抗体文库筛选的方法

专利名称：抗体文库筛选的方法
技术领域：
本发明涉及筛选分子文库的方法，尤其是噬菌体展示文库，以鉴别或选择其中一种或多种成员，所述成员是一种或多种靶体的候选结合伴侣(partners)，尤其是细胞表面分子的候选的结合伴侣。本发明进一步涉及到从其它文库成员中分离所述靶体的备选结合伴侣的经改进的方法。
背景技术：
噬菌体抗体展示技术被证明是一项非常适于抗体的筛选和选择以确定目标抗原的技术(综述见Hoogenboom等人，1998，Immunotechnol.，41-20)。大量的方案依赖于可以获得纯化和/或重组的抗原，所述抗原在被固定至固体载体上之后被筛选。
探测细胞表面的分化和鉴别某些细胞类型或疾病相关的状态特有的细胞表面分子的结合伴侣是开发标靶向治疗的最有前途的方法。然而，对这些结合伴侣的鉴别往往是挑战性的实验。
鉴别细胞表面分子的结合伴侣的常规方法是基于将细胞在含有复合的噬菌体展示单链Fv(scFv)文库的悬浮液或培养基中孵育，随后进行几次清洗(通常5次或更多)以及对结合的噬菌体的酸或碱洗脱(例子见Hoogenboom等人，1999，Eur.J.Biochem.，260774-784；Ridgeway等人，1999，Cancer Reserch，592718-2723；Wong等人.，2001，Cancer Immunol.Immunother.，5093-101)。在这之前，通常通过对不相关的细胞类型进行阴性淘洗除去不相关的结合伴侣。最近更加改进的和更加高通量的方法是将所述细胞固定至硝化纤维素薄膜之后，用噬菌体展示文库筛选细胞(Radosevic等人，2003，J.Immunol.Methods，272219-233)。
使用噬菌体展示文库对细胞表面结合蛋白的筛选、选择和分类的常规方法的可选择的和节省时间的方法已被Giordano等人阐述，且被称为BRASIL方法(Biopanning and Rapid Analysis of SelectiveInteractive Ligands，2001，Nature Med.，111249-1253)。这个方法基于对游离的和细胞结合的噬菌体的单步骤的有机相分离，相对于所述常规方法的清洗步骤(即自由噬菌体从细胞中清洗除去的步骤)而言，该方法的清洗步骤具有的本质优点是避免了密集劳动、效率低以及造成细胞和潜在配体流失。

发明内容
令人惊奇地，人们现在发现，与BRASIL方法教导的相反，筛选、选择和鉴别细胞表面分子结合伴侣的显著改进的方法涉及在有机相分离之前，使所述细胞至少经受一次清洗步骤。与如上所述的常规的清洗和洗脱方法相比，所述方法还表现出显著的进步。
概括而言，本发明因而提供一种筛选分子文库以鉴别或选择其中一种或多种成员的方法，所述成员是一种或多种靶体的候选的结合伴侣，所述方法包括(a)用一种或多种靶体接触表达文库；(b)使所述靶体经受至少一次清洗的步骤；(c)通过有机相的分离，从未结合的所述表达文库成员中分离出与表达文库的一种或多种成员结合的所述靶体，从而从其他文库成员中分离出所述靶体的候选的结合伴侣。
可选择地被认为，本发明提供一种在表达文库中从其他未结合的文库成员中分离出与靶体结合的候选结合伴侣的方法，该方法包括在此限定的步骤(a)至(c)。
根据本发明的，被筛选的分子文库可为任何蛋白质表达文库，即任何肽或多肽表达文库。适宜的表达文库的例子为公知且在本领域中已被描述，并且包括展示文库如噬菌体展示文库(例如，Winter等人，WO90/05144；McCafferty等人，WO92/01047)，细菌(例如，Samuelson等人，2002，J.Biotechno.96，129-154)，共价或非共价展示文库例如核糖体展示文库(例如出版的科罗拉多(Colorado)大学董事会(Regents)的WO92/02536，大学研究公司(University ResearchCorporation)的WO93/03172以及川崎(Kawasaki)的WO91/05058)或PROfusion文库(Phylos公司)，其中所述表达蛋白质与编码其的mRNA连接，或者共价或非共价展示系统借此所述表达蛋白质与编码其的DNA连接(例如通过如在Actinova有限公司的WO98/37186中描述的系统中的共价连接或通过如在WO04/022746中描述的顺式展示(cis-display)系统中的顺式作用蛋白质)，或者酵母展示系统(例如，Wittrup，K.D.