用wnt抑制因子－1(wif1)治疗和诊断癌症的方法

专利名称：用wnt抑制因子－1(wif1)治疗和诊断癌症的方法
相关申请的交叉参考本申请要求2004年5月21日提交的临时申请序列号60/573,197和2005年3月21日提交的临时申请序列号60/664,241的优先权，将其公开内容全文纳入本文作参考。
背景技术：
癌症是全世界的主要杀手，肺癌是大多数国家中癌症死亡的主要原因，世界范围内每年引起超过一百万人死亡。而且，美国每年报道的新诊断肺癌病例超过170,000(Fong等，Thorax58892-900(2003)；Minna等，Cancer Cell 149-52(2002))。
在过去二十几年中，许多不同类型的肿瘤发病率升高。近年来，人们对癌症的分子遗传学的了解获得显著进展。例如、原癌基因和肿瘤抑制基因是调节参与控制正常细胞生长和分化的其它基因的细胞基因。这些基因编码生长因子、生长因子受体、磷酸化各种细胞物质的激酶和调节多种细胞基因表达的DNA结合蛋白。癌症可能通过以下方式发生活化显性生长促进性原癌基因，此种基因的突变(如ras)和产物或过表达(如Her-2/neu和c-myc)可诱导恶变；使抑制肿瘤生长的抑制基因(如p53和Rb)失活，缺这些抑制基因的表达或功能将导致恶变。这些癌症的遗传基础在于导致癌症的改变是个体的一个或多个基因的核苷酸序列水平上的改变。
除上述遗传改变外，也可通过外遗机制产生癌症。一种外遗机制涉及由于基因序列，特别是富CpG区(CpG岛)的基因序列的甲基化而使基因表达沉默。正常情况下未甲基化的CpG岛的异常甲基化与人癌中已明确的肿瘤抑制基因的转录失活有关。外遗机制如基因转录的甲基化沉默提供了可用于确定细胞是否易于失去正常生长控制，因此可能变成癌细胞的标记。癌症常常是一种潜在疾病，直到疾病晚期才产生临床体征或症状。因此，如采用能鉴定怀疑个体所患癌症的标记或者甚至能够检测早期癌症的标记是很有好处的。
不幸的是，大多数癌症没有这种标记。例如，常规切除早期非小细胞肺癌(NSCLC)后患者的存活率为35-85％，这取决于肿瘤发展阶段。不幸的是，检测到的大多数肺癌已是晚期，以致NSCLC的五年总存活率仅为15％。肺癌患者死亡率高的主要原因是诊断时大约三分之二的患者已存在肿瘤转移。对这些患者早期检测到癌症可提高存活率。DNA甲基化的检测是一种有希望的鉴定肺癌的特异性生物标记的方法，也是一种早期检测生物标记的非侵入性方法。
分泌性糖蛋白Wnt家族是广泛参与发育过程和癌发生的一组信号转导分子(WO04/032838)。二十多年前就已发现了Wnt的致癌作用。从那以后，许多报道证明，在完全不同的人癌如结直肠癌、头颈癌(Rhee等，Oncogene 216598-605(2002))、黑色素瘤(Weeraratna等，Cancer Cell.1279-88(2002))和白血病(Jemal等，Cancer J.Clin.548-29(2004))中Wnt信号传导途径被异常活化。
近年来，有报道称Dvl蛋白在间皮瘤和NSCLC中过表达(Uestema等，Oncogene227218-7221(2003))。也证明了在肺癌细胞系中抑制Wnt-1能诱导凋亡和抑制肿瘤生长(Li等，J.Biol Chem.2775877-81(2002))。Wnt拮抗剂可根据其作用机制分为两组第一组包括分泌的Frizzled相关蛋白(sFRP)家族、WNT-抑制因子-1(WIF-1)和Cerberus。这些拮抗剂通过直接结合Wnt分子而抑制Wnt信号转导。第二组包括Dickkopf(DKK)家族，通过结合Wnt受体复合物的LRP5/LRP6组分而抑制Wnt信号转导(Kawano等，J.细胞Sci.1162627-34(2003))。
WIF-1是天然分泌的Wnt信号转导拮抗剂。WIF-1是379个氨基酸残基组成的蛋白质。WIF-1具有28个氨基酸残基的N-末端信号序列、约150个氨基酸残基的独特的WIF结构域(WD)、五个表皮生长因子(EGF)样重复序列和45个氨基酸残基的C末端亲水结构域(Hsieh等，Nature 398431-436(1999)；GenBank NP_009122)。WIF-1与Fz或sFRP的CRD(富半胱氨酸结构域)没有相似性(Bui等，Oncogene14(10)1249-53(1997)；Melkonyan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(25)13636-41(1997)；Shimizu等，Cell.Growth Differ.8(12)1349-58(1997)；和Todd等，Cancer Res.57(7)1344-52(1997))。WIF-1涉及几种发育过程的调节。例如，已证明在爪蟾(Xenopus)胚胎中WIF-1过表达能阻断Wnt-8途径并诱导异常的体节发生(Hsieh等，Proc.NatlAcad.Sci.USA 963546-51(1999))。
尽管在过去的几十年期间肺癌治疗取得了进展，但肺癌的5年存活率仍然在15％以下。NSCLC占所有肺癌的75-80％。更好了解肺癌发病机理的分子机制应能改善肺癌患者的治疗。本发明提供了用于检测和治疗WIF-1表达下调的癌症如肺癌和诱导WIF-1表达下调的细胞凋亡的组合物、方法和试剂盒。
发明概述本发明一方面基于以下发现WIF-1启动子的CpG岛中超甲基化(hypermethylate)常与它在癌细胞中的转录沉默和WIF-1低表达相关。因此，在本发明的一些方面，提供的组合物可用于各种方式，例如抑制WIF-1低表达癌细胞增殖、诱导WIF-1低表达癌细胞凋亡、抑制癌细胞中的Wnt信号转导和治疗WIF-1低表达相关疾病。
在本发明优选实施方式中，组合物包含能结合Wnt多肽的Wnt-抑制因子-1(WIF-1)亚域多肽。优选能抑制Wnt信号转导的WIF-1亚域多肽。在优选实施方式中，该WIF-1亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约1-180的氨基酸序列。其它优选的WIF-1亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-180、SEQ IDNO2的氨基酸残基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸残基39-176的氨基酸序列。还优选融合于WIF-1多肽的异源氨基酸序列的WIF-1亚域多肽。
本发明提供了抑制WIF-1低表达癌细胞增殖的方法。此方法包括使癌细胞与有效量的WIF-1多肽接触的步骤，以抑制癌细胞增殖。在本发明的优选实施方式中，所述癌细胞包含超甲基化的WIF-1启动子，接触癌细胞的步骤包括通过降低WIF-1启动子的甲基化来提高癌细胞中WIF-1的表达。
在本发明的另一优选实施方式中，一定量的WIF-1多肽能诱导癌细胞凋亡。
接触癌细胞的步骤可包括在癌细胞中由包含编码WIF-1多肽的序列的分离多核苷酸表达WIF-1多肽。
本发明还提供了诱导WIF-1低表达癌细胞凋亡的方法。此方法包括使癌细胞与有效量的WIF-1活性多肽相接触的步骤，以诱导癌细胞凋亡。
本发明的另一优选方法是抑制癌细胞中Wnt信号转导的方法，该方法包括使癌细胞与有效量的WIF-1多肽接触的步骤，以抑制癌细胞中的Wnt信号转导。
本发明也提供了治疗WIF-1低表达相关疾病的方法。此方法包括给予需要这种治疗的对象有效量的WIF-1活性多肽，以治疗该疾病。优选疾病是癌症。
本发明也提供了检测超甲基化WIF-1启动子的方法。在优选实施方式中，此方法包括使超甲基化的WIF-1启动子与有效量的含有能与超甲基化WIF-1启动子特异性杂交序列的寡核苷酸相接触的步骤，以检测超甲基化的WIF-1启动子。
可用于本发明方法的癌细胞，或可用本发明的组合物、方法或试剂盒诊断和/或治疗的癌症包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、结肠癌、间皮瘤、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肝细胞癌、脑肿瘤、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、胶质瘤和成胶质细胞瘤。
可用于本发明方法的优选WIF-1多肽是WIF-1亚域多肽。WIF-1亚域多肽可包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约1-180的氨基酸序列，对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-180的氨基酸序列，对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-176的氨基酸序列或对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约39-176的氨基酸序列。还优选融合于WIF-1多肽的异源氨基酸序列的WIF-1亚域多肽。
可在体外和体内实施本发明方法。
本发明也提供包含WIF-1多肽和药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂的药物组合物。药物组合物包含本文所述WIF-1多肽。
附图简要说明

图1显示人WIF-1启动子区中的CpG岛。
图2A显示人癌细胞系中的WIF-1表达。N，正常细胞系；T，肿瘤细胞系。图2B显示了不同细胞系中人WIF-1启动子的甲基化分析(MSP)。U，未甲基化；M，甲基化。
图3A显示人WIF-1启动子的甲基化分析(硫酸氢盐测序)。图3B显示了去甲基化试剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)处理不同细胞系对WIF-1表达的再活化。
图4A显示原发性人肺癌组织样品中的WIF-1表达。图4B显示了原发性人肺癌组织样品中WIF-1启动子的甲基化分析(MSP)。图4C显示了原发性人肺癌组织样品中WIF-1启动子的甲基化分析(硫酸氢盐测序)。
图5显示了多种癌细胞系中的WIF-1转染。
图6显示转染人WIF-1 cDNA能使NSCLC细胞系凋亡增加并抑制Wnt信号转导。A图显示了NSCLC细胞系H460、A549、H838和H1299中WIF-1表达的Western分析。在正常人原代支气管上皮细胞(NHBE)和小呼吸道上皮细胞(SAEC)中观察到WIF-1表达，得自293T细胞的WIF-1 CM用作阳性对照。β-肌动蛋白用作加样对照。B图显示了将WIF-1 cDNA质粒(深色柱)转染入NSCLC细胞系A549和H460中显著引起更多的细胞群凋亡(转染5天后)。空载体用作转染对照(浅色柱)。C图显示了WIF-1质粒转染后的Western分析(“+”；转染72小时后)；空载体用作对照(“-”)，检测了β-联蛋白和存活蛋白。β-肌动蛋白用作加样对照。
图7显示WIF-1 CM诱导NSCLC细胞系凋亡。A图显示了WIF-1 CM处理后(处理约5-7天后)SAEC细胞和三种NSCLC细胞系(H460、A549和H838)的0.5％结晶紫染色结果。B图显示了WIF-1 CM能诱导三种NSCLC细胞系(H460、A549和H838)凋亡。此图显示了用流式细胞术进行凋亡分析的例子。用WIF-1 CM处理NSCLC细胞约5-7天(深色柱)。收集293T细胞的无血清培养基用作对照(浅色柱)。C图显示了H460细胞(处理5天后)的流式细胞术分析，作为剂量依赖性凋亡诱导的例子。FL1-H代表膜联蛋白的V-FITC染色。D图显示了WIF-1 CM处理72小时之前(“对照”)和之后(“WIF-1(1/50)”和“WIF-1(1/5)”)的Western分析。此分析显示人WIF-1能抑制肺癌细胞系H460中的Wnt信号传导途径。分析了β-联蛋白、存活蛋白、细胞周期蛋白D1和细胞色素C的表达。β-肌动蛋白用作加样对照。制备胞浆蛋白质。采用全细胞蛋白质作细胞周期蛋白D1分析。
图8显示纯化的人WIF-1蛋白能诱导NSCLC细胞系凋亡。A图显示了流式细胞术分析，证明WIF-1蛋白能以剂量依赖方式引起H460细胞死亡。用WIF-1蛋白处理H460细胞约7天。下方的图显示了H460细胞的0.5％结晶紫染色结果。B图显示了WIF-1蛋白能剂量依赖地诱导H460细胞凋亡。FL1-H代表膜联蛋白的V-FITC染色。C图显示用(“+”)或不用(“-”)WIF-1 CM处理H460细胞72小时的Western分析。分析了Dv1-3、β-联蛋白和细胞周期蛋白D1的表达。β-肌动蛋白用作加样对照。制备胞浆蛋白质。采用全细胞蛋白质作细胞周期蛋白D1分析。
图9显示WIF-1再表达能诱导多种人癌细胞系凋亡。用pcDNA3.1-空(浅色柱)或用pcDNA3.1-WIF-1(深色柱)转染所示细胞系，测定％凋亡。
图10显示无血清条件培养基中的重组WIF-1蛋白能剂量依赖地诱导肺癌细胞系H460凋亡。
图11显示纯化的重组人WIF-1蛋白(Abnova Corp.)能剂量依赖地诱导肺癌细胞系H460凋亡。
图12显示无血清条件培养基中的重组WIF-1结构域(WD)蛋白能剂量依赖地诱导肺癌细胞系A427凋亡。
图13显示无血清条件培养基中的重组WIF-1蛋白能剂量依赖地诱导黑色素瘤细胞系LOX凋亡。
图14显示无血清条件培养基中的重组WIF-1蛋白能剂量依赖地诱导黑色素瘤细胞系FEMX凋亡。
图15显示无血清条件培养基中的重组WIF-1结构域(WD)蛋白能剂量依赖地诱导黑色素瘤细胞系LOX凋亡。
图16显示重组WIF-1结构域(WD)蛋白能抑制黑色素瘤细胞系LOX中的Wnt信号传导途径。分析了蓬乱蛋白(dishevelled)-3、β-联蛋白、存活蛋白和细胞色素C的表达。β-肌动蛋白用作加样对照。
图17显示正常细胞和癌细胞中的WIF-1蛋白表达。WIF-1蛋白在正常的原代培养细胞、NHBE、SAEC和NHEK中表达。WIF-1蛋白在人癌细胞，包括肺癌(H460、A549)、乳腺癌(MCF-7)、结肠癌(SW480)和间皮瘤(MS-1、H2052)中低表达。
图18显示编码WIF-1全长(三角形)的DNA和编码WIF-1结构域(WD；星号)的DNA能在体内减小肿瘤体积。对照组包括无载体对照(菱形)和载体对照(正方形)。每周测定两次肿瘤大小。
图19显示WIF-1结构域(WD；正方形)重组蛋白能在体内减小肿瘤体积。对照，菱形。每周测定两次肿瘤大小。
图20显示重组全长人WIF-1多肽(SEQ ID NO2)在肝细胞癌细胞系SNU 398中诱导的凋亡细胞百分数和细胞毒作用。将10μl和100μl含重组全长人WIF-1多肽的CM(SEQ ID NO2)加入细胞中。用膜联蛋白V试验定量测定处理5天后的凋亡细胞。
图21显示重组全长人WIF-1多肽(SEQ ID NO2)对结直肠癌细胞系HCT-116的细胞毒作用。加入200μl含重组全长人WIF-1多肽(SEQ ID NO2)的CM4天后，HCT-116细胞的0.5％结晶紫染色结果，观察到几乎100％的细胞杀死。活细胞被染色。
图22显示重组人WIF-1亚域多肽(SEQ ID NO26)对黑色素瘤细胞系LOX和肺癌细胞系H460引起的凋亡细胞百分数和细胞毒作用。
图23显示重组人WIF-1亚域多肽(SEQ ID NO27)对黑色素瘤细胞系LOX引起的凋亡细胞百分数和细胞毒作用。
图24显示在黑色素瘤细胞系LOX上重组成熟人WIF-1多肽(SEQ ID NO30)引起的凋亡细胞百分数和细胞毒作用。
图25显示人WIF-1氨基酸序列(hWIF-1；参见SEQ ID NO2和GenBank登录号NP_009122)与相应的小鼠序列(mWIF-1；参见SEQ ID NO22和GenBank登录号NP_036045)、大鼠序列(rWIF-1；参见SEQ ID NO23和GenBank登录号Q6IN38)、爪蟾序列(xWIF-1；参见SEQ ID NO24和GenBank登录号AAD25404)和纹斑鱼序列(zWIF-1，参见SEQ ID NO25和GenBank登录号Q9W6F9)的比对。“*”表示所比对的WIF-1序列中在所示位置上的WIF-1氨基酸残基相同；“”表示发现的保守氨基酸取代位置；“.”表示所发现的非保守氨基酸取代位置。
发明详述I.定义术语“WIF-1”指核酸、多肽及其多态性变体、等位基因、突变体和其种间同源物，如本文进一步所述，它们(1)所具有的氨基酸序列优选在至少约25、50、75、100、150、200、250、300、350或379个氨基酸的区域上，与下述WIF-1序列的氨基酸序列相同性高于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高；(2)能结合针对包含以下所示氨基酸序列或其保守性修饰的变体的免疫原所产生的抗体，如多克隆抗体；(3)能结合Wnt蛋白；(4)能干扰Wnt与Wnt结合分子的结合；(5)能至少部分抑制Wnt信号传导途径；(6)在严谨的杂交条件下能与以下所示核酸序列或其保守性修饰变体特异性杂交；(7)所具有的核酸序列优选在至少约30、50、100、200、500、1000、1,500、2000或更多个核苷酸的区域上，与SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18或SEQ ID NO19的核苷酸序列相同性高于约90％，优选高于约96％、97％、98％、99％或更高；和/或(8)至少具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ IDNO28、SEQ ID NO29或SEQ ID NO30的25个，常常是50、75、100、150、200、250、300、350或379个毗连氨基酸残基；或者至少具有SEQ ID NO1、SEQID NO3、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18或SEQ ID NO19的25个，常常是50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1,000、1,200、1,500、2,000或更多个毗连核苷酸。
WIF-1多核苷酸或多肽序列一般是人的，但可能是其它哺乳动物的，包括但不限于非人灵长类，啮齿类如大鼠、小鼠或仓鼠；牛、猪、马、绵羊或其它哺乳动物。“WIF-1”多肽和多核苷酸包括天然产生的形式或重组形式。因此，在一些实施方式中，本文所述的WIF-1多肽和WIF-1亚域多肽可包含对应于人WIF-1序列的序列。因此，本文提供了示范性WIF-1，它们是本领域已知的。例如，人WIF-1多肽的GenBank登录号是AAD25402、AAQ88710、AAH18037、NP_009122和Q9Y5W5。全长WIF-1的氨基酸残基178存在有一些氨基酸序列异质性。据报道此位置为亮氨酸和谷氨酰胺氨基酸残基。小鼠WIF-1多肽的GenBank登录号是(例如)Q9WUA1、NP_036045和AAD25403；大鼠WIF-1的GenBank登录号是Q6IN38；牛WIF-1的登录号是XP_582244；爪蟾WIF-1的登录号是AAD25404和Q9W6F8，纹斑鱼WIF-1的登录号是Q9W6F9和AAD25405。
术语“Wnt”、“Wnt多肽”或“Wnt配体”指与无翅型果蝇(Drosophila)节段极性基因相关的一个哺乳动物蛋白质家族。在人类中，Wnt基因家族一般编码38-43kDa具有疏水信号序列的富半胱氨酸糖蛋白和保守的天冬酰胺-连接的寡糖共有序列(Shimizu等，Cell Growth Differ8(12)1349-58(1997))。Wnt家族至少包含19个哺乳动物成员。示范性Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、WNT10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15和Wnt16。Wnt多肽优选哺乳动物Wnt多肽，更优选人Wnt多肽。
在涉及WIF-1蛋白的内容中，术语“Wnt结合亚域蛋白”、“WIF-1结构域蛋白”、“WIF-1亚域多肽”、“WD蛋白”或其语法等效形式，指可结合Wnt多肽或可干扰Wnt信号传导途径的WIF-1蛋白片段。
本文所用“WIF-1相关”多肽指WIF-1同源物、WIF-1同种型，WIF-1直向同源物、WIF-1融合蛋白或它们的片段或组合。
“WIF-1同源物”指包含与WIF-1相似的氨基酸序列但不一定具有与WIF-1相似或相同功能的多肽。
“WIF-1同种型”指由相同基因编码，但pI或MW或二者不同的WIF-1变体。这种同种型的氨基酸组成可以不同(如因另路剪接或限制性蛋白水解所致)，另外，或者可由不同的翻译后修饰产生(如糖基化、酰化或磷酸化)。
本文所用“WIF-1直向同源物”指非人多肽，其(i)包含与人WIF-1相似的氨基酸序列，和(ii)具有与人WIF-1相似或相同的功能。
本文所用“WIF-1融合蛋白”指包含以下氨基酸序列的多肽(i)WIF-1、WIF-1片段、WIF-1亚域多肽、WIF-1相关多肽或WIF-1相关多肽的片段的氨基酸序列，和(ii)异源多肽(即非WIF-1、非WIF-1片段或非WIF-1相关多肽)的氨基酸序列。
“全长”WIF-1多肽或核酸指WIF-1多肽或多核苷酸序列或其变体，它们含有通常在一种或多种天然产生的野生型WIF-1多核苷酸或多肽序列所含的所有元件。“全长”可以在翻译后加工或剪接，包括另路剪接和信号肽切割的各个阶段之前或之后。
术语“超甲基化”指在WIF-1基因序列中通常不甲基化的位置，如WIF-1启动子中的胞嘧啶甲基化。如本领域技术人员所理解，检测WIF-1基因区域如启动子中的超甲基化不需要分析该启动子中的每个CpG残基。甲基化分析的目标可以是一个或多个CpG残基。因此，提到多核苷酸序列时，“超甲基化”一般指与对照(如癌细胞与非癌细胞)相比甲基化碱基的数量增加。“超甲基化”也指与对照相比含有加入甲基的胞嘧啶残基的数量或频率。
“WIF-1启动子”指包含控制“WIF-1”转录的一个或多个调控区的序列。在一些实施方式中，WIF-1启动子是人WIF-1启动子。示范性人WIF-1启动子序列包含SEQ ID NO3所列核苷酸序列。
提到多核苷酸序列如WIF-1启动子时，“减少甲基化”指与对照(如癌细胞与非癌细胞)相比甲基化碱基的数量减少。该术语也指与对照相比含有加入甲基的胞嘧啶残基的数量或频率。
本文所用“生物样品”是含有核酸或多肽的生物组织或液体样品。这种样品一般来自人，但包括分离自非人灵长类或啮齿类如小鼠和大鼠的组织。生物样品也可包括组织切片如活检和尸检样品、为进行组织学检验制备的冷冻切片、血液、血浆、血清、痰、粪便、眼泪、粘液、头发、皮肤等。生物样品也包括外植体和获自患者组织的原代和/或转化的细胞培养物。“生物样品”也指细胞或细胞群或动物的一些组织或液体。最常见的是，生物样品取自动物，但术语“生物样品”也可指体内分析，即不从动物取出的细胞或组织。“生物样品”一般含有动物的细胞，但该术语也指可用于测定癌症相关性多核苷酸或多肽水平的无细胞生物材料，如血液、唾液或尿液的无细胞组分。许多类型的生物样品可用于本发明，包括但不限于组织活检样品、血液样品、口腔刮出物、唾液样品或乳头溢液。本文所用“组织活检样品”指得自动物，优选人的用于诊断分析的一些组织。在癌症患者中，组织可取自肿瘤，以便分析肿瘤中的细胞。“组织活检样品”可指任何类型的活检样品，如穿剌活检样品、细针穿剌活检样品、手术活检样品等。
“提供生物样品”指获得生物样品，用于本发明所述方法。最常见的是，通过提取患者的细胞样品，但也可采用先前分离的细胞(如由另一人分离、在另一个时间、和/或用于另一种目的)，或在体内进行本发明方法提取。具有治疗或结果病史的存档组织尤其有用。
生物样品中的“WIF-1 mRNA水平”指转录自细胞或生物样品中存在的WIF-1基因的mRNA量。该mRNA通常编码有功能的WIF-1蛋白，但可存在改变或消除了该编码蛋白功能的突变。不需要定量测定“WIF-1 mRNA水平”，但可简单地检测，如用人目测，与或不与对照样品的水平或对照样品的预计水平作比较。
生物样品中的“WIF-1蛋白或多肽水平”指由细胞或生物样品中存在的WIF-1mRNA翻译产生的多肽量。该多肽可以具有或不具有WIF-1蛋白活性。不需要定量测定“WIF-1蛋白水平”，但可简单地检测，如用人目测，与或不与对照样品的水平或对照样品的预计水平作比较。
本文所用术语“治疗”包括(1)预防疾病，如癌症，即引起可能倾向于发生该疾病但仍未经历任何疾病症状的对象不发生该疾病的临床症状；(2)抑制疾病，即阻滞或降低疾病或其临床症状的发展；或(3)缓解疾病，即引起疾病或其临床症状消退。需要这种治疗的对象优选为哺乳动物，更优选人。
提到两个或多个核酸或多肽序列时，术语“相同”或“相同性”百分数指用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，以下述默认参数或通过手工比对和观察(参见例如，NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)测定时，两个或多个序列或亚序列相同或特定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即比较窗或指定区域上比较和比对最大对应性时，特定区域上相同性约60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。那么，可称这些序列“基本相同”。此定义也指，或可用于，受试序列的互补序列(compliment)。此定义也包括具有缺失和/或加入的序列，以及具有取代的序列，以及天然产生的序列如多态性或等位基因变体和人造变体。如下所述，优选的算法可计算缺口等。相同性优选存在于长度至少约为25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
为了比较序列，一般将一个序列用作参比序列，将受试序列与其作比较。当采用序列比较算法时，将受试序列和参比序列输入计算机，(如果需要)指定亚序列坐标，指定序列算法程序参数。优选采用默认程序参数，或可指定另选参数。然后，用序列比较算法根据这些程序参数计算受试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。
