专利名称：用于生物检测的系统和方法及其微共振传感器的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及用于检测细菌的系统和方法，包括使用微共振器的光传感器。
背景技术：
生物品种的检测是一些工业领域中的一种重要分析技术，例如包括食品工业、环境监测和防止术后感染的保健。例如，传统的检测细菌的方法需要微生物培养。虽然这些方法提供了所需的检测水平，但是它们需要受过严格训练的实验室人员并且获得结果通常需要若干天。
术后传染构成外科病人最常见的传染。多数情况下，在皮肤已经被外科处理之后细菌仍然留在皮肤上。大约20％的人的皮肤上具有较高的细菌量，即超过1000CFUcm-2，并且具有最大的传染风险。因此，当治疗这些外科病人时微生物检测尤其重要。典型地在皮肤上的细菌是革兰氏阳性型，因此能够辨别革兰氏阳性细菌是重要的。在其它的保健方面，重要的是把革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌区分开，并且检测来自皮肤、伤口和体液(例如，尿液)样品的细菌数量。同样重要的是能够检测来自从食品加工和临床装置抽取的环境样品的细菌。在这些样品中的细菌类型典型地是革兰氏阴性。可以利用稳定的鲎属阿米巴细胞溶解产物(LAL)试剂检测低浓度的革兰氏阴性细菌。由大量的LAL供应的显色基片(p-硝基苯胺)在脂多糖(LPS)的情况下从无色变为黄色，并且容易由分光光度计测量。然而，LAL不能将溶液中包裹细菌表面的LPS和自由的(可溶解的)LPS区分开。自由的LPS存在于大多数环境样品中。它是在正常的细菌繁殖过程下释放的或者来自死亡的革兰氏阴性细菌。来自完整细菌的可溶解LPS的分离是非常有挑战性的课题。
发明内容
因此，还有一种对用于检测生物品种的方法的需要，例如细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性)、病毒、孢子、蛋白质和DNA及RNA链，这种方法比传统的方法灵敏、价格低并且得到结果要快。
本发明的一个实施例提供一种生物传感器系统，包括具有内部容积的检测室和可操作地耦合到检测室内部容积的生物传感器单元。过滤器设置在该检测室内。检测室具有用于将分析物溶液引入检测室的检测室输入端。该输入端被设置且配置以致于至少一些溶液在到达过滤器之前与生物传感器单元相互作用。在一些实施例中，该生物传感器单元包括具有光学微腔的光学生物传感器。
本发明的另一实施例提供一种操作生物传感器的方法。该方法包括将包含分析物的溶液放置入包含生物传感器的至少一个表面和过滤器的检测室中；将越过该生物传感器的至少一个表面的溶液冲洗到过滤器。在过滤器中截留至少一些分析物。背向生物传感器表面冲洗掉过滤器上的至少一些截留分析物。检测生物传感器表面上的分析物。
本发明的再一实施例提供一种微共振器传感器装置，包括光学耦合以将探测光注入探测波导的光源。在探测波导的输入耦合区域，微腔共振器光学耦合到探测波导。探测波导包括第一探测光反射镜，从而来自光源通过探测波导的输入耦合区域传播而不耦合入微腔共振器的光朝向输入耦合区域反射回。
本发明的再一实施例提供一种微共振器传感器装置，包括产生探测光的光源和限定回音壁模式的微腔共振器，该微腔共振器被光学耦合以接收至少一些探测光进入至少一个回音壁模式。该装置还包括检测器单元和在微腔共振器和检测器单元之间光学耦合的信号波导。信号光从微腔共振器经信号波导传播到检测器单元。该信号波导包括以信号光波长反射的信号光反射器。该信号光反射器设置地朝向检测器单元反射信号波导中的信号光。
本发明的上述内容不是用来描述本发明的每个示例性实施例或每个实施例。附图和接下来的详细说明更加具体地说明这些实施例。
结合附图，参考下面本发明各实施例的详细说明可以更加完整地理解本发明，其中图1A-1C示意性示出了根据本发明原理的微腔传感器的不同实施例；图2A-2C示意性示出了根据本发明原理的微腔传感器的不同实施例；图3示意性示出了根据本发明原理的用于吸引所选细菌的附着有抗体的微球共振器的实施例；图4示出了荧光放射强度的时间函数图；以及图5A-5C示意性示出了根据本发明原理的细菌传感器系统的实施例。
虽然本发明可以具有各种变形和替换的形式，但是其具体形式已由附图中的实施例的形式示出并且将详细地描述。然而，应该理解，这种方式不将本发明限制到描述的具体实施例。相反，期望涵盖了由所附权利要求所限定的本发明的精神和范围内的所有变形、等效和替换。
具体实施例方式
本发明具体可应用于利用微腔共振器的微生物检测。这样的共振器也可以被称为微共振器。
相对于常规的微生物传感技术，光学生物传感器提供了一种灵敏、快速且成本合算的替换方式。一种基于微球体的生物传感器是这样类型的一种光学生物传感器，其依赖于在微球体表面内侧环流的回音壁模式(WGM)。微球体典型地由熔融石英形成，并且可以由CO2激光器或燃烧器系统制造。微球体典型的大小是直径从数十微米到几百微米变化。微球体在形状上不必是绝对的球状，其术语用于在三维空间上提供光学限制的微腔。这旨在包括在共同拥有的序列号为No.10/855,462的美国专利申请中说明的膨胀状微腔，该申请以参考的方式并入本文。相反，平坦或平面的微腔，例如以板或圆盘的形式，仅在二维空间上提供光限制。