等人，WO99/36569；Wittrup，K.D.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12，395-399；Lee，S.Y.等人(2003)Trends in Biotechnol.21，45-52中描述的那些)，或者细菌双杂交系统(例如，Chien等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,9578)。可容易地被使用的表达文库的可选择类型例如细菌表达文库或其他文库，其中蛋白质作为可溶的片段被表达和分泌。化学的文库也可被筛选，例如合成的肽文库。在本发明中使用的优选的文库为噬菌体展示文库。
由所述表达文库表达的蛋白质可为任何适宜的长度，只要所述的长度足以能够使得蛋白质作为(或潜在地作为)靶体的结合伴侣。因此，所述蛋白质可为短的线性肽段(例如，在长度上达到5-50或7-30个氨基酸的数量)，或可折叠的而不是线性的较长的肽段或多肽。与如Giordano等人所描述的现有技术BRASIL方法相反，见前，相对于短肽文库而言，本发明的方法对于筛选包括较长多肽的表达文库，更具体地为抗体表达文库表现出有用的优势。
因此，表达文库的所述蛋白质可由整个基因或其片段编码，例如，编码所述表达文库成分的核苷酸可为cDNA或mRNA文库或其片段，例如由特定的细胞类型产生，或者可为基因组DNA文库或片段。
优选的表达文库表达多肽结合伴侣，所述多肽结合伴侣为候选的配体、受体、酶、基质、抗原等等，或者其片段，更加优选的表达文库表达抗体分子或抗体片段，所述抗体分子或抗体片段可随后被用于筛选与一种或多种已知或未知目标抗原结合的候选物。所述抗体表达文库可表达任意适宜形式的抗体，且可包括整个抗体分子或抗体片段如单链抗体(例如scFv)、Fab、Fv、Fab’2、双价抗体(diabodies)，双特异性抗体(bispecific antibodies)、微型抗体(minibodies)、重链或轻链、cameloid抗体、四元体(tetrabodies)、单域抗体、三元体等等。抗体片段的优选形式为scFv片段。
所述抗体分子或片段可为任何Ig同种型，如IgG、IgM或IgA等等，且所述表达文库可包括一种或多种这些抗体的亚型。
许多抗体文库为已知并在本领域中被描述，且任何这些都可使用本发明的方法进行筛选。
当本文提到表达文库时，该术语可被用于提示在核苷酸或蛋白质水平的文库，即在所编码的蛋白质的表达发生之前或之后。然而显而易见，该表达文库必须在蛋白质水平，以为了发生与靶体的相互作用。
构建这些表达文库和编码它们的核苷酸的方法在本领域中公知且被描述，且任何公知的表达文库或新开发的表达文库可在此使用。例如，这些文库可包括天然产生的多肽或其片段，或者可整体或部分地随机或合成。例如，对于抗体表达文库，通过从来自健康捐献者的原生的淋巴细胞种群(例如根据EP-A-368684中的描述)，或者从富集的淋巴细胞种群，例如从暴露于抗原或用疫苗或如肿瘤细胞免疫的患者中分离的淋巴细胞(例如根据Affitech AS的WO03/095491中的描述)，或者对特定抗原的淘洗而富集到的淋巴细胞种群中克隆核苷酸得到所述文库。
所述表达文库，尤其是所述抗体表达文库可从任何适宜的来源中得到，尤其哺乳动物来源，更加优选地是人源。也可使用嵌合表达文库或人源化表达文库。所述文库还可通过选择天然产生的骨架且在适宜的位置所包括的随机序列而产生。可选地，所述骨架可基于从各种天然产生的结构中得到的一种或多种一致的序列。
一般地，用于制备所述文库结构成分的技术应该基于已知的基因工程技术。在这点上，编码实际的蛋白质或肽的核苷酸序列被整合入适于所使用的表达系统类型的表达载体中，所述实际的蛋白质或肽将在表达文库中表达且通常在不同的文库成员之间改变，因此提供了文库多样性。用于噬菌体展示、共价和非共价展示、细菌表达等等的适合的表达载体为本领域公知常识且被描述(例子参见前面讨论的表达文库文献)。如果选择噬菌体展示为表达文库，那么可使用或者噬菌体或者噬粒载体，尽管优选为噬粒载体。
