专利名称：用于样本中标记成分的检测的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于在包含至少一个标记成分的样本中检测已占用结合部位(occupied binding site)的方法和设备。
背景技术：
US6 327 031 B1公开了一种源于光盘(CD)读写设备的光学设备，其适于检查在旋转圆盘上的生物、化学或生化样本。该设备检测分布在所述圆盘上的目标物质的不透光的、反射的或荧光部位的目标特定响应，当用激光束照射所述部位时，产生所述响应。该圆盘可以进一步在其表面上带有编码，其允许(再)定位圆盘上的特定位置。
通常，生物传感器的用途是检测在被分析物中的目标物质的存在和/或浓度。该检测基于对“结合部位”或固定在基层上的捕获探针的特定结合。为了使该结合是可检测的，将一个标记成分(labelingelement)(或简称“标记”)附着到目标上。标记的信号需要以最高可能的灵敏度来检测。有不同的方法来构造这样的捕获探针—目标—标记组合(例如可以首先将标记附着到目标，随后使这一对结合到捕获探针，或者可以首先将目标结合到捕获探针，在第二步标记该固定的目标)。如果人们想要在结合反映仍在进行同时进行测量，或者对于从溶液和消除非特定结合的目标和/或标记所需的清洗步骤而来的背景信号问题而言，这是相关联的。虽然测量到标记的存在，但人们只是对附着到被基层上的捕获探针固定的目标上的标记感兴趣。
发明内容
基于这种情况，本发明的一个目的是提供装置，用于对在样本中的目标物质或标记成分进行高灵敏度和可靠性的检测和量化。
通过根据权利要求1的方法和根据权利要求10的设备来实现该目的。在从属权利要求中公开了优选实施例。
根据本发明的方法允许对样本中已占用的结合部位的检测，其中根据定义，结合部位的“占用”意味着结合部位包含至少一个标记成分(例如某个荧光分子)。在最简单的情况下，“结合部位”可以仅是在样本中的某个位置，“结合”是在所述位置处标记成分的出现。将结合本发明的优选实施例来论述(已占用)结合部位的其它实例。该方法包括以下步骤a)使用(优选地为电磁)辐射斑点(spot)对所述样本进行扫描，其中该斑点的有效范围和该斑点的有效扫描速度使得在相应的检查持续期间，在当前所检查斑点区域内，几乎总是最多出现一个已占用的结合部位。
辐射斑点例如可以是由光学拾波器(pickup)单元(OPU)产生的(激光)光束的焦点，光学拾波器单元在样本上扫描，无需与样本的机械接触。“斑点的范围”必须相对于斑点的形状来合理的规定，例如可以是斑点的最大或平均直径(与在简单的圆形斑点的情况下的通常直径相对应)。类似的，“扫描速度”必须相对与扫描的具体方法来合理的规定，例如可以是斑点移动穿过样本的平均空间速度(以m/s为单位)。最后，在样本中一个斑点区域的“相应的检查持续期间”规定为该区域的点被该斑点不间断地照射的(平均)时间。例如如果辐射斑点步进式的移动穿过样本，“相应的检查持续期间”就是在两步之间的时间。如果斑点连续的移动，“相应的检查持续期间”可以规定为样本中斑点区域的平均照射时间(即其所有点上的平均值)。
斑点范围和扫描速度的假设条件意味着每次大致(即大于90％，优选的大于99％的时间)没有或最多一个已占用结合部位被斑点照射，其中扫描速度的考虑顾及了已占用结合部位的出现可以是动态过程。所提出的扫描可以因此被称为“数字的”，因为在样本中的一个位置处，实际上只有两个可能的测量结果，即“空”或“单一占用”。
在特定情况下，假设条件的满足可以与扫描速度无关，其中斑点的有效范围(例如以大约10-1到10-5的系数)小于在已占用结合部位之间的平均距离。这与孤立的已占用结合部位的稀疏分布位置相对应，其中—除了极少的例外—斑点每次最多照射一个已占用结合部位。
b)对于前述辐射斑点所检查的每个位置，如果从该位置处观测到目标特定响应，则将该位置的记录作为已占用结合部位的“候选”。“目标特定响应”的具体定义取决于所检查的结合部位和标记成分的类型。例如如果标记成分包含金属粒子，则对斑点辐射的目标特定响应可以是扫描光线的反射。在荧光标记成分的情况下，特定响应可以是荧光光线的受激发射，在化学发光的情况下，目标特定响应可以是在斑点区域所观测到的自发产生的光。
c)对前述候选的位置进行至少一次重复扫描。这意味着候选的每个位置至少测量两次，以便能够观测到潜在结合部位的时间演化。在重复扫描之间，可以执行某个处理比如清洗步骤和/或温度改变，例如作为严格性测试，以更好的区分特定和非特定结合。