在基于微球的生物传感器中，抗体首先被固定到微球表面上。接下来细菌到抗体的结合引起可由相应检测器检测的光转换信号。在微球光学生物传感器的研发中的一个挑战是有效地将细菌传送到发生结合情况的传感表面。由于微球生物传感器的表面积小，所以大部分的细菌样本恰好在它们到达球表面附近之前从传感器腔抽出。在样本浓度低时尤其如此。
近来电介质微球体作为检测应用中荧光传感器逐渐引起注意。在这些传感器中，传感器表面由诸如抗体的分子层固定，用于随后的诸如抗原的分析物的捕获。在直接检验结构中，抗原与荧光染料分子配对当抗原与传感器表面上的抗体结合时，该荧光分子保持足够地接近微球体表面，其由微球体内的挥发性光环流激励。在夹层式结构中，抗原首先束缚于传感器表面上的抗体，然后增加由荧光染料标记的第二层抗体以束缚于捕获的抗原。束缚于第二层抗体的荧光分子由在回音壁(WGM)模式中传播的光引起的快速衰减场激励。由激励的染料得到的荧光被收集并且用作抗原束缚情况的指示剂。
光学系统一种使用微共振器的微腔波导系统100的例子在图1A中示意性地示出。光源102指引探测光沿着波导104到达检测器单元106。微共振器110光耦合到波导104。来自光源102的探测光108发射入波导104中并且朝向检测器单元106传播。微共振器110快速衰减地耦合波导104中的一些探测光108，外耦合的光112在微共振器110内以微共振器110的一个共振频率传播。
光源102可以是任何合适类型的光源。为了增加效率和灵敏度，有利的是光源产生有效地耦合入波导104的光，例如光源可以是诸如激光二极管的激光器或可以是发光二极管。光源102也可以包括灯，与用于将来自该灯的光耦合入波导104的合适的光学器件一起使用。一些合适类型的光源在共同拥有的序列号为No.10/854,911的美国专利申请中有进一步的说明，该申请以参考的方式并入本文。
该光源102产生所需波长或在所需波长范围内的探测光108。例如，在微共振器用于传感器的情况下，光源102产生与检测的物种相互作用的波长的光。被检测的物种通常位于微共振器110表面附近，以便在WGM中传播的光与被检测的物种相互作用。
例如，当该系统100被用作荧光传感器时，在微共振器110内传播的探测光被诸如荧光染料的荧光分子所吸收，其附着到微共振器表面，作为分析物或分析物的成分。在更具体的例子中，微共振器的表面可以附着有针对所需抗原分析物的抗体。与荧光染料配对的分析物抗原分子被引入传感器系统100。抗原分子束缚于微共振器110上的抗体分子，从而保持荧光染料分子充分地接近于微共振器110以致于在微共振器110内环流的探测光快速衰减地耦合到荧光分子。吸收的探测光激励荧光分子，随后该分子发出与探测光波长不同波长的荧光。荧光检测证实存在分析物抗原。
在另一例子中，分析物抗原分子与荧光染料不配对，而是允许束缚于附着到微共振器表面的抗体。更多的可以与附着到微共振器的相同或者可以具有不同的抗原决定基并且配对到荧光分子的抗体随后被引入传感器并且束缚于抗原。此外，荧光分子通过与在微共振器110内传播的探测光快速衰减地相互作用而激励，并且随后的荧光检测可以用来确定分析物抗原的存在和多少。
光源102可以指引探测光进入多个不同的波导内，其中波导104就是这样的一个例子。该波导104可以是任何合适类型的波导，并且可以例如是平面型波导或形成在基片中或基片上的条形波导，例如形成在硅石基片中的波导。该波导104也可以是光学纤维。
该检测器单元106包括检测光的光检测器，例如光电二极管或光敏晶体管。该检测器单元106也可以包括波长敏感装置，其选择到达光检测器的光的波长。该波长选择设备可以例如是滤光镜或光谱仪。该波长选择设备可以是可调的，以致于允许用户主动地改变入射到光检测器上的光的波长。
该微共振器110可以设置地与波导104直接接触或非常接近，以致于沿着波导104传播的一部分光108快速衰减地耦合入微共振器110内。波导104典型地在微共振器110耦合到104的点上具有少量或不具有包层，以致于微共振器110直接地耦合到波导104的芯。
在一些示例性实施例中，控制单元116可以耦合以接收来自检测器单元106的检测信号。控制单元116可以用来分析检测信号，并且给用户提供指示由检测器单元106产生的检测信号的输出。控制单元116可以包括通常用于检测系统的元件，例如放大器、模数转换器、缓冲器、微处理器等。在一些实施例中，这样的输出可以简单地是电压信号，其振幅对应于检测信号的大小。在其他实施例中，该输出可以数字读数。该控制单元仅在图1A所示的实施例中示出，但是应该理解，控制单元也可以由在此论述的任何示例性实施例使用。
另一种类型的微共振器设备150在图1B中示意性示出。在设备150中，来自微共振器110的信号光158耦合入第二波导154，并且传播到检测器106。