一旦产生编码不同文库成员的核苷酸分子(即编码在文库成分之间变化的肽段)后，在筛选之前，使用标准的技术，例如通过包括以受控制的(例如，定点诱变)或随机的方式增加、删除和/或取代一个或多个核苷酸的突变，或者通过结构域交换、盒式诱变(cassettemutagenesis)、链重组(chain shuffling)等等，所述核苷酸分子还可被进一步分化。合成的核苷酸可用于产生各种分化的核苷酸序列。因此，可以化学合成编码所述表达的多肽核苷酸的全部或部分，或衍生于各种有机体或细胞类型。
所述文库的结构成分可选择地另外包括其他适合的成分，例如复制起点、启动转录的可诱导的或非诱导的启动子、增强子、抗生素抗性基因和标记、常规标签或报导分子、通过例如PCR能扩增所述结构成分的引物结合位点，或其他所需的序列元件。适当的来源和这些附加的成分在所述文库结构成分中定位以使得它们执行所需的功能属于本领域普通技术人员的常规实践。
在本发明中使用的表达文库中，包含标记或报导分子可以特别有用。这些标记或报导分子可直接地或间接地被检测，且包括例如可被抗体识别的短序列标签、放射性标记、荧光标记或能被酶检测的标记。可使用的其他标记包括结合配对的一方，如链霉素亲和素生物素。这些标记为存在于所有文库结构成分中的典型的一般标记，且能用于检测文库成员的存在。此外，检测的信号强度还可用于确定存在的特殊文库成员的含量。该存在的文库成员的定量在测定靶体对文库成员的亲合力中可证明非常有用。可选地或另外，如果例如构成所述文库分子的一种或多种核苷酸用不同的标签标记，或固定至不同大小或不同标记的珠体上，可获得关于成员内容的信息，例如核苷酸的序列。
在本发明的一个实施例中，其中本发明的方法与AffiSelect(亲和选择)方法结合(见下文)，那么在文库结构成分和表达文库成员(候选的结合伴侣)中对常规标签或标记的包含尤为重要，且这些标签用于促进文库成分(候选的结合伴侣)与固体相结合。适合的标签和标记在说明书中关于AffiSelect方法的下文中描述。
此处使用的术语“靶体”是指意在从表达文库中鉴别出结合伴侣的相关实体或分子，且所述实体或分子附着在或以某种方式相关联至易于通过有机相分离的部分，例如当应用适合的分离条件，优选为离心力时，将穿过有机相且在有机相底部采集到的部分。这些靶体可为已知或未知的意在鉴别候选的结合伴侣的分子。
这些靶体还必须能够结合于所筛选的蛋白质表达文库成员或与其相互作用。因而所述靶体是能与蛋白质或肽结合的实体，且可以是蛋白质/肽、糖肽、碳水化合物、脂类、糖脂、化学小分子、核苷酸等，其附着于适当的部分或以某种方式与其相关联(例如，存在于适当部分的表面)，所述适当的部分可通过有机相例如细胞或固相，尤其是微粒固相，例如珠体而被分离出来。因而，这些靶体可以是附着于整个细胞或作为整个细胞的组分的细胞表面分子，或是细胞膜片段，或是分子，例如附着于固相的游离的、裸露的、独立的或纯化的分子，或附着于固相的细胞膜片段。优选的靶体为蛋白质或肽，例如抗原。更加优选的靶体为细胞表面分子(即原位存在于细胞表面的分子或细胞膜片段)，且尤其是细胞表面蛋白质或肽，例如细胞表面抗原。
在本发明的实施例中，当所述靶体是附着于固相表面的分子时，那么这个分子可从任何适合来源中得到，即可为天然产生的蛋白质、碳水化合物、脂类、糖脂等等，所述分子从其天然环境中被分离或纯化出，或可以是重组的或合成的分子，例如重组蛋白质或肽或合成的化学分子。在这方面，分离、纯化的或重组的抗原是特别优选的靶体。
此处使用的术语“细胞”是指相关的任何类型的生物微粒，其能通过有机相被分离。例如该术语包括原核细胞诸如细菌、病毒(尤其是凝聚的病毒微粒，例如通过抗体或化学修饰而凝聚的微粒，或相对于水相，更优选用有机相包被的病毒微粒)、真核细胞(包括低等真核细胞诸如酵母细胞和高等真核细胞诸如哺乳动物细胞，尤其是人类细胞)。正常情况下密度不足以通过有机相而被分离的生物微粒被基本排除在此处使用的术语“细胞”之外。细胞的片段也包含在这个术语的范围内，例如膜片段、细胞壁片段、细胞壁蛋白质、膜蛋白质等等，只要它们保留或被赋予了通过有机相能被分离的能力。(例如，对于细胞壁蛋白质和膜蛋白质，它们可能需要被凝聚以有助于通过有机相而分离)。
