专利名称：亲和性物质测定方法
技术领域：
本发明涉及利用载体颗粒的凝集反应的亲和性物质的测定方法和装置。
背景技术：
作为检测或测定亲和性物质存在的方法，以往使用了例如酶免疫测定法、或者放射线免疫测定法等。在任何一种方法中，将亲和性物质与其结合配偶体(binding partner)结合，并基于二者结合的程度来测定亲和性物质。这些方法灵敏度高而且精度也高。但是由于将酶或者放射性同位素作为标识使用，因此试剂不稳定。此外，在利用放射性同位素时，存在保管和保存上的限制，因此在测定时需要仔细考虑以及技术。因此需要更加简便的测定方法。此外由于这些方法需要较长的测定时间，所以难以对应于紧急的检查。在这些背景情况下，对高灵敏度并且迅速的检测方法正在形成广泛研究。
1970年后，将载体颗粒的凝聚度作为指标来测定亲和性物质与结合配偶体之间的结合的分析方法被实用化。该方法通过光学方法测定载体颗粒的凝集程度，使得定量分析成为可能。例如利用作为载体颗粒的胶乳颗粒的、采用光学方法测定免疫学的颗粒凝集反应的方法被称为胶乳凝集比浊法(LatexAgglutination Turbidimetry)。这些分析方法中的反应温度一般在37-45℃的范围中进行，通过搅拌叶片等的搅拌进行特别的凝集反应。此时测定(反应)所需的时间大概为10-20分钟，与酶免疫测定法或者放射线免疫测定法相比迅速。另一方面，对于测定灵敏度或者测定范围，可以说比酶免疫测定法等差。
还公知的是胶乳凝集法中的粒度分布测定法(非专利文献1/Cambiaso等，J.Immunol.Methods 18，33，1977，非专利文献2/松泽等，化学和工业，第36卷，第4号，1982)。胶乳凝集比浊法与测定颗粒悬浊液的光透过度相对，在颗粒分布测定法中测定分散的各个颗粒的状态和数目。在Cambiaso等的报告中，在颗粒直径为0.8μm的胶乳中，将结合抗体的试剂和抗原在37℃下反应20分钟。计算反应后的颗粒数目，基于通过凝集使得颗粒数目减少的程度来测定抗原。颗粒数目采用将激光散射光作为原理的计数器来测定。
另一方面，松泽等将使抗体与颗粒粒径为1μm的胶乳颗粒结合的试剂和抗原反应6小时。反应后，通过电阻法计测平均颗粒的容积，来测定抗原。但是通过实用化而普及的系统仅存在着采用由鞘流引起的激光散射法的PAMIA系统(SYSMEX株式会社)。在PAMIA中，使用颗粒粒径为0.78μm的胶乳颗粒。在45℃下反应15分钟以后，对胶乳颗粒进行计数以进行免疫测定。PAMIA与胶乳凝集比浊法，灵敏度更高，但是与放射免疫测定法(RIA)或酶免疫测定法(EIA)的高灵敏度免疫测定相比，灵敏度可以说较差。
在胶乳凝集比浊法中，一般使用0.05-0.6μm颗粒粒径的胶乳颗粒。在胶乳凝集粒度分布分析法的情况下，这种小颗粒容易受到妨碍测定的物质的影响。例如，在血液或尿等的体液中，共存着脂质、蛋白、血球成分等。这些共存物质难以进行与载体颗粒的识别。因此存在着不能正确对载体颗粒进行计数的情形，为避免这些测定妨碍物质的影响，可使用较大颗粒。另一方面，在为如松泽等的1μm程度的颗粒粒径时，由于难以引发凝集反应，因此使用0.8μm程度的胶乳颗粒。此外，松泽等在计测平均颗粒容积时使用的细孔(aperture)口径为30μm。该尺寸下容易受到细孔堵塞的影响。但是，比该尺寸更大口径的细孔不能检测出0.8-1μm的颗粒。
而且，为了促进基于亲和性物质与结合配偶体的结合的载体颗粒的凝集，此外还为了容易检测所形成的凝集块，公知的是对反应系统施加交流电压的方法(特开平7-83928号/专利文献1)。该方法是通过载体颗粒的凝集检测出或者测定亲和性物质的存在的方法，其特征为，在10mM以上的盐的共存下，对该反应系统施加交流电压以形成5-50V/mm的电场强度。
保持有结合配偶体的载体颗粒被置于电场中时，就沿着电场而并列排列(串珠(pearl chain)化)。此后电场停止时，将并列排列的载体颗粒进行再分散。在进行串珠化时存在亲和性物质时，结合配偶体与亲和性物质结合。结果，在电场停止后不再引起载体颗粒的分散，仍然可发现串珠化的载体的存在。上述测定方法利用了该现象。也即，在电场中促进了亲和性物质的反应。而且，在停止电场后，如果载体颗粒再分散的话，就可检测出作为反应生成物的载体颗粒的凝集块。
专利文献1特开平7-83928号非专利文献1Cambiaso等，J.Immunol.Methods 18，33，1977，
非专利文献2松泽等，化学和工业，第36卷，第4号，1982发明内容发明所要解决的问题本发明的课题是在通过亲和性物质与结合配偶体的结合而使载体颗粒凝集的方法中，提供可促进二者的结合的方法。或者本发明的课题是提供一种用于抑制二者结合时阻碍因素的影响的方法。在利用电场施加的亲和性物质的测定方法中，亲和性物质的反应是在保持着结合配偶体的载体颗粒的串珠化时发生的。通过二者的反应而凝集的载体颗粒作为结合指标进行检测或测定。因此，考虑如果可促进二者的反应的话，就可实现反应效率的提高。或者提供一种明确阻碍反应的因素以消除该影响的方法是有用的。
本发明的其他课题是提供一种在对通过串珠化而形成的凝集块进行检测时不易受稀释影响的亲和性物质的测定方法以及用于该测定方法的装置。如上所述，在通过对载体颗粒的凝集进行计数来测定亲和性物质的方法中，凝集块和未凝集的载体颗粒的识别结果对测定结果有较大影响。但是即使在载体颗粒不形成凝集块的情况下，颗粒也相互重叠，处于可见的位置关系时，存在着作为凝集块进行计数的可能性。本发明者等基于颗粒的三维信息，已经确认通过对凝集颗粒进行计数，可解除颗粒间的重叠问题。但是，在基于三维信息的分析中，还在颗粒浓度较浓的状态下，有时同时检测出多个颗粒。也即，确认到存在着对未凝集的多个载体颗粒作为凝集块进行计数的情况。
如果预先将颗粒浓度设定为较低的话，则在对凝集颗粒进行识别时，也许可以避免颗粒的重叠。但是在颗粒浓度较低的条件下，难以进行串珠化。为了通过串珠化发生颗粒凝集反应，就需要某种程度的颗粒浓度。也即，在串珠的形成工序中颗粒浓度高，而在此后在凝集颗粒的检测工序中颗粒浓度较低的话是理想的。为使颗粒浓度降低，例如可对包含载体颗粒的反应液进行稀释。
但是在实际中，通过反应液的稀释会使得形成的凝集块崩塌。结果凝集颗粒的数目计数得比实际低。也即通过稀释产生负误差。通过本发明就能提供一种在对由串珠化形成的凝集块进行检测时不易受稀释影响的亲和性物质的测定方法以及用于该测定方法的装置。
解决问题的方式本发明者等明确了用于提高亲和性物质与结合配偶体的结合效率的方法，由此完成了本发明。为了使得串珠化的载体颗粒所保持的结合配偶体与亲和性物质能有效地结合，如果提供这样的条件的话最好，也即使得尽可能多的亲和性物质与结合配偶体接触。换言之，丧失与结合配偶体的接触机会的亲和性物质较多的条件，可以说是反应效率低的条件。在这种条件下，在通过载体颗粒的凝集来检测二者的结合的测定方法中，存在着妨碍测度灵敏度提高的可能性。这种问题通过本发明就可以解决。
此外，施加了电场的反应液温度由于焦耳热而上升。本发明者等分析了反应液温度对亲和性物质-结合配偶体之间反应的影响。结果确认到存在这样的可能性，即反应液温度上升对二者结合存在着阻碍作用。而且，已发现通过对施加着电场的反应液温度条件进行控制，可实现较好的反应条件，由此完成了本发明。也即本发明提供了以下的测定方法、测定装置或者用于促进保持着结合配偶体的载体颗粒的由亲和性物质引起的凝集的方法。
一种亲和性物质的测定方法，其包含以下工序(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液进行培养(incubate)的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)对工序(1)的反应液施加电压脉冲的工序；(3)在工序(2)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(4)在工序(3)之后，基于凝集块形成的程度(level)、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
在[1]记载的方法中，工序(1)是在37-90℃下对所述反应液进行培养的工序。
在[2]记载的方法中，工序(1)是在40-90℃下对所述反应液进行培养的工序。
在[1]记载的方法中，其特征为，在所述反应液中含有水溶性高分子。
在[1]记载的方法中，将工序(2)中反应液的粘度调整至0.8-3mPas。
在[1]记载的亲和性物质的测定方法中，工序(2)在0-20℃下进行。
在[6]记载的亲和性物质的测定方法中，工序(2)在0-10℃下进行。
在[1]记载的方法中，将凝集块和未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者以其三维信息作为指标来进行计数。
在[1]记载的方法中，亲和性物质与结合配偶体的结合是由抗原抗体反应引起的结合。
在[9]记载的方法中，亲和性物质为抗原，结合配偶体为抗体或者为包含该抗原结合区域的片断。
在[9]记载的方法中，亲和性物质为抗体或者为包含该抗原结合区域的片断，而结合配偶体为抗原或者为包含该抗原决定基的片断。
在[1]记载的方法中，电压脉冲为交流电压脉冲。
一种亲和性物质的测定方法，其包含以下工序(1’)在与凝集试剂成分混合之前或之后对包含载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液进行培养的工序，其中该载体颗粒结合了至少具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该工序中所述载体颗粒由凝集试剂而凝集，并且由测定对象亲和性物质阻碍该凝集；(2’)在凝集试剂成分存在的情况下对工序(1’)的反应液施加电压脉冲的工序；(3’)在工序(2’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(4’)在工序(3’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
在[13]记载的方法中，在工序(1’)中，在培养所述反应液后，在工序(2’)之前混合凝集试剂。
在[13]记载的方法中，包含在混合后、工序(2’)之前进一步对凝集试剂进行培养的工序。
在[13]记载的方法中，在工序(1’)中，在凝集试剂的存在下对所述反应液进行培养后，实施工序(2’)。
一种用于使载体颗粒凝集的装置，包括对包含载体颗粒和特定物质的反应液施加电压脉冲的单元，该载体颗粒结合了具有与所述特定物质的结合活性的结合配偶体，其特征为，具有将反应液的温度加热至37℃-90℃的单元。
一种用于使载体颗粒凝集的方法，包括对包含载体颗粒和特定物质的反应液施加电压脉冲的工序，该载体颗粒结合了具有与所述特定物质的结合活性的结合配偶体，其特征为，使施加电压期间的反应液的温度为0℃-20℃。
在[18]记载的方法中，结合配偶体与特定物质的结合是抗原抗体反应。
在[18]记载的方法中，电压脉冲是交流电压脉冲。
在[18]记载的方法中，对反应液添加水溶性高分子。
在[18]记载的方法中，将反应液的粘度调整至0.8-3mPas。
在[18]记载的方法中，包含在施加电压脉冲之前在37℃-90℃下对所述载体颗粒和特定物质进行培养的工序。
一种用于使载体颗粒凝集的装置，包括对包含载体颗粒和特定物质的反应液施加电压脉冲的单元，该载体颗粒结合了具有与所述特定物质的结合活性的结合配偶体，其特征为，具有用于使施加电压期间的反应液的温度为0℃-20℃的单元。
一种测定装置，用于将载体颗粒的由亲和性物质或者凝集试剂引起的凝集作为指标来测定所述载体颗粒与应测定的亲和性物质的结合，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该测定装置包括以下要素a用于保持反应液的空间；b用于在37℃-90℃下对反应液的温度进行培养的单元；c用于对反应液施加电压脉冲的单元；d用于使施加脉冲电压时反应液的温度为0℃-20℃的单元；以及e用于对反应液中所含的载体颗粒和载体颗粒的凝集块中的任何一方或者二者进行计数的单元。
此外，本发明者等对载体颗粒凝集块的检测工序进行了反复研究。而且，考虑在对串珠化后的反应液进行稀释的工序中，如果利用可对形成凝集块的结合进行强化的单元的话，就可消除稀释带来的不利影响。进而，明确了有效防止由稀释造成的不利情况的方法，确认了该效果，由此完成了本发明。也即本发明涉及以下的测定方法和测定装置。
一种亲和性物质的测定方法，其包含以下的工序(1)-(3)或者(1’)-(3’)，其中，在工序(2)或者(2’)之前，包含通过对亲和性物质与结合配偶体、或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合进行强化的单元来对反应液进行稀释的工序。
(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)在工序(1)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3)在工序(2)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序，或者(1’)对将载体颗粒和测定对象亲和性物质与凝集试剂成分混合的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该工序中所述载体颗粒由凝集试剂而凝集，并且由测定对象亲和性物质阻碍该凝集；(2’)在工序(1’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3’)在工序(2’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质程度的工序。
在[26]记载的方法中，对反应液进行稀释的工序是在电压脉冲施加的条件下混合反应液与稀释液的工序。
在[27]记载的方法中，电压脉冲为交流电压。
在[28]记载的方法中，交流电压的频率为2KHz-20MHz。
在[27]记载的方法中，稀释反应液的工序包含在电压脉冲施加的条件下混合反应液与稀释液之后在停止电场后进一步附加地稀释载体颗粒的工序。
在[27]记载的方法中，稀释反应液的工序是在向反应液中添加对测定对象亲和性物质与结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体间的结合进行强化的结合强化剂之后与反应液混合、或者采用包含所述结合强化剂的稀释液对反应液进行稀释的工序。
在[26]记载的方法中，稀释反应液的工序是在向反应液中添加对测定对象亲和性物质与结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体间的结合进行强化的结合强化剂之后将反应液与稀释液混合、或者采用包含所述结合强化剂的稀释液对反应液进行稀释的工序。
在[32]记载的方法中，测定对象亲和性物质与结合配偶体、或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合为免疫学的结合。
在[33]记载的方法中，抗原为蛋白质抗原，结合强化剂是从戊二醛和碳化二亚胺中选择的任何一种或者两者的化合物。
在[32]记载的方法中，稀释反应液的工序是在电压脉冲施加的条件下混合反应液与稀释液的工序。
在[26]记载的方法中，在工序(1)或(1’)中电压脉冲为交流电压脉冲。
在[26]记载的方法中，在工序(1)或(1’)中电压脉冲施加数次。
在[37]记载的方法中，在工序(1)或(1’)中包含在施加电压脉冲后使载体颗粒分散、此后施加下一次电压脉冲的工序。