另一种类型的微共振器设备170在图1C中示意性示出。在此设备170中，第二检测器172设置地接近于微共振器110以检测来自微共振器110的光。由第二检测器172检测的光没有通过波导传到第二检测器172，而是传播到自由空间。来自微共振器110的光，即由第二检测器172检测的光，例如可以散射到微共振器110外，或可以是由附着于微共振器表面的荧光物种通过在微共振器110内环流的光激励而引起的荧光。第二检测器172可以检测来自微共振器110的所有的光波长，或者，例如通过使用配置在第二检测器172和微共振器110之间的波长选择元件174，可以检测在特定波长范围内的光。波长选择元件174例如可以是滤光镜，其滤除具有在微共振器110内共振的激励波长的光并且透射荧光波长的光。第二检测器172也可以采用与图1B示出的类似的结构。
现在参考图2A-2C说明本发明的其他示例性实施例。在图2A示出的示例性实施例200中，检测器单元206包括第一和第二检测器206a和206b。同样，取决于波长的分光器206c用于将来自微共振器110沿着波导104接收的光分开，以致于一个波长或第一波长范围的光通过第一检测器206a，第二波长或第二波长范围的光通过第二检测器206b。该取决于波长的分光器206c可以使用任何合适的方法将不同波长的光分开。例如，该分光器206c可以使用基于波导的取决于波长的元件，例如定向波导耦合器或布拉格反射器，或者可以使用基于自由空间的元件，例如滤光镜，棱镜等。第一和第二波长或者波长范围的值可以由操作员改变。
在一个例子中，第一波长或者波长范围可以包括由光源102发射的探测光，而第二波长或者波长范围可以包括由附着于微共振器110表面的分析物发射的光。在另一个例子中，第一和第二波长或者波长范围可以包括附着于微共振器的分析物品种发出的光。例如当附着于微共振器表面的分析物材料包括发射不同的波长的光的至少两个荧光物种时，此配置可以是有用的。
检测器单元206也可以用于例如在图1B中示出的实施例，其中来自微共振器110的信号光沿着不同于第一波导104的第二波导154传播。此外，检测器单元206可以与检测来自微共振器的穿过自由空间传播的光的另一检测器一起使用。
波导104可以具有一个或多个诸如布拉格光栅的反射镜，以优选地反射不同波长的光。例如，如在图2B中示意性地所示，微共振器传感器系统220可以具有包括反射荧光的反射镜222的波导。因此，在朝向光源的方向从微共振器110耦合入波导104的信号耦合区224的信号光可以由反射镜222反射回检测器单元206。信号耦合区224是信号光从微共振器耦合入的波导的区域。信号光可以是荧光或者可以是探测光波长的光。利用反射镜222可以导致在检测器单元206检测的光信号的振幅增大。
在信号耦合区域224和检测器单元206之间的波导104上设置的探测光反射镜226可以用来将探测光反射回信号耦合区域224。第二反射镜226可以用来通过引入在微共振器110内以与直接从光源102耦合的探测分量112a相反的方向传播的探测分量112b，增大耦合入微共振器110的探测光的量。
波导反射器也可以采用其他的结构。例如，在如图1B示出的结构中，信号光的反射镜可以与第二波导一起设置，以将光反射到检测器单元。
另一种结构在图2C中示意性示出，其中波导104具有第二探测反射镜228。在此结构中，来自光源的光在第二耦合区域230例如通过定向耦合器耦合入波导104，并且在输入耦合区域232耦合入微共振器。输入耦合区232是探测光耦合入微共振器处的波导区域。在示出的实施例中，输入耦合区域230和信号耦合区域224基本上重叠。然而，当不同的波导用于探测光和信号光时，输入耦合区域是在一个波导中，信号耦合区域是在另一个波导中。
第一探测光反射镜226反射来自光源102的即未耦合入微共振器110的探测光。不是所有的反射探测光在回程中都耦合入微共振器110，因此可以通过第二探测反射镜228反射回输入耦合区域232。谐振腔可以建立在两个探测反射镜226和228之间。取决于一些因素，例如由光源102发射的光的相关长度和谐振腔的Q因数，探测光可以在两个探测反射镜之间共振，从而增大探测光在输入耦合区域232的电场，这可以进一步提高耦合入微共振器110的探测光的量。在一些高Q因数的环境下，在由探测反射镜226和228形成共振腔模式、微共振器110模式和光源102模式(如果有的话)之间可能有一些模式匹配。也应该理解，例如在序列号为No.10/854,911的美国专利申请中说明的宽带激光器可以用作光源。
细菌检测可以使用利用上述传感器系统的各种细菌检测方法。例如，该传感器系统可以被用来检测革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌。下面是不同方法的列表1.相对于一种具体类型的细菌将抗体(例如金黄色葡萄球菌的抗体，金黄色葡萄球菌是一种常见的术后感染原因)或束缚分子固定到微球体的表面，并且使该细菌束缚于该抗体，利用荧光染料给细菌着色，然后检测来自染料的荧光信号。
2.相对于一种具体类型的细菌或革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌将抗体或束缚分子固定，然后溶解该细菌，例如通过用诸如溶葡菌酶或胰岛素的酶处理，和/或与清洁剂和盐溶液混合，然后使该溶化的细菌束缚于抗体，由荧光染料给细菌着色，然后检测来自染料的荧光信号。
3.将革兰氏阳性细菌固定到微球体，使细菌着色并且检测由着色引起的荧光信号。
4.将革兰氏阴性细菌固定到微球体，使细菌着色并且检测由着色引起的荧光信号。