所述细胞可为天然产生的细胞或细胞的混合物(例如，从活体组织或来自哺乳动物受试对象的一些其他样品中得到的细胞)，或细胞系(包括无限生长分裂的细胞和基因工程细胞系，例如用编码特定靶体的核苷酸转化或转染的细胞，或用靶体的文库例如cDNA文库，转化或转染的大量细胞，随后所述靶体表达在所述细胞的表面)，等等。优选的靶体的文库是由疾病相关实体产生的文库，例如疾病相关细胞或者与病理相关因子如病毒或细菌。特别优选的文库为肿瘤细胞文库或病毒性细胞文库(例如，c-DNA文库)以使肿瘤或病毒相关蛋白质的候选结合伴侣能够得以鉴别。适合用于转染的真核细胞(或其他细胞类型)在本领域中公知且被记载，例如COS细胞，且可以使用其中的任意一种。也可使用过量表达所述靶体的细胞。
在本发明中使用的优选的“细胞”为真核细胞或其膜片段。特别优选的细胞是这些与疾病状态相关的细胞，例如癌症细胞或细胞系，例如乳腺癌或肺癌细胞或细胞系，或从疾病患者中得到的淋巴细胞(例如，外周血淋巴细胞)，或感染了病毒并因此在其表面递呈病毒蛋白质的细胞。
在本发明的方法中使用的细胞可从任何适合的来源中得到，例如该细胞可直接来自哺乳动物受试对象或可从体外培养得到。如果使用体外培养，那么所述细胞可以在悬浮液中或以单层培养，且以活的或固定的状态用于本发明的方法中。通常优选地使用活细胞，因为在所述细胞表面的靶体以其天然的形式存在，这意味着选出的候选的结合伴侣识别天然形式的靶体，因此增加了这些候选的结合伴侣用于治疗或诊断的机会。在本发明的方法中通常优选的是使用新鲜分离的细胞，而不是冰冻的或贮藏的细胞。然而，对组织切片和冰冻材料进行淘洗也是可能的。
在本发明的一个实施例中，当靶体附着于固相的表面时，可使用任何适合的固相，只要其能通过有机相被分离。本领域普通技术人员可容易的选择能达到这个效果的适合密度、大小和形状的固相。然而，可以看到的是特别优选微粒固体支持物以达到这个效果。特别优选的支持物为任选的磁性或至少可磁化的珠体，例如可使用带有超顺磁性微粒的聚合珠体。在本领域中这些支持为公知并有文献记载，且选择在本发明中使用的最适合的载体属于本领域普通技术人员的常规实践。
尤其优选微粒支持物，例如珠体，因为其易于在体外凝聚且有利于自动控制。例如如果珠体为磁性的，其通过磁场可从样品中分离并随后被清洗。可选地，如果珠体为带标记的，例如带有荧光标签，该珠体可通过流式细胞仪而被分离。合适的标签化、非标签化和磁性的珠体可从Dyno Specialty Polymers AS公司，利尼史特朗(Lillestrm)，挪威和戴诺生物科技有限公司(Dynal Biotech ASA)商业获得。此处描述的可在本方法中使用的磁珠的具体的例子是来自戴诺生物科技有限公司，挪威的M-450、M-270、M-280珠体。此处描述的可在本方法中使用的非磁性珠的具体例子是5μm的甲基丙烯酸缩水甘油酯微珠(Bangs Laboratories公司，卡梅尔(Carmel)，印第安纳州(IN))。将生物分子靶体附着于固相的方法在本领域中公知并记载。
此处与术语“靶体”结合使用的“一种或多种”是指一种或多种靶体的不同的类型，例如一种或多种不同的细胞表面分子或多肽。换句话说，本发明的方法可用于筛选一个靶体或者大量靶体或靶体文库(例如能用于文库对文库的筛选，这尤其有用)的候选的结合伴侣。如果筛选中涉及大于一个的靶体，这些靶体可以附着于或相关联于相同或不同的易于通过有机相分离的部分。例如，可以看到的是如果靶体是附着于整个细胞的细胞表面分子或其膜片段，那么有希望能鉴别大量不同细胞表面分子的候选的结合伴侣(换句话说，这是进行筛选靶体文库的候选结合伴侣情况的一个例子，即一种文库对文库的筛选形式)。当然，如果需要，这个步骤可朝向选择特定细胞表面分子的候选结合伴侣，例如，在下列情况下，具有免疫决定性靶体的细胞，或选择的已知细胞或被选择以过量表达相关靶体的细胞或被设计以过量表达该靶体的细胞。靶体文库的另外一个例子为转染的且在细胞中表达的c-DNA文库或其他基因文库，例如在真核细胞中转染和表达的消减的肿瘤c-DNA文库。