在[37]记载的方法中，多次电压脉冲是不同方向的电压脉冲。
在[26]记载的方法中，载体颗粒的平均粒径为1μm以上。
在[40]记载的方法中，载体颗粒的平均粒径为1μm-20μm。
在[26]记载的方法中，在工序(2)或(2’)中，对于凝集块和未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者将其三维信息作为指标进行计数。
在[42]记载的方法中，在工序(2)或(2’)中，对于凝集块或载体颗粒的三维信息以物理方式进行测定。
在[43]记载的方法中，用于进行物理测定三维信息的方法是从由电阻法、激光衍射散射法和三维图像分析法构成的组中选出的任何一种方法。
一种测定装置，用于将载体颗粒的由亲和性物质或凝集试剂引起的凝集作为指标来测定所述载体颗粒与应测定的亲和性物质的结合，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该测定装置包括以下要素a用于保持包含试样的反应液或者进一步附加地包含凝集试剂的反应液的空间，其中该试样包含结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体的载体颗粒和应测定的亲和性物质；b用于对反应液施加电压脉冲的单元；c用于稀释反应液的单元；和d用于对反应液中所含的载体颗粒和载体颗粒的凝集块中的任何一方或者二者进行计数的单元。
在[45]记载的装置中，用于稀释反应液的单元是用于在电压脉冲施加的条件下将反应液与稀释液进行混合的单元。
在[45]记载的装置中，用于稀释反应液的单元包含用于向反应液中添加结合强化剂的单元，其中该结合强化剂对测定对象亲和性物质与结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合进行强化。
发明效果根据本发明，提供了用于促进在施加了电场的反应液中保持有结合配偶体的载体颗粒与亲和性物质的结合反应的方法，或者抑制阻碍该反应的因素的影响的方法。在将载体颗粒的凝集作为指标的亲和性物质的测定中，示出了合适的反应条件的报告并不多。根据本发明，例如可实现这样的目的，使得利用了免疫学结合反应的测定方法的灵敏度上升，或者缩短反应时间，其中该免疫学结合反应将载体颗粒的凝集作为指标。本发明对上述反应的最优化作出了贡献。
此外，根据本发明例如可实现这样的目的，使得利用了免疫学结合反应的测定方法的灵敏度上升，或者提高再现性，其中该免疫学结合反应将载体颗粒的凝集作为指标。本发明对上述反应的最优化作出了贡献。在施加过电压脉冲的反应液中，由保持在载体颗粒上的结合配偶体和亲和性物质(或者凝集试剂)的结合反应形成凝集块。在本发明中，在对凝集块进行检测时，利用强化该结合反应的单元对反应液进行稀释后，检测凝集块。作为强化结合反应的单元，可在电压脉冲施加条件下对反应液进行稀释，或者采用结合强化剂。通过采用强化结合反应的单元，可避免凝集块稀释时所伴随的各种障碍。也即，稀释了的载体颗粒互相重叠而检测的可能性变小。其结果是可防止将颗粒重叠错误地作为凝集块而进行检测的误差。另一方面，凝集块的构造通过结合的强化来维持。因此，可避免伴随着稀释而使得凝集块崩塌而造成的不可检测的问题。由此，根据本发明可实现再现性和灵敏度的提高。
图1(A)是显示基于本发明的装置构成的图。此外(B)是显示构成基于本发明的装置的脉冲施加槽的截面的图。
图2是表示通过具有图1的构成的测定装置来实施本发明的测定方法时所得到的测定结果(与预处理温度的关系)的图。图中，纵轴表示凝集率(％)，横轴表示AFP浓度(ng/mL)。
图3是表示通过具有图1的构成的测定装置来实施本发明的测定方法时所得到的测定结果(在高温下与预处理时间的关系)的图。
图4是表示通过具有图1的构成的测定装置来实施本发明的测定方法时所得到的测定结果(与反应促进剂的关系)的图。图中曲线分别示出了以下结果。白方格抗原量0ng/mL(空白值) 白圈抗原量9.5ng/mL黑圈空白值的校正(9.5-0ng/mL)图5(A)是表示基于本发明的装置的构成的图。此外，(B)是表示构成基于本发明的装置的脉冲施加槽的截面的图。图中的符号分别表示各符号说明中所记载的单元。
图6是表示通过具有图5的构成的测定装置来实施使施加电压脉冲过程中的反应液维持在低温下的本发明的测定方法时所得到的测定结果的图。图中，纵轴表示凝集率(％)，横轴表示AFP浓度(ng/mL)。
图7是表示图6的对照法(不控制施加电压脉冲的过程中反应液的温度室温)结果的图。图中，纵轴表示凝集率(％)，横轴表示AFP浓度(ng/mL)。
图8是表示图6的对照法(不施加电压脉冲，在37℃下培养20分钟)结果的图。图中，纵轴表示凝集率(％)，横轴表示AFP浓度(ng/mL)。
图9是表示在根据本发明的前列腺特异抗原(PSA)测定中对向反应液中添加牛血清清蛋白(BSA)载体颗粒的凝集率造成的影响的图表。图中，纵轴表示凝集率(％)，横轴表示反应液中BSA的最终浓度。各个柱形从左开始依次表示PSA为0ng/mL、9.5ng/mL和32ng/mL的结果。图中一起表示出了各BSA浓度中PSA为0ng/mL处的凝集率与为9.5ng/mL处的凝集率的差(黑色四边形)、以及与为32ng/mL处的凝集率的差(白圈)。
图10是表示反应液中牛血清清蛋白(BSA)的浓度和温度对反应液的粘度的影响的图表。图中，纵轴表示粘度(mPas)，横轴表示温度(℃)。
图11(A)是表示测定载体凝集状态用的装置的概略的图。图11(B)是表示图11(A)的稀释槽5的概略的图。
图12是表示将AFP对照血清(control serum)作为检查材料液、将抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体进行反应的情况下载体凝集率的图表。通过施加电压来稀释的情况下的凝集率用黑色菱形表示，在不施加电压来稀释的情况下的凝集率用白色四边形表示。纵轴表示凝集率，横轴表示AFP浓度。
图13是表示将AFP对照血清作为检查材料液、将抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体进行反应的情况下载体凝集率的图表。通过施加电压来稀释的情况下的凝集率用黑圈表示，在不施加电压来稀释的情况下的凝集率用白色四边形表示，采用预先施加过电压的稀释液来稀释的情况下的凝集率用黑色三角形表示。纵轴表示凝集率，横轴表示AFP浓度。
图14是表示将PSA对照血清作为检查材料液、将抗PSA抗体敏化胶乳试剂作为载体并添加促进反应试剂来进行反应的情况下的载体凝集率的图表。通过施加电压来稀释的情况下的凝集率用黑色菱形表示，在不施加电压来稀释的情况下的凝集率用黑色四边形表示，采用预先施加过电压的稀释液来稀释的情况下的凝集率用白色三角形表示。纵轴表示凝集率，横轴表示PSA浓度。
图15是表示将2.0μm的抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体与AFP对照血清进行反应的情况下的载体凝集率的图表。通过施加电压来稀释的情况下的凝集率用黑色菱形表示，在不施加电压来稀释的情况下的凝集率用白色四边形表示。纵轴表示凝集率，横轴表示AFP浓度。
图16是表示将3μm的抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体与AFP对照血清进行反应的情况下的载体凝集率的图表。通过施加电压来稀释的情况下的凝集率用黑色菱形表示，在不施加电压来稀释的情况下的凝集率用白色四边形表示。纵轴表示凝集率，横轴表示AFP浓度。
图17是表示将4.5μm的抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体与AFP对照血清进行反应的情况下的载体凝集率的图表。通过施加电压来稀释的情况下的凝集率用黑色菱形表示，在不施加电压来稀释的情况下的凝集率用白色四边形表示。纵轴表示凝集率，横轴表示AFP浓度。
图18是表示在使AFP对照血清与抗AFP抗体敏化胶乳试剂反应后加入0.25％、2.5％或25％的戊二醛进行超声波处理的情况下、以及不加入戊二醛进行超声波处理的情况下的载体凝集率的图表。纵轴表示凝集率，横轴表示超声波处理时间。
图19是表示在使AFP对照血清与抗AFP抗体敏化胶乳试剂反应后加入戊二醛进行0秒、15秒、30秒或60秒的培养后进行超声波处理的情况下、以及不加入戊二醛进行超声波处理的情况下的载体凝集率的图表。纵轴表示凝集率，横轴表示超声波处理时间。
图20是表示在将2.0μm的抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体与AFP对照血清反应后加入戊二醛进行培养后再进行超声波处理的情况下、以及不加入戊二醛进行超声波处理的情况下的载体凝集率的图表。纵轴表示凝集率，横轴表示超声波处理时间。
图21是表示在将2.8μm的抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体与AFP对照血清反应后加入戊二醛进行培养后再进行超声波处理的情况下、以及不加入戊二醛进行超声波处理的情况下的载体凝集率的图表。纵轴表示凝集率，横轴表示超声波处理时间。
图22是表示在将1.7μm的抗AFP抗体敏化胶乳试剂作为载体与AFP对照血清反应后加入戊二醛进行培养后再进行超声波处理的情况下、以及不加入戊二醛进行超声波处理的情况下的载体凝集率的图表。纵轴表示凝集率，横轴表示超声波处理时间。
具体实施例方式
本发明涉及一种亲和性物质的测定方法，其包含以下工序(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液进行培养的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)对工序(1)的反应液施加电压脉冲的工序；(3)在工序(2)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(4)在工序(3)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
本发明的特征在于，对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液在施加电压脉冲之前进行培养，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体。本发明者等发现通过电压脉冲施加前对反应液的培养，从而促进了电压脉冲施加后凝集块的形成。也即，通过电压脉冲施加前的培养来促进反应。
在本发明中，反应液的培养例如在室温以上的温度下实施。培养温度以维持反应液中所含的各种反应成分的活性为限，优选为尽可能的高温。对培养用的时间没有限定。也即在培养温度下，可在不使反应成分变质的范围内进行培养。培养时间越长，则促进效果也增强。因此，优选预先设定温度和时间条件，在该条件下可期待必要程度的促进效果。
具体地，例如作为培养用的温度条件通常为37-90℃，优选为40-90℃，或者可为45-80℃。例如作为亲和性物质的蛋白质抗原，可通过采用作为结合配偶体的抗体，基于本发明来进行测定。已知构成抗体或抗原的蛋白质在高温下会变质。但是，例如在作为用于血清非动化的一般条件的、所谓56℃下培养30分钟的条件，多数蛋白质不变质。此外，本发明者等发现，在如免疫测定的低蛋白质浓度条件下短时间处理的话，即使在90℃左右的温度下，也可忽视蛋白质的变质。例如已确认在45-80℃的范围内，5-180秒的培养可获得几乎相同程度的反应促进效果(图3)。因此作为本发明优选的培养条件，可表示为优选在45-80℃，更优选为50-65℃下实施5秒以上，例如5-30秒。
在本发明中，不用说还包含更长的培养时间。但是，在期待缩短反应时间的情况下，通过采用5秒以上的较短时间，以不牺牲反应时间作为目的，可期待获得促进反应的效果。此外，例如在超过80℃的高温条件下，通过使得培养时间为5-180秒，可避免蛋白质变质。
或者在耐热性物质反应中应用本发明方法的情况下，高温条件不是问题。例如DNA在高温条件下也是非常稳定的。因此，在欲通过载体颗粒的凝集来测定DNA之间的结合的情况下，作为用于培养的温度，也可选择更高的温度。
在本发明中，通过培养而促进反应的机理可说明如下。由施加电压脉冲而排列的载体颗粒，在其上固定的结合配偶体通过亲和性物质与其他载体颗粒上的结合配偶体发生交联而构成凝集块。一连串的反应考虑是在载体颗粒排列时发生的。但是本发明者根据发现，确认电压脉冲施加前的培养反应对反应效率是有贡献的。此外还发现在该培养期间，形成载体颗粒上的结合配偶体与亲和性物质结合的状态。也即，考虑在施加电压脉冲使载体颗粒排列之前，结合配偶体已形成捕捉亲和性物质的状态，从而使得反应有效率。
考虑到在不施加电压脉冲的条件下，与施加电压脉冲时相比，载体颗粒的自由度非常大。因此，载体颗粒上的结合配偶体和亲和性物质可接触，结合配偶体可捕捉亲和性物质。在此施加电压脉冲时，具有捕捉了亲和性物质的结合配偶体的载体颗粒与其他的载体颗粒一同在电场中排列。此时结合配偶体已捕捉到亲和性物质，因此通过与接近的其它载体颗粒的结合配偶体相结合，可快速形成凝集块。通过断续施加电场，载体颗粒的排列和分散反复进行，使得接触机会增加，促进了凝集块的形成。
也即在施加电压脉冲后检测载体颗粒的凝集，将该凝集作为指标来测定亲和性物质的方法中，载体颗粒的凝集块可以说是通过以下的一次反应和二次反应形成。
一次反应载体颗粒上的结合配偶体捕捉亲和性物质的反应。此时，不必通过亲和性物质形成载体颗粒间的交联构造也是可以的。
二次反应在亲和性物质上结合多个载体颗粒上的结合配偶体的反应。该结果是通过亲和性物质形成载体颗粒间的交联构造(也即凝集块)。
二次反应通过电压脉冲而被促进。但是，到此为止还是未明确用于促进一次反应的具体条件。因此本发明还可掌握为提供用于促进一次反应的条件。也即本发明中电压脉冲施加前的培养工序也可以说是促进一次反应用的工序。
在本发明中，可向施加电压脉冲前的反应液中添加水溶性高分子化合物。在水溶性高分子化合物的存在下，通过颗粒的凝集反应检测出亲和性物质和结合配偶体的结合，由此可对凝集反应进行强化，或者达到稳定化。反应液中水溶性高分子化合物的浓度例如可从0.05-5％中适宜地进行选择。更优选为0.1-3％，进一步优选为0.3-1％。对凝集反应的强化作用较强的化合物在超过5％的浓度下，存在着非特异凝集反应的可能性增加的倾向。此外，在0.05％以下的较低浓度下，还存在着该效果不能充分实现的情况。
作为水溶性高分子化合物，可采用聚乙二醇、葡聚糖、羧甲基纤维素等。聚乙二醇的分子量优选为6000-2000000。这些水溶性高分子化合物可以为1种，还可以将2种以上进行组合。为了向反应液中添加水溶性高分子化合物，还可向包含载体颗粒的试剂中预先添加必要的量。或者可以将水溶性高分子化合物作为和载体颗粒不同的试剂进行混合。例如可向作为试样的稀释液中预先添加水溶性高分子化合物。此外，还可预先添加到混合的多种试剂以及稀释液中。
优选地，作为2试剂体系，使其含在缓冲液等的第一试剂中，和含有载体的第二试剂混合后在测定时使用。此时，可在第一试剂中添加吸收异嗜性抗体(heterophile antibody)等的非特异物质的非特异吸收剂或者吸收类风湿性因子用的物质。
基于本发明，通过电压脉冲施加前的培养来提高反应效率，这还可在阻止凝集反应中进行应用。也即本发明提供包含以下工序的亲和性物质的测定方法。培养条件和上述条件相同。此外，在阻止凝集反应体系中还可向反应液中添加水溶性高分子化合物。