5.将用于革兰氏阳性细菌的抗体或束缚分子固定到微球体表面，使革兰氏阳性细菌束缚于该抗体，光学地检测革兰氏阳性细菌的存在。
6.将用于革兰氏阴性细菌的抗体或束缚分子固定到微球体表面，使革兰氏阴性细菌束缚于该抗体，光学地检测革兰氏阴性细菌的存在。
7.相对于革兰氏阳性细菌将抗体或束缚分子固定到微球体表面，然后使该细菌束缚于抗体，利用荧光染料使革兰氏阳性细菌着色，然后检测来自染料的荧光信号。
8.相对于革兰氏阴性细菌将抗体或束缚分子固定到微球体表面，然后使革兰氏阴性细菌束缚于抗体，利用荧光染料使革兰氏阴性着色，然后检测来自染料的荧光信号。
这些不同的方法不必彼此独立地实施，并且一些可以同时实施。例如，如果指示革兰氏阳性细菌的荧光染料发出不同于指示革兰氏阴性细菌的荧光染料波长的光，那么单个微球体可用于检测革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌同时和单独地存在。例如，结晶紫染料经常被用于指示革兰氏阳性细菌的存在，而碱性品红用来指示革兰氏阴性细菌的存在。特定的抗体用来指示特定细菌类型的存在。
现在更详细地说明头两个方法。上述任何示例性光学传感系统实施例都可以用于这种方法。例如，金黄色葡萄球菌的抗体被固定在微球体的表面上。金黄色葡萄球菌允许束缚到束缚抗体上。未束缚的细菌被冲走。然后，荧光标记的抗金黄色葡萄球菌抗体允许束缚到束缚细菌，并且测量荧光强度。荧光信号的强度可以与束缚细菌的量成比例。
上述任何示例性光学传感系统实施例都可以用于第三和第四种方法。革兰氏阳性和阴性细菌被着色或/和由两个不同的染料对比着色，例如结晶紫和碱性品红，随后例如通过空气干燥或利用小型燃烧器附着于微球体表面。替代地，该着色可以在细菌附着到微球体表面之后发生。
由于该探测光在WGM中围绕该微球体旋转，其接近于该微球体表面，那么该探测光和随后反馈回波导的发射光仅激励吸附在球表面上的细菌中的染料分子。在检测单元，波长选择分光器用来将不同波长的光指引到不同的检测器。光线强度被监测和校准以获得微球体表面上的革兰氏阳性和/或阴性细菌的数量。
如上所述，探测光被较长时间地限制在微球体的WGM内。相对于在波导中形成单个通道的光的电场，在微球体表面的局部电场大大地提高。仅具有5000Q因数的平面微磁盘系统可以获得四十倍以上的场倍增因数。如在此所述，玻璃纤维微球体可以获得高达4×106的Q因数，并且伴随光场强度的进一步倍增。
来自微球体的荧光可以利用已经通过光导导入检测器单元的光或利用微球体的在自由空间传播即未加引导的光检测，例如利用接近微球体表面配置的高NA微物镜。虽然利用显微镜物镜可以具有更高的聚光效率，但是基于波导的聚光是紧凑的、灵活的、低成本的，可以远程检测的，并且更加简单。聚集来自微球体的光的另一个方法是使用接近球表面配置的透镜光纤，并且接着二色分光镜将不同波长的光分开。这是也被认为是一种自由空间技术，因为该光在微球体和透镜光纤之间未加引导地传播。
在微球体内循环的WGM的衰减场延伸超过约λ/n的微球体表面的1/e距离，其中λ是探测光的波长，n是围绕微球体表面的介质的折射率。对于600nm波长的光和水围绕介质(n＝1.33)，1/e距离小于1/2微米。因为附着于微球体表面的细菌大小大约是1微米，所以衰减耦合的大部分细粒没有延伸超过与微球体表面接触的细菌单层。
虽然吸附在微球体表面上的细菌总数可以是少的，例如几千，但是在细胞壁中染料分子的浓度可以达到更高。也就是说，多个染料分子可以与单个细菌有关联。因此，即使对于单个细菌的检测，来自接近于微球体表面的染料分子的荧光信号也可以足够地强。
在上列的方法(5)-(8)中，抗体或束缚分子首先被固定到微球体表面上。随后细菌到抗体或束缚分子的束缚产生可以由相应的检测器检测的光转换信号。参考图3说明抗体或束缚分子的使用。微球体共振器310光学耦合到波导304，示出为锥形光纤波导。该微球体在其表面附着有抗体。在示出的实施例中，虽然可以仅具有仅一个类型的抗体或束缚分子或两个以上类型的抗体和束缚分子，但是也可以具有两个不同类型的抗体或束缚分子320、322与不同类型的抗体或束缚分子关联。第一抗体或束缚分子320示意性示出为具有三角形的受体，而第二抗体或束缚分子322示意性示出为具有正方形受体。
不同细菌330和332的混合物围绕微球体共振器，例如在水溶液中。示意性示出为三角形的第一类细菌330附着到第一类抗体或束缚分子320。示意性示出为正方形的第二类细菌332附着到第二类抗体或束缚分子322。
细菌330、332可以自己发荧光而产生不同于探测波长的光，或者可以由染料着色以提供荧光信号。细菌330、332可以在附着于它们的相应的抗体或者束缚分子320、322之前或之后由染料着色。
蛋白质的检测上述检测方法还可以用于蛋白质的检测。在某种意义上，细菌的检测基于蛋白质的检测，因为抗体附着到细菌细胞壁表面上表示的特殊蛋白质上。此外，目标蛋白质束缚分子或抗体可以固定在微球体上，并且用于捕获目标蛋白质。更多的可以与附着到微共振器的相同或者可以具有不同抗原决定基并且配对到荧光分子的抗体或束缚分子，随后可以被引入传感器并且束缚于目标蛋白质。此外，荧光分子通过与在微共振器内传播的探测光逐渐消失的相互作用而激励，并且随后的荧光的检测可以用来确定目标蛋白质的存在和多少。这种方法可以提供一种在细胞信号系统中检测蛋白质-蛋白质相互作用的设备。利用微球体的蛋白质白蛋白的检测在共同拥有的序列号为No.10/854,911的美国专利申请中描述，其中由Alexa Fluor 647染料标记的链亲和素(streptavidin)用作附着于微球体的牛血清白蛋白的标签。