d)如果在前述重复的扫描中一个候选显示了预定响应行为，则将该候选分类为“检测到的”(或“真实的“)已占用结合部位。例如如果在所有或例如大于90％的重复扫描中，一个候选显示了目标特定响应，则该候选就可以分类为检测到的已占用结合部位。如将结合本发明优选实施例来更详细论述的，这种分类实现了在(生物)化学样本中的特定结合与非特定结合之间的鉴别。
由于每次只测量一个结合部位且由于是基于重复的测量而将一个位置分类为检测到的已占用结合部位的，因此，上述方法提供了在样本中已占用结合部位的非常敏感和可靠的测定。应指出，该方法可选地包括对一个以上已占用结合部位的检测，例如包含不同标记成分(例如两种不同荧光团)的结合部位的检测。
进行测量的样本可以是(近似的)二维的或三维的。
其优选的包括固体表面，在其上分布探针作为“结合部位”，所述探针能够直接或间接结合至少一个标记成分。例如固体表面可以用聚合物载体来实现，(生物)捕获分子附着到所述载体上，并具有通常在1个/m2和106个/m2之间的，优选的在10个/m2和104个/m2之间的表面密度，其中所述分子尤其结合应该被检测的标记成分。标记成分的间接结合可以借助于目标物质的在前的特定结合而特别的发生。所述目标物质例如可以由在溶液中所感兴趣的生物分子组成。这些生物分子随后通过以探针捕获它们而被固定在固体表面上。为了认定捕获是否已经发生，需要从目标的存在而来的信号。这通过将标记成分(例如荧光分子)附着到每个已占用结合部位来实现。于是测量的灵敏度就取决于标记成分(在荧光的情况下，取决于标记中染色分子的数量；染色分子越多，信号越高)。目标物质与探针的生物结合可以归因于一个cDNA链的杂交，或对抗体的蛋白质识别，等等。可以通过在附着到实际标记上(例如在包含荧光染色分子的PS球体表面上)的特定分子之间的类似生物相互作用，来将标记成分结合到目标。能够在结合到探针之前(通过在标记成分中混合并培育)，或者在将目标分子结合到探针(通过将包含标记的溶液用于已经与目标分子结合的固体表面)之后的独立步骤中，在溶液中的执行目标物质的标记。标记还可以包括在目标物质中，例如在目标物质是PCR产物(单个DNA链的增殖)并且在其中将所附着的染色分子提供给核酸的情况下。在后一情况下，标记和目标物质的混合物可以在形式上认为是在本发明意义上的“标记成分”。
根据前述实施例的进一步发展，样本的固体表面暴露于溶液，在以辐射斑点扫描样本之前或同时，溶液可能包含至少一种目标物质和/或标记成分。术语“目标物质”广义上应包含人们感兴趣的任何物质对象，例如原子，离子，分子，络合物(complex)或生物系统(如细胞或微生物体)。目标物质和/或标记成分可以离开溶液并结合到固体表面上的探针，由此固定到确定的位置以用于随后的测量。可以执行另外的清洗和标记步骤(在夹层式测定中)以改进生物结合的特性。
在前述方法中，尤其可以从所检测的在样本固体表面上已占用结合部位的所测量到的分布中，确定在所述溶液中至少一种目标物质和/或标记成分的浓度。因此不仅可以检测目标物质和/或标记成分起码的存在，还可以量化其数量和空间分布。该量化基于以下影响溶解的目标物质和/或标记成分与固体表面上的探针的结合是动力学过程还是热力学平衡，并且根据该影响，在某一时间已占用结合部位的密度与溶液中目标物质和/或标记成分的浓度成比例。因此，已占用结合部位的检测到的密度或分布允许推断溶液中目标物质和/或标记成分的浓度。由于所提出的方法非常灵敏，并且是基于对单个已占用结合部位的检测的，因此采用这种方式可以测量极低的浓度(通常为fM)。其中，检测限度的下限由捕获探针所覆盖的表面面积来确定—表面越大，发现单个目标的可能性越高—并且以扫描时间为代价。该方法的重要优势是，能够增加表面面积从而提高检测限度，且不会影响噪声或背景。
标记成分原则上可以是能够以机械的、电的、化学的方式或别的方式结合到结合部位的任何实体。优选的，标记成分包含单个分子(具体的为蛋白质或单个DNA链)、多个(相同或不同)分子的集合，优选的在10个到108个分子之间的集合，和/或半导电微粒。如果标记成分是几个分子的集合，就能够获得对辐射的相应更强的响应和更佳的信噪比。