(1’)在与凝集试剂成分混合之前或之后对包含载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液进行培养的工序，其中该载体颗粒结合了至少具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该工序中所述载体颗粒由凝集试剂而凝集，并且由测定对象亲和性物质阻碍该凝集；(2’)在凝集试剂成分存在的情况下对工序(1’)的反应液施加电压脉冲的工序；(3’)在工序(2’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(4’)在工序(3’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
如上所述，电压脉冲施加前反应液的培养对促进载体颗粒的凝集反应是有效的。此时，已经说过是培养温度越高，效果越好。另一方面，施加过电压脉冲的反应液温度由于焦耳热而上升。当导体中流过电流时，在导体中产生的热为焦耳热。本发明者等发现，与培养中高温条件对凝集反应具有促进作用相比，施加电压脉冲时温度上升对凝集反应具有阻碍作用。因此，施加电压时，维持较低的反应液温度是有利的。
也即，本发明提供一种用于使载体颗粒凝集的方法，其包含对反应液施加电压脉冲的工序，其中该反应液含有结合有结合配偶体的载体颗粒和特定物质，且该结合配偶体具有与上述特定物质的结合活性，其特征为，施加电压期间反应液的温度为0℃-20℃。
本发明的方法例如可利用在将载体颗粒的凝集作为指标来测定亲和性物质的方法中。更具体地，本发明提供包含以下工序的亲和性物质的测定方法。
(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液在0℃-20℃条件下施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)在工序(1)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3)在工序(2)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
或者，本发明提供包含以下工序的亲和性物质的测定方法。
(1’)对含结合有结合配偶体的载体颗粒、测定对象亲和性物质和凝集试剂成分的反应液在0℃-20℃条件下施加电压脉冲的工序，其中结合配偶体至少与测定对象亲和性物质具有结合活性，(2’)在工序(1’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序，以及(3’)在工序(2’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质程度的工序。
在本发明中，施加电压时的温度通常为0-20℃，例如为0-15℃，优选为1-8℃，或者为2-4℃。通过施加电压脉冲使得反应液的温度上升。因此，为了较低地保持反应液的温度，利用冷却单元是有利的。作为局部形成低温环境用的合适冷却单元，例如可示出佩尔蒂(Peltier)元件。所谓佩尔蒂元件是Peltier(Jean Charles A.Peltier)发现的、利用佩尔蒂效果的由半导体构成的电子元件。在N型和P型的半导体中流过直流电流时，半导体的一方吸收温度，另一方发生放热(热交换现象)。温度被吸收的一侧温度低，被冷却。市场销售的佩尔蒂元件通常具有-10℃左右的冷却能力。佩尔蒂元件的冷却能力可根据提供给半导体的电流自由控制。因此，在施加电压脉冲期间，采用温度传感器对反应液温度进行监视，并且根据需要通过佩尔蒂元件的操作，可将反应液的温度维持在预定温度范围内。
或者，在施加电压脉冲时，使得反应液充分冷却，并在施加电压脉冲后反应液的温度也处于预定范围的情况下，不一定必需在施加电压脉冲时进行冷却。例如施加电压脉冲完成时反应液的温度为20℃以下的话，在施加期间即使不冷却，也可满足必要的温度条件。预先充分冷却反应液，进一步地根据需要，如果可抑制反应液所处的环境温度上升，则在施加电压脉冲期间无需积极地进行冷却。
在本发明中，施加电压脉冲的反应液可预先进行培养。培养用的条件如上所述。反应液在37℃-90℃的高温下进行培养的情况下，施加电压脉冲前充分进行冷却。通常反应液的体积为1mL以下，因此反应液可在极短的时间冷却。将高温下培养过的反应液冷却，在0-20℃下施加电压脉冲的条件是本发明中优选的条件。
施加电压脉冲时的温度上升对凝集反应发生阻碍作用的机理可考虑如下。在施加过电压脉冲的反应液中，载体颗粒的排列和分散反复进行。载体颗粒上的结合配偶体与反应液中亲和性物质(或者凝集试剂成分)的接触的机会增加，因此载体颗粒的分散是有效的。同时，为了使多个载体颗粒通过与亲和性物质(或凝集试剂成分)结合而交联以形成凝集块，载体颗粒的整齐排列是有效的。但是在反应液中载体颗粒的运动激烈的情况下，载体颗粒存在不能充分整齐排列的可能性。在反应液温度上升了的状态，反应液中所含的载体颗粒的布朗运动变激烈，可以说在施加电压时，载体颗粒难以形成整齐的排列状态。结果阻碍了施加电压时载体颗粒的整齐排列，对凝集反应造成阻碍。基于本发明在施加电压脉冲时控制反应液温度的情况下，通过施加电压，可充分获得载体颗粒的整齐排列效果，由此可抑制由温度上升引起的对凝集反应的阻碍。
在施加过电压脉冲的反应液中，为抑制载体颗粒的运动，提高反应液的粘度也是有效的。一般凝集反应的反应液不足0.75mPas。在这种粘度下，不能抑制载体颗粒的运动，存在阻碍凝集反应的情形。对此，本发明者在0.8mPas以上的粘度下，确认可有效促进凝集反应。也即本发明提供一种使载体颗粒凝集的方法，其包含对反应液施加电压脉冲的工序，该反应液中含有结合有结合配偶体的载体颗粒和特定物质，该结合配偶体与所述特定物质具有结合活性，其特征为，在施加电压期间，反应液的粘度为0.8mPas以上。
更具体地说，在包含以下工序的亲和性物质测定方法中，由本发明提供使反应液的粘度为0.8mPas以上的方法。
(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)在工序(1)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3)在工序(2)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序，或者本发明是包含以下工序的亲和性物质的测定方法，由本发明提供使反应液的粘度为0.8mPas以上的方法。
(1’)对包含载体颗粒、测定对象亲和性物质和凝集试剂成分的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了至少具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2’)在工序(1’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3’)在工序(2’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质程度的工序。
在本发明中，反应液的粘度通常为0.8mPas以上，例如为1-3mPas，优选为1-2mPas。反应液的粘度可通过添加可调节粘度的化合物来进行调节。作为可调节粘度的化合物，可利用不干扰亲和性物质与结合配偶体之间的结合的任意化合物。例如通过添加牛血清清蛋白、酪蛋白、甘油、蔗糖或者氯化胆碱等，可提高反应液的粘度。这些化合物的添加量例如可从0.05-5％之中进行适宜选择。更优选为0.1-3％，进一步优选为0.3-1％。此外，即使反应液的组成相同，只要反应液温度降低，一般粘度也会升高。因此，在提高反应液粘度的方面，在低温条件下施加电压脉冲也是有效的。
本领域普通技术人员通过在反应液中添加这些化合物，在施加电压脉冲的温度条件下测定其粘度，可设定适度的添加量。确定液体粘度的方法是公知的。一般采用旋转式粘度计、超声波式粘度计或者振动式粘度计等。
此外，本发明在包含以下工序(1)-(3)或(1’)-(3’)的亲和性物质的测定方法中，在工序(2)或(2’)之前，包含通过强化亲和性物质和结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合的单元以稀释反应液的工序。
(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)在工序(1)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3)在工序(2)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序，或者(1’)对将载体颗粒和测定对象亲和性物质与凝集试剂成分混合的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该工序中所述载体颗粒由凝集试剂而凝集，并且由测定对象亲和性物质阻碍该凝集；(2’)在工序(1’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3’)在工序(2’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质程度的工序。
在本发明的反应液稀释工序中，在上述工序(2)或(2’)之前，可通过能对亲和性物质和结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合进行强化的任意单元来加以实施。例如在施加电压脉冲的条件下对反应液进行稀释的方法，是本发明中优选的稀释方法。更具体地是通过向施加了电压脉冲的稀释液中添加反应液来进行稀释。稀释液被配置在电极之间，来施加电压脉冲。换言之，在对置的电极之间配置稀释液。
本发明的稀释工序限制在对反应液施加电压脉冲的条件下进行稀释，对于电极的大小和电极的间隔没有特别限制。也即，其特征是串珠化后反应液和稀释液的初始接触是在包夹对置电极的电场中进行的。例如，在图6(B)所示的稀释方式中，可确认当电极的大小是(宽度)2至12mm×(长度)10至50mm×(厚度)0.01至0.04mm，电极间的距离为5-20mm时获得几乎相同的效果。
此外，电压脉冲优选是交流电压。电压脉冲施加条件可以是不引发反应液和稀释液电解的任意条件。电压脉冲的电压例如为0.1V到1.2V，更优选为0.3V到0.9V。电压脉冲的频率例如为2KHz到20MHz，更优选为10KHz到500KHz。电压脉冲可采用任意波形。具体而言，可表示为方波、正弦波、三角波等。更优选电压脉冲为方波。在本发明中，优选至少在包含反应液和稀释液接触的瞬间的时间段中施加电压脉冲。施加时间即使为极短的时间，也可期待对稀释过程中结合的强化作用。更具体地为0.5-30秒，通常为1-10秒，例如为1-5秒。
在稀释液中可使用含盐的溶液。具体地可采用添加了50mM-600mM盐的生理盐水、甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液等。作为盐，可示出氯化钠、氯化钾、氯化钙等。在稀释液中还可含有叠氮化钠等的防腐剂或Triton X-100等的表面活性剂、甘油、蔗糖等。
在本发明中，对构成凝集块的亲和性物质(或者凝集试剂)和结合配偶体的结合反应进行强化。这是考虑通过施加电压脉冲来形成电场，由该电场带来的偶极矩效果对二者的结合进行强化。不管是哪一种，都已确认通过在施加电压脉冲的条件下进行稀释，可抑制凝集块发生崩塌，在维持凝集块的状态下实现反应液的稀释。
或者作为可对亲和性物质和结合配偶体、或者凝集试剂和结合配偶体之间的结合进行强化的稀释单元，可利用对二者的结合进行强化的结合强化剂。在本发明中的结合强化剂指的是通过在反应液中添加，可对二者的结合进行强化的成分。例如蛋白质之间的结合可通过添加戊二醛或碳化二亚胺等的化合物进行强化。因此，蛋白质抗原和抗体的免疫学结合可通过戊二醛或碳化二亚胺等进行强化。这些化合物优选作为本发明中的结合强化剂。
结合强化剂通过对亲和性物质和结合配偶体的官能基产生作用，从而使二者化学结合。或者在阻碍凝集反应的系统中，对凝集试剂和结合配偶体之间的结合进行强化。结果通过二者的结合形成的凝集块可获得高度的物理稳定性。例如，亲和性物质或者凝集试剂、以及结合配偶体若为蛋白质，则分子内存在氨基或羧基。这些官能基通过戊二醛或碳化二亚胺等的化学物质而交联。
反应液中结合强化剂的浓度可根据结合强化剂的种类适宜地设定。更具体地，例如为戊二醛的情况下，反应液的最终浓度通常为0.1-25％，优选为0.2-18％。在对包含亲和性物质和结合配偶体的结合体的反应液进行稀释之前，可向反应液中添加结合强化剂。添加结合强化剂后的反应液可优选在37℃下进行几秒-20秒左右、优选2-10秒、或者2-5秒的培养后进行稀释。将戊二醛或碳化二亚胺作为结合强化剂使用的情况下，可在添加至反应液中后直接进行稀释。
结合强化剂的添加作为本发明的稀释工序是有效的。本发明可进一步在上述施加电压脉冲条件下的稀释工序中，对结合强化剂进行组合。也即，向反应液中添加结合强化剂后，根据上述条件，在施加电压脉冲条件下，可对反应液进行稀释。或者也可利用添加有结合强化剂的稀释液，根据上述条件在施加电压脉冲条件下，对反应液进行稀释。通过二者的组合可使结合的强化作用进一步增强。
在本发明中，所谓反应液的稀释指的是通过将反应液和稀释液混合，使得反应液中载体颗粒的浓度降低。反应液中载体颗粒的浓度由试样的量和作为试剂提供的载体颗粒的量所决定。进一步地，本发明反应液中载体颗粒的浓度通常设定在可通过串珠化促进载体颗粒凝集的范围内。具体而言，反应液中载体颗粒的浓度通常为0.01-5重量％，更优选为0.1-2重量％。与此相对的是，例如可稀释到100倍以上，通常为1000倍以上，具体为1000-100000倍，优选为2000-40000倍。稀释后载体颗粒的浓度为0.1×10-5-0.005重量％，优选为0.00001-0.001重量％。
本发明中的亲和性物质、以及与亲和性物质有结合活性的结合配偶体包含可构成结合反应的所有物质的组合。也即，某些物质和某些物质结合时，一方为亲和性物质，而另一方为结合配偶体。本发明中亲和性物质和结合配偶体可为天然物质，也可以是人工合成出的化合物。而亲和性物质和结合配偶体也可以是精制出的物质，也允许杂质共存。此外，亲和性物质和结合配偶体还可存在于细胞或病毒表面。
作为本发明中亲和性物质和结合配偶体的结合反应的例子，例如可示出如下的反应。构成这些反应的物质都可以是本发明的亲和性物质或结合配偶体。
抗原或半抗原与抗体的反应(免疫反应)具有互补的碱基对的核酸间的杂交植物凝血素和其受体的反应植物凝血素和糖链的反应配合基和受体的反应DNA和转移调节因子的反应在上述结合反应中，作为本发明优选的结合反应例如可示出免疫反应。作为构成免疫反应的抗原可示出如下物质。
肿瘤标记AFP、CEA、CA19-9、PSA等凝固线溶丝标记物蛋白质C、蛋白质S、抗凝血酶(AT)III、FDP、FDP-D-二聚体等感染病标记物CRP、ASO、HBs抗原等激素甲状腺刺激激素(TSH)、催乳激素、胰岛素等组织成分肌红蛋白、肌球蛋白、血红蛋白等其他DNA等的核酸等这些抗原不仅为抗原分子本身，还可以是其片断或者为存在于细胞表面的状态。而且这些物质是抗原物质的实例，这些物质以外的抗原物质当然也可以应用于本发明。例如基于将胶乳(latex)、血球等作为载体使用的免疫学凝集反应可测定的抗原性物质都可作为本发明的亲和性物质。