这里所用的“比对窗口”包括选自通常数目约20-600、经常约50-200、更常见约100-150个毗连位置之一的片段，在将两段序列最佳排列对齐后，将一段序列与具有相同数目毗连未知的参照序列作比对。排列序列进行比对的方法是本领域熟知的。用于比对的最佳序列排列对比可以采用，例如Smith&Waterman，Adv.Appl. Math.2482(1981)中报道的局部同源算法、采用Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)中报道的同源排列算法、采用Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444(1988)中报道的相似性搜寻方法、采用计算机执行这些算法(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)、或通过手工排列对比和目测(参见，例如Ausubel等人主编的《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，1995增刊。
适合于测定序列相同性和序列相似性百分比的优选算法的例子包括BLAST和BLAST2.0算法，这些算法在Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中作了描述。BLAST和BLAST2.0使用本文所述的参数来测定本发明核酸与蛋白的序列相同性百分比。进行BLAST分析的软件公众可以通过国家生物技术信息中心获得。该算法包括鉴定查询序列中的长度为W的短字段，将该短字段与数据库序列中相同长度的字段排列对比，两者相匹配或满足一定的正评分阈值T时，先鉴定出高评分的序列对(HSPs)。T值指相邻字段的评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字段命中时可用作启动搜寻来发现包含它们在内的更长HSP的种子字段。将命中的字段沿每条序列的两侧方向延伸，尽可能提高累积的排列对比评分值。例如对于核苷酸序列而言，累积的评分可用参数M(一对匹配残基的加分总是大于0)和N(错配残基的扣分总是小于0)进行计算。对于氨基酸序列来说，可利用评分矩阵计算累计的评分值。命中字段沿两侧方向延伸在以下情况时中断累计的排列对比评分值从其达到的最高值下跌X数量时；由于一个或多个负得分残基对比的累积导致累计分值降至0或更低时；或达到了序列两末端之一时。BLAST算法参数W、T和X决定了该排列对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值是字段长度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，和对双链进行比对。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序采用的默认值是字段长度3、期望值10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))排列对比值(B)50、期望值10、M＝5、N＝-4，和对双链进行比对。
BLAST算法也进行两条序列间相似性的统计学分析(例如参见Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一种相似性衡量值是最小秩和概率(P(N))，表示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然匹配的概率。例如，如果在待测序列与参照序列的比较时最小秩和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，就认为该核酸与参照序列相似。对数值可以是大的负数，例如5、10、20、30、40、70、90、110、150、170等。
两个核酸序列或多肽基本上相同的一个标志是第一条核酸编码的多肽与用第二条核酸编码的多肽所产生的抗体可发生如下所述的免疫交叉反应。因而，例如当两段肽只有保守性置换差异时，一条多肽通常与第二条多肽基本相同。两条核酸序列基本相同的另一个标志是这两种分子或其互补链在如下所述的严谨条件下能互相杂交。两条核酸序列基本相同的另一个标志是可采用相同的引物来扩增此二序列。
“宿主细胞”是含有表达载体并能支持该表达载体复制或表达的天然产生的细胞或转化的细胞。宿主细胞可以是培养的细胞、外植体、体内细胞等。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞如酵母、昆虫细胞、两栖类细胞或哺乳动物细胞，如CHO、293、3T3、HeLa等(参见例如美国典型培养物保藏中心)。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯净的”指该物质几乎或基本没有其天然状态时通常所见的伴随成分。纯度和均一性通常可采用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC等分析化学技术测定。制剂中主要物质蛋白或核酸是基本上纯化的。具体地说，分离的核酸不含有与所述基因天然侧接的某些开放阅读框和编码所述基因编码蛋白以外的蛋白质的开放阅读框。在一些实施方式中，术语“纯化的”指核酸或蛋白在电泳凝胶上基本上只产生单一条带。所述核酸或蛋白的纯度优选至少85％、更优选至少95％、最优选至少99％。在其他实施方式中，“纯化”指从待纯化的组合物中去除至少一种杂质。就此含义而言，纯化不要求所纯化的化合物均一，例如100％纯。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。此术语用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸残基聚合物以及天然氨基酸聚合物、可包含修饰的残基以及非天然的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及功能类似于天然氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸指那些由遗传密码子编码的氨基酸以及那些随后经修饰的氨基酸(例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。“氨基酸类似物”指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构(例如，结合氢原子、羧基、氨基和R基团的α碳原子)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、亚砜甲硫氨酸、甲锍甲硫氨酸。这样的类似物可以具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持了天然氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指其结构不同于氨基酸通常的化学结构、但其功能类似于天然氨基酸的化合物。
本文中氨基酸用其通用的3字母符号表示或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸用其通用的单字母码表示。
“保守性修饰变体”用于指氨基酸和核酸序列。对于具体的核酸序列而言，保守性修饰变体指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或所述核酸不编码例如与天然邻接序列基本相同或相关序列的氨基酸序列。由于遗传密码子的简并性，许多功能上相同的核酸编码大部分蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在由一个密码子确定丙氨酸的每个位置上，该密码子可改变为所述的另一个密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守性修饰变异的一种。本文所述编码多肽的每个核酸序列也包括该核酸的沉默变异。本领域技术人员应当知道，在某些上下文中可修饰某核酸中的各密码子(除AUG和TGG外，AUG是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)而产生功能上相同的分子。因此，就表达产物而非实际探针序列而言，在所述序列中通常包含编码多肽的核酸的沉默变异。
关于氨基酸序列，本领域技术人员应当知道，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行个别的置换、筛除或添加或在编码序列中进行低百分比氨基酸的置换、删除或添加是一种“保守性修饰变体”，如果所述的改变导致用化学上相似的氨基酸置换某氨基酸时。提供功能上相似的氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。这类保守性修饰变体是本发明多态性变体、种间同源物和等位基因的补充而不是排斥。典型的相互保守性置换是1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；3)天冬酰胺酸(N)和谷酰胺(Q)；4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton所著《蛋白质》(Proteins)，1984)。
大分子结构如多肽结构可用术语“组成水平不同”来描述。对这种组织水平的总体描述，可参见例如Alberts等所著《细胞分子生物学》第3版(Molecular Biology ofthe Cell(1994))以及Cantor&Schimmel所著《生物物理化学》第一部分《生物大分子构象》(Biophysical Chemistry Part IThe Conformation of Biological Macromolecules(1980))。“一级结构”指具体肽的氨基酸序列。“二级结构”指多肽中局部有序的三维结构。这些结构通常称为结构域。结构域是通常形成该多肽紧凑单位的一部分，通常长度为25-500个氨基酸。典型的结构域由例如β折叠和α螺旋等更低组成部分的结构构成。“三级结构”指多肽单体完整的三维结构。“四级结构”指通常由独立的三级单位通过非共价缔合形成的三维结构。
本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法等效形式指共价连接在一起的至少两个核苷酸。寡核苷酸一般长约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸，可长达约100个核苷酸。核酸和多核苷酸可以是任何长度的聚合物，包括较长长度，如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。本发明核酸通常含有磷酸二酯键，但在一些情况下，包括可具有另一种主链的核酸类似物，包括例如亚氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚氨基磷酸酯(phophoroamidite)连接(参见Eckstein，《寡核苷酸和类似物实践方法》(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach)，牛津大学出版社)；以及肽核酸主链和连接。其它核酸类似物包括具有带正电主链、非离子型主链和非核糖主链的核酸，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及Sanghui和Cook主编《反义研究中的糖修饰》(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)中ASC研讨会系列580第6章和第7章所述核酸。核酸的一种定义也包括含有一个或多个碳环糖的核酸。可因各种原因而修饰核糖-磷酸主链，例如增加所述分子在生理环境中或作为生物芯片上的探针的稳定性和半衰期。可制备天然产生的核酸和类似物的混合物；或者，可制备不同核酸类似物的混合物以及天然产生的核酸和类似物的混合物。
各种参考文献公开了这种核酸类似物，包括例如亚氨基磷酸酯(Beaucage等，Tetrahedron 49(10)1925(1993)和其参考文献；Letsinger，J.Org. Chem. 353800(1970)；Sprinzl等，Eur.J.Biochem. 81579(1977)；Letsinger等，Nucl.Acids Res.143487(1986)；Sawai等，Chem.Lett. 805(1984)，Letsinger等，J.Am.Chem. Soc. 1104470(1988)；和Pauwels等，Chemica Scripta 26141 91986))，硫代磷酸酯(Mag等，NuclearAcids Res.191437(1991)；和美国专利号5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等，J.Am.Chem.Soc.1112321(1989)，O-甲基亚氨基磷酸酯连接(参见Eckstein，《寡核苷酸和类似物实践方法》(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach)，牛津大学出版社)；以及肽核酸主链和连接(参见Egholm，J.Am.Chem.Soc.1141895(1992)；Meier等，Chem.Iht.Ed.Engl.311008(1992)；Nielsen，Nature 365566(1993)；Carlsson等，Nature 380207(1996)，将所有这些文献纳入作参考)。其它核酸类似物包括具有带正电主链的核酸(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926097(1995)；具有非离子型主链的核酸(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30423(1991)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.1104470(1988)；Letsinger等，Nucleoside and Nucleotide 131597(1994)；Y.S.Sanghui和P.Dan Cook主编《反义研究中的糖修饰》(Carbohydrate Modifications inAntisense Research)中ASC研讨会系列第2章和第3章；Mesmaeker等，Bioorganic andMedicinal Chem.Lett.4395(1994)；Jeffs等，J. Biomolecular NMR 3417(1994)；Tetrahedron Lett.37743(1996))和非核糖主链，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及Y.S.Sanghui和P.Dan Cook主编《反义研究中的糖修饰》(CarbohydrateModifications in Antisense Research)中ASC研讨会系列580第6章和第7章所述的核酸。核酸的一种定义也包括含有一个或多个碳环糖的核酸(参见Jenkins等，Chem.Soc.Rev.169-176页(1995))。Rawls，C&E News，1997年6月2日，第35页描述了几种核酸类似物。特别将所有这些参考文献纳入本文作参考。
其它类似物包括作为肽核酸类似物的肽核酸(PNA)。与天然产生核酸的高度带电磷酸二酯主链相反，在中性条件下，这些主链基本上是非离子型。这产生了两个优点。第一，PNA主链具有改进的杂交动力学。PNA的错配碱基对与完美匹配碱基对相比解链温度(Tm)改变较大。有一个内部错配的DNA和RNA一般Tm降低2-4℃。采用非离子型PNA主链时，Tm降低接近7-9℃。类似地，由于它们的非离子特性，连接于这些主链的碱基杂交时对盐浓度相对不敏感。此外，PNA不会被细胞酶降解，因此可能更稳定。
如具体描述的那样，核酸可以是单链或双链，或者含有双链或单链序列部分。本领域技术人员应理解，所述单链的定义也包括互补链序列；因此本文所述序列也包括该序列的互补序列。所述核酸可以是DNA(包括基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，所述核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及以下碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌啉、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。“转录物”一般指天然产生的RNA，如前mRNA、hnRNA或mRNA。本文所用术语“核苷”包括核苷酸和核苷以及核苷酸类似物和修饰核苷，如氨基修饰的核苷。此外，“核苷”包括非天然产生的结构类似物。因此，例如，本文中将各含有一个碱基的肽核酸的单个单元称为核苷。
“标记”或“可检测部分”是可用分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测到的组合物。例如，有用的标记包括32p、荧光染料、电子致密试剂、酶(如常用于ELISA中的)、生物素、地高辛或半抗原以及蛋白质或其他能被检测到的试剂，例如通过将放射性标记掺入肽中，或用于检测与所述肽特异性反应的抗体。可将标记掺入乳腺癌核酸、蛋白质和抗体的任何位置中。可采用本领域已知的抗体和标记偶联方法，包括Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；以及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30407(1982)所述的那些方法。
“标记的核酸探针或寡核苷酸”是通过接头或化学键以共价方式，或通过离子键、范德华力、静电作用或氢键以非共价方式结合有某标记物的核酸，可通过检测结合于探针的该标记物的存在来测定该探针的存在。或者，可采用高亲和力相互作用方法获得相同结果，其中结合伴侣之一与另一伴侣(如生物素、链霉抗生物素蛋白)结合。
如本文所用“核酸探针或寡核苷酸”定义为能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成结合于互补序列靶核酸的核酸。本文所用探针可包括天然碱基(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外，探针中的碱基可通过除磷酸二酯键以外的连接键相连接，只要它不干扰杂交功能。因此，例如，探针可以是组成碱基通过肽键而非磷酸二酯键相连接的肽核酸。本领域技术人员知道，探针可依据杂交条件的严谨性结合与该探针序列不完全互补的靶序列。探针优选直接标记或间接标记，如用同位素、生色团、发色团、色原直接标记，或用随后可结合链霉抗生物素蛋白复合物的生物素间接标记。通过测定是否存在该探针，可以检测是否存在选择的序列或亚序列。可根据基因组水平，或RNA水平或蛋白质表达水平进行诊断或预后。
在用于指例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过外源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变进行了修饰，或所述细胞衍生自这种经修饰的细胞。因此，例如重组细胞可表达在该细胞天然(未重组)形式中未发现的基因或可表达该细胞异常时表达的、低表达的或完全不表达的基因。本文所用术语“重组核酸”指通常最初在体外形成的核酸通过核酸操作，例如用聚合酶和内切酶，以通常自然界中不存在的形式存在的核酸。这样，实现了不同序列的操作性连接。因此认为，将分离的线性核酸，或将通常不连接的DNA分子在体外连接形成表达载体均是符合本发明目的的重组核酸。应理解，一旦制备了重组核酸并将其重新导入宿主细胞或有机体中，该核酸将以非重组方式复制，即在体内能利用宿主细胞的细胞机制而不是体外操控而复制；然而，这样的核酸一旦以重组方式产生，虽然随后以非重组方式复制，仍认为是适应于本发明目的的重组核酸。类似地，“重组蛋白”是用重组技术制造(即通过上述重组核酸的表达)的蛋白质。
当用于指核酸部分时，术语“异源”表示所述核酸包含两个或多个亚序列，这些亚序列通常在自然条件下不存在相同的相互关系。例如，含有两个或多个序列的所述核酸通常以重组方式产生，例如从无关基因制备新的功能性核酸，例如，从一种来源的启动子和另一来源的编码区制备新的核酸。类似地，异源蛋白质通常指天然不存在相互关系的两个或多个亚序列组成的蛋白质(例如融合蛋白)。
“启动子”定义为指导核酸转录的一列核酸控制序列。本文所用启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，如聚合酶II型启动子是TATA元件。启动子也任选地包括远端增强子或阻抑子元件，它们可以位于距离转录起始位点多达几千个碱基。
“组成性”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“操作性连接”指核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点序列)与第二核酸序列之间的功能性连接，此连接中表达控制序列能指导对应于第二序列的核酸转录。
“表达载体”是通过重组或合成方法产生的核酸构建物，它具有能够在宿主细胞中转录特定核酸的一系列特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包含的待转录核酸操作性连接于启动子。
术语“选择性(或特异性)杂交”指当一序列存在于复杂混合物(如总细胞或文库的DNA或RNA)中时，在严谨的杂交条件下该分子仅与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。
术语“严谨杂交条件”指一般在复杂的核酸混合物中，探针与其靶亚序列而不与其它序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖的，并且在不同情况下不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指南可见Tijssen，《生物化学和分子生物学技术—与核酸探针杂交》(Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes)，“杂交原理和核酸试验方案概述”(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays)(1993)。通常，选择比特定序列在确定离子强度pH下热解链点(Tm)低约5-10℃的严谨条件。Tm是与靶序列互补的50％探针与靶序列杂交达到平衡(由于靶序列过量存在，在Tm下，50％探针平衡时被占据)时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件是在pH7.0-8.3时盐浓度低于约1.0M钠离子，一般约为0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)；对于短探针(如10-50个核苷酸)温度至少约为30℃，对于长探针(如大于50个核苷酸)温度至少约为60℃的条件。也可通过加入去稳定剂如甲酰胺获得严谨条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的两倍，优选为背景杂交的10倍。示范性严谨杂交条件可以如下50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，42℃孵育，或者5×SSC、1％SDS，65℃孵育，用0.2×SSC洗涤，以及65℃，0.1％SDS。对于PCR，低严谨扩增的温度一般约为36℃，但是退火温度可在约32℃～48℃之间变化，这取决于引物长度。对于高严谨PCR扩增，温度一般约为62℃，但高严谨退火温度可约为50℃-65℃，这取决于引物长度和特异性。高严谨和低严谨扩增的循环条件包括变性阶段90℃-95℃，30秒-2分钟；退火阶段持续30秒-2分钟；延伸阶段为约72℃1-2分钟。文献提供了低严谨和高严谨扩增反应的方案和指南，如Innis等，(1990)《PCR方案，方法和应用指南》(PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，Inc.纽约)。
如果核酸编码的多肽基本相同，在严谨条件下不互相杂交的核酸仍然基本相同。例如，当利用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，发生这种情况。在这种情况下，核酸一般在中等严谨杂交条件下杂交。示范性“中等严谨杂交条件”包括在含40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中37℃杂交，用1×SSC在45℃洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域技术人员不难认识到，可采用另一种杂交和洗涤条件来提供严谨性相似的条件。许多参考文献中提供了确定杂交参数的其它指南，例如《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等编。
“测定功能性作用”指测定在WIF-1的间接或直接影响下参数(如功能、酶、物理和化学作用)增加或降低的化合物。可用本领域技术人员已知的任何方法测定这种功能作用，如蛋白质的光谱特征(如荧光、吸光度、折射率)、流体力学特性(如形状)、色谱特性或溶解性改变，测定诱导性标记或WIF-1蛋白的转录活性；测定结合活性如结合于Frizzled受体，测定细胞增殖，测定凋亡等。也可用本领域技术人员已知的试验如体外试验测定某化合物对癌症的功能性作用，所述体外试验如软琼脂上的细胞生长；锚定依赖性；接触抑制和生长密度限制；细胞增殖；细胞转化；生长因子或血清依赖性；肿瘤特异性标记的水平；侵入基质胶(Matrigel)；体内肿瘤生长和转移；转移细胞中的mRNA和蛋白质表达以及癌细胞的其它特征。可用本领域技术人员已知的许多方法评价此功能性作用，如用于定量或定性测定形态学特征变化的显微镜观察、WIF-1 RNA或蛋白质水平变化的测定、RNA稳定性的测定、下游或报道基因表达(CAT、荧光素酶、β-gal、GFP等)的鉴定，如通过化学发光、荧光、比色反应，抗体结合、可诱导标记和配体结合实验。“功能性作用”包括体外、体内和离体活性。