当然，在筛选反应中各靶体可以多拷贝形式存在(事实上，这通常为优选的)，例如，如果靶体为细胞表面分子，那么其多拷贝优选地存在于相同的细胞上和/或相同或不同类型的多个细胞上。
在本发明一个尤为优选的实施例中，所述表达文库为抗体文库(更加优选为噬菌体展示抗体文库)且所述靶体为细胞表面分子(细胞表面抗原)。该筛选方法被称为基于细胞的抗体筛选(Cell BasedAntibody Selection，(CBAS))。
使所述靶体与所述表达文库进行接触的步骤可以根据条件以任何适合的方式进行，反之亦然，以使得所述表达文库中的适合的候选结合伴侣能与存在的靶体相互作用或结合。该条件通常基于所述表达文库、靶体和与靶体相关联的所述部分的性质而变化。然而，本领域普通技术人员可容易地确定有助于结合的适合的条件。该“接触”步骤通常发生在溶液中或在水基质中或一些其他的环境中，以使得所述表达文库-靶体混合物与所述有机相不能融合，因为这将有利于随后的有机相分离步骤。因此，如果所述靶体存在于单层培养的细胞上，或者从哺乳动物受试对象获得的细胞上，例如哺乳动物的器官或组织，那么在与所述表达文库接触之前，这些细胞通常通过合适的技术被收获并在含水基质中被重新悬浮。然而，使所述表达文库与单层细胞接触也是可能的，之后这些细胞通过适合的方法被收获和在含水基质中被重新悬浮。
示例性的“接触”条件可包括在冰上或在4℃下孵育30分钟至4小时。可选地，在室温或37℃下可以进行接触步骤且在一些情况下为优选的。所述表达文库-靶体混合物可选择地经受轻摇、混合或旋转。此外，可添加其他适合的试剂，如阻断剂以降低非特异性结合。例如可使用1-4％BSA或其他适合的阻断试剂(如牛奶)。然而应当意识到的是，根据所述筛选方法的目的，本领域普通技术人员可改变和调整所述接触条件。例如，如果升高孵育温度，例如至室温，这可增加鉴别靶体不同亚型的结合物的可能性，例如易于内在化的细胞表面蛋白质的结合物。另外对这些条件的修改属于本领域普通技术人员的实践范围。
本发明的方式中使用的表达文库的大小和多样性，以及包括在接触步骤中的靶体拷贝的总量可变化。例如，在本发明的优选实施例中，当表达文库为噬菌体展示文库时，优选地使用滴度在108-1013范围内的噬菌体，更加优选地在1011范围内。
可通过改变与靶体相关联存在的部分的数量而方便地改变靶体的拷贝数。例如，当靶体为附着于固相的细胞表面分子，或多肽等等，那么可通过升高或降低存在于接触混合物中的细胞或固体支持物的量，或通过升高或降低附着于单独的固体支持物的多肽等的量，来调节靶体的量。此外，所需的靶体的量可通过反复实验而被容易地确定，但是例如当靶体为细胞表面分子时，可方便地使用105-107的细胞。
通过反复实验法也可容易地确定靶体的适合浓度，但是例如当靶体为细胞表面分子时，可方便地使用1×105-2×106细胞/ml的浓度。
在适合的条件下使靶体与所述表达文库接触，以发生所述靶体和适合的文库成员之间的结合/相互作用，在此之后，且在有机相分离之前，进行所述清洗步骤(b)。非常值得注意的是所要求的筛选方法不排除在所述方法其他时刻进行的额外的清洗步骤，例如在步骤(a)之前，例如在制备用于与所述表达文库接触的靶体的中，或在步骤(c)之后如所述靶体或表达文库成员的进一步分析中。然而，在使所述表达文库与所述靶体接触的步骤之后以及在有机相分离之前，不涉及清洗步骤的方法属于例外情形(例如，BRASIL方法，Giordano等人，见前)。
根据所述靶体和其所附着的部分的性质，可以任何适合的方法实施所述清洗步骤。例如，如果所述靶体附着于细胞或细胞的膜片段，那么通过在一定条件下将所述表达文库-靶体混合物离心而方便地进行所述的清洗，以使得所述细胞形成团块，除去上清液，随后将所述团块重新悬浮在适合的水基质中(例如与进行所述接触步骤相同的基质)。这些使细胞成团块和重新悬浮的步骤将构成一个清洗步骤。该条件通常也适于对与微粒固相相关联的靶体的清洗。然而，如果所述靶体与例如磁性固相相关联，那么可通过向进行所述接触步骤的容器施加磁场、除去上清液以及将固相重新悬浮在适合的水基质中而方便地进行所述清洗步骤(b)。清洗微粒固相的适合的方法为本领域普通技术人员所公知。此外，这些磁性分离和重新悬浮的步骤构成一次清洗步骤。