抗原性物质和识别该物质的抗体的任一种可作为亲和性物质，而另一方可作为结合配偶体来进行利用。本发明中的亲和性物质在将该物质作为测定对象时，称为亲和性物质。另一方面，结合配偶体是指可作为测定亲和性物质的探测器来进行利用的、具有对该亲和性物质的结合活性的物质。因此，在测定抗原时，可将抗体用作结合配偶体。相反，在测定抗体时，可将该抗体识别的抗原作为结合配偶体进行利用。例如，基于将胶乳、血球等作为载体使用的免疫学凝集反应可测定的抗体都可以在本发明中作为亲和性物质。与HBs(B型肝炎病毒表面抗原)、HBc(B型肝炎病毒芯部抗原)、HCV(C型肝炎)、HIV(AIDS病毒)、TP(梅毒)等相对的抗体，可通过免疫学凝集反应来进行测定。
将载体颗粒的凝集作为指标来测定亲和性物质和结合配偶体的反应用的几个反应原理是公知的。这些反应原理都可应用于本发明。以下例示出了将载体颗粒的凝集作为指标的、利用亲和性物质和结合配偶体的反应的测定原理。
直接凝集反应通过测定对象物质与载体颗粒上结合配偶体的反应，来检测载体颗粒的凝集。例如利用作为结合配偶体的抗体来测定抗原分子的情况就包含在该原理中。或者相反，将结合有抗原的载体颗粒的凝集作为指标来测定作为亲和性物质的抗体的情况，也包含在该原理中。在直接凝集反应中，通常凝集颗粒的程度和作为测定对象物质的亲和性物质的量成正比。在直接凝集反应中，通常凝集程度和作为测定对象物质的亲和性物质的量成正比。也即，当凝集块的形成程度高时，亲和性物质的程度(也即浓度)高。相反，当未形成凝集块的载体颗粒的程度高时，亲和性物质的程度(也即浓度)低。
阻碍凝集反应被称作半抗原的低分子抗原难以通过载体颗粒凝集时所需的抗原形成交联结构。因此，采用直接凝集反应的原理不能检测出半抗原。在此，由载体上结合着片断的聚半抗原和载体颗粒上的抗体的结合来利用凝集反应，其中的片断包含多个分子的半抗原或者其表位。聚半抗原可交联多个抗体分子，因此使得载体颗粒凝集。但是存在半抗原时，阻碍了聚半抗原和抗体的反应，从而阻碍了载体颗粒的凝集。阻碍凝集的程度与半抗原的存在成正比。换言之，测定对象物质的量和凝集反应的程度成反比。也即，当凝集块的形成程度高时，亲和性物质的程度(也即浓度)低。相反，当未形成凝集块的载体颗粒的程度高时，亲和性物质的程度(也即浓度)高。
在分类为半抗原的测定对象抗原中，例举出如下的成分。
荷尔蒙雌激素、雌二醇药剂茶碱本发明为了基于阻碍凝集反应的原理对半抗原进行测定，就需要可使得结合有与半抗原相对的抗体的载体颗粒发生凝集的成分。可使得结合有与半抗原相对的抗体的载体颗粒发生凝集的成分在本发明中称为凝集试剂。凝集试剂被定义为这样的试剂，其具有与抗体的特异亲和性，并且通过与抗体的结合具有交联载体颗粒的作用。如上所述的聚半抗原在半抗原测定中可作为凝集试剂使用。
无论直接凝集反应还是阻碍凝集反应，都可相对于预先包含一定量亲和性物质的标准试样在同一反应体系中测定，通过测定凝集块或未形成凝集块的载体颗粒程度来制作标准曲线或者回归方程式。通过试样测定所得的凝集块形成程度和未凝集的载体颗粒的程度都适用于标准曲线或回归方程式的话，就可确定试样中亲和性物质的程度。
本发明中，结合配偶体是结合在载体颗粒上来利用的。作为本发明的载体颗粒，可举出胶乳颗粒、高岭土、金胶粒、红血球细胞、明胶、核蛋白体等。作为胶乳颗粒，可使用凝集反应中一般使用的物质。聚苯乙烯类胶乳、聚乙烯甲苯类胶乳、聚甲基丙烯酸酯类胶乳颗粒是公知的。优选的颗粒载体为聚苯乙烯类胶乳颗粒。还可使用通过具有官能基的单体的共聚，在胶乳颗粒的表面导入了官能基的胶乳颗粒。例如公知具有羧基-COOH、羟基-OH、氨基-NH2、磺酸基-SO3等官能基的胶乳颗粒。在具有官能基的胶乳颗粒上，可与结合配偶体发生化学结合。
载体颗粒的平均粒径例如为胶乳颗粒的情况下具体为0.5-10μm，更优选为1-10μm，最优选为2-5μm。此外，通过采用电介质极化大的椭圆形颗粒，还可使用更小的载体颗粒。
由此可知，与公知的胶乳凝集比浊法中载体颗粒为0.05-0.6μm的情况相比，本发明的方法可利用1μm以上的大尺寸颗粒。通过利用施加电压脉冲的工序对凝集反应进行促进的结果，是为了即使是大尺寸颗粒也可在短时间下充分地进行反应。载体颗粒大时存在着如下的优点。首先，用于计测颗粒的细孔尺寸可以较大。结果细孔不容易发生阻塞。此外，通过使得载体颗粒变大，与体液中所含的妨碍测定的物质的识别变得容易。结果提高了测定精度。另一方面，即使在采用获得图像信息的计数单元的方法等其他计数单元中，装置的设计也变得容易。
在本发明中，采用其他颗粒取代胶乳颗粒作为载体颗粒的情况下，也可利用与胶乳颗粒同样尺寸的颗粒。例如，在采用高岭土、金胶粒、明胶或者核蛋白体等颗粒作为载体颗粒的情况下，载体颗粒的平均粒径优选为0.3-20μm。
结合配偶体和颗粒载体可通过与各原材料对应的方法进行结合。本领域普通技术人员对二者的结合方法进行适宜地选择。例如在胶乳颗粒上可物理吸附着抗原和抗体、或者他们的片断等的蛋白质。在表面上具有官能基的胶乳颗粒上，可化学结合取代基，该取代基可与该官能基发生共价结合。例如在具有羧基-COOH的胶乳上，可结合蛋白质的氨基-NH2。
结合有结合配偶体的载体颗粒可根据需要进行封闭(blocking)。具体地，通过非活性蛋白质对载体颗粒表面进行处理，可防止非特异蛋白质对载体颗粒表面的结合。作为非活性蛋白质，可利用牛血清清蛋白或脱脂奶粉等。此外，为提高载体颗粒的分散性，可向分散媒质中添加表面活性剂或糖类。此外，为防止微生物繁殖，还可向颗粒载体添加抗菌剂。
本发明包含对反应液施加电压脉冲的工序，该反应液包含亲和性物质以及结合有结合配偶体的载体颗粒。通过对反应液施加电压脉冲以进行凝集反应的方法是公知的(特开平7-83928号)。通过施加电压脉冲，载体颗粒沿着电场整齐排列，促进了亲和性物质和载体颗粒上结合配偶体的结合反应。
此时，在利用阻碍凝集反应原理的情况下，亲和性物质和载体颗粒在凝集试剂共存下发生整齐排列。凝集试剂能在载体颗粒和测定对象亲和性物质接触后再进行接触的。或者，通过预先将测定对象亲和性物质和凝集试剂混合后再添加载体颗粒，可使3个成分同时接触。而且，通过凝集试剂和结合配偶体的反应形成凝集块，而亲和性物质阻碍了二者的结合。
电压脉冲可利用交流成分或直流成分。可将二者进行任意组合。由于交流电压容易使得反应液发生电解，因此优选。交流电压可采用方波、矩形波或者正弦波等。通过反应液(试剂)的离子强度可任意设定交流电压的电源频率。交流电压用峰值表示时，以获得5-50V/mm的电解强度的方式来进行施加。当电解强度小于5V/mm时，载体难以发生串珠化，因此对凝集反应的促进不足。当电解强度超过50V/mm时，反应液难以发生电解，凝集反应的测定变得困难。更优选以获得10-20V/mm的电解强度的方式来进行施加。交流频率优选为10KHz到10MHz。更优选为50KHz到1MHz。
在本发明中，电压脉冲指的是具有从通常的稳定状态发生振幅偏移、仅持续有限时间而返回原来状态的波或者波形的电压。交流电压为代表性的电压脉冲。交流电压是如同电压平均值为0的时间的周期函数。例如具有正弦波、矩形波、方波或者锯齿波等的电压明显其振幅是周期性的，包含在交流电压中。一般，在交流电压中，任意的一个周期其正电位侧的面积和负电位侧的面积相等，二者的总计为0。各面积是由横轴(电位差为0)和上侧曲线或者下侧曲线限定的面积。本发明中，为防止反应液电解而施加电压脉冲。因此，在不引起反应液发生电解或可抑制到即使发生电解对反应实质上也不产生干扰程度的情况下，还可利用正电位和负电位的总计不为0的电压脉冲。
在本发明中，方波或矩形波的电压脉冲指的是反复发生正电位/电位差0/负电位，并且正电位和负电位中的至少一方是指包含电压为恒定状态的电源。而且，方波或矩形波的电位差从0的状态到下一个0的状态期间的时间为脉冲宽度。方波指的是在将纵轴作为电压、横轴作为时间的图表中对电压变化进行描画时，形成大致四边形形状的电压脉冲。四边形包含正方形和长方形。与此相对，矩形波指的是不包含正方形的长方形形状的电压脉冲。因此，矩形波包含在方波中。在本发明中，优选的脉冲宽度通常为50微秒以下。作为优选的脉冲宽度可例举出0.1-10微秒。
对构成方波或矩形波的电位差为0的状态的时间没有限制。一般电位差为0时，是在正电位和负电位之间移动的瞬间。但是，如电位差为0的状态较长时间持续的电压脉冲也可在本发明中使用。例如，具有0.1-10微秒脉冲宽度的正电位/负电位的反复期间，可包含0.1-100微秒的电位差为0的状态。
本发明中对于向工序(1)或(1’)的反应液施加电压脉冲的次数没有限制。也即，可施加1次以上，例如1-20次，通常为1-10次，或者为1-5次断续地施加电压脉冲。通过断续地施加，使得载体颗粒的分散和排列发生反复。其结果是增加了载体颗粒上结合配偶体与亲和性物质、或与凝集试剂接触的机会。也即，通过断续地施加电压脉冲可期待促进反应的效果。在本发明中，在多次施加电压脉冲时，可从不同方向对反应液施加电压脉冲。具体地，在反应液内配置多组电极，通过改变通电的电极，可对反应液施加不同方向的电压脉冲。或者，移动反应液内的电极，也可改变电压脉冲的方向。或者固定电极，移动收纳反应液的空间，也可获得同样的效果。
此外，在多次施加电压脉冲的期间，还可使载体颗粒分散。通过加入分散工序，可期待进一步增强结合配偶体与亲和性物质或者与凝集试剂接触的机会。通过反应液的搅拌、摇震或者对反应液施加振动，可在施加电压脉冲期间使得载体颗粒分散。
一般，反应系统中载体颗粒的浓度越高，越容易形成串珠，因此促进凝集。但是另一方面，随着载体颗粒浓度上升，在不存在生物学特异反应性物质的情况下进行再分散时，载体颗粒的凝集率(背景(background))存在变大的倾向。在基于二维信息对凝集颗粒进行观察的公知方法(特开平7-83928号)中，载体颗粒浓度越高，则将未发生凝集的颗粒误作为凝集颗粒捕获的可能性越高。由于颗粒浓度高时，颗粒接近，所以对仅仅是颗粒的重叠以及由于凝集而形成颗粒块的识别较为困难。因此为了对凝集块进行特异性识别，存在着必须保持较低颗粒浓度的需要。具体地，在特开平7-83928号中公开的反应系统中载体颗粒的浓度例如在为胶乳颗粒的情况下，优选为0.01-1重量％，更优选为0.025-0.5重量％，最优选的浓度为0.05-0.1重量％。这样的颗粒浓度在串珠化过程中，不一定可说是最佳条件。也即，在基于二维信息对凝集块进行计数的方法中，通过牺牲颗粒浓度实现对凝集块的特异性识别。
本发明是基于三维信息对凝集颗粒进行计测的，因此，可与颗粒浓度无关地对凝集块进行特异性识别。结果可施加对串珠形成最佳的条件。也即，考虑测定对象亲和性物质与具有结合活性的结合配偶体的平衡，可确定载体颗粒的浓度。例如即使选择较高的载体颗粒浓度，也可对凝集块进行特异性检测。在本发明中，通常反应系统中载体颗粒的浓度，例如在为胶乳颗粒的情况下，优选为0.01-5重量％ ，更优选为0.1-2重量％。该浓度范围是基于2维信息的方法的2倍到10倍。最佳载体颗粒的浓度可根据载体颗粒的大小以及测定对象亲和性物质的测定灵敏度等进行适宜地调节。
在本发明中，可向反应液中添加促进凝集反应的盐。例如通过添加10mM以上的较高浓度的盐，可促进凝集反应。但是当盐的浓度在反应系统中以600mM以上的浓度存在时，容易引起反应液的电解，因此不优选。更优选盐的浓度是10-300mM，最优选盐的浓度为25-150mM。当存在着生物试样本身含有促进凝集反应的盐的可能性的情况下，可对试剂的盐浓度调整，使得反应液中最终的盐浓度落入上述范围内。在采用直流成分作为电压脉冲的情况下，由于即使是约6mM的盐浓度的反应液也会发生电解，因此在盐的存在下难以对生物学特异性凝集反应进行测定。
本发明中的盐可从对生物学特异性凝集反应产生促进作用的盐中进行选择。例如可举出氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯化铵，但是不受此限制。摩尔电传导率为10mM，在25℃的水溶液中展示出100cm2/(Ω·mol)以上值的盐优选作为本发明中使用的盐。更具体地，可示出例如氯化钠、氯化钾和氯化铵等作为优选的盐。
通过对结合有结合配偶体的载体颗粒和测定对象亲和性物质混合而成的该反应液施加电压脉冲并且该结合配偶体与测定对象亲和性物质具有结合活性，以进行串珠化，从而由特异性反应形成凝集块，即使电压脉冲停止，这些凝集块也不会发生再分散情况。但是，在施加较强的物理外力时，凝集块存在崩塌的情形，不能正确地进行测定。本发明进一步的特征是为了使得该特异性反应形成的凝集块稳定，对形成凝集块的载体颗粒上附着的蛋白质官能基，进一步以化学键对此进行增强。根据本发明的操作优选在对载体颗粒进行稀释前的工序中实施。
本发明中对含亲和性物质的检查材料没有限制。也即，包含作为测定对象的亲和性物质的任意试样可作为检查材料来进行利用。例如血液试样、从咽喉等局部部位采出的试样、唾液、咳痰、尿或者便是代表的生物试样。此外，从生物体采取出的所有生物材料都可作为生物体物质测定用检查材料在本发明中进行利用。此外，通过培养这些生物试样可获得的培养物也可作为本发明的检查材料进行利用。生物体材料可直接或者根据需要进行相应处理后作为检查材料。例如，生物材料经过分级、稀释、溶解、萃取等处理，可形成为检查材料。
本发明的检查材料可以是原液，或者通过自动稀释在测定中使用。稀释倍率可任意设定。当反应中必要试剂为多种时，也可依次添加2种以上试剂。
在此所述构成两种试剂的试剂，可示出如下试剂。
在本发明中，作为非特异性反应原因的物质可采用预先分解和/或吸收用的试剂。这种试剂作为包含非特异抑制剂的试剂是有用的。将包含非特异性抑制剂的试剂与包含载体颗粒的试剂组合物构成2种试剂。包含非特异性抑制剂的试剂例如可预先与检查材料混合。非特异性抑制剂例如可使用现有技术中公知的抑制剂。
在免疫测定法中，已明确在试样中含有成为非特异性反应原因的各种物质。例如类风湿因子等的球蛋白类，对构成免疫测定法的免疫反应存在干扰情况。为防止对球蛋白类的免疫测定法产生干扰，采用非特异抑制剂。例如通过识别球蛋白类的抗体，可吸收其非特异性作用。类风湿因子是IgG或IgM由来的球蛋白。因此，通过使用抗人体IgG抗体或者抗人体IgM抗体，可吸收类风湿因子。此外，通过非特异原因物质的分解来防止干扰的方法也是公知的。具体地，已知通过对球蛋白类进行还原分解，可抑制其干扰作用。球蛋白类可通过二硫苏糖醇或2-巯基乙醇等还原。
此外，还可将2种以上包含着结合了有不同结合活性的结合配偶体的载体颗粒的试剂进行组合。通过这种构成，可同时对不同种类测定对象亲和性物质进行测定。各种试剂可分别进行个别添加。或者还可以预先将多种试剂混合后，再与检查材料进行混合。
优选在施加电压前将检查材料和试剂混合。通过使用搅拌器将二者进行物理混合。或者通过电气方法，也可将二者混合。作为电气方法，可例举出通过断续施加不同方向的电压脉冲，使载体颗粒的位置发生物理移动的方法。
以下对构成本发明测定方法的各个工序进行具体说明。与试样一起作为必要成分混合而成的反应液在配置有电极的槽中移动，由此施加电压脉冲。在施加电压脉冲之前预先对反应液进行培养的情况下，在具备电极的槽中移动后和移动前的两个阶段中或者任何一个阶段中进行培养。施加电场时，载体颗粒发生电介质极化并静电相吸以直链状排列。该现象被称为串珠化。此后电场停止时，直链状排列的载体颗粒瞬间再分散。另一方面，在进行串珠化时结合配偶体通过亲和性物质相互结合时，即使电场停止后载体颗粒也不会分散，直接以形成凝集块的状态存在。由此通过测定所形成的凝集块和未形成凝集块的载体颗粒的两种或者任何一方，可检测或测定亲和性物质的存在。
本发明测定方法的特征是将与通过作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质发生结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者两方作为指标来进行计数。在本发明中，可在电场停止后测定颗粒。或者也可在不停止电场的情况下对置于电场中的颗粒进行测定。例如置于电场中的颗粒可通过从电场中取出来进行计数。而且，在对颗粒进行计数前，可实施使颗粒分散的工序。通过计数前的分散工序，由非特异性原因，可使得凝集的颗粒分散。结果可期待提高测定精度。颗粒通过搅拌和反应液的稀释来进行分散。