WIF-1多核苷酸和多肽序列的“激活物”或“调节物”表示能活化WIF-1的物质。激活物是(例如)诱导或激活本发明多肽的表达，或者能结合、刺激、打开、激活、促进、或增强活性、致敏或上调本发明多肽活性的物质。激活物包括编码WIF-1的核酸、去甲基化合物、以及天然产生和合成的化合物、小化学分子等。检测激活物的试验包括例如，将候选化合物施加于表达WIF-1的细胞，然后测定功能性作用。将用潜在激活物处理的包含WIF-1的样品或试验与不含该激活物的对照样品作比较，以检测作用程度。将对照样品(不用候选制剂处理)的相对活性值设定为100％。当与对照相比多肽活性值为110％，任选150％，任选200％、300％、400％、500％或1000-3000％或更高时，即实现了该多肽的活化。
术语“细胞生长改变”指体内或体外细胞生长和增殖特征的任何改变，如形成细胞灶、锚定独立性、在半固体或软琼脂中生长、接触抑制和生长密度限制的改变、丧失对生长因子或血清的要求、细胞形态改变、获得或丢失永生性、获得或丢失肿瘤特异性标记、注射入合适的动物宿主时能够形成肿瘤或抑制肿瘤、和/或细胞的永生化。参见例如，Freshney，《动物细胞培养，基本技术手册》(Culture of Animal Cellsa Manual of Basic Technique)，231-241页(第3版，1994)。
“肿瘤细胞”指肿瘤中的癌前细胞、癌细胞和正常细胞。
“癌细胞”、“转化”细胞或组织培养物的“转化”指不一定涉及摄取新的遗传物质而发生的自发性或诱导性表型改变。虽然转化可用转化病毒感染和掺入新基因组DNA、或摄入外源性DNA引起，但也可自发性或在接触致癌物后使内源性基因突变而产生。转化与表型改变有关，例如细胞永生化、生长控制异常、非形态改变和/或恶变(参见，Freshney，《动物细胞培养，基本技术手册》(Culture of Animal Cellsa Manual of Basic Technique)(第3版，1994))。
“抗体”指包含能特异性结合和识别某抗原的免疫球蛋白基因或其片段的构架区的多肽。被识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ和λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，进而分别确定了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体的抗原结合区或其功能等效物通常是其结合特异性和亲和力的最重要部分。参见Paul，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)。
示范性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。各四聚体由两对相同的多肽链组成，各对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。各链的N末端确定了主要负责抗原识别的可变区，其长约100-110或更多个氨基酸。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体可以(如)完整的免疫球蛋白，或用各种肽酶消化产生的特征已熟知的许多片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化抗体时在绞链区的二硫键以下处切断，产生F(ab)′2，它是Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可在温和条件下还原F(ab)′2，切断绞链区中的二硫键，从而将F(ab)′2二聚体转变为Fab′单体。Fab′单体基本上是含有一部分绞链区的Fab(参见《基础免疫学》(FundamentalImmunology)(Paul编，第三版，1993)。虽然消化完整抗体可产生各种抗体片段，但本领域技术人员知道也可用化学方法或重组DNA方法从头合成这些片段。因此，本文所用术语抗体也包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段或用重组DNA方法从头合成的抗体片段(如单链Fv)或用噬菌体展示文库鉴定的抗体(参见例如，McCafferty等，Nature 348552-554(1990))。
为了制备抗体，如重组单克隆抗体或多克隆抗体，可采用本领域已知的许多技术(参见例如，Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday 472(1983)；Cole等，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)，77-96页(1985)；Coligan，《免疫学当前方案》(Current Protocols inImmunology)(1991)；Harlow和Lane，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A LaboratoryManual)(1988)；和Goding，《单克隆抗体原理和实践》(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice)(第2版，1986))。可采纳产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)来产生本发明多肽的抗体。也可采用转基因小鼠或其它生物如其它哺乳动物来表达人源化抗体。或者，可用噬菌体展示技术鉴定能特异性结合所选抗原的抗体和异聚性Fab片段(参见例如，McCafferty等，Nature 348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10779-783(1992))。
“嵌合抗体”是(a)恒定区或其一部分被改变、取代或交换的抗体分子，其抗原结合位点(可变区)连接于类型不同或改变的恒定区、效应物和/或物质，或是能赋予该嵌合抗体新性能的完全不同的分子，如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其一部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或交换的抗体分子。
本文所用术语“WIF-1表达下调”或“WIF-1低表达”和其语法等效形式指WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸的表达水平低于确定的参比水平。因此，例如，根据本发明，将鉴定的正常或健康对象中WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸的参比水平作为截取值，低于该截取值表明WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸水平与癌症之间显著相关。癌细胞中WIF-1水平比相同组织正常细胞中的WIF-1水平通常低至少约2倍，常低至少约5倍，更常低至少约10倍。本文中，术语“下调”和“低表达”可互换使用。本文所述的测定WIF-1水平的方法，包括但不限于RT-PCR和采用抗WIF-1抗体。
“使含量与...相关”指将一种样品中经测定的某物质、分子或标记(如WIF-1)的含量与另一样品中相同物质、分子或标记经测定的含量作比较。另一样品中相同物质、分子或标记经测定的含量可以是某给定癌症特异性的。
术语“测定含量”的同义词也认为包括在本发明范围内，其包括但不限于检测、测试、测量或测定某分子如WIF-1的存在、不存在、含量或浓度。
II.WIF-1多肽本发明提供了新型WIF-1多肽。包含信号肽序列的全长WIF-1多肽(参见例如本文所述的SEQ ID NO.2和GenBank登录号)、不含信号肽的成熟全长WIF-1多肽(如SEQ ID NO14或SEQ ID NO30)可用于实施本发明方法，并可用作本发明药物组合物和试剂盒中的组合物。在优选实施方式中，WIF-1多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-379的氨基酸序列。与人Wnt2(SEQ ID NO2)的氨基酸残基29-379比较时，此氨基酸序列可具有一个或多个氨基酸不同(加入、取代或缺失氨基酸)。
在本发明的其它方面，WIF-1多肽包含全长WIF-1多肽的片段，该片段包含WIF-1亚域，该WIF-1亚域多肽能结合Wnt多肽和/或抑制Wnt信号转导。因此，优选的WIF-1多肽是能结合Wnt多肽和/或抑制Wnt信号转导的WIF-1亚域多肽。在优选实施方式中，此亚域包含SEQ ID NO2的氨基酸残基1-180。在其它优选实施方式中，此结构域包含SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15的氨基酸序列、SEQ ID NO16的氨基酸序列、SEQ ID NO26的氨基酸序列、SEQ IDNO27的氨基酸序列、SEQ ID NO28的氨基酸序列、SEQ ID NO29的氨基酸序列、或至少与这些序列基本相同能结合Wnt多肽或抑制Wnt信号转导的氨基酸序列。在其它实施方式中，Wnt结合域包含SEQ ID NO2的氨基酸残基29-180、SEQID NO2的氨基酸残基29-176、或至少与该序列基本相同能结合Wnt多肽或抑制Wnt信号转导的氨基酸序列。因此，本发明WIF-1的亚域多肽可包含约120-180个氨基酸残基，在一些实施方式中可包含约130-150个氨基酸残基。
在本发明的其它优选实施方式中，WIF-1多肽是由WIF-1的Wnt结合域组成的WIF-1片段。在优选实施方式中，此亚域由SEQ ID NO2的氨基酸残基1-180组成。在其它优选实施方式中，此结构域由SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ IDNO15的氨基酸序列、SEQ ID NO16的氨基酸序列、SEQ ID NO26的氨基酸序列、SEQ ID NO27的氨基酸序列、SEQ ID NO28的氨基酸序列、SEQ ID NO29的氨基酸序列或至少与这些序列基本相同能结合Wnt多肽或抑制Wnt信号转导的氨基酸序列，在其它实施方式中，Wnt-结合域由SEQ ID NO2的氨基酸残基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-176或至少与该序列基本相同能结合Wnt多肽或抑制Wnt信号转导的氨基酸序列组成。因此，本发明的WIF-1亚域多肽可由约120-180个氨基酸残基组成，在一些实施方式中由约130-150个氨基酸残基组成。
WIF-1的优选片段包含SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152，SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的氨基酸序列或至少与这些序列基本相同的氨基酸序列。本发明也提供了这些亚域多肽的功能性片段。因此，也优选SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28或SEQ IDNO29的较短片段，包括例如，SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ IDNO29的约70个氨基酸残基，SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO.-26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的约80个氨基酸残基，SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的约90个氨基酸残基，SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的约100个氨基酸残基，SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的约110个氨基酸残基，SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的约120个氨基酸残基，SEQ ID NO14的氨基酸残基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的约130个氨基酸残基，或者至少与这些序列基本相同能结合Wnt多肽和/或抑制Wnt信号转导的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方式中，能结合Wnt多肽和/或抑制Wnt信号转导的WIF-1亚域多肽是包含SEQ ID NO2所示WIF-1前体蛋白的少于或等于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％序列的片段。在另一优选实施方式中，能结合Wnt多肽和/或抑制Wnt信号转导的WIF-1亚域多肽是包含SEQ ID NO2所示WIF-1前体蛋白的少于或等于99％、95％、90％、85％、80％、75％。70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％序列的片段，WIF-1前体蛋白不含信号肽序列MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEA(SEQ ID NO20)。
在另一优选实施方式中，WIF-1亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约1-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基约29-180或SEQ ID NO2的氨基酸残基29-176的氨基酸序列。与SEQ ID NO2的氨基酸残基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-180或SEQ ID NO2的氨基酸残基29-176比较时，这些氨基酸序列可以有一个或多个氨基酸不同(加入、取代或缺失氨基酸)。
WIF-1亚域多肽片段优选包含上述序列的毗连序列。然而，如本文所述，可对氨基酸残基进行一个或多个插入、取代和/或加入。本发明包括这种多肽，只要它们能结合Wnt多肽和抑制Wnt信号转导。
SEQ ID NO2的178位氨基酸残基可以是亮氨酸(参见例如，SEQ ID NO2和GenBank登录号AAD25402和NP_009122)或谷氨酰胺(参见例如，SEQ ID NO14和16以及GenBank登录号Q9Y5W5、AAH18037、AAQ88710)。
从本文所述内容中可明显看出仍会产生有功能的WIF-1亚域多肽的其它氨基酸取代，例如图20。虽然对应于WIF-1亚域多肽的氨基酸序列在各种动物如人、大鼠、小鼠、爪蟾和纹斑鱼中非常保守，但发现了某些氨基酸取代，包括保守取代和非保守取代(图25)。这些氨基酸取代似乎不干扰WIF-1活性。因此，人WIF-1亚域多肽可包含一个或多个以下的氨基酸取代H43N、V47I、S59A、S86A、S86H、M87V、A94S、A94T、G95D、L104Q、S 105T、G112D、A115D、V121M、L123R、T126S、S132T、V134I、LI41R、K143N、K143D、D153N、D153T、V154I、I155L、N158D、S159A、E160G、T163P、T163V、T163I、Q166R或Q169H。
在本发明的另一优选实施方式中，WIF-1多肽，优选WIF-1亚域多肽是糖基化的。N-连接的氨基酸共有序列是Asn-X-Ser或Thr，其中X可以是除脯氨酸(praline)以外的任何氨基酸残基。大多数O-连接糖与蛋白质的共价连接包括单糖N-乙酰半乳糖胺和氨基酸丝氨酸或苏氨酸之间的连接。在SEQ ID NO2的88位和SEQ ID NO2的245位分别发现了N-连接的糖基化位点NFT、NCS。因此，全长WIF-1多肽包含这两个N-连接的糖基化位点，而WIF-1亚域多肽仅包含NFT糖基化位点。这些糖基化位点在所分析的所有WIF-1种类中保守(参见图25)，表明它是WIF-1的重要功能特征。由真核细胞纯化的重组全长WIF-1多肽和重组WIF-1亚域多肽是糖基化的，而在细菌中制备的WIF-1多肽没有发现糖基化(数据未显示)。因此，在本发明的优选实施方式中，在真核细胞中产生WIF-1多肽，优选WIF-1亚域多肽。本文描述了在真核细胞中产生重组蛋白的方法。
因此，在本发明的优选实施方式中，提供了包含至少两个N连接糖基化位点的WIF-1多肽。本发明还提供包含至少一个N连接糖基化位点的WIF-1亚域多肽。如本文所述，在诱导凋亡中糖基化的WIF-1多肽和糖基化的亚域多肽比它们的非糖基化对应物更有效。因此，本发明也提供了包含至少一个额外的N连接糖基化位点的WIF-1多肽和WIF-1亚域多肽。可用本领域已知的体外诱变方法加入额外的糖基化位点。
III.鉴定WIF-1序列在本发明的一个方面，测定患者样品中的WIF-1 mRNA或蛋白水平来提供所需的诊断或预后信息。即，可鉴别正常组织(如正常肺、乳腺或其它组织)与相同来源的癌组织或转移性癌组织；或者可将癌组织或转移性癌组织与其它患者，如存活的癌症患者的相似组织样品作比较。
A.通用重组DNA法本发明的这个方面依赖重组遗传学领域的常规技术。刊登了本发明通用方法的基础教科书包括Sambrook和Russell，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)；Kriegler，《基因转移和表达实验室手册》(GeneTransfer and ExpressionA Laboratory Manual)(1990)；《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编，1994-1999)。用于产生本发明所用WIF-1的方法也可用于产生蛋白质配体或调节配体与受体结合的多肽，用于本发明。
对于核酸，以千碱基(kb)或碱基对(bp)表示大小。这些对大小的估计获自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、获自核酸测序或获自已发表的DNA序列。对于蛋白质，以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数表示大小。可从凝胶电泳、蛋白质测序、产生的氨基酸序列或已发表的蛋白质序列估计蛋白质大小。
可根据首先由Beaucage和Carathers，Tetrahedron Letts.221859-1862(1981)描述的固相亚磷酰胺三酯法，采用自动化合成仪化学合成不能购得的寡核苷酸，如VanDevanter等，Nucleic Acids Res.126159-6168(1984)所述。通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC纯化寡核苷酸，如Pearson和Reanier，J.Chrom.255137-149(1983)所述。
克隆后可用(例如)测序双链模板的链末端分析法(Wallace等，Gene1621-26(1981))验证克隆基因和合成寡核苷酸的序列。
1.分离核苷酸序列的克隆方法通常，通过与探针杂交从cDNA和基因组DNA文库克隆，或用寡核苷酸引物扩增技术分离编码WIF-1的核酸序列和相关的核酸序列同源物。例如，这些序列一般通过与核酸探针杂交分离自哺乳动物核酸(基因组或cDNA)文库，其序列可衍生自SEQ ID NO1。
也可用引物扩增技术扩增和分离DNA或RNA核酸(参见例如，下述“多核苷酸的检测”章节)。可用本领域熟知的原理设计用于扩增特定序列的合适引物(参见例如，Dieffenfach和Dveksler，《PCR引物实验室手册》(PCR PrimerA LaboratoryManual)(1995))。可用这些引物(如)扩增全长序列或探针，其大小一般是十个至几百个核苷酸，然后将其用于鉴定WIF-1多核苷酸。
也可用抗体作探针，从表达文库中分离编码WIF-1的核酸。可用SEQ ID NO2的序列产生这种多克隆或单克隆抗体。
也可用合成寡核苷酸构建用作探针或表达蛋白的WIF-1基因。用长度通常为40-120bp、代表该基因的正义和反义链的一系列重叠寡核苷酸进行此方法。然后退火、连接并克隆这些DNA片段。或者，可用扩增技术以精确引物扩增该核酸的特定亚序列。然后将此特定亚序列连接入表达载体中。
一般将编码WIF-1的核酸克隆入中间载体中，然后转化入原核或真核细胞以复制和/或表达。这些中间载体一般是原核载体如质粒，或穿梭载体。
可任选按照标准技术制备包含WIF-1或其结构域的嵌合蛋白的编码核酸。例如，可将结构域如配体结合域共价连接于异源蛋白，如绿色荧光蛋白、荧光素酶或β-半乳糖苷酶。
2.在原核和真核生物中表达为获得WIF-1核酸高水平表达，一般将WIF-1核酸亚克隆入含有指导转录的强效启动子、转录/翻译终止子和(如果是编码蛋白的核酸)启动翻译的核糖体结合位点的表达载体中。本领域熟知合适的细菌启动子，参见例如Sambrook和Russell，同上，Ausubel等，同上。表达WIF-1蛋白的细菌表达系统可以获自(如)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门菌(Salmonella)(Palva等，Gene 22229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302543-545(1983)。可购得装有这些表达系统的试剂盒。本领域熟知哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统，也可购得这些表达系统。在一个实施方式中，真核表达载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体或逆转录病毒载体。
用于指导异源核酸表达的启动子取决于具体应用。启动子的定位距异源转录起始位点的距离任选与天然情况下其距转录起始位点的距离大约相同。然而如本领域所知，可以适当地改变此距离，而不会丧失启动子功能。
除启动子外，表达载体一般含有转录单元或表达盒，其含有在宿主细胞中表达WIF-1编码核酸所必需的所有其它元件。因此，表达盒一般含有操作性连接于编码WIF-1的核酸序列的启动子以及转录物有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。一般可将编码WIF-1的核酸序列连接于可切割信号肽序列，以促进转化细胞分泌编码蛋白。这种信号肽可包括组织纤溶酶原激活物、胰岛素和神经元生长因子的信号肽，以及烟芽夜蛾保幼激素酯酶等。表达盒的其它元件可包括增强子和(如果基因组DNA用作结构基因时)含有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除启动子序列外，表达盒也应在结构基因下游含有转录终止区，以提供有效终止作用。终止区可获自与启动子序列相同的基因，或可获自不同基因。
用于将遗传信息转运入细胞中的具体表达载体并不特别重要。可采用用于真核或原核细胞中表达的任何常规载体。标准的细菌表达载体包括质粒如pBR322质粒、pSKF、pET23D和融合表达系统如GST和LacZ。也可将表位尾加入重组蛋白，以提供方便的分离(如)c-myc方法。
真核表达载体如SV40载体、乳头瘤病毒载体和衍生自EB病毒的载体中一般采用含有真核病毒调节元件的表达载体。其它示范性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和能在以下启动子指导下表达蛋白的其它载体SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳房肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或在真核细胞中能有效表达的其它启动子。
一些表达系统具有提供基因扩增的标记，如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。或者，不涉及基因扩增的高产率表达系统也适用，如昆虫细胞中可采用杆状病毒载体，它含有在多角体蛋白启动子或其它强效杆状病毒启动子指导下的WIF-1编码序列。
表达系统一般包含的元件也包括在大肠杆菌中起作用的复制子、用于选择含有重组质粒的细菌的编码抗生素抗性的基因，和在质粒非必需区中插入真核序列的独特限制性位点。具体抗生素抗性基因的选择并不重要，本领域已知的许多抗性基因都合适。任选(如果需要)不干扰真核细胞中DNA复制的原核序列。
用标准转染方法产生能表达大量WIF-1蛋白的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后用标准技术纯化该蛋白(参见例如，Colley等，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification)，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第182卷(Deutscher编，1990))。根据标准技术转化真核和原核细胞(参见例如，Morrison，J.Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，《酶学方法》(Methods in Enzymology)101347-362(Wu等编，1983)。
可采用将外源性核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知方法。这些方法包括采用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、胞浆载体(plasma vector)、病毒载体和能将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源性遗传物质引入宿主细胞中的任何其它熟知方法(参见例如，Sambrook和Russell，同上)。仅仅需要所用具体遗传工程方法能够至少将一个基因成功引入能够表达WIF-1的宿主细胞中。