目标特定响应原则上可以是用适当的装置可以检测到的在斑点位置的任何事件或过程。在优选实施例中，目标特定响应包括被斑点的辐射所激发的荧光光线的发射和/或由化学发光所产生的光线的发射。在此情况下，扫描斑点的辐射和由荧光或化学发光而来的光响应都能够用光学系统来处理，无需与样本的机械接触。所述方法的另一个优势在于，其无需对由荧光或化学发光而来的光强度的绝对测量，而只是检测所述强度是在给定阈值之上还是之下，这可以将已占用结合部位的响应从背景区分出来。荧光例如可以源自结合标记成分的探针、标记成分、或附着到标记成分的荧光记号。而且，荧光可以是探针的“标准”行为，其在标记成分结合时被抑制或减少。在此情况下，目标特定响应是所观测到的荧光减少。当观测到化学发光时，用化学方法诱发该光产物，并仅仅需要辐射斑点来确定当前所检查位置的坐标。
在前述实施例中，整个方法的灵敏度取决于检测荧光光线并将其与背景辐射相区别的能力。为了产生强荧光信号而又不过度漂白荧光物质，因此优选地调整检查参数，尤其是在扫描斑点中辐射的强度，以便产生荧光饱和能级(level)的大约10％到90％，优选的大约30％到80％。所述饱和能级被定义为荧光的最大可获得的强度，其不能通过激发辐射的更高强度来增大。由于在所提出的方法中扫描光的斑点通常非常小(因为应检测单个结合部位)，因此，产生激发预期量的荧光所需的高强度通常不会成为问题。
根据本发明进一步的发展，基于所测量的来自扫描位置的响应来修改“目标特定响应”的定义。在使用荧光光线的实施例中，目标特定荧光响应的定义通常包括对所测量强度的阈值的设定，高于该阈值时响应就被分类为“目标特定”。该阈值的最佳值取决于所出现的背景辐射能级，该背景辐射能级必须从已占用结合部位的正确响应中区别出来。因此优选的是，连续测量自没有已占用结合部位的“空”位置而来的强度，并将其作为背景辐射能级的指示。
所提出的方法允许基于对少到一个的单个结合部位的检测(或者其不存在)而得出关于样本的结论。然而，为了提高测量的可靠性和统计性，优选地将测量设计为使得在整个检查持续期间，在一个样本中会检测到大约100到1000个已占用结合部位。能够进行调整以获得该数量的优选参数是样本的大小，例如以捕获探针覆盖的表面面积。例如如果给定在溶液中标记成分的浓度和在固体表面上的探针密度，则在表面与溶液接触后就产生在每个表面单位面积和单位时间中已占用结合部位的确定数量。为了在测量中获得已占用结合部位的预期数量，因此就应适当的选择固体表面的(扫描)面积。
本发明还涉及一种设备，用于检测在样本中已占用结合部位，其中，所述已占用结合部位包含至少一个标记成分，所述设备包括-扫描单元，其适于采用辐射斑点扫描样本，其中，斑点的范围和扫描速度能够调整，从而使得在相应的检查持续期间，在当前所检查的斑点区域内近似地总是最多出现一个已占用结合部位。扫描单元可以具体包括激光器，用于产生光束并将其聚焦为直径大约0.1到10μm的圆形斑点。
-检测单元，其适于检测从由前述斑点所检查的样本中的位置而来的目标特定响应。检测单元可以具体包括用于收集从样本发出的(反射的，发送的，发光的，…)光的光学系统，以及用于检测其强度的检测器。检测单元和扫描单元优选的集成在光学拾波器单元(OPU)中，其在样本上进行扫描。而且，这些单元通常包括用于聚焦和跟踪产生辐射斑点的光束(样本上的结构和适当的信号处理及控制，如在光学拾波器单元中，但优选的采用不旋转的样本)的装置。
-评估单元，其适于将从该处能够观测到目标特定响应的位置记录为已占用结合部位的候选，如果在重复扫描中该候选显示了预定响应行为，就将这样的候选分类为检测到的已占用结合部位。评估单元可以具体包括数据处理单元，其具有常见的部件(微处理器，存储器，I/O接口等)并具有适当的软件以执行所需的处理步骤。
前述的设备能够执行上述类型方法的所有步骤。因此，对于该设备的细节、优点和改进的更多信息参考在前的说明。还将参照附图在下面更详细的说明该设备的具体实施例。
特别的，该设备可以源自光盘播放器/记录器。而且，它可以包括样本的特定载体，所述特定载体允许以足够的空间分辨率和再现性来识别在样本中的位置。例如这样的载体可以类似于常规的光盘(CD，包括衍生物，例如DVD及同类东西)，即使用与在DVD及类似光路上得到特征相类似的特征。与CD/DVD相反，载体优选的不是旋转的且不是圆形的(具体的不具有大约12cm的直径)，而是具有信用卡格式并具有预制凹槽(和摆动)，用于放置信息和对光束自动聚焦。
对于使用斑点的样本扫描，可以相对于固定样本移动扫描单元或其一部分、相对于固定扫描单元移动样本、样本和扫描单元都移动(例如在横向上)、通过移动/旋转多角镜来引导光束穿过样本、或类似的。
参考下文中所述实施例来说明本发明的这些及其它方面，由此其将变得显而易见。