病毒和孢子的检测上述检测方法还可以用于病毒和孢子的检测。例如，束缚分子或抗体可以相对于微球体固定。束缚分子或抗体可以附着于病毒或孢子。更多的可以与附着到微球体的相同或者可以具有不同抗原决定基并且配对到荧光分子的抗体或束缚分子，随后可以被引入传感器并且束缚于抗原。此外，荧光分子可以通过与在微共振器内传播的探测光逐渐消失的相互作用而激励，并且随后的荧光的检测可以用来确定目标病毒或孢子的存在和多少。孢子检测的一个例子是炭疽孢子的检测，其由炭疽芽胞杆菌形成并且导致一种急性传染病。通常大多数炭疽存在于野生动物和家养低等脊椎动物(牛、羊、山羊、骆驼、羚羊以及其他草食动物)中，但是它还可以存在于人类中，当他们暴露于感染动物或感染动物的组织时。
DNA的检测上述检测方法还可以用于DNA/RNA的检测。例如，具有与部分目标核酸序列互补的序列的寡核苷酸固定在微球体表面上。可以使用一种未标记的寡核苷酸检测方案，或者可以包括一种DNA/RNA嵌入染料，并且该检测将以荧光检测模式进行。
例子-利用微球体的细菌检测利用下列技术制备附着有细菌样品的微球体。直径为大约150μm的石英玻璃微球体由Piranah溶液处理5分钟，然后用纯水漂洗。该Piranah溶液是浓硫酸(H2SO4)与过氧化氢(H2O2)的3∶1的混合物。该硫酸由New Jersy，phillipsburg的Mallinckrodt Baker公司提供。该过氧化氢由来自New Jersy，Phillipsburg的mallinckrodt化学实验室的30％的溶液中获得。干净的玻璃微球体从水中移除。然后把微球体放入包含0.5％的由瑞士巴赫的Fluka提供的3-巯醇基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropyl trimethoxysilane)的乙醇溶液中。该反应允许在室温下进行5分钟。该微球体从硅烷溶液中去除，并且用乙醇冲洗两次，风干，然后放入包含1.1mM的N-琥珀酰亚胺酯-4-马来酰亚胺丁酰基氧(GMBS)溶液中，该溶液由Illinois，Rockford的Pierce化学公司提供。该微球体由GMBS溶液孵化5分钟，然后用乙醇漂洗。
抗金黄色葡萄球菌抗体的溶液以0.1mg/ml的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备。该抗金黄色葡萄球菌是一种金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，并且由New York，Westbury的Accurate Chemical & Scientific公司提供。PBS由New Jersy，Gibbstown的EMD化学以10×液体浓度提供。微球体由该溶液孵化5分钟。
然后利用由Missouri，St.Louis的Sigma Aldrich提供的2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)在具有0.1％Tween 20，聚氧乙烯山梨聚糖单酯(polyoxythylenesorbitan monolaurate)的PBS中封闭5分钟，该单酯由Missouri，St.Louis的Sigma Aldrich提供。随后，Virginia，Manassas的美国典型微生物保藏中心的细菌菌株25923并且具有107细胞/ml浓度的金黄色葡萄球菌溶液被允许由该微球体孵化5分钟，从而使细菌附着于该微球体。最后，由Alexa Fluor 647标记、由Oregon，Eugene的Molecular Probes提供的浓度为10μg/ml的抗金黄色葡萄球菌抗体由该微球体孵化。这样产生由Alexa Fluor 647染料标记的金黄色葡萄球菌附着的微球体。
气流室与环氧玻璃槽一起构造。聚合体管道在适当的位置也利用环氧树脂粘合，用作输入输出通路。如上所述地进行硅烷化和GMBS处理。后面的步骤在气流室中完成。
控制微球体利用与上列同样的步骤而产生，除了微球体是由PBS孵化而不是由细菌溶液孵化该微球体之外。
样品微球体和控制微球体在光学生物检测系统中用作微共振器。该实验设备与图1C中示出的类似，其中光源引导630-635nm的范围内的光通过作为耦合波导的锥形光纤。该纤维芯以大约1.5μm-2.5μm的直径成锥形。设置第一检测器以检测在越过微球体后沿波导通过的光。设置第二检测器以检测来自该微球体的发射到自由空间的光。
该微腔被从激光二极管耦合的光照明，该激光二极管具有635nm的输出和0.5nm(500nm)的输出频宽。耦合入光线锥的光强度大约是250μW。