将表达载体引入细胞后，在有利于表达WIF-1的条件下培养转染细胞，然后用标准技术从培养物中回收WIF-1(参见例如，Scopes，《蛋白质纯化原理和实践》(Protein PurificationPrinciples and Practice)(1982)；美国专利号4,673,641；Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。
IV.检测WIF-1多核苷酸和多肽A.检测对象的癌细胞本发明的WIF-1多肽可以各种方式应用。在本发明的优选实施方式中，提供了检测对象癌细胞的方法。此方法包括提供该对象的生物样品和检测细胞中WIF-1表达水平的步骤，所述生物样品包含怀疑是癌细胞的细胞。此方法任选包括将细胞中WIF-1的表达水平与一个或多个健康对象细胞中WIF-1的表达水平作比较，或与以前确定的WIF-1表达水平的参比范围作比较。在本发明的一个实施方式中，通过检测WIF-1 mRNA水平检测WIF-1表达水平。在本发明的另一实施方式中，通过检测WIF-1多肽水平检测WIF-1表达水平。本文公开了此方法所用试剂如抗WIF-1抗体。
可能因各种原因需要检测WIF-1表达水平。检测WIF-1表达水平可能是(i)对对象进行癌症的筛检、诊断或预后的一部分；(ii)确定该对象对癌症易感性的一部分；(iii)确定该对象癌症阶段或严重性的一部分；(iv)鉴定该对象发生癌症风险的一部分；或(v)监测给予诊断患有癌症的对象抗癌药或治疗效果的一部分。给予对象抗癌药或治疗可包括给予本发明的WIF-1多肽，优选WIF-1亚域多肽。
B.鉴定处于发生癌症风险的对象和鉴定对象的癌症阶段或严重性在本发明优选实施方式中，提供了鉴定处于发生癌症风险的对象或鉴定对象癌症阶段或严重性的方法。如本文所述，在各种癌细胞中WIF-1表达下调(图2)。如本文进一步所述，WIF-1多肽，尤其是重组WIF-1多肽以剂量依赖方式诱导癌细胞(凋亡)(图10-15)。因此，WIF-1含量是各种癌症风险状态，如高、中或低风险的特征。可通过以下方法确定发生癌症的风险测定WIF-1，然后将测定结果提交给分类算法或将其与WIF-1的参比含量和/或模式(与具体风险水平或癌症的具体阶段或严重性相关)作比较。
可采用本发明方法测定发生癌症风险对象的待测生物样品中的WIF-1水平。测定发生前列腺癌风险对象待测生物样品中的WIF-1水平低于正常或健康对象同等生物样品中检测到的WIF-1水平，或低于预先确定的基线水平时，表明待测的发生癌症风险的对象具有发生癌症的风险。
C.对象癌症的筛检、诊断或预后在本发明的另一优选实施方式中，作为某对象癌症的筛检、诊断或预后的一部分，测定该对象是否有癌症。采用本发明方法，测定待筛检癌症对象生物样品中的WIF-1水平。待筛检癌症对象生物样品中检测到的WIF-1水平低于正常或健康对象同等生物样品中检测到的WIF-1水平，或低于预先确定的基线水平时，表明该筛检癌症对象患有或可能患有癌症。
D.检测超甲基化的序列在一个方面，本发明提供了检测癌细胞的方法。优选检测对象，更优选检测哺乳动物，最优选检测人的癌症。采用本文所述组合物和方法，可以各种方式检测癌症。在一个实施方式中，采用检测超甲基化的WIF-1启动子的方法检测癌症。
在一个实施方式中，通过检测超甲基化的WIF-1调节元件，如WIF-1启动子的存在来检测癌细胞，如肺癌或乳腺癌细胞。在本发明的一些方面，检测WIF-1调节元件中所含超甲基化的多核苷酸序列。WIF-1调节元件中所含的多核苷酸序列优选包含CpG岛。
在本发明的优选实施方式中，提供了检测超甲基化的WIF-1启动子的方法。可用本领域已知的任何技术，如硫酸氢盐测序、甲基化-特异性PCR或采用甲基化敏感型限制性酶检测超甲基化的WIF-1启动子。在本发明的优选实施方式中，该方法包括将超甲基化的WIF-1启动子与一种寡核苷酸相接触的步骤，所述寡核苷酸包含能特异性杂交超甲基化的WIF-1启动子的序列，其用量能有效检测超甲基化的WIF-1启动子。本文描述了用于实施本发明的寡核苷酸。此方法任选地包括测定WIF-1启动子的甲基化量并将其与正常样品相比较的步骤。
可检测某对象如患者的生物样品中超甲基化的WIF-1启动子。检测到样品中甲基化量比正常样品增加表明该患者患有癌症。
如上所述，该启动子区中半胱氨酸残基的超甲基化是WIF-1低表达指标。可用各种方法检测甲基化程度。例如，可用Southern杂交进行甲基化分析，此法能评价WIF-1启动子CpG岛中甲基化敏感型限制性位点。含CG作为其识别位点的一部分并且在C甲基化时受到抑制的任何限制性核酸内切酶可用于此分析。甲基化敏感型限制性核酸内切酶包括AciI、BsiEI、BssHII、BstUI、EagI、FauI、HaeII、HpaI、HpaII、MspI、NarI、NotI、SacII或SmaI。这些酶可单独使用或联用。
也可采用更灵敏的试验，对DNA甲基化模式作图。这些试验包括硫酸氢盐DNA测序和甲基化特异性PCR。这些技术能够分析跨越感兴趣的单CpG岛的多个CpG二核苷酸。硫酸氢盐DNA测序依据在未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶的条件下硫酸氢盐能诱导基因组DNA修饰。然后，用PCR以两组链特异性引物扩增硫酸氢盐修饰的序列，产生一对片段，各自来自一条链，其中所有尿嘧啶和胸腺嘧啶残基都扩增为胸腺嘧啶，仅有5-甲基胞嘧啶残基扩增为胞嘧啶。PCR产物可直接测序或可克隆后测序，以提供单个DNA分子的甲基化图谱(参见例如，Frommer等，Proc.Natl.Acad.Sci.891827-1831(1992))。
也可不依赖采用甲基化敏感型限制性酶用甲基化特异性PCR评价CpG岛内CpG二核苷酸位点的甲基化状态。此试验包括先用硫酸氢钠或另一种同等试剂修饰DNA，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。随后用甲基化DNA或未甲基化DNA的特异性引物扩增，导致含甲基化CpG二核苷酸的DNA被扩增。所述引物能特异性区分甲基化和未甲基化的DNA。为达到此目的，通常所选择的引物序列为含有高频率胞嘧啶的区域(以区分未修饰的DNA与修饰的DNA)和所述引物的3′末端附近有CpG对(以使PCR反应中甲基化和未甲基化DNA之间的差异最大化)。由于亚硫酸盐处理后DNA的两条链不再互补，所以可为这两条修饰链设计引物。例如，甲基化DNA的特异性引物的3′CG对中一般具有一个T，可使其与甲基化DNA中保留的C相区别，并为反义引物设计互补链。参见专利号5,786,146；Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939821-9826(1996)。
用于扩增WIF-1启动子区中甲基化和未甲基化DNA序列的示范性引物组包括例如，甲基化特异性引物5′-GGGCGTTTTATTGGGCGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO4)和5′-AAACCAACAATCAACGAAC-3′(反向)(SEQ ID NO5)和未甲基化特异性引物5′-GGGTGTTTTATTGGGTGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO6)和5′-AAACCAACAATCAACAAAAC-3′(反向)(SEQ ID NO7)，它们分别对应于WIF-1启动子区序列-488～-468和-310～-290(参见实施例)。
一个方面，用质谱检测甲基化WIF-1启动子序列，如本文进一步所述。尤其有用的是Bane等(Nucleic Acids Res.30(14)e69(2002)；以全文纳入本文作参考)所述方法。Bane等描述了采用SELDI-TOF质谱分析含有甲基化和未甲基化启动子的DNA片段。
用于本发明的另一优选质谱技术是MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)。MALDI-TOF MS是质谱的最新改进。将待分析分子与不电离、但有助于大分子(如DNA分子)电离的基质混合。例如，该基质可以是与DNA分子混合时能吸收紫外辐射的材料。可用MALDI-TOF MS分析各种大小的DNA分子。飞行时间能够高通量测定离子。用此方法，可在几秒内分析样品。示范性MALDI-TOF技术参见例如，美国专利申请号2001/0033809、2003/0010908、2003/0164449和2004/0050787，Humeny等，Anal.Biochem.313(1)160-166(2003)，Schatz等，NucleicAcids Res.32(21)e167(2004)和Rakyan等，PLos Biol.2(12)e405(2004)；将其全文纳入本文作参考。也可用MALDI-TOF对DNA分子进行DNA测序(参见例如，Taranenko等，Nucleic Acids Res.26(10)2488-2490(1998)；Edwards等，Nucleic Acids Res.29(21)e104(2001))。因此，本文也考虑用于质谱分析本文所述产生的PCR产物序列的方法和试剂。
E.检测WIF-1 mRNA在一个实施方式中，癌症检测方法包括测定对象如患者生物样品中编码WIF-1的转录物的水平(参见例如，Genbank登录号NM 007191和SEQ ID NO1)。检测到的WIF-1 mRNA水平比正常组织低表明该对象患有癌症。在一个实施方式中，测定WIF-1 mRNA水平的步骤包括扩增反应。在另一实施方式中，通过测定细胞中编码WIF-1的mRNA表达水平评价是否存在癌症。WIF-1 mRNA水平低于相应的非癌组织表明存在癌症。本领域技术人员熟知评价具体基因的RNA表达的方法，包括基于杂交和扩增的试验等。
1.直接杂交试验本领域技术人员已知用核酸杂交技术检测和/或定量WIF-1基因转录物(mRNA或由其制备的cDNA)水平的方法。例如，评价WIF-1多核苷酸的存在、不存在或含量的一种方法包括Northern印迹。也可用本领域已知技术，如斑点印迹、原位杂交、RNA酶保护、探针DNA微芯片阵列等分析基因表达水平。
2.扩增试验在另一实施方式中，采用扩增试验测定WIF-1的表达水平。在这种试验中，WIF-1核酸序列用作扩增反应(如聚合酶链反应或PCR)的模板。在定量扩增中，扩增产物量与初始样品中模板量成正比。与合适对照的比较能够衡量样品中的WIF-1水平。本领域技术人员熟知定量扩增的方法。定量PCR的详细方案参见例如，Innis等，(1990)《PCR方案，方法和应用指南》(PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，Inc.，纽约)。WIF-1的已知核酸序列(参见例如，SEQ ID NO1)足以使技术人员能够按常规方法选择引物来扩增该基因的任何部分。
在一个实施方式中，采用TaqMan试验定量测定癌症相关性多核苷酸。TaqMan试验采用含有5′荧光染料和3′淬灭剂的荧光寡核苷酸探针。该探针能杂交PCR产物，但由于3′的阻断剂其本身不可延伸。当PCR产物在后续循环中扩增时，聚合酶如AmpliTaq的5′核酸酶活性将切割TaqMan探针。此切割将5′荧光染料与3′淬灭剂分离，从而导致荧光以扩增函数方式增加(参见例如，Perkin-Elmer提供的文献，如www2.perkin-elmer.com)。
其它合适的扩增方法包括但不限于连接酶链反应(LCR)(参见Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)；Landegren等，Science 2411077(1988)；Barringer等，Gene89117(1990))、转录扩增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 861173(1989))、自身维持的序列复制(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874(1990))、斑点PCR和衔接头PCR等。
F.检测WIF-1多肽在另一实施方式中，检测癌症的方法包括测定对象如患者生物样品中WIF-1多肽的水平。检测到WIF-1多肽水平比正常组织低表明该对象患有癌症。
WIF-1表达下调表明存在癌症和可能与多种癌症相关。因此，WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸可用作癌症诊断中的生物标记。在本发明的一个优选实施方式中，测定生物样品中WIF-1的含量。正常、健康或无癌对象提供的生物样品中WIF-1含量一般与癌症对象或怀疑患有癌症对象提供的生物样品中WIF-1含量有关。癌症对象或怀疑患有癌症对象的生物样品中检测到的WIF-1含量可能是某给定癌症特异性的。
可通过以下特异性检测方法检测WIF-1多肽，包括但不限于亲和捕获、质谱、传统的WIF-1免疫试验、PAGE或HPLC，如本文进一步所述或如本领域技术人员所知。
可用于此目的的检测范例包括光学方法、电化学方法(电压计和电流计技术)、原子力显微术和射频法，如多极共振谱法。除了共聚焦和非共聚焦显微术以外，光学方法的例子是检测荧光、发光、化学发光、吸光度、光反射、透射和双折射或折射指数(如表面等离振子共振、椭圆偏光法、共振镜(resonant mirror)法、光栅耦合器波导法或干涉测量法)。
1.质谱检测在本发明的优选实施方式中，用质谱法检测WIF-1多肽，质谱法采用质谱仪检测气相离子。通常，质谱包括电离或汽化分子，在电场中加速离子，使离子通过磁场。当离子通过磁场时，离子根据其质量分离，然后进入检测器进行鉴定和分析。每个样品的质谱数据收集过程不到1分钟。
用于本发明的优选质谱技术是表面增强的激光解吸/电离(SELDI)。″SELDI″是一种气相离子谱的方法，此法中将分析物如WIF-1多肽递呈给能源的基材表面在解吸和电离过程中起积极作用。SELDI技术参见例如，美国专利号5,719,060，将其全文纳入本文作参考。美国专利号5,894,063、6,020,208、6,027,942、6,528,320，美国专利申请号2003/0091976和2002/0060290中描述了适合检测WIF-1多肽和WIF-1多核苷酸的其它质谱方法，将其全文纳入本文作参考。
用于检测WIF-1多肽的另一种优选质谱技术是上述MALDI-TOF MS。用于本发明的其它优选质谱技术是LC-ESI MS(液相色谱-电雾化电离串联质谱法)，如Song等(Anal.Chem.77(2)504-510(2005))所述。
通常使待用质谱分析的分析物如WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸(如PCR产物)与探针结合，将分析物递呈给电离源。任选使探针(如生物芯片)形成合适的形状(如正方形、矩形、圆形等)，只要它适合用于气相离子光谱仪(如可拆卸地插入到气相离子光谱仪中)。例如，探针可以是在预先确定的可寻址位置上含有一系列孔或具有其它表面形态的条形、板形或盘形。也任选探针的形状，用于气相离子光谱仪的进样系统和检测器。例如，可使探针适应于安装在可水平、垂直和/或旋转翻译的支架(carriage)中，该支架可将探针水平、垂直和/或旋转地移动到连续位置中，而无需对探针再手工定位。
在某些实施方式中，可使探针基材表面条件化，使其能结合分析物。例如，可(如用化学方法或机械方法如粗糙法)使探针基材表面条件化而能将吸附物加在其表面上。吸附物包含能与分析物如WIF-1多肽结合的官能团。在一些实施方式中，也可使基材本身具有吸附物特性，可被认为是吸附物的一部分(参见例如，美国专利申请号2003/0091976)。
可将吸附物以连续或不连续的模式加在探针基材上。如果是连续模式，可将一种或多种吸附物加在基材表面上。如果采用多种类型的吸附物，可涂布该基材表面，从而形成一维或二维梯度不同的一种或多种结合特征。如果是不连续模式，可将多种吸附物加在基材表面上预先确定的可寻址位置或特征表面(如可用质谱仪的激光束寻址)中。探针或生物芯片的特征表面包括各种实施方式。例如，生物芯片任选地包括多种特征表面，如排列成直线、正交阵列、圆或n边多边形(其中n是三或更大)。多种特征表面一般包括逻辑或空间阵列。多种特征表面各自任选地包含相同或不同的吸附物，或吸附物的一种或多种组合。例如，多种特征表面的至少两种任选包括相同或不同的吸附物，或吸附物的一种或多种组合。合适的吸附物参见例如，美国专利申请号2003/0091976所述。
探针基材可用任何合适材料制成。探针基材优选用能够支撑吸附物的材料制成。例如，探针基材可包括但不限于绝缘材料(如塑料、陶瓷、玻璃等)、磁性材料、半导体材料(如硅片)或导电性材料(如金属，如镍、黄铜、钢、铝、金、类金属、合金或导电性聚合物)、聚合物、有机聚合物、导电聚合物、生物聚合物、天然生物聚合物、用有机聚合物涂布的金属、合成聚合物、复合材料或它们的任何组合。探针基材也任选为固体或多孔性材料。
根据基材和/或吸附物的选择任选用合适方法产生探针。例如，可用能够衍生金属表面的材料涂布金属基材表面。更具体说，可用氧化硅、氧化钛或金涂布金属表面。然后，可用双功能接头衍生该表面，双功能接头的一端可以共价连接于表面上的官能团，另一端还可用起吸附物作用的基团衍生。在另一例子中，可化学修饰晶体硅产生的多孔性硅表面，使其包含用于结合分析物的吸附物。在又一例子中，可通过单体溶液的原位聚合在基材表面上直接形成含水凝胶主链的吸附物，所述单体溶液包括例如，包含所选官能团作为吸附基团的取代的丙烯酰胺单体或其衍生物。例如，美国专利号5,617,060、5,894,063、6,020,208、6,027,942、6,528,320、WO 98/59360以及美国专利申请号2003/0091976和2002/0060290中描述了适合用于本发明的探针，将其全文纳入本文作参考。
2.WIF-1抗体的产生和免疫学检测也可用抗体检测WIF-1。WIF-1抗体可购得(如Santa Cruz Biotechnology)或可用熟知技术产生(参见例如，Harlow和Lane，《抗体实验室手册》((AntibodiesALaboratory Manual)(1988)和Harlow和Lane，《抗体应用》(Using Antibodies)(1999)；Coligan，《免疫学当前方案》(Current Protocols in Immunology)(1991)；Goding，《单克隆抗体原理和实践》(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice)(第2版，1986)；和Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))。这些技术包括通过选择噬菌体或相似载体的重组抗体文库中的抗体制备抗体，以及通过免疫兔或小鼠制备多克隆和单克隆抗体(参见例如，Huse等，Science 2461275-1281(1989)；Ward等，Nature341544-546(1989))。这种抗体一般用于(例如)检测肺癌或乳腺癌中的诊断或预后应用。
可用WIF-1或其片段产生能与WIF-1特异性反应的抗体。例如，如本文所述分离重组WIF-1或其抗原性片段。重组蛋白是产生单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。或者，可采用衍生自本文所述序列并偶联有载体蛋白的合成肽作为免疫原。也可采用纯化或不纯形式的天然产生的蛋白质。然后，将该产物注射入能够产生抗体的动物体内。可产生单克隆或多克隆抗体，随后用于免疫试验以测定此蛋白质。
一般选择滴度为104或更高的多克隆抗血清，采用竞争性结合免疫试验测试它们与非WIF-1蛋白或其它生物的其它相关蛋白的交叉反应。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体的结合常数Kd通常至少约为0.1mM，更通常至少约为1μM，任选地至少约为0.1μM或更好，任选0.01μM或更好。在交叉反应测定中，竞争性结合免疫试验中一般采用经过免疫吸附的抗血清来比较第二种蛋白与WIF-1蛋白。为了进行此比较，在宽泛的浓度范围中分别测定这两种蛋白，分别测定能抑制50％抗血清与固定蛋白质结合所需的两种蛋白的用量。如果抑制50％结合所需第二种蛋白的用量比抑制50％结合所需抗原性WIF-1蛋白的用量小十倍，那么称第二种蛋白能特异性结合用WIF-1免疫原所产生的多克隆抗体。
一旦获得WIF-1特异性抗体后，可用各种免疫试验方法测定与WIF-1的结合反应。免疫学和免疫试验步骤的综述参见《基础和临床免疫学》(Basic and ClinicalImmunology)(Stites和Terr编，第7版，1991)。而且，可以几种形式进行本发明免疫试验，《酶免疫试验》(Enzyme Immunoassay)(Maggio编，1980)；和Harlow和Lane，同上)中对其进行广泛综述。
免疫试验也常常采用能特异性结合和标记抗体和抗原形成的复合物的标记物。标记物本身可以是含抗体/抗原复合物的部分之一。因此，标记物可以是标记的WIF-1多肽或标记的抗WIF-1抗体。或者，标记物可以是第三种分子，如特异性结合抗体/抗原复合物的第二抗体(第二抗体一般对产生第一抗体的动物的抗体特异)。能特异性结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白质，如蛋白A或蛋白G也可用作标记物。这些蛋白对多种动物的免疫球蛋白恒定区具有强烈的非免疫原性反应性(参见例如，Kronval等，J.Immunol.1111401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.1352589-2542(1985))。可用可检测分子如生物素修饰该标记物，从而使另一种分子如链霉抗生物素蛋白可特异性结合该检测分子。本领域技术人员熟知各种可检测分子。
常用试验包括非竞争性试验如夹心试验，和竞争性试验。在竞争性试验中，通过测定样品中存在的未知WIF-1取代(竞争掉)抗WIF-1抗体上加入的(外源性)已知量WIF-1，间接测定样品中存在的WIF-1量。常用试验形式包括免疫印迹，可用其检测和定量样品中蛋白质的存在。其它试验形式包括脂质体免疫试验(LIA)，该试验采用的脂质体经设计能结合特定分子(如抗体)并释放包裹的试剂或标记。然后，按照标准技术检测释放的化学物质(参见Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41(1986))。
此试验中所用的具体标记或可检测基团不是本发明的重要方面，只要其不显著干扰实验所用抗体的特异性结合。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的任何物质。免疫试验领域已开发出这种可检测标记，通常，用于这种方法的大多数标记可应用于本发明。因此，标记是可用分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。可用于本发明的标记物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素黄、得克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和常用于ELISA的其它酶)和发色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。
可根据本领域熟知方法将标记物直接或间接偶联于所需试验组分。如上所述，可采用各种标记，根据所需灵敏度、易于与化合物偶联、稳定性要求、可用设备和处理规定选择标记物。
常用间接方式连接非放射性标记。通常，将配体分子(如生物素)共价结合于该分子。然后，使配体结合于另一分子(如链霉抗生物素蛋白)，该分子本身可被检测或将其共价结合于信号系统，如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。可与能识别WIF-1的抗体或识别抗WIF-1抗体的第二抗体适当组合使用所述配体和其靶分子。
也可将所述分子直接偶联于能产生信号的化合物，如与酶或荧光团偶联。用作标记物的感兴趣酶主要是水解酶，具体是磷酸酶、酯酶和糖苷酶；或者氧化酶，具体是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素黄及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢酞嗪二酮，如鲁米诺。可采用的各种标记或信号发生系统的综述参见美国专利号4,391,904。
本领域技术人员熟知检测标记的方法。因此，例如，当标记是放射性标记时，检测方法包括闪烁计数或照相胶片(如放射性自显影)。当标记是荧光标记时，可通过合适波长的光激发荧光团并检测阐述的荧光来检测标记。可通过以下方法检测荧光目测、照相胶片、采用电子检测器如电荷耦合装置(CCD)或光电倍增器等。相似地，可通过提供合适的酶底物并检测得到的反应产物检测酶标记。最后，可通过简单地观察与标记相关的颜色来检测简单的发色标记。因此，在各种沾棒试验(dipstick assay)中，偶联金常呈粉红色，而各种偶联珠呈现珠的颜色。
一些试验形式不需要采用标记组分。例如，可用凝集试验检测靶抗体的存在。在这种情况下，抗原包被的颗粒被包含靶抗体的样品凝集。在这种形式中，不需要标记任何组分，可通过简单的目测检测靶抗体的存在。
V.鉴定WIF-1的激活物WIF-1激活物，即WIF-1多肽或多核苷酸表达的激活物可用于治疗癌症，如肺癌或乳腺癌。可用各种方法检测能激活WIF-1的物质。能激活WIF-1的物质包括能激活增强WIF-1活性的化合物以及能增加WIF-1表达的物质，包括能减少WIF-1启动子甲基化的去甲基制剂。
经测试可作为WIF-1激活物的物质可以是小分子化合物或生物分子，如蛋白质、糖、核酸或脂质。测试化合物一般是小化学分子和肽。基本上任何化合物都可用作本发明试验中的潜在激活物，但采用可溶解于水溶液或有机溶液(尤其是DMSO有机溶液)的最常见的化合物。
A.大规模和高通量筛选设计了可用自动化试验步骤和任何方便来源的化合物平行运行的试验(如在机器人试验微量滴定板上进行的微量滴定形式试验)来筛选大化合物文库。
在一些实施方式中，高通量筛选法包括提供含有大量潜在治疗化合物(潜在的调节剂化合物)的组合化学文库或肽文库。然后，如本文所述，在一个或多个试验中筛选这种“组合化学文库”或“配体文库”，以鉴定显示出所需特征活性的文库成员(尤其是化学物质或亚类)。这样鉴定的化合物可用作常规的“先导化合物”或其本身可用作潜在的或实际的治疗剂。