在本发明的方法中至少进行一次清洗步骤(b)，例如可进行至少1次、至少2次、至少3次，或至少1次清洗步骤。优选地进行小于5次的清洗步骤，即优选地在步骤(b)中进行1、2、3或4次清洗步骤。更加优选地在所述方法的步骤(b)中进行1或2或3次且更加优选地2次清洗步骤。这些清洗步骤的优选次数具有额外的优点，而且所述方法相比于包含至少5次清洗步骤的常规方法仍然为显著地更为快速和所需劳力更少。
这些清洗步骤将导致部分的非结合表达文库成员除去，即未与靶体相互作用或未特异性相互作用的成员。随后非结合的表达文库成员的另一部分在所述方法的步骤(c)中除去，即有机相分离步骤。
为了有利于所述有机相分离，在清洗步骤(b)之后，使含在适合的极性基质例如含水基质中的所述靶体与有机相接触。所述含水基质可覆盖在所述有机相的顶部或所述有机相位于所述含水基质的顶部。在前一种情况中，当被离心时，所述结合的靶体在所述有机相中聚集且优选地成团块，而非结合的文库成员保留在含水基质中。在后一种情况中，当被离心时，含未结合的表达文库成员的含水基质向上穿过所述有机相，同时所述结合的靶体在有机相下聚集且优选地成团块。可选择地，还可将两相混合，其随后在离心时分离。由此，获得相同的结果。
此处使用的术语“有机相”是指不可与水或其他极性基质或含水基质混合的流动相。作为适于在本发明中使用的有机相，当经受适合的条件，例如离心时，所述有机相可使结合的靶体-表达文库成员复合物从非结合的表达文库成员中分离，例如使所述结合的靶体-表达文库成员复合物通过并将排除所述表达文库的未结合成员，也就是排除所述表达文库的非复合的或游离的成员。显然任何这样的实验系统并非100％完美。因此，适合的有机相是排除大量或绝大部分表达文库未结合成员的有机相，或者是基本排除表达文库未结合成员的有机相。
此外，选择适合的有机相，以使得其对所述靶体、所述靶体所附着的部分、所述表达文库成员和混合物中在所述靶体和文库成员之间的结合反应的破坏或损害最小。尤其是对于所述靶体、表达文库成员和两者间的结合反应。例如，应当对有机相进行选择，以使得一旦从所述有机相中收集到这些成分，则它们适于在任何适合的下游分析步骤中使用。然而，通常为了使所述有机相可能对混合物中生物分子的任何负面影响最小化，所述生物分子接触所述有机相的时间通常保持在最低值。
，本领域普通技术人员可以基于上述功能要求容易确定在所要求的方法中使用的适合的有机相。可在所要求的方法中使用的有机相的例子为基于邻苯二甲酸酯的有机相，诸如在Giordano等人(见前)讨论的内容，例如双丁基邻苯二甲酸酯∶环己烷(9∶1[v∶v])或者双丁基邻苯二甲酸酯∶邻苯二甲酸二异辛酯(4∶6[v∶v])，或水不可混合的油诸如Versilube F50油(Alfa Chemicals有限公司，沃瑞汉姆(Woringham))。实际上，为了将表达文库-靶体复合物(具体地为噬菌体-靶体复合物)从未结合的表达文库成员(具体地为未结合的噬菌体颗粒)中分离，使用与水不能混合的油构成本发明的另一方面。
通过有机相的分离通常通过以适当速度离心至使所述靶体成团块状或至少使所述靶体聚集而进行，所述靶体(结合的靶体)在有机相中与表达文库的一种或多种成员结合，然而所有的，或大部分的，或大量的未结合表达文库成员保留在含水的相中。影响分离的适合的离心条件取决于所述靶体(以及其其所附着的部分)和使用的具体有机相的性质。然而，当使用细胞且细胞表面分子为靶体时，示例性的条件可为在室温或4℃下10000-11000g离心5-10分钟。
在离心步骤(c)之后，所述结合的靶体可从有机相中收集且可选地进行下一步分析。如果需要，通过冰冻所述有机相并转移含有所述结合靶体的团块，例如通过在适合的位置切割离心管可以有助于该收集步骤。后接解冻步骤(在收集到结合靶体后的某些时刻)的这种冰冻步骤对所述结合的靶体-表达文库成员复合物的下游分析通常不具有负面影响。然而，应当提醒的是在任何包含该步骤的实验程序之前，应当在恰当的实验中对此加以核查。