以下，借助附图以实例来说明本发明，其中
图1示意性的示出了用于检测样本中的已占用结合部位的设备的透视图；图2示出了样本表面的放大的透视图，样本表面包括预制凹槽，用于跟踪激光束；图3示出了图2的横截面线III-III；以及图4示出了共焦测量光学器件。
具体实施例方式
现在将更详细的说明本发明的实施例，本实施例涉及对在液体混合物中的生物组分(“目标物质”)的浓度进行定量的和高灵敏的测量的难题。这通常通过检测目标到捕获探针的一个选择性结合的出现来实现，捕获探针附着到固体表面。通过标记成分(或简称“标记”)的存在来检测结合的出现，标记成分附着到目标，或出现在第二(或第三)探针上，第二探针选择性的与所结合的目标(或目标—探针复合物)相结合。在这类分析中的最佳标准是荧光，其通过用光线对标记的照射来激发，以及通过化学发光来激发，化学发光通过化学或酶的反应来激发。一个主要难题是具有非常低的检测限度。由生物相互作用的亲和力和选择性(交叉反应性，非特定吸附，结合常数等)，以及由传感器或检测器的灵敏度(需要多少个事件以给出明显的信号)来决定某个测试的检测限度。通常，检测器测量荧光强度，在被激发光束(例如被生物分子探针所附着的光导(light guide)的渐消失区)照射时，荧光强度从表面发出。该强度能够以二极管来测量，或者在生物分子以组成图案的方式(复合的)进行附着的情况下，通过CCD照相机来测量。对于样本中目标分子的低浓度，指示表面上已占用结合部位的标记的密度较低，从而使得所测量的强度受到其它源的影响，例如在光路中的基层和所有其它物质的荧光。通过背景测量的准确性以及背景扣除(subtraction)，来确定检测限度的下限。根据标记与表面的非特定结合或者根据在表面附近此类标记的出现，可以预料到存在相当大的背景信号。后者使得难于“实时”测量，“实时”意思是在结合反应出现的同时，而不是在反应步骤和严格清洗完成之后。
通常的，只检测所结合标记的整体(其为每单位面积的强度或合计的光密度，即每单位面积的光强度乘以面积)。采用这种方式，特定结合与非特定结合相比，在局部变动之间就不可能有区别，由于校准取决于共同决定背景信号的许多参数，因此其是困难的。这是通过以下所述的单一事件的“数字检测”来克服的。本发明还提供了一种非常方便和节省成本的检测技术。以类似于用于光数据存储系统的光学拾波器单元的扫描激光器来实现。这样的布置允许对所结合标记(已占用结合部位)的数量和坐标进行测量。采用这种方式，背景扣除不再是关键的，结合事件的存在期允许在特定和非特定结合之间的辨别，并且采用这种方式获得与在满足条件的表面进行的生化反应有关的更加准确和详细的信息。其还允许结合与分离的测量同时持续，这对于生化分析的特性描述是非常重要的。
已有的解决方案利用了标记的表面选择性照明来增加选择性。这是通过渐消失区照明来实现的(例如WO2004/023143 A2，Duveneck等人，Proc.SPIE，vol.2928(1996))。这些方法可获得的强度远低于染色分子的饱和限度。其它已有的解决方案利用了共焦扫描光束进行照明。采用这种方式，被照亮区域受到限制，因此背景辐射和串扰被减小。高空间分辨率和灵敏度测量导致了非常长的“扫描”时间。作为替换方案，在US6 437 345 B1中提出了光路阵列(包括源、光学元件和检测器)的使用。然而，这是相对昂贵的解决方案并需要分析盒(cartridge)与读出器的精确定位。
减小从基层或其它组件而来的背景荧光另一种方法是使用电、化学或酶触发来激发光的发射。这些方法被称为电致发光或化学发光，且不需要利用照射光束的激发。取而代之的是，增加至少一个基层，其能够引起导致光产生的反应。
在此提出的从根本上不同的方法是基于对单一事件或“已占用结合部位”和每个事件的坐标的检测的，而不是基于检测(整体/平均)发光强度的。单一结合事件检测的基础是足够强的信号，其能够从背景强度中明显的辨别出来。通过扫描结合事件非常稀少(少于1ppm，取决于扫描速度和斑点直径)的表面，可以非常准确的确定背景的信号能级，因为测量的绝大多数是背景。大多数噪声源没有高空间或时间变化。只有当信号高于确定阈值时，其才被确定为(潜在的)结合事件，并且将该点的坐标记录为已占用结合部位的候选。以这种方式，可以由潜在已占用结合部位构成映射，并且扫描能够重复。通过连续比较这些映射，能确定结合部位的存在期，时间长的存在期可以被确定为特定结合事件或已占用结合部位。时间短的存在期可以作为噪声或非特定结合而被废弃。因此该方法提供了所测量结合的更多信息和更多确定性。这是通过对扫描斑点的尺寸和所照射标记的强度的调整来实现。扫描速度和标记尺寸是相关的，并能够对于每个应用来优化。