组合化学文库是通过化学合成或生物合成，通过组合许多化合物“建筑块”如试剂产生的各种化合物的集合。例如，通过以各种可能方式组合给定长度的化合物(即多肽化合物中的氨基酸数量)的一组化合物建筑块(氨基酸)形成线性组合化学文库如多肽文库。可通过这种化合物建筑块的组成性混合合成几百万化合物。
本领域技术人员熟知组合化学文库的制备和筛选。这种组合化学文库包括但不限于肽文库(参见例如，美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)和Houghton等，Nature 35484-88(1991))。也可采用产生化合物多样性文库的其它化学方法。这种化学方法包括但不限于类肽(如PCT公开号WO 91/19735)，编码肽(如PCT公开WO 93/20242)，随机生物寡聚物(如PCT公开号WO 92/00091)，苯并二氮杂(如美国专利号5,288,514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮杂和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993))，插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))，小化合物文库的类似有机合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))，寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science 2611303(1993))，和/或肽酰膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))，核酸文库(参见Ausubel等(1993)；Berger和Sambrook，同上)，肽核酸文库(参见例如，美国专利5,539,083)，抗体文库(参见例如，Vaughn等，Nature Biotechnology 14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖文库(参见例如，Liang等，Science 2741520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，小有机分子文库(参见例如，苯并二氮杂，Baum C&EN，1月18日，33页(1993)；类异戊二烯，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinone)和间噻嗪酮(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮杂，5,288,514等)。
可购得制备组合文库的装置(参见例如，357 MPS，390 MPS，Advanced ChemTech，Louisville KY；Symphony，Rainin，美国马萨诸塞州沃本；433 A AppliedBiosystems，加利福尼亚州福斯特城；9050 Plus，Millipore，马萨诸塞州贝德福德)。此外，可购得许多组合文库(参见例如，ComGenex，新泽西州普林斯顿；Tripos，Inc.，密苏里州圣路易斯；3D Pharmaceuticals，Exton，宾夕法尼亚州；Martek Biosciences，马里兰州哥伦比亚等)。
1.固相和可溶解性高通量试验在高通量试验中，可能在一天内筛选多达几千种不同的调节物或配体。具体说，可用微量滴定板的各孔对所选潜在调节物进行独立试验，或者，如果要观察浓度或培育时间的作用，可用每5-10孔测试一种调节物。因此，一块标准的微量滴定板可测定约100(如96)种调节物。如果采用1536孔板，那么一块板可容易地测定约100-1500种不同化合物。每天可测定几块不同的板；可用本发明集成系统筛选多达约6,000-20,000或更多种不同化合物。此外，可采用微流体方法操作试剂。
B.筛选WIF-1激活物的方法1.WIF-1活性WIF-1和其等位基因和多态性变体具有抑制Wnt信号转导的作用。因此，可用各种终点确定WIF-1活性。它们包括但不限于测定WIF-1与Frizzled受体的结合。而且，也可用细胞生长和/或凋亡评价WIF-1活性。本领域熟知进行这些试验的方法(参见例如，Masuhara等，Biochem.Biophys.Res.Commun.239439-446(1997)；Minamoto等，Biochem.Biophys.Res.Commun.23779-83，(1997))。
在一个实施方式中，可通过测定细胞活力确定WIF-1活性。可通过测定许多不同的终点评价细胞活力，包括胞质酶水平、细胞对染料的通透性、DNA片段化、释放放射性同位素标记如51Cr或其它形式。一般用适合高通量筛选形式的试验，如比色或荧光活力试验测定细胞活力。例如，在Alamar蓝(AB)试验中加入了在代谢活性的反应中能改变颜色或荧光的氧化还原指示剂。在存在活细胞而非死细胞时Alamar蓝发荧光。可用微孔板或流式细胞术方便地读取这种试验的结果。也可方便地以高通量形式应用比色试验如MTT试验，测定细胞活力和增殖，MTT试验测定MTT(3-(4，5-二甲基)噻唑-2-基-2，5-二苯基溴化四唑)还原为甲 也可采用测定细胞数量的其它试验。这些试验包括测定染料嵌入细胞DNA中的试验。嵌入染料的量与细胞数量成正比。例如，可用染料如Hoechst 33342染细胞，该染料能嵌入活细胞的DNA中，通过测定荧光量确定细胞数量。也可直接计细胞数。
将可能的WIF-1激活物处理的样品或试验结果与未经测试化合物处理的对照样品作比较，以检测调节程度。将对照样品(未经激活物处理)的相对WIF-1活性值设定为100。当与对照相比WIF-1的活性值为110％，任选150％、200％、300％、400％、500％或1000-2000％时即实现WIF-1的活化。
2.表达试验也提供了筛选能提高WIF-1表达的化合物的试验。筛选方法通常包括进行细胞试验，该试验中使测试化合物与能表达WIF-1的一种或多种细胞接触，然后检测WIF-1表达(转录或翻译产物)的增加。可用表达WIF-1的任何细胞进行此试验。
可用多种不同方法检测WIF-l表达。如上所述，可用能与WIF-1转录物(或其衍生的互补核酸)特异性杂交的探针检测细胞中表达的mRNA来测定细胞中WIF-1的表达水平。可通过以下步骤进行检测裂解细胞和进行Northern印迹，或者不裂解细胞采用原位杂交技术。或者，可用免疫方法检测WIF-1e蛋白，此法中用特异性结合于WIF-1的抗体检测细胞裂解物。
其它基于细胞的试验包括报道物试验，用标准的报道基因试验对细胞进行该试验。可在表达或不表达WIF-1的细胞中进行这些试验。用异源核酸构建物进行这些试验中的一些试验，所述构建物包含操作性连接于编码可检测产物的报道基因的WIF-1启动子。可采用许多不同的报道基因。一些报道物本身是可检测的。这种报道物的例子是能发射可用荧光检测器检测的荧光的绿色荧光蛋白。其它报道基因能产生可检测产物。这种报道物常常是酶。示范性酶报道物包括但不限于CAT(氯霉素乙酰基转移酶；Alton和Vapnek，Nature 282864-869(1979))、荧光素酶、 -半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(Toh等，Eur.J.Biochem.182231-238(1980)；和Hall等，J.MoI.Appl.Gen.2101(1983))。
在这些试验中，使含有报道构建物的细胞与测试化合物接触。通过检测可检测报道物的水平监测受调节启动子的表达。此试验可鉴定许多不同类型的WIF-1激活物。例如，可通过结合启动子而抑制该启动子、通过结合转录因子或其它调节因子而抑制该启动子、结合其启动子或引发级联反应产生抑制该启动子的分子来鉴定受试化合物。相似地，也可(如)通过结合启动子而激活该启动子、通过结合转录因子或其它调节因子而激活该启动子、结合其启动子或引发级联反应产生激活该启动子的分子来鉴定受试化合物。
可将表达水平或活性水平与基线值相比较。基线值可以是对照样品的值或代表对照群体(如本文所述贫乏(lean)个体)或细胞(如未接触WIF-1调节物的组织培养细胞)WIF-1表达水平的统计值。也可测定不表达WIF-1的细胞(作为阴性对照)的表达水平。此外，这种细胞与受试细胞在遗传上基本相同。
可进行各种对照(测定)以保证观察到的活性是真实的，包括用缺乏报道构建物的细胞进行平行反应或不使含有报道构建物的细胞与受试化合物接触。也可如下所述进一步验证这些化合物。
化合物可通过各种机制提高WIF-1的表达。例如，在一个实施方式中，化合物可通过降低WIF-1启动子的甲基化增加表达。这种化合物包括可引入细胞的甲基化抑制剂如5-氮胞苷等。
3.增加WIF-1活性的核酸在本发明的一个方面，WIF-1激活物也可包含表达WIF-1或WIF-1多肽的核酸分子，如包含本文鉴定的Wnt-结合域的核酸分子。可用常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法将编码WIF-1的核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸露的核酸和与递送载体如脂质体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在递送给细胞后它们具有游离的或整合的基因组。基因治疗方法的综述参见Anderson，Science 256808-813(1992)；Nabel和Feigner，TIBTECH 11211-217(1993)；Mitani和Caskey，TIBTECH 11162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11167-175(1993)；Miller，Nature 357455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology6(10)1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience835-36(1995)；Kremer和Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)31-44(1995)；Haddada等，《当今微生物学和免疫学论题》(Current Topics in Microbiology andImmunology)Doerfler和Bhm(编)(1995)；和Yu等，Gene Therapy 113-26(1994)。
a)非病毒递送方法编码本发明工程改造多肽的核酸的非病毒递送方法包括脂转染(lipofection)、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质核酸偶合体、裸DNA、人造病毒粒子以及DNA摄取增强剂。例如，在美国专利5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述了脂转染，并且可购得脂转染试剂(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner在WO 91/17424和WO 91/16024所述的那些物质。可以向细胞(离体给药)或靶组织(体内给药)递送。
本领域技术人员熟知包含靶向脂质体如免疫脂质复合物的脂质核酸复合物的制备方法(参见例如Crystal，Science 270404-410(1995)；Blaese等，Cancer Gene Ther.2291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5382-389(1994)；Remy等，BioconjugateChem.5647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy 2710-722(1995)；Ahmad等，CancerRes.524817-4820(1992)；美国专利4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
b)病毒递送方法使用RNA或DNA病毒系统来递送WIF-1核酸是本领域内已知的。常规病毒系统包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒以及单纯疱疹病毒载体。
在许多基因治疗应用中，希望基因治疗载体以高特异性递送到特定组织类型(例如肺组织或乳腺组织)中。可改造病毒载体使之表达的配体成为与病毒外表面上病毒包膜蛋白相融合的蛋白质而对给定的细胞类型具有特异性。选择与已知存在于感兴趣细胞类型上的受体具有亲和力的配体。例如，Han等在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A929747-9751(1995)中报道了可改造莫罗尼小鼠白血病病毒使其表达与gp70融合的人本调蛋白(heregulin)，并且重组病毒能感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。可将这一原理延伸到其它配对的表达配体融合蛋白的病毒和表达受体的靶细胞。例如，可以改造丝状噬菌体使其展示对所选细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如Fab或Fv)。虽然以上描述主要用于病毒载体，但可将同样的原理用于非病毒载体。可以改造这样的载体，使其包含认为有助于被特定靶细胞摄取的特定摄取序列。
可以通过给予患者个体、一般通过全身给药(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部应用(如下所述)体内递送基因治疗载体。另外，可将载体递送给离体细胞，如从患者个体取出的细胞。
本领域技术人员熟知用于诊断、研究或基因治疗的离体细胞转染方法(例如，通过将转染细胞重新输入宿主生物体)。在一些实施方式中，分离对象生物体的细胞，用WIF-1核酸转染后再输回该对象生物体(例如患者)。本领域技术人员熟知适于离体转染的多种细胞类型(参见，例如Freshney等，《动物细胞培养基础技术手册》(Cultureof Animal Cells，A Manual of Basic Technique)，第3版，1994))以及其中说明如何分离并培养患者细胞所引用的参考文献)。
也可将含治疗性核酸的载体(如逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)直接给予生物体，用于体内细胞转导。另外，可以给予裸DNA。通过常用途径之一给予导入分子使其与血液或组织细胞最终接触。本领域技术人员可以获得并且熟知给予这种核酸的适当方法，虽然可用一种以上的途径给予特定组合物，但常常是某特定途径比其他途径提供更快捷、更有效的反应。
药学上可接受的的运载体部分取决于所给予的特定组合物以及用于给予该组合物的特定方法。因此，如下所述，本发明药物组合物有多种合适剂型(参见例如，《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第17版，1989))。
VI.药物组合物本发明提供了用于治疗WIF-1表达下调癌症的药物组合物。这种药物组合物包含例如WIF-1多肽、WIF-1类似物、WIF-1模拟物、WIF-1相关多肽；上述物质的抗体；编码WIF-1多肽、WIF-1类似物、WIF-1模拟物、WIF-1相关多肽的多核苷酸；WIF-1表达的激活物；或WIF-1活性调节物。
在本发明的优选实施方式中，用于治疗WIF-1表达下调的癌症的药物组合物包含(i)编码WIF-1多肽的多核苷酸和(ii)药学上可接受的运载体。在本发明的优选实施方式中，该多核苷酸编码SEQ ID NO2的WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，该多核苷酸编码SEQ ID NO14的WIF-1多肽。在本发明又一实施方式中，该多核苷酸编码SEQ ID NO15的WIF-1多肽。在本发明另一实施方式中，该多核苷酸编码SEQ ID NO16的WIF-1多肽。在优选实施方式中，该多核苷酸编码包含SEQ ID NO2的氨基酸残基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽。
在本发明的另一优选实施方式中，用于治疗WIF-1表达下调癌症的药物组合物包含(i)WIF-1多肽和(ii)药学上可接受的运载体。在本发明的优选实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO14的氨基酸序列。在本发明的另一优选实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO15的氨基酸序列。在本发明又一实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO16的氨基酸序列。在优选实施方式中，WIF-1多肽是包含SEQ ID NO2的氨基酸残基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽。
A.给予药物组合物可将包含WIF-1激活物、WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸的药物组合物给予患者，以治疗癌症，如肺癌或乳腺癌。如下所详述，激活物可以任何适当形式、任选地与药学上可接受的运载体一起给予。
可将治疗有效剂量的经鉴定的激活物给予患者，以预防、治疗或控制癌症。可将所述化合物给予患者，其用量足以引发患者的有效治疗反应。有效治疗反应是至少部分阻滞或减缓疾病的症状或并发症的反应。将足够达到此目的的用量定义为“治疗有效剂量”。该剂量取决于所用具体WIF-1激活物的功效和对象的病况，以及待治疗患者的体重和体表面积。该剂量的大小也取决于具体对象的具体化合物或载体所伴有的副作用性质和程度。
可在细胞培养物或实验动物中用标准药学方法，例如测定LD50(导致50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)测定所述化合物的毒性和疗效。毒性和疗效之间的剂量之比是治疗指数，可用LD50/ED50比值表示。优选治疗指数大的化合物。虽然可采用具有有毒副作用的化合物，但应小心设计使这种化合物靶向患病组织部位的递送系统，以最大程度降低对正常细胞的可能损伤，从而减少副作用。
可利用获自细胞培养试验和动物研究的数据制订用于人的剂量范围。这种化合物的剂量的循环浓度优选在包括毒性很小或没有毒性的ED50范围内。剂量可根据所用剂型和给药途径在此范围内变化。对用于本发明方法的化合物而言，一开始时可从细胞培养试验估计治疗有效剂量。可在动物模型中确定剂量，以获得循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养中测定的IC50(实现症状半数最大抑制的受试化合物浓度)。可利用这些信息更准确地确定人用剂量。可通过(例如)高效液相色谱(HPLC)测定血浆水平。通常，一般对象的调节物剂量相当于约1ng/kg-10mg/kg。
可用一种或多种生理学可接受的运载体或赋形剂，以标准技术配制本发明所用药物组合物。可配制所述化合物及其生理学上可接受的盐和溶剂合物，经任何适当途径给药，包括吸入、局部、经鼻、口服、胃肠道外(如静脉内、腹膜内、膀胱内或鞘内)或经直肠给药。
对于口服给药，药物组合物可采取(例如)用药学上可接受的赋形剂以常规方法制备的片剂或胶囊形式，赋形剂包括粘合剂，例如预胶凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素；填充剂，例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅；崩解剂，例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠；或湿润剂，例如十二烷硫酸钠。片剂可用本领域熟知的方法包衣。用于口服给药的液体制剂可采取(例如)溶液、糖浆或悬液形式，或者，可以是临用前用水或其它合适运载体重建的干燥产品。可用药学上可接受的添加剂以常规方法制备这种液体制剂，添加剂例如有悬浮剂，如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪；乳化剂，如卵磷脂或阿拉伯树胶；非水性运载体，例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油；和防腐剂，如甲基或丙基-对羟基苯甲酸酯或山梨酸。制剂也可适当地含有缓冲盐、调味剂、色素和/或甜味剂。如果需要，可适当配制口服给药制剂，以控制释放活性化合物。
对于吸入给药，可由加压包或喷雾器以气溶胶喷雾递呈形式方便地递送这些化合物，加压包或喷雾器中采用合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体。就加压气雾剂而言，可通过提供阀门确定剂量单位，以递送计量的药物。用于吸入器或吹药器的(例如)明胶胶囊或药筒可含有所述化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可将所述化合物配制成通过注射，如推注或连续输注的胃肠道外给药剂型。注射剂可以是装在(例如)安瓿或多剂量容器中的添加有防腐剂的单位剂型。所述组合物可采取用油或水运载体配制的悬液、溶液或乳液形式，并可含有配方试剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，临用前用合适的运载体，如无菌无热原水重建。
也可将所述化合物配制成直肠给药组合物，如栓剂或保留灌肠剂，其(例如)含有常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯。
而且，可将所述化合物配制成长效制剂。可通过植入(如皮下或肌肉内)或肌肉内注射给予这种长效制剂。因此，例如，可用合适的聚合材料或疏水材料(例如作为用可接受油配的乳剂)或离子交换树脂配制所述化合物，或配制成微溶衍生物如微溶盐。
如果需要，可在包装或分配装置中提供所述组合物，这种包装或分配装置可装入一个或多个含活性成分的单位剂型。所述药包可(例如)包含金属或塑料箔片，例如，起泡包装。所述包装或分配装置可附有给药说明书。
VII.治疗癌症的方法用于治疗WIF-1下调癌症和诱导WIF-1下调的细胞凋亡的本发明方法部分基于以下发现，即正常细胞表达的WIF-1在人癌细胞中低表达。WIF-1低表达和可用本发明方法治疗的癌症包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、结肠癌、间皮瘤、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肝细胞癌、脑肿瘤、阴道或睾丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、胶质瘤和成胶质细胞瘤。癌症优选是肺癌、肝细胞癌、结直肠癌或黑色素瘤。
本发明提供治疗或预防WIF-1表达下调癌症的方法。此方法包括给予患者药物组合物的步骤。所述药物组合物包含例如，WIF-1多肽、WIF-1类似物、WIF-1模拟物、WIF-1相关多肽；上述物质的抗体；编码WIF-1多肽、WIF-1类似物、WIF-1模拟物、WIF-1相关多肽的多核苷酸；WIF-1表达激活物；或WIF-1活性调节物。本发明药物组合物可单独给予或与一种或多种其它治疗化合物或疗法联合给予。这种治疗化合物或疗法的例子包括但不限于泰素、环磷酰胺、他莫昔芬、氟尿嘧啶和多柔比星。
治疗癌症的方法可任选地包括一个或多个下述步骤获得个体的组织或体液生物样品；筛检该生物样品中WIF-1多肽的表达，例如将该生物样品与WIF-1抗体接触；或筛检该生物样品中WIF-1多核苷酸的表达，例如检测WIF-1 mRNA。
A.抑制细胞增殖可以各种方式使用本发明WIF-1多肽。在本发明的优选实施方式中，提供了抑制WIF-1低表达细胞增殖的方法。“增殖”指细胞生长、细胞繁殖或倍增或者病理性囊肿(morbid cyst)。低表达的WIF-1可以是WIF-1多肽或WIF-1 mRNA。此方法包括使细胞与WIF-1多肽接触的步骤，所述多肽的用量能有效抑制细胞增殖。用WIF-1多肽，优选本发明WIF-1亚域多肽来抑制细胞，优选癌细胞的增殖。
在本发明优选实施方式中，在体外实施此方法。如本文进一步所述，也可在体内实施本发明方法。
在本发明的优选实施方式中，与WIF-1多肽接触的细胞是选自下组的癌细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、结肠癌、间皮瘤、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肝细胞癌、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、胶质瘤或成胶质细胞瘤的细胞。优选的癌细胞为肺癌细胞、肝细胞癌细胞、结直肠癌细胞或黑色素瘤细胞。
在本发明的优选实施方式中，与WIF-1多肽接触的癌细胞包含本文所述的超甲基化的WIF-1启动子。通常用本文所述方法降低WIF-1启动子的甲基化后，细胞中WIF-1的表达增加。
B.抑制Wnt信号转导可以各种方式使用本发明WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，提供了本文所述抑制细胞，优选癌细胞中Wnt信号转导的方法。此方法包括将WIF-1低表达细胞与WIF-1多肽接触的步骤，所述多肽的用量能有效抑制Wnt信号转导。可用WIF-1多肽，优选本发明WIF-1亚域多肽抑制细胞，优选癌细胞中的Wnt信号转导。
C.治疗疾病可以各种方式使用本发明WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，提供了治疗WIF-1低表达相关疾病的方法。此方法包括给予对象，优选需要治疗的对象WIF-1活性多肽的步骤，所述多肽的用量能有效治疗该疾病。所述对象优选人。可用WIF-1多肽，优选本发明WIF-1亚域多肽治疗WIF-1低表达相关疾病。