图4中示出了附着葡萄球菌的微球体和控制球体的由第二自由空间检测器检测的作为时间函数的荧光响应。在所有情况下，激励光最初在锥形光纤的输入端被阻挡，以致于没有光耦合入该微球体。在时间t＝8秒时，该激励光被解除阻挡，并且观察到荧光信号。作为由在微球体中光共振的结果，这对应于荧光团发射光。来自激光二极管的光是中断的，并且荧光信号利用锁定放大器检测。在大约25-35秒的激励时间之后，该荧光信号已经衰减到低水平。信号强度随时间的减小是由于染料分子的漂白。
附着葡萄球菌的微球体的初始荧光信号最初大约是控制样品的两倍，这表示染料到葡萄球菌的特定束缚产生非常大的光学作用。
微球体光学生物传感器的一个挑战是有效地将目标传递到束缚事件发生的检测表面。因为微球体的表面积是小的，所以在从该室移除之前溶液中大部分的目标可能不均匀地到达球表面邻近。这是当样品浓度很小时尤其重要的问题。
因此，这对增大溶液中的目标的有效浓度是有用的。此浓度增加可以利用过滤器实现，该过滤器接近于微球体传感器的表面设置并且设置在传感器室的远端。生物传感器系统的示例性实施例在图5A-5C中示意性示出。系统500包括设置在室512内的传感器单元502，该室在一端具有过滤器514。该过滤器514具有适于截留被检测的目标的孔径大小，并且也可以具有例如最多2μm、1μm、0.8μm和/或0.45μm的孔径大小。在一些情况中，例如在该系统被用于检测蛋白质分子或者DNA、RNA碎片时，该过滤器可以是分子过滤器。这样的过滤器具有甚至更小的孔，例如在大约5nm-10nm的范围内，并且可以设计成截留具有高于特定分子量(例如10000)的分子。此外，当溶液通过具有这样的小孔的过滤器时可以使用不同类型的泵。
该检测器单元502包括一种生物传感器，例如上述的基于微球体的光学生物传感器，或者可以是其它类型的生物传感器，例如基于表面声波(SAW)的生物传感器，并且进一步的描述在共同拥有的序列号为No.60/533169和60/533176的美国临时专利申请中，在此其以参考的方式并入本文。
包含目标分析物的样品通常以箭头″A″指示的方向引入检测室512，例如利用注射器或泵，比如蠕动泵。样品由检测器单元502冲洗，并且一些目标分析物504附着在该检测器单元502的活性表面上。在基于微球体的生物传感器的情况下，该活性表面是微球体的表面，其可以具有适合于被检测的目标细菌、蛋白质、孢子、病毒或DNA/RNA的抗体或束缚分子。当该溶液透过室512时，最初没有附着于检测器单元502的大多数目标分析物504被过滤器514截留。然后，如在图5B中示意性地示出，随后的回流，通常以箭头″B″标示的方向，被用于将来自过滤器514的目标分析物回收并且再一次越过检测器单元502冲洗该目标分析物504。在该回流中更多的分析物附着在检测器单元502的活性表面上。在该检测器单元502由特点类型的抗体或者束缚分子固定的情况下，可以被捕获感兴趣的分析物504，剩下未束缚的并且因此未经过选择的物种被回流冲走。
整个的检测器单元502不必设置在室512内。例如，在该检测器单元502包括具有微腔共振器的光学生物传感器的情况下，该微腔共振器提供用于截留细菌的活性表面，并且因此室512中仅存在该微腔共振器510或者该微腔共振器的一部分，如图5C中示意性地示出。产生耦合到微腔共振器510的光的光源506，将来自光源506的光耦合到微腔共振器510的波导508，检测器单元509和将来自微球体的光耦合到检测器单元509的任何波导，在示出的实施例中的波导508，不必设置在检测室512内。这使得检测室512变小，例如具有与微腔共振器510的数量级相同的大小。然而，应该理解，该检测器单元502的一些元件不必由检测室限制。例如，该微腔共振器510可以完全地设置在室502内，一个或多个波导使光进入和离开室502，该室用于向和从一个或多个波导进行耦合，该波导将光耦合入和耦合出微共振器腔510，同时光源506和检测器单元509位于检测室512的外面。
同样地，对于其他类型的生物传感器，仅检测表面可以存在于室512中，而该生物传感器的其他元件可以设置在室512外面。该回流可以利用任何合适的方法产生，例如通过利用注射器或者由泵将溶液注射入室512中。此外，用于将样品注入室的同样的设备可以同时用来产生回流。例如，如果泵用来将样品导入室512，那么该泵可以反向以触发回流。例如，蠕动泵可以很好地适合于引发反向流。也可以采用其他类型的泵。
过滤捕获方法的方法可用于显著地增大目标分析物的有效浓度，这在检测器室的大小相对小时尤其有用。例如，用于光学生物传感器的微球体典型地具有大约100μm-200μm数量级的直径。微球体所在的检测器室因此可以具有大约1mm3或者更小的体积。过滤器的浓度效应可以非常大浓度比R可以通过该表达式描述R＝(V/C)×RC×RB(1)其中V是流过该室的样品体积，C是室容积，Rc是过滤器的捕获比，即在顺流中由过滤器捕获的目标分析物的百分比，典型地对于适当地设计的过滤器大约是100％，RB是来自过滤器的回收率，即从过滤器洗刷掉的捕获分析物的部分在回流中返回入该室中。
在目标分析物是细菌的一个示例性实施例中，该室的大小C是1×1×1mm(10-3ml)。如果是1ml的流入量(V＝1ml)，具有100细胞/ml的浓度，通过该室，并且该过滤器捕获100％的细菌，那么该过滤器截留100细菌。如果该回流回收率是20％，那么20个细胞可以从该过滤器被回收到该室，并且产生2×104细胞/ml的细胞浓度。从而，通过利用回流过滤技术可以产生增大的有效样品浓度，并且导致灵敏度增加。