为了对凝集的单体颗粒进行计数可利用公知的方法。例如基于二维信息确定凝集程度的方法是公知的。也即对反应液进行显微镜图像扫描，对每单位面积中占据的凝集块和非凝集颗粒的任何一方或者二者进行计数。
或者在本发明中，也可将三维信息作为指标对载体颗粒进行计数。在本发明中，将三维信息作为指标进行计数指的是，对颗粒和/或凝集块的三维信息进行测定，基于该结果对颗粒和/或凝集块进行计数。基于三维信息对载体颗粒进行计数优选作为本发明的计数方法。
对测定三维信息用的方法没有特别限制。此外，本发明中的计数指的是求出颗粒和/或凝集块的数目。颗粒和/或凝集块的数目也可仅简单地测定数目。或者也可以将凝集了的颗粒与未凝集的颗粒区别开来进行测定。此外，对于凝集了的颗粒，对于每一凝集了的颗粒数目测定其凝集块的数目。已知有几种用于将三维信息作为指标对颗粒进行计数的方法。
可利用在本发明中的颗粒计数方法中基于物理原理的测定方法是有利的。本发明中的物理测定方法指的是可对颗粒或凝集块中固有的物理信息进行评价的测定方法。颗粒或凝集块中固有的物理信息也可说是真的测定结果。与此相对，对从图像信息取得的二维信息进行分析的方法，实际上是将未凝集的颗粒的重叠作为凝集块进行检测的。这种检测结果不能说是颗粒固有的物理信息。
在对颗粒或凝集块进行物理测定时，利用流动系统是有利的。流动系统是可对通过微细流动单元中的颗粒的物理信息进行分析的系统。通过利用流动系统，可容易地实施物理测定。也即本发明中所谓的物理测定包含通过流动系统对颗粒和凝集块的任何一方或者两方的三维信息进行测定以计数的工序。作为将三维信息作为指标对颗粒进行物理计数用的方法，可示出例如库尔特(Coulter)原理或激光衍射散射法。
库尔特原理(USPA2656508，1953年)指的是在细孔两侧放置电极以基于通过细孔内的颗粒造成的电阻的变化对颗粒的体积进行检测的分析方法。通过电解液在两个电极间流过微细的电流时，电解液中悬浮的颗粒被吸引而通过细孔时，与颗粒体积相当的电解液被颗粒置换。结果，由于两个电极间的电阻产生改变，因此通过测定该变化，可对颗粒进行计数和测定颗粒的尺寸(体积)。作为检测体积的方法有静电容量法，但是实用化的方法大部分是电阻法。
细孔尺寸可根据成为分析对象的颗粒进行适宜调节。一般在对免疫学颗粒凝集反应中使用的载体颗粒的凝集进行检测的情况下，作为细孔尺寸通常是30-1000μm，优选可为50-200μm。
细孔尺寸相对于载体颗粒的平均粒径为几倍到几百倍，例如为几倍-100倍，优选为5倍-50倍是有利的。该情况下，可检测出与体积成比例的信号，实现精度好的高灵敏度测定。细孔尺寸相对于颗粒粒径的倍率越小，则灵敏度越好，但是过小时，容易造成颗粒阻塞，过大时颗粒检测灵敏度下降，因此不优选。
更具体地，例如对颗粒粒径为1-5μm，特别是2-3微米的载体颗粒进行计数的情况下，细孔尺寸可从30-100μm，优选从50-80μm，例如65-75μm的范围进行选择。在根据本发明的亲和性物质的测定方法中，作为特别优选的颗粒尺寸可例举2-3μm的载体颗粒。即本发明提供包含以下工序的亲和性物质的测定方法。
(1)将结合有结合配偶体的平均粒径为2-3μm的载体颗粒和测定对象亲和性物质混合，施加电压脉冲的工序，其中结合配偶体与测定对象亲和性物质具有结合活性，或者(1’)将结合有结合配偶体的具有2-3μm平均粒径的载体颗粒、测定对象亲和性物质与凝集试剂成分混合，施加电压脉冲的工序，该结合配偶体与测定对象亲和性物质具有结合活性，该工序中所述载体颗粒由凝集试剂而凝集，并且由测定对象亲和性物质阻碍该凝集，(2)在工序(1)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者，根据具有50-80μm细孔尺寸的库尔特原理，将其三维信息作为指标进行计数的工序，或者(2’)在工序(1’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而使得凝集受到阻碍的载体颗粒的任何一方或者二者，根据具有50-80μm细孔尺寸的库尔特原理，将其三维信息作为指标进行计数的工序，以及(3)在工序(2)或(2’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
一般细孔尺寸小时，可对非凝集颗粒进行更正确的计数。相反，通过使细孔尺寸变大，可使得凝集颗粒难以堵塞在细孔中。细孔堵塞是造成分析效率降低的原因。堵塞频率降低，则分析效率随之提高。例如，预测到凝集颗粒大量产生的情况下，通过将细孔尺寸设定为较大，可防止细孔堵塞。或者通过采用颗粒粒径小的载体颗粒，也可获得同样效果。此外，通过稀释试样来降低凝集颗粒比例，还可防止细孔堵塞。通常，根据所期待的检测灵敏度、预想的检测对象物质浓度、以及设备构成(特别是细孔尺寸)，可分别选择合适的条件。
通过如此对凝集颗粒进行计数，可获得凝集颗粒的比例。所谓凝集颗粒的比例指的是凝集颗粒占所计数的全部颗粒的比例。此外，凝集颗粒的比例称为凝集率(agglutination ratio)。而且，相对于预先知道浓度的标准试样求得凝集率，二者的关系可通过在图表中画图获得标准曲线。与此相对，对检查材料的凝集率进行对照的话，可确定检查材料中所含的测定对象亲和性物质的浓度。
或者，所述标准曲线还可作为回归方程式表示。得到回归方程式的话，通过将凝集率代入到回归方程式，也可计算出测定对象亲和性物质的浓度。
另一方面，激光衍射散射法指的是通过在对颗粒照射激光时所产生的振动进行检测，对颗粒进行计数以及测定平均粒径。在任何一种情况下，为提高测定精度，为抑制颗粒的误测定，优选采用对反应颗粒进行稀释，施加超声波或/和鞘流方式等。
作为颗粒体积的测定方法，还可示出如以下的其他方法。
离心沉降法由表示液体中颗粒的沉降速度和粒径的关系的斯托克斯公式测定粒径分布的方法。(在光透过式离心沉降法中，适用斯托克斯法则，其利用了这样的原理，如果为相同比重的颗粒，则大粒径颗粒比小粒径颗粒更快地沉降。由光透过对此时的颗粒浓度进行浊度变化分析，可求出粒度分布。)毛细管方式当在毛细管中流过的粘性流体的雷诺数小的情况下，在此产生泊肃叶流体。该流动越在毛细管中央则越迅速，越在管壁处越慢，因此大颗粒在平均较快的流束中流动，而小颗粒在平均较慢的流束中流动。也即，颗粒在具有一定长度的毛细管中流动时，通过该移动速度的不同对尺寸分别进行分离检测。
三维图像分析对从不同方向拍摄出的多个图像信息进行分析，可求出颗粒的三维信息。或者通过对xy平面的图像信息在z轴方向扫描，可求出颗粒的三维信息。
在本发明的测定方法中，对凝集的(或者未凝集的)载体颗粒进行计数。通过计数结果，对作为测定对象的亲和性物质进行定性或定量的测定。在定性测定中，凝集颗粒的存在意味着作为测定对象的亲和性物质的存在。或者在阻碍凝集反应的情况下，在检测出阻碍凝集时，则证明测定对象的存在。
而在定量的测定中，可将凝集程度与作为测定对象的亲和性物质的量相关联。更具体地说，对于预先明确亲和性物质的量的试样来实施本发明的测定方法，可明确凝集颗粒的检测结果和亲和性物质的量的关系。此后，对于试样同样进行测定，从基于堆积情况对凝集颗粒的检测结果，可明确亲和性物质的量。即使在阻碍凝集反应的情况下，也可同样进行定量测定。
作为颗粒和/或凝集块的计数方法，在对一定颗粒数目进行计数的单元中，可根据2个以上凝集的颗粒数目/总颗粒数目和单颗粒数目/总颗粒数目等的目的，选择运算公式。所谓总颗粒数可以是在某计测时间内所测定的全部颗粒的数目，在将反应液的总量作为分析对象的情况下，按照文字含义，可以为反应液中所含颗粒的总数。反应液中所含颗粒的总数，在已知反应液总容量的情况下，通过对其一部分进行计数，还可近似地进行计算。
或者通过电阻法或激光衍射散射法等，基于每隔恒定时间检测出的颗粒和/或凝集块的数目，可对亲和性物质进行检测或测定。也即，由于通过凝集反应使得单个颗粒凝集而形成凝集块，所以每单位时间计数出的颗粒数目变少。此外，还可将对预定数目的颗粒和/或凝集块进行计数所需要的时间作为指标。在这种计数方法适用于本发明的情况下，可将颗粒和/或凝集块的数目与亲和性物质的量之间的关系用回归方程式表示。抗体敏化的颗粒对应于抗原的浓度，由2个以上颗粒形成的凝集块的比例变多。而且，采用2个以上凝集而成的颗粒数目/总颗粒数目表示的凝集率收敛为1.00(100％)。
由库尔特原理或者激光衍射散射法来对颗粒的三维信息进行计测的方法，与对二维图像数据进行分析的方法相比，可期待由简单的设备结构获得高精度的分析。如上所述，在二维图像数据分析中受到反应液体积的限制。与此相对，计测三维信息的方法可应用流动式分析方法，因此不受反应液体积的限制。此外，也不受反应空间的物理形状的限制。由这些理由可使得设备构成变简单。此外，可自由设定反应液量，对再现性和检测灵敏度的提高作出贡献。
或者本发明还可用于阻碍凝集的反应系统中。利用凝集试剂，基于阻碍凝集反应的免疫学颗粒凝集反应法的原理已经在以上进行了描述。通过以上的工序，可将本发明用于免疫学颗粒凝集反应中。构成上述工序的施加电压脉冲、凝集块的形成程度或者未形成凝集块的载体颗粒的程度的分析，可根据先前具体描述的方法来实施。
在基于阻碍凝集反应的原理来实施本发明的情况下，优选选择这样的条件，使得2个以上颗粒凝集而成的凝集块形成得更多。或者，优选将单个颗粒/总颗粒数作为指标来对凝集程度进行评价的方法。基于阻碍凝集反应的原理的情况下，利用这样的运算公式，比基于2个以上凝集而成的颗粒数目/总颗粒数目的运算公式的分析可期待具有更高的灵敏度。
此外，本发明提供实施上述测定方法用的装置。也即，本发明提供一种用于使载体颗粒发生凝集的装置，其包含对反应液施加电场脉冲的单元，所述反应液中包含结合了结合配偶体的载体颗粒以及特定物质，并且所述结合配偶体与该特定物质具有结合活性，其特征为该装置具有用于将反应液温度加热至37℃-90℃的单元。
或者本发明提供一种测定装置，用于将载体颗粒的由亲和性物质或者凝集试剂引起的凝集作为指标来测定所述载体颗粒与应测定的亲和性物质的结合，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该测定装置包括以下要素1a用于保持反应液的空间；1b用于在37℃-90℃下对反应液的温度进行培养的单元；1c用于对反应液施加电压脉冲的单元；1d用于使施加脉冲电压时反应液的温度为0℃-20℃的单元；以及1e用于对反应液中所含的载体颗粒和载体颗粒的凝集块中的任何一方或者二者进行计数的单元。
图1或图5示出了包含上述要素的本发明测定装置的构成实例。
此外，本发明还提供一种测定装置，用于将载体颗粒的由亲和性物质或凝集试剂引起的凝集作为指标来测定所述载体颗粒与应测定的亲和性物质的结合，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该测定装置包括以下要素2a用于保持包含试样的反应液或者进一步附加地包含凝集试剂的反应液的空间，其中该试样包含结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体的载体颗粒和应测定的亲和性物质；2b用于对反应液施加电压脉冲的单元；2c用于稀释反应液的单元；和2d用于对反应液中所含的载体颗粒和载体颗粒的凝集块中的任何一方或者二者进行计数的单元。
图11中示出了包含上述要素的本发明测定装置的构成实例。
在本发明中，要素1a以及2a用于保持反应液的空间可利用用于保持反应液的任意空间。为使微量的试样反应，小容量的空间是有利的。例如可利用例如1μL-10mL，优选10-500μL左右的空间。该空间根据需要还可配备试样和试剂的供给单元或者以下将要描述的载体颗粒的计测单元。收容在空间中的反应液由试样构成，该试样包含结合了与测定对象亲和性物质具有结合活性的结合配偶体的载体颗粒、以及作为测定对象的亲和性物质。或者在阻碍凝集反应体系中进一步添加凝集试剂成分。
在本发明中，在要素1a用于保持反应液的空间中配置1b用于在反应液温度为37℃-90℃下进行培养的单元。为了将反应液保持在预定温度下，例如可利用温度传感器和加热单元。作为加热单元可利用加热器或佩尔蒂元件。
以下对本发明中的要素1c以及2b用于对反应液施加电压脉冲的单元进行说明。电压脉冲是通过与反应液接触的电极来进行施加的。用于使得载体颗粒在电场中整齐排列的电极例如在先前记载的在先技术文献中也有利用。这些公知的电极可利用在本发明中。本发明的装置可配备向电极提供电压用的电源。
在本发明的装置中，施加电压脉冲用的电极至少由1组(2个)电极构成。为了施加多个不同方向的电压脉冲，还可配备3个以上的电极。例如配置3个电极A、B、C，在A-B间、B-C间及A-C间的3个方向施加电压脉冲。此外，还可配置2组(4个)电极，施加正交的电压脉冲。
另外，为施加不同方向的电压脉冲，可配备驱动电极的机构。例如，通过在反应液中旋转电极，从多个不同方向施加电压脉冲。另外，本发明的装置还可配备搅拌反应液的单元、振动反应液的单元或者对反应液施加振动的单元。这些单元中的任何一种作为在多次电压脉冲之间使载体颗粒分散的单元是有用的。
本发明的装置具有要素2c用于稀释反应液的单元。在本发明中，稀释反应液的单元存在以下记载的稀释单元。稀释单元例如是由用于保持稀释液、采取反应液的至少一部分并将其与稀释液混合的机构所构成。而稀释单元由可容纳施加预定稀释倍数的稀释液的空间构成。本发明中的稀释倍数例如为100倍以上，通常在1000倍以上，具体为1000-100000倍，优选为2000-40000倍。
本发明的稀释单元优选具备这样的机构，其可对形成凝集块的结合进行强化。具体地，在施加电压脉冲条件下，可使反应液和稀释液混合的稀释单元是本发明中优选的稀释单元。例如，在保持上述稀释液的空间中，可配置用于对稀释液施加电压脉冲的电极。或者本发明的稀释单元可含有向反应液中添加结合强化剂用的机构。用于对形成这些凝集块的结合进行强化的构成可以单独地、或者二者组合起来装配。
本发明的装置具有1d用于在施加脉冲电压时使反应液温度为0℃-20℃的单元。作为用于使反应液保持在0℃-20℃的优选单元可采用温度传感器和佩尔蒂元件。
此外，本发明的装置含有要素1e以及2d用于对反应液中所含的载体颗粒和载体颗粒的凝集块中的任何一方或者二者进行计数的单元。该计数单元可装配在上述空间中。或者也可以在将保持在上述空间中的反应液从上述空间中取出并导入计数单元后再进行计数。此外，该计数单元例如包含对稀释过的反应液中所含的载体颗粒进行分析的机构。或者在从保持稀释液的空间取出稀释过的反应液并导入计数单元中后，对颗粒进行计数。载体颗粒或凝集块可基于二维图像信息或三维物理信息进行分析。
将三维信息作为指标对凝集的或未凝集的载体颗粒进行计数的单元，可利用这样的计数单元，即利用了库尔特原理或者激光衍射散射法。在为库尔特原理时，例如将所述空间内的反应液导入具有适用库尔特原理的电极的细孔中，进行必要的分析。细孔尺寸基于上述的基准可进行适宜地调节。还可采用这样的机构，根据试剂中使用的颗粒粒径或者根据预测的凝集颗粒的比例，切换具有不同尺寸的多个细孔以进行利用。例如本发明的装置可具备用于将反应液导入到多个细孔中的流路切换机构。此外，还可基于试剂种类、预测的凝集颗粒的比例等，组合对流路进行自动选择的机构。或者，本发明的装置可具备通过切换细孔尺寸，来自动地对检测灵敏度进行调节的机构。作为检测灵敏度的调节机构可示出这样的机构，例如为首先以较大的细孔尺寸进行分析，在凝集颗粒的比例预测为较小的情况下，可切换成更小的细孔尺寸的机构。在利用激光衍射散射法的情况下同样也可将反应液导入到分析用的光学单元中进行分析。将三维信息作为指标的载体颗粒和/或凝集块的分析机构优选作为本发明的计数单元。