在本发明的优选实施方式中，WIF-1低表达相关疾病是癌症。可用WIF-1多肽，优选本发明WIF-1亚域多肽治疗选自下组的癌症肺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、结肠癌、间皮瘤、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肝细胞癌、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、胶质瘤或成胶质细胞瘤细胞。癌症优选肺癌、肝细胞癌、结直肠癌或黑色素瘤。
D.用WIF-1多核苷酸治疗癌症的方法本发明提供治疗或预防WIF-1表达下调的各种癌症的方法。在本发明的一些方面，使细胞与能增加细胞中WIF-1表达的组合物相接触。在本发明的优选实施方式中，组合物包含编码WIF-1多肽，优选WIF-1亚域多肽的核酸。
本发明提供了编码以下物质的多核苷酸SEQ ID NO2的WIF-1多肽、SEQ IDNO14的WIF-1多肽、SEQ ID NO15的WIF-1多肽、SEQ ID NO16的WIF-1多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸残基1-180的WIF-1亚域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-180的WIF-1亚域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-176的WIF-1亚域多肽或包含SEQ ID NO2氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽。
在本发明其它优选实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1的核苷酸序列、SEQ ID NO17的核苷酸序列、SEQ ID NO18的核苷酸序列或SEQ ID NO19的核苷酸序列。可由SEQ ID NO1推断出编码包含下述WIF-1亚域多肽的核苷酸序列SEQ ID NO2的氨基酸残基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸残基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸残基39-176。
在本发明的优选实施方式中，治疗癌症的方法包括给予诊断患有癌症的患者治疗有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含(i)编码WIF-1多肽的多核苷酸和(ii)药学上可接受的运载体。
在此方法的优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO2的WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO14的WIF-1多肽。在本发明又一优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO15的WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO16的WIF-1多肽。其它优选的多核苷酸编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基1-180的WIF-1亚域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-1 80的WIF-1亚域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-176的WIF-1亚域多肽或包含SEQ ID NO2氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽。
在本发明的另一优选实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1。在其它优选实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基1-180的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列、编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-180的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列、编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-176的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列或编码包含SEQID NO2氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列。
给予包含编码WIF-1多肽的多核苷酸的药物组合物的方式和时间安排对本发明不重要。可以本文所述的各种方式将该药物组合物给予患者。在此方法的优选方面，将包含编码WIF-1多肽的多核苷酸的药物组合物注射到肿瘤附近。另一方面，将该药物组合物直接注射入肿瘤中。监测癌症过程(如根据肿瘤大小确定癌症是否消退)时，本领域治疗医师将确定药物组合物的注射进行一次或在适当时间后重复注射。可以每日注射。
E.用WIF-1多肽治疗癌症的方法本发明提供治疗或预防WIF-1表达下调各种癌症的方法。在本发明优选实施方式中，此方法包括给予诊断患有癌症的患者治疗有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含(i)WIF-1多肽和(ii)药学上可接受的运载体。
在此方法的优选实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO14的氨基酸序列。在本发明的另一优选实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO15的氨基酸序列。在本发明的其它实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO16的氨基酸序列。其它优选WIF-1多肽是包含SEQ ID NO2氨基酸残基1-180、SEQ IDNO2氨基酸残基29-180、SEQ ID NO2氨基酸残基29-176或SEQ ID NO2氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽。
给予包含WIF-1多肽的药物组合物的方式和时间安排对本发明不重要。可以本文所述的各种方式将该药物组合物给予患者。在优选方面，将包含WIF-1多肽的药物组合物注射到肿瘤附近。另一方面，将该药物组合物直接注射入肿瘤中。监测癌症过程(如根据肿瘤大小确定癌症是否消退)时，本领域治疗医师将确定药物组合物的注射进行一次或在适当时间后重复注射。可以每日注射。
1.WIF-1模拟物本领域技术人员也知道，可采用与WIF-1多肽、WIF-1肽或包含WIF-1的Wnt结合域的多肽结构相同的肽模拟物实施本发明方法，并可将它们包括在本发明试剂盒中。肽模拟物是结构上与某多肽充分相似，从而保留该多肽的所需性能的化合物。模拟物的基本结构常常模拟了该多肽的基本结构和/或具有该多肽的显著生物学性能。例如，WO 94/05639中描述了用作蛋白酶抑制剂的肽模拟物。WIF-1肽模拟物指能够模拟天然产生或重组WIF-1多肽生物作用的任何肽或非肽化合物。模拟物可包括但不限于(i)具有大量修饰以致于(例如)WIF-1多肽和模拟物的侧链无相似性或相似性很小(这种修饰(例如)可减少该模拟物降解)的肽；(ii)分离肽的非蛋白部分；或(iii)合成或天然的有机分子，包括核酸和通过组合化学鉴定的物质。例如，可用本领域已知的各种方法设计、选择和/或鉴定这种模拟物，所述方法包括例如，构建和筛选大的化学多样性分子文库、合成或天然的化合物文库，或通过合理、定向或随机性设计。筛选这些文库的总目的是依次应用组合选择来获得对感兴趣结合位点具有高亲和力的物质。对于定向或合理的药物设计来说，可利用WIF-1的Wnt结合域结构作为选择和设计肽模拟物的基础。例如，美国专利号6,514,729、6,627,186、6,682,923和6,746,853中也描述了肽模拟物。
F.测定癌症过程(进展、消退)癌症的阶段或严重性指指肿瘤的不同临床阶段。用医学领域已经建立的各种参数定义肿瘤的临床阶段。一些参数包括形态、肿瘤大小、肿瘤在患者体内转移的程度等。
在本发明的一个优选实施方式中，测定癌症作为确定癌症过程的一部分。因此，本发明提供了测定对象癌症过程的方法。癌症过程指癌症状态随时间的改变，包括癌症进展(恶化)和癌症消退(改善)。消退包括肿瘤缓解、肿瘤大小减小或缩小、癌细胞数量减少和前列腺癌相关的症状减轻。
G.监测给予患有WIF-1下调性癌症对象的手术或抗癌药或治疗的效果如上所述，包含WIF-1的组合物可用于治疗WIF-1表达下调的癌症。然而，其它药物，如本文所述包含WIF-1激活物的组合物也可用于治疗WIF-1表达下调癌症的患者。
在本发明的优选实施方式中，测定癌症状态作为监测手术效果(如切除肿瘤)、给予诊断患有WIF-1表达下调癌症的对象抗癌药或治疗效果的一部分。给予癌症患者手术或抗癌药或治疗的效果可以是癌症复发、癌症进展(恶化)和癌症消退(改善)。
采用本发明组合物、方法和试剂盒，在手术后多次或给予抗癌药或治疗后不同时间测定对象生物样品中的WIF-1水平。第一次(t1；如给予抗癌药或治疗之前)检测到某对象生物样品中的WIF-1水平低于第二次(t2；如给予抗癌药或治疗之后)检测同一对象同等生物样品中的WIF-1水平时，表明该对象的癌症正在消退。同样，与第一次检测到的WIF-1水平相比，第二次检测到的WIF-1水平较低，表明该对象的癌症正在进展。类似地，第一次(t1；如刚刚手术后)检测到某对象生物样品中的WIF-1水平低于第二次(t2；如术后数周或数月)检测同一对象同等生物样品中的WIF-1水平时，可能表明对象的癌症没有复发。同样，与第一次检测到的Wnt2水平相比，第二次检测到的Wnt2水平较低可能表明该对象的癌症正在复发。
VIII.凋亡诱导方法凋亡在多细胞生物的发育和体内稳态中起到核心作用。可通过多种独立的信号传导途径诱导凋亡，这些途径汇合成由几种死亡受体和其配体(属于肿瘤坏死因子(TNF)受体/配体超家族)之间多种相互作用组成的最终效应物机制。表征最好的死亡受体是CD95(“Fas”)、TNFR1(p55)、死亡受体3(DR3或Apo3/TRAMO)、DR4和DR5(apo2-TRAIL-R2)。凋亡的最终效应物机制是激活称为胱冬酶的一系列蛋白酶。这些胱冬酶的活化导致一系列活细胞蛋白的切割和细胞死亡。
本发明提供了诱导WIF-1表达下调细胞凋亡的方法。在一个方面，诱导细胞凋亡的方法包括使细胞暴露于一种组合物或使细胞接触该组合物的步骤，所述组合物包含(i)编码WIF-1多肽、WIF-1类似物、WIF-1模拟物、WIF-1相关多肽、WIF-1表达激活物或WIF-1活性调节物的多核苷酸或(ii)WIF-1多肽、WIF-1类似物、WIF-1模拟物、WIF-1相关多肽、WIF-1表达激活物或WIF-1活性调节物。通常使细胞暴露或接触有效量的所述组合物。
在优选实施方式中，使细胞离体暴露于或离体接触组合物。在另一优选实施方式中，使细胞在体内暴露于或在体内接触所述组合物。
A.用WIF-1多核苷酸诱导凋亡的方法在优选实施方式中，诱导WIF-1表达下调细胞凋亡的方法包括使细胞暴露于一种组合物或使细胞接触该组合物的步骤，所述组合物包含WIF-1多核苷酸。在优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO2的WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO14的WIF-1多肽。在本发明的又一优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO15的WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO16的WIF-1多肽。其它优选的多核苷酸编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基1-180的WIF-1亚域多肽、包含SEQ IDNO2氨基酸残基29-180的WIF-1亚域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-176的WIF-1亚域多肽或包含SEQ ID NO2氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽。
在本发明的另一优选实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1。在其它优选实施方式中，，所述多核苷酸包含SEQ ID NO17、SEQ ID NO18或SEQ ID NO19，编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基1-180的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列、编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-180的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列、编码包含SEQ ID NO2氨基酸残基29-176的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列或编码包含SEQID NO2氨基酸残基39-176的WIF-1亚域多肽的核苷酸序列。
在本发明的一个方面，用WIF-1多核苷酸在体外，如在培养细胞系中诱导凋亡。在另一优选方面，用WIF-1多核苷酸在体内，即在动物(优选哺乳动物，包括人)体内，优选癌细胞中诱导凋亡。
B.用WIF-1多肽诱导凋亡的方法可以各种方式使用本发明WIF-1多肽。在本发明的另一优选实施方式中，提供了诱导WIF-1低表达细胞，优选癌细胞凋亡的方法。此方法包括使细胞与WIF-1活性多肽接触的步骤，所述多肽的用量能有效诱导该细胞凋亡。
在此方法的优选实施方式中，WIF-1活性多肽是包含SEQ ID NO14氨基酸序列的WIF-1多肽。在此方法的另一优选实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO15的氨基酸序列。在此方法的又一优选实施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO16的氨基酸序列。在本发明的另一优选实施方式中，WIF-1活性多肽是WIF-1亚域多肽，如本文通篇所述。
在本发明的一个方面，用WIF-1多肽在体外，如在培养细胞系中诱导凋亡。在另一优选方面，用WIF-1多肽在体内，即在动物(优选哺乳动物，包括人)体内，优选癌细胞中诱导凋亡。
IX.基因治疗一方面，以基因治疗方式给予编码WIF-1多肽、WIF-1类似物、WIF-1模拟物、WIF-1相关多肽的多核苷酸；WIF-1表达激活物或WIF-1活性调节物以提高WIF-1功能。基因治疗指给予对象表达或可表达的核酸。在此实施方式中，核酸产生其编码的多肽通过提高WIF-1功能而产生疗效。
可根据本发明采用本领域已有的和本文所述的基因治疗方法。基因治疗方法的全面综述参见Goldspiel等，Clinical Pharmacy 12488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；和TIBTECH 11(5)155-215(1993年5月)。可采用的本领域众所周知的重组DNA技术方法参见Ausubel等(编)，《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，纽约(1993)；和Kriegler，《基因转移和表达，实验室手册》(Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，Stockton Press，纽约(1990)。
在一个优选方面，通过基因治疗方式提高WIF-1功能的核酸包含编码WIF-1多肽、其片段或嵌合蛋白的序列，其中所述核苷酸序列是在合适宿主中表达WIF-1多肽、其片段或嵌合蛋白的表达载体的一部分。具体说，这种核酸的启动子操作性连接于WIF-1编码区。此启动子可以是诱导型或组成型(任选为组织特异性)启动子。在另一具体实施方式
，所用核酸分子中WIF-1编码序列和其它所需序列侧接能促进在基因组所需位点上同源重组的区域，从而提供WIF-1核酸的染色体内表达(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature342435-438(1989))。
可直接将所述核酸递送给对象，在这种情况下使对象直接暴露于或接触所述核酸或携带核酸的载体；此法称为体内基因治疗。或者，可间接将核酸递送给对象，在这种情况下先用该核酸体外转化细胞，然后移植入对象体内；此方法称为离体基因治疗。
X.用于诊断和/或预后应用的试剂盒对于上述诊断、研究和治疗应用而言，本发明也可提供试剂盒。在诊断和研究应用中，所述试剂盒可装有以下一种或所有成分检测试剂、缓冲液、WIF-1多肽、WIF-1特异性核酸或抗体、杂交探针和/或引物、WIF-1表达构建物、WIF-1的小分子激活物等。治疗产品可包括无菌盐水或另一种药学上可接受的乳液和悬液基。
此外，试剂盒可装有说明材料，包括实施本发明方法的指南(即操作方案)。说明书可以各种形式在试剂盒中提供，试剂盒中可装有一种或多种形式的说明书。虽然说明材料一般包括书面或打印材料，但不限于此。能够存放此说明书并将它们传递给最终使用者的任何介质都包括在本发明中。这种媒介包括但不限于电子存储媒体(如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学媒体(如CD ROM)等。这种媒介可包括提供所述说明材料的因特网址。
本发明也提供了用于筛选WIF-1活性调节物的试剂盒。这种试剂盒可以由易于获得的材料与试剂制备。例如，这样的试剂盒可装有一种或多种以下材料WIF-1多肽或多核苷酸、反应试管以及检测WIF-1活性的说明书。该试剂盒任选装有生物活性WIF-1蛋白。可根据本发明制备各种试剂盒和组分，这取决于试剂盒的预期使用者和使用者的具体需要。
在本发明的优选实施方式中，该试剂盒是一种药盒，装有含以下组分的药物组合物(i)编码WIF-1多肽的多核苷酸和(ii)药学上可接受的运载体。在本发明的另一优选实施方式中，该试剂盒是药盒，装有含以下组分的药物组合物(i)WIF-1多肽，优选WIF-1亚域多肽和(ii)药学上可接受的运载体。药盒任选装有说明该药物组合物可以或应该用于治疗WIF-1表达下调的癌症的说明书。
本发明试剂盒还可装有进行质谱所需的试剂。本领域技术人员熟知这种试剂，包括例如探针或芯片。
本发明的其它试剂盒实施方式包括能使本领域普通技术人员实施本文所述方法变型的任选功能组分。
虽然为了阐明和理解以描述和举例方式详细描述了上述发明，但本领域普通技术人员根据本发明内容不难明白，可以对其进行某些改变、更改、修饰和等价物取代，而这不背离本发明构思和范围。因此，本文所述实施方式涉及各种修饰、改变等，而本发明范围仅由所附权利要求书决定。本领域技术人员不难认识到，可改变、修改或修饰各种非关键性参数，而能产生基本相似的结果。
虽然本文所述的本发明各部分内容都含有多种实施方式，但是应理解，除非另有说明，本发明给定部分的各实施方式能够与本发明其它部分的各实施方式一起应用，这些应用各自形成本发明的独特实施方式。
将本说明书引用的所有发表物、专利和专利申请全文纳入本文作参考，就像特别和个别地将各发表物、专利和专利申请纳入作参考那样。
如从上述公开内容所理解的那样，本发明有各种应用。还通过以下实施例进一步说明本发明，以下实施例仅为说明，不旨在以任何方式限制本发明的定义和范围。
XI.实施例实施例1总方法A.细胞系和组织样品NSCLC细胞系(NCI-H1703、NCI-H460、NCI-H838和NCI-A549)、黑色素瘤细胞系LOX、肝细胞癌细胞系SNU398和结直肠癌细胞系HCT116获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，在补充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640中培养。正常人小呼吸道上皮细胞(SAEC)和支气管上皮细胞(NHBE，16HBE)(原代培养物)获自Cambrex Bio ScienceWalkersville，Inc.(Walkersville，马里兰州)或Clonetics(Walkersville，马里兰州)，用Clonetics SAGMTMBullet试剂盒培养。在37℃、含有5％CO2的湿培养箱中培养所有细胞。
在肺癌切除术时收集患者的新鲜肺癌组织和邻近正常肺组织，立即用液氮速冻(IRB批号H8714-15319-040)。将这些组织样品保存在-170℃的液氮器中，待用。
B.克隆和序列分析为了克隆人WIF-1基因的启动子区，采用基于PCR的技术。用DNA STAT-60TM试剂(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，得克萨斯州)根据生产商方案抽提各细胞系和新鲜组织样品的基因组DNA。用甲基化试剂盒(EZ DNA甲基化试剂盒，ZymoResearch，美国加利弗尼亚州奥伦奇)对基因组DNA进行硫酸氢盐修饰。用以下两对引物扩增硫酸氢盐处理的基因组DNA5′-GAGTGATGTTTTAGGGGTTT-3′(正向)(SEQ ID NO8)和5′-CCTAAATACCAAAAAACCTAC-3′(反向)(SEQ ID NO9)(设计用于扩增WIF-1启动子区的nt-555～-140)以及5′-GTAGGTTTTTTGGTATTTAGG-3′(正向)(SEQ ID NO10)和5′-TCCATAAATACAAACTCTCCTC-3′(反向)(SEQ ID NO11)(用于扩增nt-161～+118)(WIF-1的起始密码子ATG定义为+1)。用抽提试剂盒(QIAquick凝胶抽提试剂盒，Qiagen，加利弗尼亚州巴伦西亚)提取琼脂糖凝胶中的PCR产物，然后在UCSF癌症中心(加利福尼亚州旧金山)的DNA测序中心进行测序。
用PCR产生人基因组DNA中WIF-1的5′基因组区的截短形式，将其亚克隆入pGL3Basic载体中。用凝胶纯化消化的插入物和载体，连接产生缺失构建物。通过限制性酶消化和测序核查克隆片段。
C.瞬时转染和启动子活性测定对于瞬时转染实验，在转染前24小时将细胞(2×105)接种于六孔板中。用Lipofectamine 2000介导转染，采用1.0μg pGL3Basic载体中的各启动子构建物，0.5μg pSV-β-半乳糖苷酶来校正转染效率。孵育转染细胞24小时，然后测定荧光素酶活性。在一些实验中，用细胞因子处理转染细胞6小时，然后测定荧光素酶活性。将所有荧光素酶活性按β-半乳糖苷酶活性标准化，相对于pGL3Basic空载体的基础活性(设定为一个单位)给出该活性。在用细胞因子处理细胞的实验中，相对于细胞因子处理后pGL3Basic空载体的基础活性给出标准化的荧光素酶活性。一式三份进行测定，在至少重复三次独立实验。所示数据表示平均值(+S.D.)。
D.集落形成试验在瞬时转染实验中，在转染前24小时将细胞(2×105)接种于六孔板。按照生产商方案用Lipofectamine 2000(Life Technologies)介导转染，采用5.0μg pCDNA3载体中的WIF-1 cDNA构建物，以5.0μg pCDNA3空载体作对照。转染48小时后，剥离转染细胞，接种于10厘米的细胞培养皿。然后，用G418(400μg/ml)选择细胞。集落用0.5％亚甲蓝染色，转染4周后计数。
E.条件培养基(CM)、重组蛋白和蛋白孵育用含人WIF-1开放阅读框的pcDNA3.1表达载体产生条件培养基。在一组实验中，WIF-1开放阅读框包含全长WIF-1编码区，即编码SEQ ID NO2的WIF-多肽区域。因此，切去信号肽后，纯化含SEQ ID NO2氨基酸残基29-379的重组成熟WIF-1多肽。在另一组实验中，WIF-1开放阅读框包含WIF-1亚域多肽编码区，如编码SEQ ID NO26所示WIF-多肽的区域。因此，切去信号肽后，纯化含SEQ ID NO27氨基酸序列的重组WIF-1亚域多肽。另一WIF-1亚域多肽序列见SEQ ID NO28。切去信号肽后，纯化含SEQ ID NO29氨基酸序列的重组WIF-1亚域多肽。
简要说，根据生产商方案用Lipofectamine 2000(Life Technologies)介导pcDNA3.1/myc-his中WIF-1 cDNA构建物转染之前，用无血清Freestyle 293表达培养基维持293T细胞系。制备未转染293T细胞的无血清条件培养基(对照CM)。4天和7天后收集条件培养基。离心去除收集的CM中的细胞碎片，通过离心浓缩10倍，过滤并冻存于-80℃。纯化的麦芽产生的重组人WIF-1蛋白购自Abnova Corp.(Taiwan，ROC)。在实验前一天将NSCLC细胞接种于6孔板。然后，用含有或不含各种浓度的重组人WIF-1蛋白的CM替换正常培养基，在37℃、含有5％CO2的湿培养箱中孵育细胞。一般将40μl、100μl和200μl含WIF-1多肽的CM加入细胞中。根据SDS-PAGE定量，估计加入细胞导致WIF-1多肽活性可被检测的WIF-1多肽浓度范围约为10ng/ml至500ng/ml。为了检测细菌中产生的WIF-1多肽的相似WIF-1多肽活性，将浓度高得多的WIF-1多肽加入细胞中。在一些实验中，细菌表达的WIF-1量约为500μg/ml。这相当于比哺乳动物细胞产生该蛋白所需的浓度高1000倍以上。