该过滤捕获方法可以比其他方法更迅速、廉价、并且容易地比例增大到更大的量，例如磁性颗粒密度。此外，该过滤捕获方法不必限于基于微球体的生物传感器，并且可以与其他类型的检测器一起使用，例如表面声波(SAW)检测器。
例子-过滤捕获利用金黄色葡萄球菌作为模型系统的许多实验已经完成以探测过滤捕获技术及其在光学生物检测系统中的适用性。在三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐中金黄色葡萄球菌的浓度从107细胞/ml到104细胞/ml变化。该过滤器是聚碳酸酯和醋酸纤维素滤膜，使用具有0.45μm、0.8μm或1μm的孔径大小。在每个实验期间，监测两个参数，即i)捕获效率，即由过滤器阻碍的细菌数目，ii)回收率，即可以通过回流从过滤器回收的全部细菌的部分。进一步地，为了回收率测量，连续地使用1ml回流五次，并且该回收率在每个回流之后恢复。
当该细胞浓度是107细胞/ml时，通过荧光计利用荧光检测方法完成定量化。当浓度是104细胞/ml时，该荧光检测方法不是十分地灵敏，因此替代地使用一种细菌培养和计数法。
实验A-回收率，高浓度最初，准备具有107细胞/ml浓度的金黄色葡萄球菌溶液。该过滤器的直径为47mm，其中具有1μm孔径大小的聚碳酸酯过滤器或0.8μm孔径大小的醋酸纤维素过滤器。表I列出在5次1ml回流之后金黄色葡萄球菌的回收率。
表I 金黄色葡萄球菌的浓度＝107细胞/ml
从而，在浓度为107细胞/ml时，回收基本完成。
实验B-回收率，低浓度然而，在低浓度时，回收率比当该浓度是107细胞/ml时更小。例如，在104细胞/ml的浓度时，该回收率衰减到24％。这种回收率的减少至少部分地归因于细菌吸附到滤膜所引起的死容积。可发现该回收率在使用具有更小面积的过滤器时增大。例如，当该过滤器直径减小为13mm时，该回收率增加到53％(平均三个实验，参见下面的表II-IV)。应该理解，在实际的微球体生物传感器室中，该过滤器直径可以是1mm那么小，从而甚至产生更小的死容积，以及增大的回收率。
表II-IV示出了当金黄色葡萄球菌浓度以大约104细胞/ml的值而变化时，每1ml回流带来的回收率。对于这些实验，该过滤器是Acrodisc注射式过滤器，可以从Michigan，Ann Arbor的Gellman仪器公司得到。该过滤器的直径为13mm，并且由具有0.45μm孔大小的亲水聚丙烯薄膜形成。该捕获效率没有在下面的表中列出，保持在大约100％。在该过滤器截留细菌之后，每个过滤器受到每次1ml的重复回流。在每个回流之后，该溶液被去除并且培养以计算通过回流从过滤器中去除的细菌。在5次1ml的回流之后总的回收率超过40％。每个表列出在每个回流步骤回收的细胞数量，以及数字表示的总的细胞计数的百分比。每个表的底端行示出细胞回收的总数，由第二列中的数量合计得到，并且示出了细胞回收的总百分比。
表II 金黄色葡萄球菌的浓度＝9400细胞/ml
表III 金黄色葡萄球菌的浓度＝12000细胞/ml
表IV 金黄色葡萄球菌的浓度＝12600细胞/ml
因此，当过滤器受到五次回流时回流回收率至少为40％。这些证实，回流捕获技术可以用来有效地增大用于提供至检测器的样品浓度。
因此，本发明应该被认为不限于如上所述的具体实施例，而是应该理解为在所附权利要求中清楚的表述涵盖了本发明的所有方面。本发明可以应用的各种变形、等效处理以及许多结构对于本领域技术人员来说是容易显而易见的，并且根据本说明书的说明可以指导本发明。权利要求旨在涵盖这样的变形和设备。
权利要求
1.一种生物传感器系统，包括具有内部容积的检测室；可操作地耦合到检测室的内部容积的生物传感器单元，该生物传感器单元检测分析物的存在；在该检测室内设置的过滤器；以及用于将分析物溶液引入检测室的检测室输入端，该输入端被设置且配置以致于至少一些溶液在到达过滤器之前与生物传感器单元相互作用。
2.根据权利要求1所述的系统，其中该生物传感器单元包括具有微腔共振器的光学生物传感器单元，微腔共振器具有外表面，该微腔共振器的至少部分外表面暴露在室的内部容积中。
3.根据权利要求2所述的系统，进一步包括光学耦合以将探测光注入微腔共振器的光源。
4.根据权利要求2所述的系统，进一步包括光学耦合以检测来自附着于微腔共振器外表面的分析物的荧光的光检测器单元。
5.根据权利要求4所述的系统，其中该光检测器单元通过光波导光学耦合到微腔共振器。
6.根据权利要求4所述的系统，其中该光检测器单元设置在微腔共振器附近，从而检测从微腔共振器通过自由空间传播的信号光。
7.根据权利要求4所述的系统，进一步包括耦合以接收来自光学检测单元的检测信号的控制单元，该控制单元分析所述检测信号。
8.根据权利要求1所述的系统，其中该过滤器具有不大于2μm的孔尺寸。
9.根据权利要求1所述的系统，其中该过滤器具有不大于1μm的孔尺寸。
10.根据权利要求1所述的系统，其中该过滤器具有不大于0.8μm的孔尺寸。