使用上述原理的设备的一个实施例是基于DVD光学拾波器单元的，并在图1中示意性的示出。其适于检测从“二维”样本10(仅示出其一小部分)中的已占用结合部位15而来的荧光。
该设备包括扫描单元20，扫描单元20具有激光源21、第一透镜23(其中在此及随后的术语“透镜”还包括具有几个独立透镜的光学系统)，其将从激光源21发出的激光束22校准为平行光束、二色分光镜24，其以合适的角度向样本10的表面反射激光束22、以及第二透镜25(物镜)，其将激光束22聚焦到样本10中的斑点26。
为了对从样本10而来的荧光光线进行检测，该设备包括检测单元30，检测单元30具有以下部件已经提到的透镜25，其收集从样本10发出的荧光光线，并将它校准为平行光束，该平行光束通过分光镜24发送；第三透镜33，其将光束32聚焦在检测器31上，检测器31适于测量入射光(荧光)的强度并产生相应的电信号。
最后，该设备包括评估单元40，评估单元40例如可以用常规计算机来实现。评估单元40执行对于所测量数据的所有所需的处理，其在下面被更详细的说明。而且，使评估单元40可以适于控制该设备，即控制在确定位置和/或具有确定参数的测量。
例如在650nm激发的物镜25的数值孔径(NA)0.2可以用于获得表面面积～10μm2的斑点26(对应于大约3.6μm的斑点直径)。如果面积为0.1×0.1mm2的样本的每一个分区都以一个标记进行统计学地标记，其可以被划分为1000个3.3×3.3μm2的虚拟子分区11、12、…，虚拟子分区能够被前述激光斑点26单独扫描。对于1pM浓度的目标分子(如蛋白质)，计算得到的有效结合比率或“命中率”是每μm2每秒10-4个事件。在平均1000秒的时间期间中，如果每秒扫描一个子分区，那么将可以测量到平均1个特定结合事件。
上述方法和设备的灵敏度不依赖于事件(即检测到的已占用结合部位)的数量，而是依赖于能够如此识别单一事件所具有的确定性。除了测量持续期间的合理的时间量程之外，对于能检测到的浓度没有下限。对于特定光学装置，甚至可以在结合反应期间进行测量，同时未结合的标记仍然出现感测表面上的溶液中。将更详细的解释这些方面。
所提出的方法的基础是在扫描光学装置中单一事件检测。单一事件检测要求所发出辐射的确定的最小功率和能量，以便由传感器检测到。作为在这点上的第一方面，应考虑荧光饱和强度及功率。荧光团的平均荧光存在期τfluor是2ns数量级(参见S.W.Hell和J.Wichmann，Opt.Lett.19，780(1994))。用于这些样本的吸收σabs的横截面的典型值的范围在10-16到10-17cm2之间。饱和荧光激发强度为Is=hcλτfluorσabs---(1)]]>h为具有普朗克常数，c为光速，和λ为被吸收光的波长。对于λ为650nm，σabs为10-16cm2，及τfluor为2ns，得到的饱和荧光激发强度Is为1.5MW/cm2或15kW/mm2的(M.A.Kramer，W.R.Tompin，R.W.Boyd，phys.Rev.A34，2026(1986))。标记的生物样本应该被激发的接近于，但低于饱和能级，以获得最佳荧光发射，从而获得最佳的信噪比(SNR)。节省的激发能级是饱和能级的60％到70％。在0.2μm2，10μm2，和1mm2表面面积上分别得到2mW，100mW，和10kW的生物样本的最佳激发功率，其中，0.2μm2的表面面积与DVD光学拾波器单元(0.6NA，650nm)的光斑点大小相对应。在荧光多层存储技术评估中(参见WO01/06501A2)，2mW的激发功率被用于使用DVD光学拾波器单元(0.6NA，650nm)优化从染色分子的荧光发射。
获得了最大SNR，并且增大激光功率也不会再提高SNR。应指出，在其被漂白之前，对有机荧光团的激发周期的最大值平均为105。有机荧光团的平均总存在期为T=τexcN=(hcλτabsI)N---(2)]]>N为激发周期的最大值，τexc为在激发强度I时的一个激发周期的存在期。激发周期的存在期与激发强度成反比，并等于在饱和强度的荧光存在期(对于I≈Is，τexc≈τfluor)。对于2ns数量级的荧光团的平均荧光存在期τfluor，在饱和能级的有机荧光团的平均总存在期为0.2ms。