F.凋亡分析转染3天、5天或1周后(如上所述)，用胰酶消化收获细胞(如NSCLC细胞)，加工后，用膜联蛋白V FITC凋亡检测试剂盒(Oncogene，美国马萨诸塞州剑桥市；Apotarget，BioSource Intemational)根据生产商方案测定细胞表面膜联蛋白-V和碘化丙锭(PI)含量。采用膜联蛋白-V-PI双染方案，以双色流式细胞术中区分三种细胞群，(a)非凋亡细胞是膜联蛋白-V和PI阴性；(b)早期凋亡细胞，磷脂酰丝氨酸外露但细胞膜仍然完整，能结合膜联蛋白V-FITC但排斥碘化丙锭；(c)坏死细胞或晚期凋亡细胞被膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭双标记。立即用流式细胞术分析染色细胞(FACScan；Decton Dickinson，Franklin Lake，新泽西州)。
G.半定量RT-PCR用抽提试剂盒(RNeasy小抽试剂盒，Qiagen，美国加利福尼亚州巴伦西亚)分离肺癌细胞系、新鲜肺癌和配对的相邻正常组织的总RNA。在GeneAmp PCR系统9700中用Life Technologies Inc.的一步RT-PCR试剂盒根据生产商方案进行RT-PCR。RT-PCR引物获自Operon Technologies Inc.(美国加利福尼亚州阿拉米达)。人WIF-1cDNA的引物序列是5′-CCGAAATGGAGGCTTTTGTA-3′(正向)(SEQ ID NO12)和5′-TGGTTGAGCAGTTTGCTTTG-3′(反向)(SEQ ID NO13)。GAPDH用作内标。如以下文献所述进行5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)(Sigma，密苏里州圣路易斯)处理(Altieri，Nat.Rev.Cancer 3(1)46-54(2003)；Blanc-Brude等，Clin.Cancer Res.9(7)2683-92(2003)；Bowen等，J.Invest.Dermatol.120(1)48-55(2003)；Cong等，Mol.Cell.Biol.23(23)8462-70(2003)；Deng等，Cell 115(1)61-70(2003)；He等，Neoplasia，印刷中(2003)；Ishitani等，Mol.Cell Biol.23(1)131-9(2003)；Kawano和Kypta，J. Cell Sci.116(Pt13)2627-34(2003)；Kim等，Lancet 362(9379)205-9(2003)；Krilleke等，Int.J.Cancer 107(4)520-7(2003)；Pham等，Mol.Pathol.56(5)280-5(2003)；Soengas和Lowe，Oncogene 22(20)3138-51(2003)；Topol等，J.Cell.Biol.162(5)899-908(2003)；Uematsu等，Oncogene 22(46)7218-21(2003)；Uematsu等，Cancer Res.63(15)4547-51(2003)；Usami等，Oncogene 22(39)5978-86(2003)；Veeman等，Dev.Cell.5(3)367-77(2003)；Westfall等，J.Cell Biol.162(5)889-98；和Wong等，Mol.Cell.12(5)1251-60(2003))。
H.Western印迹采用Western印迹的标准方案。WIF-1兔多克隆抗体获自Santa CruzBiotechnology，Inc.(Santa Cruz，加利福尼亚州)。抗WIF-1、抗Dv13和抗存活蛋白抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，加利福尼亚州)。抗-人WIF-1单克隆抗体购自R&D Systems(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。抗-细胞周期蛋白D1抗体获自Oncogene(美国马萨诸塞州剑桥市)。抗-β-肌动蛋白单克隆抗体获自Cell SignalingTechnology，Inc.(美国马萨诸塞州贝弗利)。抗-β-联蛋白抗体购自TransductionLaboratories(美国肯塔基州莱克星顿)。抗-细胞色素c抗体获自BD Biosciences(加利福尼亚州圣地亚哥)。制备胞浆蛋白质。
I.甲基化特异性PCR用甲基化-特异性引物组或非甲基化-特异性引物组扩增硫酸氢盐处理的基因组DNA。实验中采用热启动Taq DNA聚合酶(Qiagen Inc.)。甲基化-特异性引物的序列是5′-GGGCGTTTTATTGGGCGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO4)和5′-AAACCAACAATCAACGAAC-3′(反向)(SEQ ID NO5)。非甲基化-特异性引物的序列是5′-GGGTGTTTTATTGGGTGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO6)和5′-AAACCAACAATCAACAAAAC-3′(反向)(SEQ ID NO7)，它们分别对应于WIF-1启动子区序列-488～-468和-310～-290。
J.WIF-1表达载体构建了几种表达载体在真核和原核细胞中表达WIF-1多肽和WIF-1亚域多肽。用标准的重组DNA技术(如Sambrook和Russell，《分子克隆，实验室手册》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)；Kriegler，《基因转移和表达实验室手册》(Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual)(1990)；和《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编，1994-1999)构建以下表达载体在真核细胞中表达WIF-1(1)pcDNA3.1-myc-his1-379，包含编码SEQ ID NO2所示WIF-1多肽的核酸；(2)pcDNA3.11-379，包含编码SEQ IDNO2所示WIF-1多肽和表达SEQ ID NO30所示WIF-1多肽(切去信号肽后)的核酸；(3)pcDNA3.11-180，包含编码SEQ ID NO26所示WIF-1多肽和表达SEQ ID NO27所示WIF-1多肽(切去信号肽后)的核酸；(4)pcDNA3.11-176，包含编码SEQ IDNO28所示WIF-1多肽和表达SEQ ID NO29所示WIF-1多肽(切去信号肽后)的核酸；和(5)腺病毒载体1-379，包含编码SEQ ID NO2所示WIF-1多肽和表达SEQID NO30所示WIF-1多肽(切去信号肽后)的核酸。对于原核细胞表达，(1)pColdI29-379，编码和表达包含序列SEQ ID NO30的His加尾WIF-1多肽和(2)pColdI29-180，编码和表达包含序列SEQ ID NO27的His加尾WIF-1多肽。
K.在细菌中表达WIF-1多肽在大肠杆菌中产生SEQ ID NO27所示WIF亚域多肽和SEQ ID NO30所示全长WIF-1多肽。将各编码区插入pColdI载体中，使WIF-1多肽与N-末端His尾一起表达，并在大肠杆菌(菌株BL21 DE3)中表达。由细菌裂解物抽提这两种蛋白，并用镍NTA柱纯化。用抗-WIF-1和抗-His抗体(R&D，Santa Cruz Biotechnology)以Western印迹证实WIF-1多肽。用SDS-PAGE凝胶(考马斯试验)和BCA蛋白质定量实验进行WIF-1多肽的定量。
L.用腺病毒载体表达WIF-1多肽将WIF-1全长多肽的编码区(SEQ ID NO2氨基酸残基1-379)克隆入腺病毒载体。用该重组腺病毒载体感染HEK-293细胞。浓缩上清(10X)，然后用抗-人WIF-1单克隆抗体(R&D)以Western印迹确认。在黑色素瘤细胞系LOX以及肺癌细胞系H460和A427(数据未显示)中观察到剂量-(200μl、100μl、40μl)和时间依赖性凋亡。通过Western分析该通路中的几种关键蛋白，如DVL-3、β-联蛋白、细胞周期蛋白D1等证实阻断了Wnt信号传导途径。
M.WIF-1蛋白质糖基化分析对WIF-1蛋白进行蛋白质糖基化分析。用GlycoProfile III试剂盒(Sigma Chemical)根据生产商说明书进行糖基化试验。在细菌产生和抽提的WIF-1蛋白(全长WIF-1多肽和WIF-1亚域多肽)或购自Abnova Biotech，Inc.的WIF-1蛋白(数据未显示)上没有检测到蛋白质糖基化。然而，由转染的293T细胞纯化的全长重组WIF-1多肽和重组WIF-1亚域多肽显示有糖基化(数据未显示)。
N.统计学分析采用Excel的非配对t检验比较不同构建物处理后的活性。
实施例2鉴定WIF-1启动子区为了鉴定WIF-1启动子，用WIF-1的1140-bp编码序列作为虚拟探针对UCSCr的人基因组数据库进行BLAST检索。用启动子检索程序证实该基因的5′区代表了启动子区典型特征。此外，用CpG岛检索程序对WIF-1启动子中的CpG岛作图(图1)。在此启动子区(WIF-1开放阅读框ATG之前的1.2kb)中鉴定到105个CpG。
实施例3含有缺失突变的人WIF-1启动子的功能分析为了研究该启动子活性，将完整1kb片段(ATG之前)以及五个截短片段克隆入无启动子的荧光素酶(LUC)表达载体pGL3Basic中。用这些构建物转染293T细胞，检测LUC活性。完整的野生型构建物(构建物1)显示出非常高的基础活性(与设定为一个单位活性的空载体相比，LUC活性增加约200倍)。
实施例4癌细胞中该启动子超甲基化下调了WIF-1表达用半定量RT-PCR检测几种正常和肿瘤细胞系中的WIF-1表达(图2A)。发现所有三种正常原代细胞培养物NHBE、16HBE和SAEC中都表达WIF-1。相反，在四株NSCLC细胞系的三株中WIF-1转录物消失或显著低表达。然后分析了这些细胞系中CpG岛的甲基化状态。用甲基化-特异性PCR(MSP)发现，经测定缺乏WIF-1表达的所有癌细胞系都是超甲基化的(图2B)。相反，在表达WIF-1的所有正常对照中没有观察到超甲基化。WIF-1在H1703细胞系中低表达程度较低，此细胞系中MSP仅部分甲基化。而且，用硫酸氢盐测序详细分析了几种细胞系中包含该启动子的-554～ATG和ATG～+118的第一外显子一部分的WIF-1的672bp片段中有60个CpG位点处于甲基化状态(图3A)。与MSP结果一致，发现在所测试的所有NSCLC细胞系中这些CpG岛被密集地甲基化。此外，发现用去甲基化试剂DAC处理缺乏WIF-1表达的这些细胞系后恢复了WIF-1表达(图3B)。正常细胞和癌细胞中WIF-1 mRNA水平下调与这些细胞中的WIF-1蛋白水平有关。发现正常原代培养细胞(NHBE、SAEC和NHEK)表达了WIF-1蛋白(图17)。然而，在人癌细胞，包括肺癌(H460、A549)、乳腺癌(MCF-7)、结肠癌(SW480)和间皮瘤(MS-I、H2052)中WIF-1蛋白低表达(图17)。这些结果证明，NSCLC细胞系中WIF-1的表达状态与WIF-1启动子区的密集CpG甲基化有关。
实施例5新鲜的人NSCLC组织样品中该启动子超甲基化导致WIF-1表达下调分析了原代NSCLC组织样品中WIF-1的表达和甲基化状态。在十八个手术切除的早期肺癌的匹配对中，发现与他们的自体正常样品相比，十五个癌症样品(83％)没有或只有少量WIF-1 mRNA(图4A)。采用MSP，在缺乏WIF-1表达的所有肿瘤样品中发现异常甲基化，但在其匹配的正常样品中没有发现异常甲基化(图4B)。在可获得RNA和硫酸氢盐-处理的基因组DNA的8个病例(患者6、7、9、10、11、12、15、18)中证明了这种相关性。此外，在8个其它匹配样品(患者19～26)中进行MSP，其中7个样品发现了甲基化证据。可能由于非癌样品中不可避免的癌细胞污染或肿瘤周围正常组织的恶变前改变，在几个病例中，分别在正常和肿瘤组织中观察到轻微甲基化条带和未甲基化的条带。这些数据证明，WIF-1的沉默与原代NSCLC组织样品中该启动子的超甲基化有关。此外，分析了许多样品经硫酸氢盐处理后WIF-1启动子区的序列。在这些CpG位点中检测到密集甲基化(图4C)。总之，WIF-1在NSCLC中常常下调，此下调与该启动子超甲基化有关。
实施例6恢复WIF-1诱导凋亡性细胞死亡证明了恢复WIF-1可引起因启动子超甲基化造成WIF-1基因下调肺癌细胞系的生长抑制。转染和随后的药物选择一周后，发现与空载体转染的对照转染物相比，WIF-1转染的H460、A549 MS1、SW480、H28和MCF7细胞中活细胞数显著减少(P＜0.005)(图5)。流式细胞术分析显示，WIF-1甲基化-沉默的WIF-1转染的H460、A549和H28细胞中凋亡诱导水平(转染1周后约57-70％)显著高于空载体转染的H460、A549和H28细胞(转染1周后约12-26％)(P＜0.005)(图5)。此结果证明，在H460、A549和H28细胞中恢复WIF-1表达能通过诱导凋亡抑制细胞生长。选择药物抗性集落4周后，发现与空载体转染的细胞相比，WIF-1转染细胞的集落数量减少(P＜0.005)。
已知WIF-1能结合Wnt蛋白抑制其活性(Hsieh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(7)3546-51(1999))。近年来，Wissman等报道了用微阵列分析几种人癌中WIF-1的下调，后来用免疫组化在60％乳腺癌和75％肺癌中证实此下调。在本申请中，报道了在NSCLC细胞系中WIF-1转录水平下调。而且已发现，与正常组织相比，WIF-1在83％新鲜NSCLC手术样品中也下调。WIF-1沉默与癌细胞系和人NSCLC原代组织中其启动子超甲基化有关。
我们提出，NSCLC中是通过外遗调节使WIF-1下调，类似于先前对结直肠癌中sFRP的报道。值得注意的是，WIF-1与Fz或sFRP的CRD结构域没有任何序列相似性(Bui等，Oncogene 14(10)1249-53(1997)；Melkonyan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(25)13636-41(1997)；Shimizu等，Cell Growth Differ.8(12)1349-58(1997)；Todd等，Cancer Res.57(7)1344-52(1997))。WIF-1含有Wnt结合域和五个表皮生长因子样重复序列。它可在胞外空间结合于XWnt-8和果蝇Wg，并且抑制XWnt-8-Dfz相互作用(Hsieh等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 96(7)3546-51(1999))。对WIF与Wnt的作用机制仍然是部分了解。鉴定了WIF-1启动子中的Tcf效应元件(数据未显示)，提示WIF-1的作用是Wnt信号转导的负反馈调节物。
已认识到导致下调该基因转录的启动子区异常甲基化是一种使人癌肿瘤抑制基因失活的机制。在肺癌中，首先报道p16是甲基化的。目前，在各种类型的肺癌中发现，许多其它基因如APC、H-钙粘着蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、视黄酸受体β-2、E-钙粘着蛋白、RAS相关结构域家族IA是甲基化的，近年来报道，NSCLC细胞中人SOCS-3启动子超甲基化(Altieri，Nat.Rev.Cancer 3(1)46-54(2003)；Blanc-Brude等，Clin.Cancer Res.9(7)2683-92(2003)；Bowen等，J.Invest.Dermatol.120(1)48-55(2003)；Cong等，Mol.Cell.Biol.23(23)8462-70(2003)；Deng等，Cell 115(1)61-70(2003)；He等，Neoplasia，印刷中(2003)；Ishitani等，Mol.Cell.Biol.23(1)131-9(2003)；Kawano和Kypta，J.Cell.Sci.116(Pt13)2627-34(2003)；Kim等，Lancet362(9379)205-9(2003)；Krilleke等，Int.J.Cancer 107(4)520-7(2003)；Pham等，Mol Pathol.56(5)280-5(2003)；Soengas和Lowe，Oncogene 22(20)3138-51(2003)；Topol等，J.Cell Biol 162(5)899-908(2003)；Uematsu等，Oncogene 22(46)7218-21(2003)；Uematsu等，Cancer Res.63(15)4547-51(2003)；Usami等，Oncogene22(39)5978-86(2003)；Veeman等，Dev.Cell.5(3)367-77(2003)；Westfall等，J.CellBiol 162(5)889-98；和Wong等，Mol Cell.12(5)1251-60(2003))。发现启动子甲基化使WIF-1沉默(如本文所述)揭示是NSCLC发育期间的重要外遗事件，提示WIF-1可能是肺癌Wnt信号转导的关键拮抗剂。
也发现，WIF-1表达能诱导各种人癌细胞系凋亡，这些细胞系包括肺癌细胞系A427、A549和H460，乳腺癌细胞系MCF-7，结肠癌细胞系SW480以及间皮瘤细胞系MS-I和H28。而且，WIF结构域(WD)多肽是WIF的功能性Wnt结合亚域，包含如SEQ ID NO2所示WIF-1多肽的氨基酸39-176，能剂量依赖性地诱导肺癌细胞系A427凋亡。WIF-1多肽能剂量依赖性地诱导肺癌细胞系H460凋亡；纯化的重组人WIF-1蛋白能剂量依赖性地诱导肺癌细胞系H460凋亡；WIF-1多肽能剂量依赖性地诱导黑色素瘤细胞系LOX(图24)和FEMX凋亡；WD多肽能剂量依赖性地诱导黑色素瘤细胞系LOX和H460凋亡(图22和23)。而且，重组的人WIF-1蛋白能抑制肺癌细胞系H460的Wnt信号传导途径。
总之，本文所述的发现显示，WIF-1沉默是启动子超甲基化的结果，可能是癌症中，尤其是肺癌中Wnt通路组成性活化的重要原因。这些发现提高了用例如抗体阻断等方法抑制Wnt信号传导途径进行治疗的可能性，产生了用去甲基化试剂逆转WIF-1失活的兴趣。这些方法在NSCLC中尤其引人关注，因为Wnt通路似乎极为重要，目前的治疗仍然令人失望。
实施例7转染WIF-1 cDNA诱导癌细胞系凋亡和抑制Wnt信号转导为了证明WIF-1可诱导NSCLC细胞系凋亡和阻断Wnt信号转导，将WIF-1多肽编码质粒转染入细胞系H460和A549中。将人WIF-1开放阅读框克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3.1在NSCLC细胞中重表达WIF-1蛋白。此项研究所用表达载体包含编码SEQ ID NO2全长WIF-1多肽或SEQ ID NO26所示WIF-1亚域多肽的核酸。首先，证实与SAEC细胞、NHBC细胞和293T细胞的WIF-1无血清CM(对照；图6A)相比时，WIF-1蛋白水平低表达。转染5天后，观察到这两种细胞系的凋亡性细胞死亡显著增加(图6B)。而且，Wnt经典信号通路的关键介导物—胞浆β-联蛋白下调(图6C)。此外，WIF-1转染后A549和H460细胞中的凋亡抑制蛋白—存活蛋白也下调。存活蛋白是Wnt信号传导途径中的重要下游基因(He等，Neoplasia 67-14(2004)；You等，Oncogene 236170-6174(2004))。这些结果证明，WIF-1蛋白的重表达通过抑制Wnt信号传导途径诱导NSCLC细胞系H460和A549的程序性细胞死亡。此外，WIF-1重表达诱导间皮瘤细胞系MS1和H28、结肠癌细胞系SW480和乳腺癌细胞系MCF-7凋亡(图9)。
实施例8WIF-1表达质粒转染细胞的无血清条件培养基能诱导癌细胞系凋亡为了进一步证实WIF-1在NSCLC细胞中具有诱导凋亡作用，用WIF-1无血清CM处理细胞系H460、A549和H838。通过瞬时转染产生重组的人全长WIF-1 CM。用Western印迹分析确认无血清CM中含有WIF-1蛋白(图6A)。孵育5天后，观察到NSCLC细胞系H460、A549和H838细胞死亡显著增加(图7A)。流式细胞术实验表明，细胞死亡主要由于凋亡诱导作用(孵育5-7天后＞80％是凋亡细胞)(图7B)。而且，所测试的所有三株NSCLC细胞系中凋亡诱导作用都是剂量依赖性的，例如，H460细胞中WIF-1和凋亡诱导是剂量反应关系，见图7C和图10。Wnt信号转导的剂量反应性抑制与WIF-1 CM诱导的凋亡水平有关(图7D)。胞浆β-联蛋白和存活蛋白都下调(图7D)。而且，WIF-1 CM处理后Wnt信号转导的关键下游基因，细胞周期蛋白D1下调(图7D)。细胞色素C的过表达可用作WIF-1 CM诱导细胞凋亡的额外证据。这些数据证明，WIF-1 CM抑制Wnt信号传导途径并以剂量依赖方式诱导凋亡。重组的全长人WIF-1多肽也以剂量依赖方式诱导肝细胞细胞系SNU398和结直肠癌细胞系HCT-116凋亡(图20和21)。
实施例9WIF-I(WD)表达质粒转染细胞的无血清条件培养基能诱导凋亡为了证明WIF-1的凋亡作用不限于全长WIF-1，采用WIF-1(WD)表达质粒(如本文所述地制备)转染的细胞的无血清条件培养基孵育肺癌细胞系A427。此表达质粒编码包含氨基酸残基1-180的功能性WIF-1亚域多肽，切除信号肽后它包含SEQ IDNO27所示氨基酸序列。发现此WIF-1(WD)多肽也能诱导肺癌细胞系A427凋亡(图12)。
当加入黑色素瘤癌细胞系LOX和肺癌细胞系H460时，SEQ ID NO27的重组WIF-1亚域多肽也显示出显著的细胞毒作用(图22和23)。
实施例10WIF-1表达质粒转染细胞的无血清条件培养基能诱导非肺癌细胞系凋亡为了证明WIF-1的凋亡作用不限于NSCLC细胞，我们用WIF-1表达质粒(如上所述产生的)转染细胞的无血清条件培养基处理其它癌细胞。发现WIF-1介导和NSCLC细胞中观察到的凋亡作用不仅限于NSCCLC细胞。无血清条件培养基中的重组WIF-1蛋白能剂量依赖性地诱导黑色素瘤细胞系LOX(图13)和黑色素瘤细胞系FEMX(图14)凋亡。如在NSCLC细胞中所观察到的那样，WIF-1结构域(WD)也足以诱导黑色素瘤细胞系LOX凋亡(图15)。除诱导凋亡外，WIF-1(WD)也抑制黑色素瘤细胞系LOX的Wnt信号传导途径，如蓬乱蛋白-3表达降低所证明的那样(图16)。
实施例11纯化的人WIF-1能诱导NSCLC细胞系凋亡用纯化的重组人WIF-1验证WIF-1在NSCLC细胞中的作用。用纯化的rhWIF-1蛋白处理NSCLC细胞系H460。孵育7天后，用细胞病理效应试验测定死H460细胞的百分数。观察到大量细胞死亡(图8A)。细胞杀伤作用主要由于诱导了凋亡(孵育7天后40.1-62.8％是凋亡细胞)(图8B)。Uematsu等曾证明Dv1-3在NSCLC细胞中过表达(Uematsu等，Oncogene 227218-7221(2003))。而且，He等和You等证明，抑制Wnt信号传导途径导致Dv1-3下调，并诱导NSCLC细胞凋亡(He等，Neoplasia 67-14(2004)；You等，Oncogene 236170-6174(2004))。本文证明，NSCLC细胞系H4600与纯化WIF-1接触后胞浆β-联蛋白和Dv1-3都下调(图8C)。还发现将rhWIF-1加入H460细胞后，β-联蛋白-TCF关键靶向基因之一的细胞周期蛋白D1也下调(图8C)。与WIF-1 CM数据一致(参见上述内容和图7)，纯化的人WIF-1能诱导NSCLC细胞凋亡和抑制Wnt信号转导。而且，纯化的重组人WIF-1蛋白能剂量依赖性地诱导肺癌细胞系H460凋亡(图11)。
实施例12编码WIF-1全长的DNA和编码WIF-1结构域(WD)的DNA能减小体内肿瘤大小为了证明WIF-1可减小哺乳动物的肿瘤大小，用pcDNA3.1全长WIF-1(氨基酸1-379；SEQ ID NO2)和pcDNA3.1 WIF-1结构域(WD；氨基酸1-180；SEQ ID NO16)进行体内测试。将3×106LOX细胞皮下注射入无胸腺裸小鼠中。三天后(第3天)，将表达载体注射到肿瘤(5mm)附近。第10天重复注射表达载体。采用以下表达载体和对照(图18)(i)对照，50μl PBS；载体对照，用50μl lipofectamine配的200μgpcDNA3.1；用50μl lipofectamine配的200μg pcDNA3.1全长WIF-1；用50μllipofectamine配的200μg pcDNA3.1 WIF-1结构域(WD)。用游标卡尺测量肿瘤大小，每周两次，用公式x2y(x＜y)计算肿瘤体积。WIF-1(全长WIF-1和WIF-1结构域(WD))治疗的动物和对照组(即无载体和载体对照)之间的肿瘤体积差异有统计学显著性(P＜0.01，斯氏t检验)。当对照动物体内的肿瘤进展时，观察到WIF-1治疗动物的肿瘤生长显著减慢(图18)。在无载体对照和载体对照动物中肿瘤生长进展相似。全长WIF-1和WIF-1结构域(WD)的肿瘤生长抑制作用也相似。
实施例13重组WIF-1结构域(WD)蛋白能减小体内肿瘤大小为了证明WIF-1结构域蛋白(WD；SEQ ID NO16的氨基酸29-180)可减小哺乳动物的肿瘤大小，进行体内测试。将3×106LOX细胞皮下注射入无胸腺裸小鼠中。三天后(第3天)，将重组WIF-1结构域蛋白注射到肿瘤上。每天重复注射，共14天。如本文所述，用pcDNA3.1 WIF-1结构域(WD)表达载体包含SEQ ID NO18序列转染的293细胞产生了重组WIF-1结构域蛋白。用pcDNA3.1载体转染293细胞的上清注射对照动物。用游标卡尺测量肿瘤大小，每周两次，在第18天测量最后一次。用公式x2y(x＜y)计算肿瘤体积。第18天WIF-1结构域(WD)治疗的动物和对照动物之间的肿瘤体积差异有统计学显著性(P＜0.02，斯氏t检验，n＝3)。当对照动物体内的肿瘤进展时，观察到WIF-1结构域(WD)蛋白治疗的动物肿瘤生长显著减慢(图19)。
序列表NM_007191.智人(Homo sapiens)WNT...[gi18379354]位置NM_007191 2020bp mRNA线性PRI 20-DEC-2003定义智人WNT抑制因子(WIF1)，mRNA.