11.根据权利要求1所述的系统，其中该过滤器具有不大于0.45μm的孔尺寸。
12.根据权利要求1所述的系统，其中该生物传感器单元被应用并配置成检测细菌分析物。
13.根据权利要求1所述的系统，其中该生物传感器单元被应用并配置成检测蛋白质分析物。
14.根据权利要求1所述的系统，其中该生物传感器单元被应用并配置成检测病毒分析物。
15.根据权利要求1所述的系统，其中该生物传感器单元被应用并配置成检测孢子分析物。
16.根据权利要求1所述的系统，其中该生物传感器单元被应用并配置成检测DNA或RNA分析物。
17.一种操作生物传感器的方法，包括(a)将包含分析物的溶液放置入包含生物传感器的至少一个表面和过滤器的检测室中；(b)将越过该生物传感器的至少一个表面的溶液冲洗到过滤器并且在过滤器中截留至少一些分析物；(c)将过将滤器上的至少一些截留分析物冲洗回生物传感器表面；以及(d)检测生物传感器表面上的分析物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中该生物传感器的表面包括至少部分微腔共振器，并且检测生物传感器表面上的分析物包括检测指示附着于微腔共振器表面的分析物的存在的光信号。
19.根据权利要求18所述的方法，其中冲洗至少一些截留的分析物包括向微共振器腔冲洗过滤器截留的分析物。
20.根据权利要求17所述的方法，其中冲洗溶液包括通过泵移动溶液。
21.根据权利要求17所述的方法，其中检测分析物包括至少在生物传感器的表面上检测细菌分析物。
22.根据权利要求17所述的方法，其中检测分析物包括至少在生物传感器的表面上检测病毒分析物。
23.根据权利要求17所述的方法，其中检测分析物包括至少在生物传感器的表面上检测蛋白质分析物。
24.根据权利要求17所述的方法，其中检测分析物包括至少在生物传感器的表面上检测孢子分析物。
25.根据权利要求17所述的方法，其中检测分析物包括至少在生物传感器的表面上检测DNA或RNA分析物。
26.一种微共振器传感器装置，包括光学耦合以将探测光注入探测波导的光源；以及在探测波导的输入耦合区域光学耦合到探测波导的微腔共振器，探测波导包括第一探测光反射镜，从而来自光源通过探测波导的输入耦合区域传播而不耦合入微腔共振器的光被反射回耦合区域反射。
27.根据权利要求26所述的装置，其中第一探测光反射镜包括在输入耦合波导中的布拉格光栅。
28.根据权利要求26所述的装置，其中该探测波导进一步包括第二探测光反射镜，其被设置地使得探测波导的输入耦合区域位于第一探测光反射镜和第二探测光反射镜之间。
29.根据权利要求28所述的装置，其中在探测波导的输入耦合区域和第二探测光反射镜之间，探测光在探测波导的第二耦合区域从光源耦合入探测波导。
30.根据权利要求26所述的装置，进一步包括耦合以检测来自微腔共振器的光的检测器单元。
31.根据权利要求26所述的装置，进一步包括耦合以接收来自检测器单元的检测信号的控制单元。
32.根据权利要求26所述的装置，其中该光源包括半导体激光器。
33.一种微共振器传感器装置，包括产生探测光的光源；限定回音壁模式的微腔共振器，其被光学耦合以接收进入至少一个回音壁模式之内的至少一些探测光；检测器单元；以及在微腔共振器和检测器单元之间光学耦合的信号波导，信号光从微腔共振器经信号波导传播到检测器单元，该信号波导包括以信号光的波长进行反射的信号光反射器，其被设置地朝向检测器单元反射信号波导中的信号光。
34.根据权利要求33所述的装置，其中该探测光通过信号波导耦合入微腔共振器内。
35.根据权利要求33所述的装置，其中信号光在信号波导的输出耦合区域从微腔共振器耦合入信号波导，并且信号波导的输出耦合区域在信号光反射镜和检测器单元之间。
36.根据权利要求33所述的装置，其中该信号反射镜在第一光波导中包括布拉格反射器。
37.根据权利要求33所述的装置，其中该检测器单元包括用于检测第一波长的信号光的第一检波器和用于检测不同于第一波长的第二波长的信号光的第二检测器，以及取决于波长的分光器设置地接收来自微腔共振器的光并且将第一波长的光指引到第一检测器和将第二波长的光指引到第二检测器。
38.根据权利要求37所述的装置，其中第一波长是探测光的波长。
39.根据权利要求33所述的装置，其中该光源包括半导体激光器。
40.根据权利要求33所述的装置，进一步包括耦合以接收来自检测单元的检测信号的控制单元。
全文摘要
提供一种用于检测生物品种(例如细菌、蛋白质、病毒、孢子和DNA或RNA)的生物传感器系统。该生物传感器系统也能够区分革兰氏阳性与革兰氏阴性细菌。在一些实施例中，分析物溶液流经检测器表面到达截留该分析物的过滤器。然后该分析物被冲洗回流经检测器表面，从而增大附着到该表面的分析物品种的数量。该检测器可以包括光学微共振器和光检测器，该微共振器通过波导光学地耦合到光源。一个波导可以具有波长选择反射镜以增加耦合入微共振器的探测光的量，或者增加由光检测器检测的信号光的部分。
文档编号G01N1/28GK101057134SQ200580031714
公开日2007年10月17日 申请日期2005年8月15日 优先权日2004年9月20日
发明者郭春梅, 范旭东 申请人:3M创新有限公司