所有适当修饰和等价替换都被认为属于本发明的概念之内。
还应该理解，在此使用的措辞和术语学是描述性而非是限制性的。本领域所属技术人员应该理解本公开内容所基于的概念可容易地用作设计实施本发明若干目的的方法和系统的基础。只要不偏离本发明的精神和范围，可以认为权利也要求包括了这些等价的诠释。
序列表<110> 特兰斯泰克制药公司(TransTech Pharma，Inc)<120> 荧光偏振分析(Fluorescence Polarization Assay)<130> SCT064291-66<150> 60/554，183<151> 2004-03-18<160> 7<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 404<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1Gly Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Ara35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lvs Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr LyS Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160
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Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210> 7<211> 339<212> PRT<213> Artificial Sequence<220>
<223> Modified peptide sequence<400> 7Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190
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权利要求
1.检测RAGE调节物的方法，包括(a)提供(i)包括RAGE配体结合结构域的RAGE多肽，(ii)荧光RAGE配体，和(iii)目的化合物；(b)向所述RAGE多肽中加入所述目的化合物和荧光RAGE配体；以及(c)测定所述荧光RAGE配体的偏振。
2.权利要求1的方法，还包括步骤(d)将偏振水平与结合于所述RAGE多肽的荧光RAGE配体的量进行相关分析。
3.权利要求2的方法，还包括在存在不同量目的化合物的条件下测定结合于所述RAGE多肽的荧光RAGE配体的量。
4.权利要求3的方法，还包括基于荧光RAGE配体与RAGE多肽的结合降低到预定量所需的目的化合物的量确定测定所述目的化合物对RAGE配体结合结构域的亲和性。
5.权利要求4的方法，其中将目的化合物降低荧光RAGE配体与RAGE多肽结合的能力与第二化合物降低荧光RAGE配体与RAGE多肽结合的能力进行比较。
6.权利要求5的方法，其中第二化合物并未充分地结合于RAGE配体结合结构域，因此第二化合物可作为阴性对照来测定对于RAGE配体结合结构域的结合。
7.权利要求5的方法，其中第二化合物具有对于RAGE配体结合结构域的充分的结合亲和性，因此第二化合物可作为阳性对照来测定对于RAGE配体结合结构域的结合。
8.权利要求5的方法，其中第二化合物包括至少一种所述目的化合物的结构变体或化学变体。
9.权利要求1的方法，其中所述荧光配体包括高级糖化终产物。
10.权利要求1的方法，其中所述荧光配体包括淀粉样β多肽。
11.权利要求10的方法，其中所述淀粉样β肽包括具有SEQ IDNO5的氨基酸序列的淀粉样蛋白β(1-40)。
12.权利要求10的方法，其中所述淀粉样β肽包括具有SEQ IDNO6氨基酸序列的淀粉样蛋白β(1-42)。
13.权利要求10的方法，其中所述荧光素附着于淀粉样β多肽的氨基末端。
14.权利要求1的方法，其中所述荧光配体包括s100b。
15.权利要求1的方法，其中所述荧光配体包括羧甲基赖氨酸(CML)。
16.权利要求1的方法，其中荧光配体包括amphoterin。
17.权利要求1的方法，其中所述荧光配体包括钙粒蛋白。
18.权利要求1的方法，其中所述荧光配体包括分子量低于1000道尔顿的有机小分子。
19.权利要求1的方法，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO4，或与其具有至少90％同一性的序列。
20.权利要求1的方法，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，或与其具有至少90％的同一性的序列。
21.权利要求1的方法，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或与其具有至少90％的同一性的序列。
22.权利要求1的方法，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽共价连接于第二多肽，或与第二多肽复合。
23.权利要求22的方法，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽可以与识别RAGE或其片段的抗体复合。
24.权利要求1的方法，其中所述目的化合物包括有机小分子。
25.权利要求24的方法，其中所述有机小分子的分子量低于1000道尔顿。
26.检测调节配体与RAGE结合的化合物的系统，包括如下成分的单独包装的容器(a)荧光RAGE配体；(b)包括RAGE配体结合结构域的RAGE多肽；和(c)在存在目的化合物情况下的用于稀释(a)和(b)的至少一种分析试剂，因此可以对荧光RAGE配体与包括RAGE配体结合结构域的多肽的结合进行定量。
27.权利要求26的方法，还包括测定所述荧光配体的偏振的装置。
28.权利要求26的系统，还包括对RAGE配体结合结构域具有预定结合亲和性的化合物。
29.权利要求28的系统，其中对RAGE配体结合结构域具有预定结合亲和性的化合物并未充分结合于所述RAGE结合结构域，因此第二化合物可作为阴性对照来测定对于RAGE配体结合结构域的结合。
30.权利要求28的系统，其中第二化合物具有对于RAGE结合结构域的充分结合亲和性，因此第二化合物可作为阳性对照来测定对于RAGE配体结合结构域的结合。
31.权利要求28的系统，其中第二化合物包括至少一种所述目的化合物的结构变体或化学变体。
32.权利要求26的系统，其中所述荧光配体包括高级糖化终产物。
33.权利要求26的系统，其中荧光配体包括淀粉样β多肽。
34.权利要求33的系统，其中所述淀粉样β肽包括具有SEQ IDNO5氨基酸序列的淀粉样蛋白β(1-40)。
35.权利要求33的系统，其中所述淀粉样β肽包括具有SEQ IDNO6氨基酸序列的淀粉样蛋白β(1-42)。
36.权利要求26的系统，其中所述荧光素附着于淀粉样β多肽的氨基末端。
37.权利要求26的系统，其中所述荧光配体包括s100b。
38.权利要求26的系统，其中所述荧光配体包括羧甲基赖氨酸(CML)。
39.权利要求26的系统，其中所述荧光配体包括amphoterin。
40.权利要求26的系统，其中所述荧光配体包括钙粒蛋白。
41.权利要求26的系统，其中所述荧光配体包括分子量低于1000道尔顿的有机小分子。
42.权利要求26的系统，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO4，或与其具有至少90％同一性的序列。
43.权利要求26的系统，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，或与其具有至少90％同一性的序列。
44.权利要求26的系统，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或与其具有至少90％同一性的序列。
45.权利要求26的系统，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽连接于第二多肽，或与第二多肽复合。
46.权利要求45的系统，其中包括RAGE配体结合结构域的所述多肽可以与识别RAGE或其片段的抗体复合。
47.权利要求26的系统，其中所述目的化合物包括有机小分子。
48.权利要求47的系统，其中所述有机小分子的分子量低于1000道尔顿。
全文摘要
本发明公开了使用荧光偏振对具有结合高级糖化终产物受体(RAGE)和/或调节其活性的能力的化合物进行鉴定的方法和系统。使用本发明方法和系统鉴定的化合物可包括有机小分子RAGE拮抗剂。使用本发明方法和系统鉴定的有机小分子RAGE拮抗剂可用来治疗RAGE－介导的疾病，例如，包括但不限于糖尿病或阿尔茨海默病。
文档编号G01N33/542GK1938591SQ200580008732
公开日2007年3月28日 申请日期2005年3月18日 优先权日2004年3月18日
发明者阿德南·M·M·米亚里, 杰弗里·C·韦布斯特 申请人:特兰斯泰克制药公司