典型的染料是由氧杂蒽和花青族而来的，具有横跨可见光谱的激发特性和发射特性。这些染料以几个名字进行交易，例如Bodipy，Alexa和Cy-dyes(所使用的商品名取决于染料的准确化学成分)。还已知尤其适用于激光激发的染料。例如，俄勒冈绿(Oregon green)488和514能够分别在488和514nm被激发，并且是特别耐光的。
许多商业染料的量子效率在0.1和1之间。然而，许多未替代的荧光和若丹明(例如德克萨斯红(Texas Red))漂白得相对较快(对于德克萨斯红，在饱和强度下在10s内为1％)。替代染料，例如四甲基若丹明(TMR)，具有更高的耐光性，但TMR的荧光量子场与荧光素结合物相比较低。
有时候会宁可选择磷光性的发射(例如为了减小背景荧光发射)。具有相对新的发射的典型染料是曙红和赤藓红。这些磷光团的量子场较低，通常是荧光的量子场的10％-20％。
其它适宜的染料包括金属络合物，诸如那些由Eu，Pt，Cu，Zn，Tb，Dy，Sm，Yb，Nd，Er，Ho，Gd和Ce得来的。此外镧系元素络合物诸如基于Ru，Os，Ir，Pd，Re的镧系元素络合物具有适宜的发射特性。
当使用确定大小的荧光小珠(bead)时，也能够实现荧光发射的增大。这些小珠通常由聚合物组成，在其中散布着或者以化学的方式连接的荧光团。使用的典型聚合物是聚苯乙烯和葡聚糖。这些小珠显示了高耐光性。还可以选择不同的染料，以使得能够在相同的波长上进行激发而发射出现在选择的波长上。通过染料的仔细选择，能够在染料之间使用荧光共振能量转移(FRET)，以获得预期的波长。小珠大小的范围从20nm到几微米。通常20nm的聚苯乙烯小珠包含大约180个低分子量荧光团；200nm的小珠包含大约1.1×105个荧光团及1微米的小珠包含大约1.3×107个荧光团。原则上能够获得高信号放大率。
小半导电微粒(“量子点(dot)和杆(rod)”)也是适宜的标记，因为它们能够在漂白出现之前经得起高激光功率。量子点的大小通常在1-5nm(直径)之间。发射波长是粒子大小的函数(从蓝到红直径增大)，而同时吸收光谱没有大的变化。用于量子点的典型材料是CdSe，CdTe等。还描述了核心外壳型量子点，例如具有CdSe核心和ZnS外壳的微粒。量子点还可以用电或化学的方式来激发。量子杆会具有特殊的重要性，这是因为当它们的空间和/或旋转运动被扰乱(例如在结合时)时，它们能够发射线性偏振光。
关于激光斑点26的大小，应用的目标浓度范围是重要的。对于目标分子(例如蛋白质)的1pM的浓度，能够预期有效结合率/命中率会小于每μm2每秒10-4个事件(已占用结合部位)。为了合理的分析准确度，人们希望有100-1000个事件(用于可靠统计和动态范围)。采用100×100微米的传感器面积，每秒一个事件的测量速度看来是合理的。这意味着在100-1000s之后，分析将结束。于是，在104μm2面积上，需要检测100-1000个结合的标记，这对应于0.01-0.1个/μm2的密度。这意味着采用1μm2的光束面积，达到了在光束中统计上的单一事件的限制。该方法的能力在于，其能够容易地扩展到较低浓度或较短时间。由于单一事件灵敏度，可以在相同时间中相同的表面面积上测量1fM(这与在1000s中在104μm2上的1个结合事件相对应)。
对于增大的检测限度，能够以感受器来覆盖更大的面积。以这种方式，1000个事件的时间按比例的减少。扫描时间将增加。这能通过斑点大小和斑点功率的增大来补偿。因此检测速度不会受到影响，也不会影响读出的灵敏度。
常规基于荧光的生物传感器使用扩散波激发或衰减波(evanescent wave)激发来照亮整个样本表面，例如1mm2。扩散波和衰减波激发的最大SNR分别用～10kW和～2W的激发功率来获得。所需的功率在商业生物传感器中是不可行的，因此使用了低得多的激发功率，导致了生物传感器较低的可能的灵敏度。
关于扫描方面，在光记录技术中存在许多光学扫描解决方案。例如，基层表面中可以存在连续的凹槽，其与混合物接触以进行分析。凹槽包含与位置(所谓的“颤动”)有关的信息。扫描通过移动安装了分析盒的平台实现，在分析盒中发生液体或气体混合物与感受器表面的(生物)化学反应，或者也可以替换地通过移动光学拾波器单元(如上所述，包含光源、光学元件和检测器)实现。后者可以通过2D转换平台实现，或者替换地通过被驱动镜和固定光源及检测器来实现。所述移动可以是线性扫描，如读取页面，或是连续迹线，如在光盘中所采用的。光束的移动优于分析盒的移动，这是因为在后一情况下，加速和减速会影响在传感器中液体移动。