在本发明中，在电场中串珠化的载体颗粒根据需要被再分散后，可进行计数。本发明的装置可装备用于对载体颗粒进行再分散的机构。载体颗粒可通过稀释或超声波处理进行再分散。
构成本发明装置的上述(1a)-(1e)的要素，或者(2a)-(2d)的要素，可配置在1个连续的流路内。或者各个要素作为不连续的空间构成，通过在各个要素间移动反应液，也可实施本发明的测定方法。
在本发明的装置中，可组合用于实施上述测定方法的附加机构。在本发明装置中可组合的附加机构为如下所例举的。
试样的分取机构试样的稀释机构测定结果的记录机构测定结果的显示机构测定结果的印刷机构本说明书中引用的全部在先技术文献作为参考组合在本说明书中。以下基于实施例对本发明作更具体的说明。
实施例实施例1促进抗原抗体反应(1)AFP抗体敏化胶乳试剂的配制将0.1mg的抗α胎蛋白(AFP)抗体(DAKO公司制造)溶解在1mL甘氨酸缓冲液(含有50mM甘氨酸、50mM氯化钠、0.09％叠氮化钠，以下简称为GBS)中，加入1mL的2.0μm的胶乳(积水化学工业制造，固体成分为1％的悬浊液)，在37℃下搅拌2小时后，将敏化后的胶乳进行离心分离，以除去上部清液。使沉淀在1mL的0.5％牛血清清蛋白的甘氨酸缓冲液(0.5％BSA-GBS)中悬浊，配制出抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图1(A)的装置，通过抗原抗体反应来测定亲和性物质(AFP)。图1的装置具有分注(dispensing)·搅拌槽1以及温度控制机构2，其中分注·搅拌槽1对检查材料和试剂1(缓冲液)进行分注并混合，进一步将试剂2(胶乳试剂)进行分注并混合以制成反应液。但实际上在为1个试剂体系的情况下，可省略对试剂1(缓冲液)的分注。此后，在反应槽3(施加脉冲槽)中移动反应液，通过电极4对反应液施加几秒到几十秒的电压脉冲。置于电场中的载体颗粒被串珠化。施加了电压脉冲的反应液在稀释槽5中稀释，采用粒度分布计6测定载体的凝集状态。脉冲施加槽的截面在图1(B)中示出。电极间的距离为0.8mm，电极的厚度为0.03mm，电极的长度为20mm。
(3)检查材料的测定采用0.5％的BSA-GBS，稀释AFP抗原液，配制出浓度为0、0.0075以及0.015ng/mL的检查材料液。采用试管将3μL的这些检查材料和3μL上述抗AFP抗体敏化胶乳试剂进行混合。进行20秒以及45℃、62℃、80℃的任何一个温度下进行培养后，直接将其注入附加有电极的反应单元中。采用(2)的装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲。施加30秒后，立即切断电场，将反应液在生理盐水中稀释，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(Agglutination Ratio；AR；％)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)(4)对照的测定对照1采用试管分别对3μL(3)的各个检查材料以及抗AFP敏化胶乳试剂在25℃下进行20秒的培养后，注入附加有电极的反应单元，与(3)一样地施加高频率电压。除了25℃下进行的培养以外的操作按照(3)的操作。结果作为图2的“比较例1”示出。
对照2采用试管分别对3μL(3)的各个检查材料以及抗AFP敏化胶乳试剂在37℃下进行20分钟的培养。将0.5μL的该反应液在20mL的生理盐水20mL中进行稀释后，使用如(3)的库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，同样计算出凝集率。结果作为图2的“比较例2”示出。
(5)结果图2中示出了各个检查材料和各个对照的测定结果。施加电压脉冲前的反应液在高温下(45℃、62℃或80℃)进行20秒培养的本发明条件下，施加电压脉冲前的反应液在室温(25℃)下配制，与不进行高温处理的现有方法(对照1，图2的“比较例1”)相比，可确认具有较高的凝集率。而在不施加脉冲电压的一般的胶乳凝集法中，在37℃下进行20分钟的培养的对照2(图2的“比较例2”)中，未发现0.015pg/mL的低浓度区域的反应。从该结果可知，本发明的方法比现有的方法(施加脉冲电压前不进行温度处理)可以更高灵敏度进行测定。
实施例2对抗原抗体反应的促进(1)AFP抗体敏化胶乳试剂的配制与实施例1一样，配制抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图1的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(3)检查材料的测定采用0.5％的BSA-GBS，稀释AFP抗原液，配制出浓度为0、0.0075以及0.015ng/mL的检查材料液。采用试管将3μL的这些检查材料和3μL上述抗AFP抗体敏化胶乳试剂进行混合。在62℃下以及在5秒、20秒或180秒的任何一个时间下进行培养后，直接将其注入带有电极的反应单元中，采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲，形成串珠。施加30秒后，立即切断电场，将反应液在生理盐水中稀释，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(Agglutination Ratio；AR；％)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)(4)对照的测定除了在施加电压脉冲前不进行高温处理(0秒)以外，按照(3)的方式进行测定。
(5)结果结果示于图3。在作为“5秒”、“20秒”或“180秒”示出的本发明的条件下(施加电压脉冲前，反应液在高温下62℃进行5秒、20秒或180秒的培养)，与作为“0秒”示出的现有技术方法(施加电压脉冲前不进行高温处理)相比，凝集率变高。也即根据本发明展示出可比现有技术中的方法以更高的灵敏度进行测定。
实施例3抗原抗体反应的促进化(1)PSA抗体敏化胶乳试剂(试剂2)的配制将0.1mg的抗PSA抗体(DAKO公司制造)溶解在1mL的甘氨酸缓冲液(含有50mM甘氨酸、50mM氯化钠、0.09％叠氮化钠，以下简称为GBS)中，加入1mL的2.0μm的胶乳(积水化学工业制造，固体成分为1％的悬浊液)，在37℃下搅拌2小时后，将敏化后的胶乳进行离心分离，以除去上部清液。使沉淀在1mL的0.5％牛血清清蛋白的甘氨酸缓冲液(0.5％BSA-GBS)中悬浊，配制出抗PSA抗体敏化胶乳试剂。
(2)含有PEG20000的Tris盐酸缓冲液(试剂1)的配制配制出在0.5％牛血清清蛋白的50mM-Tris盐酸缓冲液(含有50mMTris、50mM氯化钠、0.09％叠氮化钠，pH为8.4)中含有0.1-1.0％聚乙二醇(分子量为20000，以下简称为PEG20000)的反应促进试剂。
(3)对照的Tris盐酸缓冲液的配制作为对照，除了不含PEG20000以外，配制出与(2)记载的试剂为同样成分的试剂。
(4)测定装置使用图1的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。温度控制机构2设定为室温。
(5)检查材料和对照的测定采用0.5％的BSA-GBS，稀释PSA抗原液，配制出浓度为0以及9.5ng/mL的检查材料液。将1μL的这些检查材料和3μL含有0-1.0％的PEG20000的0.5％BSA-Tris盐酸缓冲液混合后，在试管中混合3μL上述抗PSA抗体敏化胶乳试剂，此后，直接将其注入附加有电极的反应单元中。采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲。施加30秒后，立即切断电场，将反应液在生理盐水中稀释，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(Agglutination Ratio；AR；％)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)(6)结果结果示于图4。从图4可知，通过采用作为水溶性高分子化合物的PEG，展示出凝集率增加。由此可知，本发明与对照法相比可以更高灵敏度进行测定。
实施例4凝集反应的促进(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制与实施例1一样，配制抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图5(A)的装置，通过抗原抗体反应来测定AFP。图5(A)的装置具有分注·搅拌槽以及温度控制机构，其中分注·搅拌槽对检查材料和试剂1(缓冲液)进行分注并混合，进一步将试剂2(胶乳试剂)进行分注并混合以制成反应液。但实际上在为1个试剂体系的情况下，可省略缓冲液的分注。此后，在反应槽2(施加脉冲的槽)中移动反应液，通过电极3施加几秒到几十秒的电压脉冲。此时反应液由温度控制单元冷却至4℃。施加了电压脉冲的反应液在稀释槽5中稀释，采用粒度分布计6测定载体的凝集状态。图5(B)是示出了脉冲施加槽的截面的图。电极间的距离为0.8mm，电极的厚度为0.03mm，电极的长度为20mm。
(3)检查材料的测定采用0.5％的BSA-GBS，稀释AFP抗原液，配制出浓度为0以及0.0075ng/mL的检查材料液。采用试管将3μL的这些检查材料和3μL上述抗AFP抗体敏化胶乳试剂进行混合，并直接将其注入带有电极的反应单元中。采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲。此时，反应单元的温度维持在4℃。施加30秒后，立即切断电场，将反应液在生理盐水中稀释，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(Agglutination Ratio；AR；％)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)
上述操作同样地反复测定5次，求出测定结果的平均值和平均值±2.6SD，示出在图6中。
(4)对照的测定对照1采用(3)的各个检查材料以及抗AFP敏化胶乳试剂，除了使反应单元的温度为22℃以外，全部按照(3)的操作实施。结果在图7中示出。
对照2采用试管分别对3μL(3)的各个检查材料以及抗AFP敏化胶乳试剂在37℃下进行20分钟的培养。将0.5μL的该反应液在20mL的生理盐水20mL中进行稀释后，如(3)所示使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，同样计算出凝集率。而且，与(3)一样反复测定5次，结果在图8中示出。
(5)结果抗原浓度为0ng/mL的情况下的测定值(本底信号)，如果可识别为在测定某浓度抗原时的值的话，则可测定该浓度的抗原。可测定的抗原浓度的最小值为检测界限。例如以下的值A和B不重叠的话，可检测出0.0075ng/mL以上的抗原。
测定值A对0ng/mL和0.0075ng/mL的抗原量进行反复测定时，测定0ng/mL的凝集率的平均值+2.6SD测定值B测定0.0075ng/mL的凝集率的平均值-2.6SD根据图6、图7和图8比较各个条件下的检测界限。本发明的方法(图6)的检测界限示出为0.0075ng/mL。另一方面，在作为对照的现有方法(图7和图8)中展示出不可检测出该浓度。由此可知，在施加电压脉冲时将反应液维持在低温下的本发明，与现有方法相比可以非常短的时间以更高的灵敏度进行测定。
实施例5凝集反应的促进化(1)配制抗PSA抗体敏化乳剂试剂(试剂2)与实施例3一样，配制抗PSA抗体敏化胶乳试剂。
(2)Tris盐酸缓冲液(试剂1)的配制分别配制在Tris盐酸缓冲液(含有50mM Tris、50mM氯化钠、0.09％叠氮化钠、0.25％的PEG20000，pH为8.4)中含有0.5％、2.5％、5％、7.5％以及10％的牛血清清蛋白(以下简称为BSA)的试剂1。
(3)测定装置使用图1的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。将温度控制机构2设定为室温。
(4)测定采用0.5％的BSA-GBS，对PSA抗原液进行稀释，配制出浓度为0、9.5以及32ng/mL的检查材料液。将1μL的这些检查材料和3μL包含0.5％、2.5％、5％、7.5％或10％BSA的Tris缓冲液混合后，加入3μL上述抗PSA抗体敏化胶乳试剂，混合后，直接注入到带电极的反应单元中。采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲。施加30秒后，立即切断电场，将反应液在生理盐水中稀释，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(Agglurination Ratio；AR；％)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)另外，最终反应液中的BSA浓度为0.5％、1.4％、2.4％、3.5％、4.6％。在此，将最终反应液中BSA浓度为0.5％的作为对照进行比较。
(5)反应液的温度测定根据上述测定方法，对形成串珠时反应液的温度变化进行测定。
(6)最终反应液的粘度测定采用振动式粘度计(粘度测定计)，对上述最终反应液(BSA浓度为0.5％-4.6％)、BSA浓度为0.3％以及6.8％的反应液在4-52℃的粘度进行测定。
(7)结果表1最终反应液中的BSA浓度施加前刚关断前0.5％24℃ 37℃1.4％24℃ 38℃2.4％25℃ 37℃3.5％25℃ 38℃4.6％24℃ 37℃结果示于图9和图10以及表1中。如图9所示，随着最终反应液中BSA的浓度从0.5％增加到2.4％，各浓度的凝集率增加。即使在PSA为0ng/mL(空白(blank))的情况下，凝集率也存在着上升的倾向，因此比较空白校正过的凝集率。结果，通过使得最终反应液中BSA浓度从0.5％增加到2.4％，可确认凝集率显著上升。也即根据本发明可展示出更高的灵敏度。
从图10中展示出最终反应液中BSA浓度和粘度的关系、以及反应液中温度和浓度的关系。首先，从图9和图10可知，在不对形成串珠时的温度进行控制的条件下，通过使得最终反应液中BSA浓度从0.5％增加到2.4％，可提高凝集率。此时，最终反应液中的粘度从0.75mPas调整至0.9mPas。也即，通过将最终反应液中的粘度从0.75mPas调整至0.9mPas，可展出高灵敏度。
表1是对通过施加交流电压来形成串珠时反应液温度变化进行测定的结果。施加前反应液的温度为室温(约25℃)，施加后上升至约37℃。另一方面，在现有的方法中最终反应液中的BSA浓度为0.5％左右，但是由于施加电压脉冲使得温度上升，从而使得反应液的粘度不足0.8mPas(0.6-0.75mPas)。从以上的情况，展示出通过在反应液粘度为0.8-0.9mPas的条件下施加交流电压，可进一步以高灵敏度进行测定。
此外，与实施例4中示出的、在施加电压脉冲时将反应液的温度保持在低温下的本发明相关的反应液粘度，从表1可知为1.4mPas。由此可知，在反应液中的粘度为0.8-3mPas的条件下施加交流电压，可进一步以高灵敏度进行测定。由以上结果可确定，为提高灵敏度，优选粘度为1-3mPas，更优选为1-2mPas。