本发明的方法可涉及另外的附加步骤。例如，在使所述表达文库与所述靶体在所述方法的步骤(a)中接触之前，通过将所述表达文库与一种或多种非相关的实体(非靶体)例如非相关的生物分子实体，或非相关的细胞接触，可预淘洗所述表达文库以除去一些非需要的表达文库成员或降低所述文库的多样性。这种预淘洗也被称为“阴性淘洗”。例如，所述表达文库可用不相关的细胞，或其膜片段进行预淘洗，例如所述细胞不表达所需的相关靶体或以低水平表达靶体。例如，如果所述方法被设计成鉴别与特定癌细胞类型结合的表达文库成员，可通过将所述表达文库与不同或不相关的细胞类型接触而进行预淘洗，例如不同类型的肿瘤细胞或非肿瘤细胞例如外周淋巴细胞或内皮细胞或其他不相关的细胞。所述预淘洗步骤的目的是除去部分的不与相关的靶体结合的表达文库成员。所述预淘洗步骤为所述方法的步骤(a)，(b)和(c)的附加步骤，因而所要求的方法的步骤(a)，(b)和(c)不包含该预淘洗步骤。所述预淘洗步骤可通过任何适合的方法进行，例如通过常规的方法或甚至如上所述的BRASIL方法。然而，优选地所述预淘洗步骤采用前面概括的步骤(a)，(b)和(c)进行，除了在步骤(a)中所述表达文库与非相关实体(非靶体)接触且应当保留非结合的表达文库成员。因此，应当保留而不是丢弃来自任何清洗步骤(b)的上清液，且在分离步骤(c)中保留未通过有机相分离的未结合的文库成员。随后，被删减的该表达文库被用于进行本发明的方法。
可以对相同或不同的非相关单位实体进行一轮或多轮预淘洗。
可以认为本发明的方法的步骤(a)至(c)构成了相对于表达文库成员的靶体的一轮淘洗。尽管在第一轮淘洗的分离步骤(c)之后，所述结合的靶体可从有机相中被收集且可选择地进行进一步的分析，然而通常，为进一步降低所述表达文库的多样性和获得适当富集的所述靶体的候选结合伴侣种群以能够进行生产性的和时效性的进一步分析，可进行一轮或多轮的进一步的淘洗。
进一步的淘洗回合通常涉及到从所述方法的步骤(c)获得结合靶体、从靶体中分离、分开、洗脱或离析出所述表达文库成员(可选地扩大或放大所述表达文库成员)，并对所述表达文库成员实施另一轮所述方法的步骤(a)至(c)。进行这些操作的最佳方法将根据使用的表达文库而改变。例如，对于噬菌体展示文库，可用与细菌一起孵育所述靶体-结合噬菌体复合物。这将从所述靶体中洗脱出噬菌体并感染细菌，以使得所述噬菌体微粒被放大而备用，例如用于所要求的方法的步骤(a)中。
如果有多轮淘洗，本领域普通技术人员能容易的确定所必需或最佳的淘洗次数。例如，如果所述表达文库为噬菌体展示文库，或实际上为非噬菌体文库，针对来自所述方法步骤(c)的对应于靶体的候选结合伴侣进行的简单的多克隆ELISA分析可给出阳性候选物存在的比例以及是否需要另一轮的淘洗的提示。关于这点，与靶体(例如，设在相关的细胞上)而不是与非靶实体(例如，由不相关的细胞提供)(作为比较对照)结合的文库成员(例如，噬菌体)的增加足以显示已进行了足够次数的淘洗回合。因为各轮淘洗(所述方法的步骤(a)至(c)的每一轮的重复)可造成所需的表达文库成员的损失，淘洗的轮次通常保持为最低值。实际上，单独基于清洗步骤，此处描述的改进的方法相对于BRASIL方法和常规方法具有进一步的优势，因为在比较实验中可以看出几轮淘洗之后能获得适当的富集。例如，在此描述的试验中，相对于3轮(常规方法)或4轮(BRASIL方法)，本发明的改进的方法在2轮淘洗后就表现出适当的富集。
因此，所述方法的步骤(a)至(c)可重复一次或多次，例如达4至5次。然而，在本发明优选的实施例中，在所述候选结合伴侣和/或所述靶体经受进一步分析之前，仅进行1，2或3轮淘洗(即1，2或3轮步骤(a)至(c))。
对比实验还表明，此处描述的改进的方法可造成所述靶体的结合伴侣的数量有所增加的鉴定结果，即可造成阳性克隆的数量有所增加的鉴定结果。例如，在3轮淘洗之后，相比于BRASIL方法的12％和常规方法的28％，由本发明的方法选择的候选结合伴侣对靶体表现出41％的阳性。
因此，可选择的看来，本发明提供一种鉴别靶体的结合伴侣的改进的方法，所述方法包括进行此处限定的一轮或多轮步骤(a)至(c)。
当然，如果最初筛选的表达文库含相对少数的成员或者是例如富集的文库，如像在WO03/095491(见前)中描述的那样从暴露于免疫刺激原(immunochallenge)的患者中分离的抗体文库，那么不需要进一步的淘洗轮回。另外，本领域普通技术人员可以容易地知道这些情况，例如采用前面描述的方法。