在提出的基于图1中所示DVD光学拾波器单元的扫描荧光生物传感器的实施例中，样本中的预制凹槽可以用于使用常规伺服技术，如在DVD播放器中用于聚焦和跟踪的技术，来引导斑点26。图2和3分别在放大的透视图和截面图中示出了用于跟踪的此种预制凹槽16。样本10包括下层13以及上层14，下层13包含已占用结合部位15，上层14包括预制凹槽16。预制凹槽16对于激发光线和荧光光线应是透明。凹槽深度应进行调整来优化聚焦和跟踪信号。
对于在平均1000s时间期间的pM浓度，1个特定结合事件通常发生在10μm2大小的斑点26内。所扫描的斑点允许对一个特定结合(已占用结合部位)的局部检测。而且，几天的特定结合长存在期允许沿着105个子分区11，12进行光斑点的快速扫描，不仅实现局部测量，还实现时间分解测量。例如在1000s的总测量时间期间，能够对图1的整个样本10扫描100次。这与0.3m/s的扫描速度相对应(1×DVD速度是4.8m/s)。时间分解能够用于在具有几天存在期的特定结合事件与具有分钟量级的较短存在期的非特定结合事件之间进行辨别。由于局部的和时间分解的测量，获得了更高的SNR和灵敏度。从没有发生结合事件的子分区12，…而来的背景影响可以从测量中扣除。由于局部测量造成的背景衰减提高了SNR。从非特定或随机事件而来的背景贡献也能够由测量中区分出来。由于时间分解测量造成的背景衰减进一步提高了分析的灵敏度，并提供了关于结合动力学的额外信息。用～100mW的激发功率得到了最大SNR，其对于商业生物传感器是可行的功率要求(650nmDVD记录激光二极管具有20-200mW的功率)。因此对所提出的扫描荧光生物传感器的功率要求与基于扩散波和衰减波激发的现有技术生物传感器相比要小的多。
在结合反应期间，溶液中未结合的标记的荧光也将被测量，该测量在结合反应之后得到。然而，对于共焦光学装置，甚至可以在结合反应期间来测量，同时未结合的标记仍然存在于感测表面之下的溶液中。图4示出了图1的扫描荧光生物传感器的一种变形的光学器件，所述变形基于共焦DVD光学拾波器单元。在检测器31之前的针孔34用于阻塞从散焦区域17而来的光线。只有从焦点对准面18而来的光线穿过针孔，导致了较小的焦深或光学深度分辨率。即使采用所检测到的量的低渗透，液体中的标记也会快速移动(由于布朗运动、扩散或对流)。在重复扫描时，它们的坐标会不同。通过使不同扫描相互关联，它们能作为未结合的而被排除。
上述扫描荧光生物传感器的实施例的更多变形为，例如-尽管上面使用了0.2的NA用于荧光光线的激发和收集，对于使用相同透镜的激发而言，也可以使用大得多的NA来收集荧光光线，例如0.85NA，及较低的NA，例如0.2NA。荧光收集效率的以系数(0.90.2)2=20]]>的提高，导致了SNR进一步的提高，从而提高了生物传感器的灵敏度。关于该方法的更多细节可以在WO2004023459A2中找到，其合并于本申请中作为参考。
-在所述实施例中，整个OPU在固定样本上进行扫描。在OPU和样本是固定的时，没有转换部件的扫描荧光生物传感器可以通过用非转换倾斜镜来获得，例如电反射镜。
-激光的脉冲操作能够用于减小漂白效应，并用于在相同频率下进行测量，由此滤除发生在其它频率上的进程。
-在反射中的测量能够以照亮通过样本并在感受器表面上使用反射器(例如Au)来实现。Au反射器可以直接用于荧光(分子信标(beacon))的熄灭。另外，能够使用任何其它不活跃金属或绝缘表面。
-为增加传感器的动态范围，能在同一芯片上使用不同的斑点尺寸。
-能够以结合时荧光的开关触发(例如分子信标)来使用灵敏荧光探针。
-能够使用单独显示荧光或显示是否结合了某个标记的探针，且该探针在目标物质的结合之后停止或减小荧光。在此情况下，要检测的目标特定响应是在通常荧光样本中的荧光“孔”。
在此提出的扫描荧光生物传感器具有以下优点-与现有技术生物传感器相比，SNR提高了，这是因为生物样本的最佳荧光激发接近于饱和能级，因为特定结合事件的局部测量，以及因为特定与非特定结合事件的时间(和空间)分解测量，。
-该方法允许结合动力学的检测。
-该方法允许用于“简单”和便宜的读出系统(用DVD代替昂贵的共焦扫描器)。
所述设备和方法的重要应用可以在分子诊断(临床诊断，现场护理诊断)、生物传感器、DNA和蛋白质排列(例如用于分子诊断或筛选的蛋白质或基因序列的检测)、细胞分析、药物筛选、环境传感器、食品质量传感器等领域中，尤其用在需要高灵敏度和吞吐量的地方。