登录号 NM_007191版本NM_007191.2 GI18379354关键字 .
来源智人(人)生物体 智人真核生物域后生动物亚域；脊索动物门；有头动物亚门；脊椎动物亚门；硬骨脊椎动物；哺乳动物纲；真兽亚纲；灵长目；狭鼻亚目；人科；人属。
参考号 1(碱基1-2020)作者Clark，H.F.，Gurney，A.L.，Abaya，E.，Baker，K.，Baldwin，D.，Brush，J.，Chen，J.，Chow，B.，Chui，C.，Crowley，C.，Currell，B.，Deuel，B.，Dowd，P.，Eaton，D.，Foster，J.，Grimaldi，C.，Gu，Q.，Hass，P.E.，Heldens，S.，Huang，A.，Kim，H.S.，Klimowski，L.，Jin，Y.，Johnson，S.，Lee，J.，Lewis，L.，Liao，D.，Mark，M.，Robbie，E.，Sanchez，C.，Schoenfeld，J.，Seshagiri，S.，Simmons，L.，Singh，J.，Smith，V.，Stinson，J.，Vagts，A.，Vandlen，R.，Watanabe，C.，Wieand，D.，Woods，K.，Xie，M.H.，Yansura，D.，Yi，S.，Yu，G.，Yuan，J.，Zhang，M.，Zhang，Z.，Goddard，A.，Wood，W.I.and Godowski，P.
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题目结合Wnt蛋白抑制其活性的新分泌蛋白杂志Nature 398(6726)，431-436(1999)PUBMED 10201374注释REVIEWED REFSEQNCBI员工管理此记录。参比序列来自AF122922.1和BC018037.1.2002年1月28日此序列版本被替换gi6005949.
摘要WNT蛋白是参与胚胎发育控制的胞外信号分子。此基因编码结合WNT蛋白抑制其活性的分泌蛋白。此蛋白含有WNT抑制因子(WIF)结构域和5个表皮生长因子(EGF)样结构域。它可能参与中胚层分段。发现此蛋白存在于鱼类、两栖类和哺乳类中。
完整性3′端完整特征位置/限定词来源1..2020/生物体＝“智人”/mol-类型＝“mRNA”/db_xref＝″taxon9606″/染色体＝“12”/图＝“12q14.1”基因1..2020/基因＝“WIF1”/注释＝“同义词WIF-1”/注释＝“基因ID11197”/注释＝“基因座ID11197”/注释＝“MIM605186”CDS 119..1258/基因＝″WIF1″/注释＝“Wnt抑制因子-1”go-功能蛋白酪氨酸激酶活性[goid 0004713][证据IEA]go-功能结构分子活性[goid 0005198][证据IEA]
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661 gtgcccaggc gggtgccgaa atggaggctt ttgtaatgaa agacgcatct gcgagtgtcc721 tgatgggttc cacggacctc actgtgagaa agccctttgt accccacgat gtatgaatgg781 tggactttgt gtgactcctg gtttctgcat ctgcccacct ggattctatg gagtgaactg841 tgacaaagca aactgctcaa ccacctgctt taatggaggg acctgtttct accctggaaa901 atgtatttgc cctccaggac tagagggaga gcagtgtgaa atcagcaaat gcccacaacc961 ctgtcgaaat ggaggtaaat gcattggtaa aagcaaatgt aagtgttcca aaggttacca1021 gggagacctc tgttcaaagc ctgtctgcga gcctggctgt ggtgcacatg gaacctgcca1081 tgaacccaac aaatgccaat gtcaagaagg ttggcatgga agacactgca ataaaaggta1141 cgaagccagc ctcatacatg ccctgaggcc agcaggcgcc cagctcaggc agcacacgcc1201 ttcacttaaa aaggccgagg agcggcggga tccacctgaa tccaattaca tctggtgaac1261 tccgacatct gaaacgtttt aagttacacc aagttcatag cctttgttaa cctttcatgt1321 gttgaatgtt caaataatgt tcattacact taagaatact ggcctgaatt ttattagctt1381 cattataaat cactgagctg atatttactc ttccttttaa gttttctaag tacgtctgta1441 gcatgatggt atagattttc ttgtttcagt gctttgggac agattttata ttatgtcaat1501 tgatcaggtt aaaattttca gtgtgtagtt ggcagatatt ttcaaaatta caatgcattt1561 atggtgtctg ggggcagggg aacatcagaa aggttaaatt gggcaaaaat gcgtaagtca1621 caagaatttg gatggtgcag ttaatgttga agttacagca tttcagattt tattgtcaga1681 tatttagatg tttgttacat ttttaaaaat tgctcttaat ttttaaactc tcaatacaat1741 atattttgac cttaccatta ttccagagat tcagtattaa aaaaaaaaaa aattacactg1801 tggtagtggc atttaaacaa tataatatat tctaaacaca atgaaatagg gaatataatg1861 tatgaacttt ttgcattggc ttgaagcaat ataatatatt gtaaacaaaa cacagctctt1921 acctaataaa cattttatac tgtttgtatg tataaaataa aggtgctgct ttagttttca1981 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa//SEQ ID NO2包含信号肽序列的全长WIF-1MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQAECPGGCRNGGFCNERRICECPDGFHGPHCEKALCTPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVNCDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCEISKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCSKGYQGDLCSKPVCEPGCGAFGTCHEPNKCQCQEGWHGRHCNKRYEASLIHALRPAGAQLRQHTPSLKKAEERRDPPESNYIWSEQ ID NO3 WIF-1启动子序列AATTCGGCAACTTTTAAAAAATTATTTTATTTATTTATTTATATATTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTATCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGCCACGATCTTGGCTTAATGCAACCTCCGCCTCCCGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGGGTAGCTAGGACTACAGGCCCCCGCCACCATGCCCAGCTAATTTTTGCATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCACGCTGGCCAAGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCAGGGATTACAGGCGTGAGCCATCGCGCCCGGCCGAATTCAGCAACTTTTAAAAAATATCAGCAAACGTGAAGATATCCACGATGTTAGAGGAGCCCTACCCCGGAGGGTCAGGTACAGCTATCGTCCAGGGCCCAGGGCACTCTTCCGGGCACTGCCGGGTTATCAGGGAGACAGACGGGAATCCCCAAATGCTGGGTGTCGGGCAAGTACCAGCTGGACGCCCTGCGCCTCGAGCCAAGGCCAGCGCCTGCCATCGGCACCATCGGACAGTCGAGCCTCGAGTTTTAACTGCTTGGGAGCGCGCAAAGTGCCAGCCTATCGCAGAACGGAGCGCATAGGGTTGGCGGAGAGAGGAATCCTACTGGCTGAAAGGGAGACGAAGGGCAATTTGCGCCTTCAGTGAGCGCCGGAGGAGGAACAGGAGTCATCACCTCATCATCATCATCATCATCATCATCACCATCACCATCACCATCATCAGCACTCAGTCAAGCCCAGCGTTGTCTGCTCTCCCCATTTCCCTCCCCCGAAGCCTCCCTTGGCCCGAGGAGGTGGCGAGTGATGTCCCAGGGGTCTCTGAGTGCCCTTCTCCGGGTCCGCCAGCCCTACACGCCCACTTCGCGGGCGCTCCACTGGGCGCACCGCACTGTGAATGCAGCCTCGGGGGTCCCTCGCGGCCCCGCCCCCGGGGGGGCCCCACAGCGCCCCCAAGTGGCGGCCGCCCAGGCCTCGCGGGCCCCACTCCTCGCTCGCACCTCGCTCGCGCCAGCCCTTCCCGCTCTTCTGTTCTCGCTCTATTTGCCCCGCTGACTGCTGGCCTCGCCAGCTTTGCCAGTCTTACGTCTCTGCCGCCCCCACTCCCGCCCGCGCCCCATCTTCTTGCGCGACTCGCGCCCGCTGGTCCCCCCCTCCTCCTCCCGCGTCCTGCCTGCCCCCTCCTCCTGCTCTCGCAGGCTCCTTGGCACCCAGGCCGGGAGGCGACGCGCCCAGCCGTCTAAACGGGAACAGCCCTGGCTGAGGGAGCTGCAGCGCAGCAGAGTATCTGACGGCGCCAGGTTGCGTAGGTGCGGCACGAGGAGTTTTCCCGGCAGCGAGGAGGTCCTGAGCAGCATGGCCCGGAGGAGCGCCTTCCCTGCCGCCGCGCTCTGGCTCTGGAGCATCCTCCTGTGCCTGCTGGCACTGCGGGCGGAGGCCGGGCCGCCGCAGGAGGAGAGCCTGTACCTATGGATCGATGCTCACCAGGCAAGAGTACTCATAGGATTTGAAGAAGATATCCTGATTGTTTCAGAGGGGAAAATGGCACCTTTTACACATGATTTCAGAAAAGCGCAACAGAGAATGCCAGCTATTCCTGTCAATATCSEQ ID NO4GGGCGTTTTATTGGGCGTATSEQ ID NO5AAACCAACAATCAACGAAC
SEQ ID NO6GGGTGTTTTATTGGGTGTATSEQ ID NO7AAACCAACAATCAACAAAACSEQ ID NO8GAGTGATGTTTTAGGGGTTTSEQ ID NO9CCTAAATACCAAAAAACCTACSEQ ID NO10GTAGGTTTTTTGGTATTTAGGSEQ ID NO11TCCATAAATACAAACTCTCCTCSEQ ID NO12CCGAAATGGAGGCTTTTGTASEQ ID NO13TGGTTGAGCAGTTTGCTTTGSEQ ID NO14人WIF-1蛋白序列(无信号肽)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILKTPQNAIFFKTCQQAECPGGCRNGGFCNERRICECPDGFHGPHCEKALCTPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVNCDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCEISKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCSKGYQGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCQEGWHGRHCNKRYEASLIHALRPAGAQLRQHTPSLKKAEERRDPPESNYIWSEQ ID NO15人WIF1的WIF结构域蛋白序列WIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILKTPQNAIFFKTCSEQ ID NO16截短的人WIF-1蛋白序列(氨基酸1-180)MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILKTPQNAIFFKTCQQASEQ ID NO人全长WIF-1cDNA序列NM_007191.2；GI183793541 atggcccgga ggagcgcctt ccctgccgcc gcgctctggc tctggagcat cctcctgtgc61 ctgctggcac tgcgggcgga ggccgggccg ccgcaggagg agagcctgta cctatggatc121 gatgctcacc aggcaagagt actcatagga tttgaagaag atatcctgat tgtttcagag181 gggaaaatgg caccttttac acatgatttc agaaaagcgc aacagagaat gccagctatt241 cctgtcaata tccattccat gaattttacc tggcaagctg cagggcaggc agaatacttc301 tatgaattcc tgtccttgcg ctccctggat aaaggcatca tggcagatcc aaccgtcaat361 gtccctctgc tgggaacagt gcctcacaag gcatcagttg ttcaagttgg tttcccatgt421 cttggaaaac aggatggggt ggcagcattt gaagtggatg tgattgttat gaattctgaa481 ggcaacacca ttctccaaac acctcaaaat gctatcttct ttaaaacatg tctacaagct541 gagtgcccag gcgggtgccg aaatggaggc ttttgtaatg aaagacgcat ctgcgagtgt601 cctgatgggt tccacggacc tcactgtgag aaagcccttt gtaccccacg atgtatgaat661 ggtggacttt gtgtgactcc tggtttctgc atctgcccac ctggattcta tggagtgaac721 tgtgacaaag caaactgctc aaccacctgc tttaatggag ggacctgttt ctaccctgga
781 aaatgtattt gccctccagg actagaggga gagcagtgtg aaatcagcaa atgcccacaa841 ccctgtcgaa atggaggtaa atgcattggt aaaagcaaat gtaagtgttc caaaggttac901 cagggagacc tctgttcaaa gcctgtctgc gagcctggct gtggtgcaca tggaacctgc961 catgaaccca acaaatgcca atgtcaagaa ggttggcatg gaagacactg caataaaagg1021 tacgaagcca gcctcataca tgccctgagg ccagcaggcg cccagctcag gcagcacacg1081 ccttcactta aaaaggccga ggagcggcgg gatccacctg aatccaatta catctggtgaSEQ ID NO18人WIF-1亚域(WD)cDNA序列1 atggcccgga ggagcgcctt ccctgccgcc gcgctctggc tctggagcat cctcctgtgc61 ctgctggcac tgcgggcgga ggccgggccg ccgcaggagg agagcctgta cctatggatc121 gatgctcacc aggcaagagt actcatagga tttgaagaag atatcctgat tgtttcagag181 gggaaaatgg caccttttac acatgatttc agaaaagcgc aacagagaat gccagctatt241 cctgtcaata tccattccat gaattttacc tggcaagctg cagggcaggc agaatacttc301 tatgaattcc tgtccttgcg ctccctggat aaaggcatca tggcagatcc aaccgtcaat361 gtccctctgc tgggaacagt gcctcacaag gcatcagttg ttcaagttgg tttcccatgt421 cttggaaaac aggatggggt ggcagcattt gaagtggatg tgattgttat gaattctgaa481 ggcaacacca ttctccaaac acctcaaaat gctatcttct ttaaaacatg tctacaagctSEQ ID NO19编码WIF结构域蛋白序列(氨基酸残基39-177)的人WIF-1亚域(WD)cDNA序列1 tggatcgatg ctcaccaggc aagagtactc ataggatttg aagaagatat cctgattgtt60 tcagagggga aaatggcacc ttttacacat gatttcagaa aagcgcaaca gagaatgcca121 gctattcctg tcaatatcca ttccatgaat tttacctggc aagctgcagg gcaggcagaa181 tacttctatg aattcctgtc cttgcgctcc ctggataaag gcatcatggc agatccaacc241 gtcaatgtcc ctctgctggg aacagtgcct cacaaggcat cagttgttca agttggtttc301 ccatgtcttg gaaaacagga tggggtggca gcatttgaag tggatgtgat tgttatgaat361 tctgaaggca acaccattct ccaaacacct caaaatgcta tcttctttaa aacatgtSEQ ID NO20人WIF-1的信号肽序列MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEASEQ ID NO21编码WIF结构域蛋白序列(氨基酸残基39-176)的人WIF-1亚域(WD)cDNA序列1 tggatcgatg ctcaccaggc aagagtactc ataggatttg aagaagatat cctgattgtt60 tcagagggga aaatggcacc ttttacacat gatttcagaa aagcgcaaca gagaatgcca121 gctattcctg tcaatatcca ttccatgaat tttacctggc aagctgcagg gcaggcagaa181 tacttctatg aattcctgtc cttgcgctcc ctggataaag gcatcatggc agatccaacc241 gtcaatgtcc ctctgctggg aacagtgcct cacaaggcat cagttgttca agttggtttc301 ccatgtcttg gaaaacagga tggggtggca gcatttgaag tggatgtgat tgttatgaat361 tctgaaggca acaccattct ccaaacacct caaaatgcta tcttctttaa aacaSEQ ID NO22 小鼠WIF-1多肽序列(Gen Bank登录号NP_036045)mWIF-1MARRRAFPAFALRLWSILPCLLLLRADAGQPPEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSE 60mWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVN 120mWIF-1VPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVNVIVMNSEGNTILRTPQNAIFFKTCQQA 180mWIF-1ECPGGCRNGGFCNERRVCECPDGFYGPHCEKALCIPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVN 240mWIF-1CDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCELSKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCPKGY 300mWIF-1QGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCREGWHGRHCNKRYGASLMHAPRPAGAGLERHT 360mWIF-1PSLKKAEDRRDPPESNYIW 379SEQ ID NO23大鼠WIF-1多肽序列(Gen Bank登录号NP_036045)rWIF-1MARRRAFPAFVLRLWSILPCLLLLRADAGQPPEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSE 60rWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQASGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVN 120rWIF-1VPRLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVNVIVMNSEGNPILRTPQNAIFFKTCQQA 180rWIF-1ECPGGCRNGGFCNERRVCECPDGFYGPHCEKALCIPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVN 240rWIF-1CDKANCSATCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCELSKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCPKGY 300rWIF-1QGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCREGWHGRHCNKRYGASLMHAPRPAGAGLERHT 360rWIF-1PSLKKAEGRRDPPESNYIW 379
SEQ ID NO24爪蟾WIF-1多肽序列(GenBank登录号AAD25404)xWIF-1MSLTGYFAAPLCSIFLFILAH-ADAGQ-QEDSLYMWIDAHQARVLIGFEEDILIVAE55xWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHAMNFTWQATGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVN 115xWIF-1MPLLGTVPHKATVIQVGFPCLGNQDGVAAFEVNVIVMNSEGNVILQTPQNAIFFKTCQQA 175xWIF-1KCTGGCRNGGFCNDRHVCECPDGFYGPHCEKALCMPRCMNGGLCVTPGLCICPPGYYGIN 235xWIF-1CDKVNCTTHCLNGGTCFYPGKCICPSGYEGEQCETSKCQQPCRNGGKCSGKNKCKCSKGY 295xWIF-1QGDLCSKPVCEPSCGAHGTCIEPNKCQCKEGWNGRYCNKKYGSNLMNALRPTGSRNRQH 354xWIF-1TPSPKRTEDRQALPESNYIW 374SEQ ID NO25纹斑鱼WIF-1多肽序列(GenBank登录号Q9W6F9)Q9W6F9)zWIF-1MAFRTPAVQLHLKACVLLLLGGLLEAAYQERGTMYMWIDANQARILIGFEEDILIVSE 58zWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHHVNFTWQATDQAEYFYEFQTLRSLDKDIMDDPTVN 118zWIF-1VPLLGSVPHKASVVQVGFPCRGDQDGVAAFEVTILVMDAGGNIILRTPHNAIFFKTCQRA 178zWIF-1KCPGGCRNGGYCNERQVCECQDGFYGVHCEKALCSPRCLNGGLCMSPGVCICPPGYFGSS 238zWIF-1CERANCSTTCLNGGTCFHPGKCICAVSFEGVRCELSKCRQPCRNGGKCTGRNKCKCSKGY 298zWIF-1HGDLCSKAVCEPSCGAHGTCVEPNRCQCREGWHGRHCNKRFRGGVSNSQRVSPSKHKSPS 358zWIF-1VAAAKEAPETSQPSETNYVV 378SEQ ID NO26人WIF-1亚域多肽序列(1-180)MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYILWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQASEQ ID NO27人WIF-1亚域多肽序列(29-180)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQASEQ ID NO28人WIF-1亚域多肽序列(1-176)ARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTSEQ ID NO29人WIF-1亚域多肽序列(29-176)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTSEQ ID NO30人WIF-1亚域多肽序列(29-379)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQAECPGGCRNGGFCNERRICECPDGFHGPHCEKALCTPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVNCDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCEISKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCSKGYQGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCQEGWHGPAGAQLRQHTPSLKKAEERRDPPESNYIW60497789v权利要求
1.一种组合物，其包含能结合于Wnt多肽的Wnt抑制因子-1(WIF-1)亚域多肽。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述WIF-1亚域多肽能抑制Wnt信号转导。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述WIF-1亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约1-180的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述WIF-1亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-180的氨基酸序列
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述WIF-1亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-176的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述WIF-1亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约39-176的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述WIF-1亚域多肽融合于WIF-1多肽的异源氨基酸序列。
8.一种抑制WIF-1低表达癌细胞增殖的方法，所述方法包括以下步骤使癌细胞与WIF-1多肽接触，该多肽的用量能有效抑制癌细胞的增殖。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述癌细胞含有过度甲基化的WIF-1启动子。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述接触癌细胞的步骤包括通过降低WIF-1启动子的甲基化而增加癌细胞中WIF-1的表达。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，WIF-1多肽的用量能诱导癌细胞凋亡。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述接触癌细胞的步骤包括分离的多核苷酸在癌细胞中表达WIF-1多肽的步骤，所述多核苷酸包含编码WIF-1多肽的序列。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述WIF-1多肽是WIF-1亚域多肽。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ IDNO2氨基酸残基约1-180的氨基酸序列。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ IDNO2氨基酸残基约29-180的氨基酸序列。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ IDNO2氨基酸残基约29-176的氨基酸序列。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ IDNO2氨基酸残基约39-176的氨基酸序列。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述亚域多肽融合于WIF-1多肽的异源氨基酸序列。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在体外实施所述方法。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在体内实施所述方法。
21.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述癌细胞选自肺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、结肠癌、间皮瘤、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肝细胞癌、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、胶质瘤和成胶质细胞瘤细胞。
22.一种诱导WIF-1低表达癌细胞凋亡的方法，所述方法包括以下步骤使癌细胞与WIF-1活性多肽接触，该活性多肽的用量能有效诱导癌细胞凋亡。
23.一种抑制细胞中Wnt信号转导的方法，所述方法包括以下步骤使细胞与WIF-1亚域多肽接触，所述亚域多肽能有效抑制细胞中的Wnt信号转导。
24.一种治疗WIF-1低表达相关性疾病的方法，所述方法包括以下步骤给予需要治疗的对象WIF-1活性多肽，该活性多肽的用量能有效治疗所述疾病。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述WIF-1多肽是WIF-1亚域多肽。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌症。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述癌症选自肺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、结肠癌、间皮瘤、卵巢癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肝细胞癌、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、胶质瘤和成胶质细胞瘤。
28.一种药物组合物，其包含WIF-1多肽和药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其特征在于，所述WIF-1多肽是WIF-1亚域多肽。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约1-180的氨基酸序列。
31.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-180的氨基酸序列。
32.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约29-176的氨基酸序列。
33.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于，所述亚域多肽包含对应于SEQ ID NO2氨基酸残基约39-176的氨基酸序列。
34.一种检测过度甲基化的WIF-1启动子的方法，所述方法包括以下步骤使过度甲基化的WIF-1启动子与一种寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含能特异性杂交过度甲基化WIF-1启动子的序列，其用量能有效检测过度甲基化的WIF-1启动子。
全文摘要
本发明提供了用于诊断和治疗Wnt抑制因子－1(WIF－1)低表达癌症的组合物、方法和试剂盒。
文档编号G01N33/53GK1984923SQ200580023718
公开日2007年6月20日 申请日期2005年5月23日 优先权日2004年5月21日
发明者尤亮, 何飚, 徐志东, D·M·雅布隆斯 申请人:加利福尼亚大学董事会