实施例6(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制将0.1mg的抗AFP抗体(DAKO公司制造)溶解在1mL甘氨酸缓冲液(含有50mM甘氨酸、50mM氯化钠、0.09％叠氮化钠，以下简称为GBS)中，加入1mL2.06μm的胶乳(Polyscience公司制造，固体成分为1.0％的悬浊液)，在37℃下搅拌2小时后，将敏化后的胶乳进行离心分离，以除去上部清液。使沉淀在1mL 0.5％牛血清清蛋白的甘氨酸缓冲液(0.5％BSA-GBS)中悬浊，配制出抗AFP抗体的敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图11(A)的装置，测定生物学特异凝集反应(抗原抗体反应)。图11(A)的装置具有分注·搅拌槽温度控制机构1，其对检查材料和试剂1(缓冲液适用于2个试剂体系的情况。在仅为单试剂系统/胶乳试剂的情况不需要)进行分注并混合，进一步将试剂2(胶乳试剂)进行分注并混合。在分注·搅拌槽温度控制机构1中混合反应液后，此后，在反应槽(施加脉冲槽)3中移动反应液，通过电极4施加几秒到几十秒的电压脉冲，进行串珠化过程。反应液被串珠化后，进行稀释(稀释槽5)，采用粒度分布计6测定载体的凝集状态。(将温度控制机构1以及2设定为OFF。)稀释槽5的概要示出在图11(B)中。向稀释容器103中分注稀释液，在对置电极101之间分注反应液。
(3)检查材料的测定将AFP对照血清L(15.6ng/mL)、M(125ng/mL)、H(1000ng/mL)以及无血清(0ng/mL)作为检查材料液进行测定。采用试管将3μL的检查材料和3μL上述抗AFP抗体敏化胶乳试剂进行混合，直接将其注入带有电极的反应单元中。采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲，形成串珠。进行该30秒时间的施加后，立即切断电场，将反应液在生理食盐水中稀释。稀释采用图1(B)所示的装置，一边通过电极对稀释液施加频率为200KHz的交流电压(矩形波)±0.7V，一边加反应液后，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(AR)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)(4)对照的测定使用(2)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了在形成串珠后对反应液进行稀释的工序中，不施加电场地进行稀释以外，均与(3)同样地实施。结果作为图12的“对照法”示出。
(5)结果图12中示出了结果。AFP为1000ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的53.4％，作为对照的现有方法为40.9％。也即在本发明的方法中，与现有方法相比，在对反应液进行稀释时崩塌的凝集块，也即特异凝集了的载体颗粒的凝集块的崩塌可减轻约20％。此外，AFP为0ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的7.4％，作为对照的现有方法为10.6％。在测定0ng/mL试样时的凝集率可考虑是伴随着非特异性凝集的背景。也即，根据本发明的方法，可抑制非特异性凝集。从以上结果可知，本发明的测定方法显示出凝集率倾角大且直线性良好。因此，根据本发明可进行高灵敏度并且宽浓度范围的测定。
实施例7(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制与实施例6同样，配制出抗AFP抗体的敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图11的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(3)检查材料的测定将AFP对照血清L(15.6ng/mL)以及无血清(0ng/mL)作为检查材料液进行测定。采用试管将3μL的检查材料和3μL上述抗AFP抗体敏化胶乳试剂进行混合，直接将其注入带有电极的反应单元中，采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲，形成串珠。进行该30秒时间的施加后，立即切断电场，将反应液在20mL生理食盐水中稀释。稀释采用图11(B)所示的装置，一边通过电极对稀释液施加频率为200KHz的交流电压(矩形波)±0.7V，一边加反应液后，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(AR)(AR)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)将上述操作同样地反复5次，进行测定，求出测定结果的平均值和平均值±2SD。
(4)对照的测定对照1使用(3)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了在形成串珠后对反应液进行稀释的工序中，不施加电场地进行稀释以外，均与(3)同样地实施。结果作为图13的“对照法1”示出。
对照2使用(3)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了预先对反应液的稀释液施加与(3)一样条件的电场，并将其作为稀释液使用以外，按照与(3)同样地实施。结果作为图13的“对照法2”示出。
(5)结果图13中示出了结果。AFP为15.6ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的35.7％，作为对照的现有方法为32.6％。也即在本发明的方法中，与现有方法相比，在对反应液进行稀释时崩塌的凝集块，也即特异凝集了的载体颗粒的凝集块的崩塌可减轻约10％。此外，AFP为0ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的5.6％，作为对照的现有方法为11.1％。在测定0ng/mL试样时的凝集率可考虑是伴随着非特异性凝集的背景。也即，根据本发明的方法，可抑制非特异性的凝集。此外，对AFP为15.6ng/mL进行5次测定时的CV值，相对于本方法的1.16％，作为对照的现有方法为4.28％，测定的再现性也显著提高。因此，根据本发明展示出可进行高灵敏度和高精度的测定。
实施例8抗原抗体反应的促进(1)抗PSA抗体敏化胶乳试剂(试剂2)的配制将0.1mg的抗PSA抗体(DAKO公司制造)溶解在1mL甘氨酸缓冲液(含有50mM甘氨酸、50mM氯化钠、0.09％叠氮化钠，以下简称为GBS)中，加入1mL2.06μm的胶乳(Polyscience公司制造，固体成分为1％的悬浊液)，在37℃下搅拌2小时后，将敏化后的胶乳进行离心分离，以除去上部清液。使沉淀在1mL 0.5％牛血清清蛋白的甘氨酸缓冲液(0.5％BSA-GBS)中悬浊，配制出抗AFP抗体的敏化胶乳试剂。
(2)Tris盐酸缓冲液(试剂1)的配制配制出在0.5％的牛血清清蛋白的50mM-Tris盐酸缓冲液(含有50mMTris、50mM氯化钠、0.09％叠氮化钠，pH为8.4)中含0.25％聚乙二醇(分子量20000，以下简称为PEG20000)的反应促进试剂。
(3)测定装置使用图11的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(4)检查材料的测定将PSA对照血清L(9.5ng/mL)、M(32ng/mL)以及无血清(0ng/mL)作为检查材料液进行测定。采用试管将1μL检查材料和上述Tris盐酸缓冲液以及3μL抗PSA抗体敏化胶乳试剂进行混合，直接将其注入带有电极的反应单元中，采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲，形成串珠。在该30秒施加电压后，立即切断电场，将反应液在20mL的GBS中稀释。此时的稀释倍率为约3300倍。稀释采用图11(B)所示的装置，一边通过电极对稀释液施加频率为200KHz的交流电压(矩形波)±0.7V，一边加反应液后，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(AR)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)(5)对照的测定对照1使用(4)的各个检查材料和Tris缓冲液以及抗PSA敏化胶乳试剂。除了在形成串珠后对反应液进行稀释的工序中，不施加电场地进行稀释以外，按照与(4)同样地实施。结果作为图14的“对照法1”示出。
对照2使用(4)的各个检查材料和Tris缓冲液以及抗PSA敏化胶乳试剂。除了预先对反应液的稀释液施加与(4)相同条件的电场并作为稀释液使用以外，按照与(4)同样地实施。结果作为图14的“对照法2”示出。
(6)结果图14中示出了结果。PSA为32g/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的35.7％，作为对照的现有方法为30.3％。也即在本发明的方法中，与现有方法相比，在对反应液进行稀释时崩塌的凝集块，也即特异凝集了的载体颗粒的凝集块的崩塌可减轻约20％。此外，PSA为0ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的1.73％，现有方法为2.45％。在测定0ng/mL试样时的凝集率可考虑是伴随着非特异性凝集的背景。也即，根据本发明的方法，可抑制非特异性凝集。从以上结果可知，本发明的测定方法显示出凝集率倾角大且直线性良好。因此，根据本发明可进行高灵敏度并且宽浓度范围的测定。
实施例9(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制按照与实施例6同样的方法，配制出抗AFP抗体的敏化胶乳试剂。其中将2.0μm胶乳(积水化学工业社制造)、3μm(Polyscience公司制造)以及4.5μm(Polyscience公司制造)胶乳作为固体成分为1.0％的悬浊液使用，配制出3种抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图11的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(3)检查材料的测定使用上述3种胶乳试剂，与实施例6一样地进行测定。
(4)对照的测定使用(3)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了在形成串珠后对反应液进行稀释的工序中，不施加电场地进行稀释以外，均与(3)同样地实施。结果作为图15、图16和图17的“对照法”示出。
(5)结果采用含2.0μm、3μm和4.5μm的胶乳试剂的结果分别在图15、图16和图17中示出。
在采用2.0μm的胶乳试剂的情况下，AFP为15.6ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的35.8％，作为对照的现有方法为24.1％，特异性凝集了的凝集块的崩塌可减轻30％(图15)。此外，在图15中，AFP为0ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的5.3％，现有方法为8.0％。
在采用3μm的胶乳试剂的情况下，AFP为15.6ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的29.5％，作为对照的现有方法为23.6％，特异性凝集了的凝集块的崩塌可减轻20％(图16)。此外，在图16中，AFP为0ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的13.6％，现有方法为17.8％。
而在采用4.5μm的胶乳试剂的情况下，AFP为15.6ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的11.5％，作为对照的现有方法为3.0％，特异性凝集了的凝集块的崩塌可减轻70％(图17)。此外，在图17中，AFP为0ng/mL的测定结果(凝集率)是，相对于本方法的4.1％，现有方法为2.5％也即，本发明与现有方法相比，可明确减轻特异性凝集的载体颗粒的凝集块的崩塌。而且，还可抑制在稀释时产生的非特异凝集。因此，根据本发明可展示出可进行高灵敏度测定。
实施例10(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制使用0.1mL 2.2mg的抗AFP抗体(DAKO公司制造)和0.5mL 1.716μm的胶乳(Polyscience公司制造、固体成分为2.5％的悬浊液)以及碳化二亚胺试剂盒(Polyscience公司制造)，根据试剂盒(kit)的手册进行操作，通过使抗AFP抗体和胶乳颗粒发生化学结合，来配制抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图1的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(3)检查材料的测定将AFP对照血清H(1000ng/mL)作为检查材料液进行测定。采用试管将3μL检查材料和3μL上述抗AFP抗体敏化胶乳试剂进行混合，直接将其注入带有电极的反应单元中，采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲，形成串珠。进行该30秒时间的施加后，立即切断电场，加入16μL0.25％-25％的戊二醛液(以下简称为GA)，在37℃下进行60秒的培养后，在20mL生理食盐水中稀释。对该反应稀释液，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(AR)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)此后，对残留的反应稀释液施加30秒、60秒的超声波后，进行同样的操作对粒度分布进行测定(崩塌性严格试验)。
(4)对照的测定使用(3)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了在不含GA的生理食盐水中稀释以外，均与(3)同样地实施。结果作为图18的“0％GA”示出。
(5)结果结果在图18中示出。与刚稀释后的凝集率相比，在进行GA处理后，稀释过的是21％的凝集率，与此相对，未进行GA处理的为16％，确定产生5％的崩塌。而在崩塌性严格试验中，可明确在25％的GA处理中，可显著改善崩塌性。从以上可知，本发明与现有方法相比，可减轻特异性凝集了的载体颗粒的凝集块的崩塌，并且可以高灵敏度地进行测定。
实施例11(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制与实施例10同样地，来配制抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图11的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(3)检查材料的测定将AFP对照血清H(1000ng/mL)作为检查材料液进行测定。采用试管将3μL检查材料和3μL上述抗AFP敏化胶乳试剂进行混合，直接将其注入带有电极的反应单元中，采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲，形成串珠。进行该30秒时间的施加后，立即切断电场，加入16μL25％的戊二醛液(以下简称为GA)，在37℃下进行0-60秒的培养后，在生理食盐水中稀释。对该反应稀释液，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(AR)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)此后，对残留的反应稀释液施加30秒、60秒的超声波后，进行同样的操作对粒度分布进行测定(崩塌性严格试验)。