最后指出在本申请中术语“包括”不排除其它元件或步骤，“一个”不排除多个，单一处理器或其它单元可以实现几个装置的功能。而且，权利要求书中的参考标记不应解释为限制其范围。
权利要求
1.一种用于检测在样本(10)中的包含至少一个标记成分的已占用结合部位(15)的方法，所述方法包括以下步骤a)用辐射斑点(26)扫描所述样本(10)，其中，所述斑点(26)的范围(d)和扫描速度是这样的使得在相应的检查持续期间，在当前所检查的斑点区域内几乎总是最多存在一个已占用结合部位(15)；b)对于所述辐射斑点(26)所检查的每个位置(11)，如果从该位置观测到目标特定响应，则将其记录为已占用结合部位(15)的候选；c)至少再一次扫描所述候选的位置(11)；d)如果在所述重复扫描中候选显示出预定响应行为，就将该候选分类为检测到的已占用结合部位(15)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本(10)包括固体表面，其上分布有探针，所述探针能够直接或间接地结合标记成分，所述结合优选地是通过目标物质的在先结合完成的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述扫描过程之前或期间，所述样本(10)的所述表面暴露于包含标记成分和/或目标物质的溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述溶液中的所述标记成分和/或目标物质的浓度由在所述样本(10)的所述表面上的检测到的已占用结合部位(15)的分布来确定。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记成分中的至少一个是单个分子、多个分子的集合，其优选的是数量为101与108个之间的多个分子、和/或半导电微粒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标特定响应包括由于荧光或化学发光造成的光发射。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扫描斑点(26)的辐射强度对应于所述荧光标记的饱和能级的约10％到90％，优选的约30％到80％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标特定响应的定义是基于测量到的扫描位置(11，12)的响应来进行调节的。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选择所述扫描样本(10)的大小和全部检查持续时间，以使得检测到大约100到1000个已占用结合部位(15)。
10.一种用于检测在样本(10)中的包含至少一个标记成分的已占用结合部位(15)的方法，所述设备包括扫描单元(20)，其适于采用辐射斑点(26)扫描所述样本(10)，其中，所述斑点(26)的范围(d)和扫描速度是这样的使得在相应的检查持续期间，在当前检查的斑点区域内几乎总是最多存在一个已占用结合部位(15)；检测单元(30)，其适于检测从所述扫描单元所产生的辐射斑点(26)所检查的位置(11)而来的目标特定响应；以及评估单元(40)，其适于将具有目标特定响应的位置(11)记录为已占用结合部位(15)的候选，并且如果候选在两次或多次扫描中显示预定响应行为，就将这样的候选分类为检测到的已占用结合部位(15)。
全文摘要
本发明涉及一种方法和设备，用于检测在样本(10)中的已占用结合部位(15)，优选的用于检测与在固体表面上的探针相结合的荧光标记成分。该方法包括使用激光(22)的斑点(26)扫描所述样本(10)并使用检测单元(30)检测目标特定响应，例如荧光光线(32)。扫描斑点(26)的大小选择得足够小，以使得在同一时间，只有一个已占用结合部位(15)被照射。如果在位置(11)的重复扫描中观测到目标特定响应，则将该位置分类为已占用结合部位(15)。这种重复扫描尤其允许在特定与非特定结合之间进行区分。
文档编号G01N21/64GK101031660SQ200580033425
公开日2007年9月5日 申请日期2005年9月26日 优先权日2004年10月1日
发明者赖因霍尔德·温贝格尔-弗里德尔, 马尔切洛·巴利斯特雷里, 亨德里克·施塔伯特 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司