(4)对照的测定使用(3)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了在不含GA的生理食盐水中稀释以外，均与(3)同样地实施。结果作为图19的“无GA”示出。
(5)结果结果在图19中示出。与刚稀释后的凝集率相比，在进行25％GA处理后稀释了的是与处理时间(15秒、30秒、60秒)无关地产生21％的凝集率，与此相对，处理时间为0秒(刚混合后稀释)时为18％，未添加GA的凝集率为16％。而在崩塌性严格试验中，可明确25％的GA处理(处理时间为15-60秒)可几乎同等程度地改善崩塌性。从以上可知，本发明与现有方法相比，可减轻特异性凝集了的载体颗粒的凝集块的崩塌，并且可以高灵敏度地进行测定。
实施例12(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制与实施例6同样，来配制抗AFP抗体敏化胶乳试剂。其中将2.0μm胶乳(积水化学工业社制造)、2.8μm(Polyscience公司制造)以及1.7μm(Polyscience公司制造)胶乳作为固体成分为1.0％的悬浊液使用，配制出3种抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图11的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(3)检查材料的测定使用上述3种胶乳试剂，与实施例11同样地进行测定。
(4)对照的测定使用(3)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了在不含GA的生理食盐水中进行稀释以外，均与(3)同样地实施。结果作为图20、图21和图22的“对照法”示出。
(5)结果采用含2.0μm、2.8μm和1.7μm的胶乳试剂的结果分别在图20、图21和图22中示出。以上从图20、图21和图22可知，本发明与现有技术(不包含结合强化剂的稀释液)相比，可与胶乳颗粒粒径无关地减轻特异性凝集的载体颗粒的凝集块的崩塌，可进行高灵敏度地测定。
实施例13同时再现性试验(1)抗AFP抗体敏化胶乳试剂的配制与实施例10同样地，配制抗AFP抗体敏化胶乳试剂。
(2)测定装置使用图11的装置，测定亲和性物质(抗原抗体反应)。
(3)检查材料的测定将AFP对照血清L和M作为检查材料液进行测定。采用试管将3μL检查材料和3μL上述抗AFP抗体敏化胶乳试剂进行混合，直接将其注入带有电极的反应单元中，采用上述装置，在频率为200KHz的交流电压(矩形波)±12V/mm的电解强度下施加30秒的电压脉冲，形成串珠。进行该30秒时间的施加后，立即切断电场，加入16μL25％的戊二醛液(以下简称为GA)，在37℃下进行0-60秒的培养后，在生理食盐水中稀释。对该反应稀释液，使用库尔特粒度分析仪对胶乳颗粒的粒度分布进行测定，由以下公式求出胶乳的凝集率(AR)。
AR＝(2个以上凝集而成的颗粒数目)/(总颗粒数)×100(％)上述操作反复10次进行测定，进行再现性试验。
(4)对照的测定使用(3)的各个检查材料和抗AFP敏化胶乳试剂。除了在不含GA的生理食盐水中稀释以外，均与(3)同样地实施。结果作为表2的“对照法”示出。
(5)结果结果在表2中示出。可知在本发明中，同时再现性的CV值为2％左右，但是对照法的CV值为7-11％，偏差较大。从以上可知，本发明与对照法相比，可再现性良好地进行测定。
表2
产业上的可利用性本发明的测定方法或者测定装置对具有亲和性的所有物质的测定是有用的。具体而言，通过对从生物体取出的试样进行分析，可获得各种对疾病诊断有用的信息。更具体地，激素、肿瘤标记、酶、药剂、感染性病原体或者与之相对的抗体在医疗机构中进行日常测定。这些测定对象成分都含在本发明的亲和性物质中。或者还可根据本发明对生物试样或食品、或者从环境中取出的试样中含有的微生物或药剂等进行测定或者进行检测。
权利要求
1.一种亲和性物质的测定方法，其包含以下工序(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液进行培养的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)对工序(1)的反应液施加电压脉冲的工序；(3)在工序(2)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(4)在工序(3)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
2.按权利要求1记载的方法，工序(1)是在37-90℃下对所述反应液进行培养的工序。
3.按权利要求2记载的方法，工序(1)是在40-90℃下对所述反应液进行培养的工序。
4.按权利要求1记载的方法，其特征为，在所述反应液中含有水溶性高分子。
5.按权利要求1记载的方法，将工序(2)中反应液的粘度调整至0.8-3mPas。
6.按权利要求1记载的亲和性物质的测定方法，工序(2)在0-20℃下进行。
7.按权利要求6记载的亲和性物质的测定方法，工序(2)在0-10℃下进行。
8.按权利要求1记载的方法，将凝集块和未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者以其三维信息作为指标来进行计数。
9.按权利要求1记载的方法，亲和性物质与结合配偶体的结合是由抗原抗体反应引起的结合。
10.按权利要求9记载的方法，亲和性物质为抗原，结合配偶体为抗体或者为包含该抗原结合区域的片断。
11.按权利要求9记载的方法，亲和性物质为抗体或者为包含该抗原结合区域的片断，而结合配偶体为抗原或者为包含该抗原决定基的片断。
12.按权利要求1记载的方法，电压脉冲为交流电压脉冲。
13.一种亲和性物质的测定方法，其包含以下工序(1’)在与凝集试剂成分混合之前或之后对包含载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液进行培养的工序，其中该载体颗粒结合了至少具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该工序中所述载体颗粒由凝集试剂而凝集，并且由测定对象亲和性物质阻碍该凝集；(2’)在凝集试剂成分存在的情况下对工序(1’)的反应液施加电压脉冲的工序；(3’)在工序(2’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(4’)在工序(3’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序。
14.按权利要求13记载的方法，在工序(1’)中，在培养所述反应液后，在工序(2’)之前混合凝集试剂。
15.按权利要求13记载的方法，包含在混合后、工序(2’)之前进一步对凝集试剂进行培养的工序。
16.按权利要求13记载的方法，在工序(1’)中，在凝集试剂存在的情况下对所述反应液进行培养后，实施工序(2’)。
17.一种用于使载体颗粒凝集的装置，包括对包含载体颗粒和特定物质的反应液施加电压脉冲的单元，该载体颗粒结合了具有与所述特定物质的结合活性的结合配偶体，其特征为，具有用于将反应液的温度加热至37℃-90℃的单元。
18.一种用于使载体颗粒凝集的方法，包括对包含载体颗粒和特定物质的反应液施加电压脉冲的工序，该载体颗粒结合了具有与所述特定物质的结合活性的结合配偶体，其特征为，使施加电压期间的反应液的温度为0℃-20℃。
19.按权利要求18记载的方法，结合配偶体与特定物质的结合是抗原抗体反应。
20.按权利要求18记载的方法，电压脉冲是交流电压脉冲。
21.按权利要求18记载的方法，对反应液添加水溶性高分子。
22.按权利要求18记载的方法，将反应液的粘度调整至0.8-3mPas。
23.按权利要求18记载的方法，包含在施加电压脉冲之前在37℃-90℃下对所述载体颗粒和特定物质进行培养的工序。
24.一种用于使载体颗粒凝集的装置，包括对包含载体颗粒和特定物质的反应液施加电压脉冲的单元，该载体颗粒结合了具有与所述特定物质的结合活性的结合配偶体，其特征为，具有用于使施加电压期间的反应液的温度为0℃-20℃的单元。
25.一种测定装置，用于将载体颗粒的由亲和性物质或者凝集试剂引起的凝集作为指标来测定所述载体颗粒与应测定的亲和性物质的结合，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该测定装置包括以下要素a用于保持反应液的空间；b用于在37℃-90℃下对反应液的温度进行培养的单元；c用于对反应液施加电压脉冲的单元；d用于使施加脉冲电压时反应液的温度为0℃-20℃的单元；以及e用于对反应液中所含的载体颗粒和载体颗粒的凝集块中的任何一方或者二者进行计数的单元。
26.一种亲和性物质的测定方法，其包含以下的工序(1)-(3)或者(1’)-(3’)，其中，在工序(2)或者(2’)之前，包含通过对亲和性物质与结合配偶体、或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合进行强化的单元来对反应液进行稀释的工序。(1)对混合了载体颗粒和测定对象亲和性物质的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体；(2)在工序(1)之后，对通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及不与作为测定对象的亲和性物质结合而未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3)在工序(2)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质的程度的工序，或者(1’)对将载体颗粒和测定对象亲和性物质与凝集试剂成分混合的反应液施加电压脉冲的工序，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该工序中所述载体颗粒由凝集试剂而凝集，并且由测定对象亲和性物质阻碍该凝集；(2’)在工序(1’)之后，对通过与凝集试剂的结合而形成的载体颗粒的凝集块、以及通过与作为测定对象的亲和性物质的结合而阻碍凝集的载体颗粒的任何一方或者二者进行计数的工序；以及(3’)在工序(2’)之后，基于凝集块形成的程度、以及未形成凝集块的载体颗粒程度的任何一方或者二者来确定测定对象物质程度的工序
27.按权利要求26记载的方法，对反应液进行稀释的工序是在电压脉冲施加的条件下混合反应液与稀释液的工序。
28.按权利要求27记载的方法，电压脉冲为交流电压。
29.按权利要求28记载的方法，交流电压的频率为2KHz-20MHz。
30.按权利要求27记载的方法，稀释反应液的工序包含在电压脉冲施加的条件下混合反应液与稀释液之后在停止电场后进一步附加地稀释载体颗粒的工序。
31.按权利要求27记载的方法，稀释反应液的工序是在向反应液中添加对测定对象亲和性物质与结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体间的结合进行强化的结合强化剂之后与反应液混合、或者采用包含所述结合强化剂的稀释液对反应液进行稀释的工序。
32.按权利要求26记载的方法，稀释反应液的工序是在向反应液中添加对测定对象亲和性物质与结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体间的结合进行强化的结合强化剂之后将反应液与稀释液混合、或者采用包含所述结合强化剂的稀释液对反应液进行稀释的工序。
33.按权利要求32记载的方法，测定对象亲和性物质与结合配偶体、或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合为免疫学的结合。
34.按权利要求33记载的方法，抗原为蛋白质抗原，结合强化剂是从戊二醛和碳化二亚胺中选择的任何一种或者两者的化合物。
35.按权利要求32记载的方法，稀释反应液的工序是在电压脉冲施加的条件下混合反应液与稀释液的工序。
36.按权利要求26记载的方法，工序(1)或(1’)中的电压脉冲为交流电压脉冲。
37.按权利要求26记载的方法，在工序(1)或(1’)中电压脉冲施加数次。
38.按权利要求37记载的方法，在工序(1)或(1’)中包含在施加电压脉冲后使载体颗粒分散而后施加下一次电压脉冲的工序。
39.按权利要求37记载的方法，多次电压脉冲是不同方向的电压脉冲。
40.按权利要求26记载的方法，载体颗粒的平均粒径为1μm以上。
41.按权利要求40记载的方法，载体颗粒的平均粒径为1μm-20μm。
42.按权利要求26记载的方法，在工序(2)或(2’)中，对于凝集块和未形成凝集块的载体颗粒的任何一方或者二者将其三维信息作为指标进行计数。
43.按权利要求42记载的方法，在工序(2)或(2’)中，对于凝集块或载体颗粒的三维信息以物理方式进行测定。
44.按权利要求43记载的方法，用于以物理方式测定三维信息的方法是从由电阻法、激光衍射散射法和三维图像分析法构成的组中选出的任一种方法。
45.一种测定装置，用于将载体颗粒的由亲和性物质或凝集试剂引起的凝集作为指标来测定所述载体颗粒与应测定的亲和性物质的结合，其中该载体颗粒结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体，该测定装置包括以下要素a用于保持包含试样的反应液或者进一步附加地包含凝集试剂的反应液的空间，其中该试样包含结合了具有与测定对象亲和性物质的结合活性的结合配偶体的载体颗粒和应测定的亲和性物质；b用于对反应液施加电压脉冲的单元；c用于稀释反应液的单元；和d用于对反应液中所含的载体颗粒和载体颗粒的凝集块的任何一方或者二者进行计数的单元。
46.按权利要求45记载的装置，用于稀释反应液的单元是用于在电压脉冲施加的条件下将反应液与稀释液进行混合的单元。
47.按权利要求45记载的装置，用于稀释反应液的单元包含用于向反应液中添加结合强化剂的单元，其中该结合强化剂对测定对象亲和性物质与结合配偶体或者凝集试剂与结合配偶体之间的结合进行强化。
全文摘要
作为测定对象的亲和性物质和具有与该亲和性物质的结合亲和性的结合配偶体之间的结合反应通过凝集反应来测定。结合配偶体结合在载体颗粒上，通过结合反应使得载体颗粒凝集。本发明通过在施加电场前对反应液进行培养，增强凝集反应。此外，本发明通过对置于电场中的反应液的温度和粘度进行调整，增强凝集反应。本发明对测定灵敏度的提高作出了贡献。此外，本发明包含在对凝集块进行计数之前对包含单体颗粒的反应液进行稀释的工序。本发明的稀释工序对亲和性物质与结合配偶体之间的结合进行强化。其结果是可防止凝集块发生崩塌，提高测定灵敏度。另外，还可以高精度对稀释了的载体颗粒和凝集块进行识别。
文档编号G01N33/543GK101031797SQ200580014858
公开日2007年9月5日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月12日
发明者岩田惠助, 水谷幸仁 申请人:脉冲-免疫技术株式会社