一旦进行了任何适合的进一步的淘洗轮次，那么所述结合的靶体从步骤(c)的有机相中收集并可进行进一步的分析或使用。所述进一步的分析或使用通常需要将所述候选结合伴侣从所述靶体中分开，移除、离析或洗脱，且优选地所述候选结合伴侣独立于所述靶体而被表达或被产生。因此，本发明的方法可包括可选的步骤(d)，其中所述候选结合伴侣从所述靶体中被分开、移除、洗脱，或优选地被分离，或独立于所述靶体而被表达或被产生。例如，在表达文库为噬菌体文库且所述靶体为细胞表面分子的情况中，所述进一步的分析或使用通常涉及通过感染细菌而分离候选结合伴侣以及将编码所述候选结合伴侣的DNA克隆至合适的表达载体中。这种感染步骤还可以扩增候选结合伴侣。对于非噬菌体文库，在该阶段通过适合的方法可扩增候选结合伴侣，例如通过对编码所述候选结合伴侣的核苷酸进行PCR操作或将所述核苷酸转化至适合的宿主细胞(就合适的表达载体而言)。
所述的进一步分析可涉及到对与靶体结合的表达文库成员(即所述候选结合伴侣)和所述靶体本身或两者之一的进一步分析。因此本发明的方法允许筛选和鉴别新型的表达文库成员(新型的结合伴侣)和新型的靶体，例如新型的细胞表面分子或蛋白质，如新型抗原。
分析所述表达文库成员(候选结合伴侣)的适合方法对于本领域普通技术人员而言众所周知。通常地，在所述进一步的分析中的第一个步骤涉及分析或测试以确认所选择的表达文库成员(候选结合伴侣)确实与目标靶体结合。关于这点可使用任何适合的分析方法。然而，如前所述，关于这一点通常可使用多克隆ELISA分析。如前所述，该确认步骤还提供指示，所述指示是关于何时能够富集到所选择的文库成员以结合所述相关靶体，以致可停止筛选且可开始对所选择的克隆的更详细的分析。
因此，一旦完成确认步骤，通常跟着进行单克隆的分析。这个分析可通过标准方法进行。例如对于噬菌体表达文库而言，这种分析包括将噬菌体递呈的多肽克隆成可溶解的形式(例如，将噬菌体递呈的scFv克隆成可溶解的scFv或Fab形式)并采用溶解形式的多肽进行对细胞(Hoogenboom等人，1999，见前)或纯化抗原(使用可溶解片段)的ELISA分析、过滤筛选分析(Radosevic等人，见前)、流式细胞仪(FACS)分析、Guava分析(Gills和Fishwild，Application noteMonoclonal Antibody Specificity using the Guava CellPaint Assay，GuavaTechnologies公司，2004)或免疫荧光分析(Wong等人，见前)、染色组织切片或细胞以及其他免疫组织化学方法。所有这些方法已在文献中详细记载，其中的一种或多种可用于分析所述克隆。可选择地，直接的筛选方法，如在WO03/095491中所述的方法，或FMAT分析仪(8200检测系统-应用生物系统(Applied Biosystems))可用于进一步研究所述克隆的特征。最后，被称为AffiSelect的方法可用于进一步分析所述候选结合伴侣。这个方法的细节在下面独立的部分讨论。
对于非噬菌体表达文库而言，当使用展示文库时，那么编码所述候选结合伴侣(其连同表达的多肽一起被选择)的DNA可克隆至合适的表达载体(如果需要在PCR之后将RNA文库成员转变成DNA)，并且所表达的多肽可如上所述被分析。对于可溶解的肽或多肽文库，在所述候选结合肽段上相关联的标签可用于鉴别所选择的肽段的序列，它们或者在体外合成并如上所述进行分析，或者确定编码所述肽段的DNA序列并将其插入到适合的表达载体中并且如前所述对表达的肽进行分析。因此，对所述候选结合伴侣的进一步分析，优选地涉及到所述候选结合伴侣的表达或产生，优选地以可溶解的形式，并分析或测试所述候选者对相关靶体的结合活性。可使用任何适合的结合分析方法。然而，优选的分析方法为一个或多个ELISA、过滤筛选分析、FACS、免疫荧光分析、免疫组织化学分析、Guava分析、8200细胞检测分析或AffiSelect分析(见下文)。
作为阴性对照，还方便地相对于非目标实体对所述备选的结合伴侣进行筛选，例如不相关的细胞类型或在表面不表达靶体或以低水平表达靶体的细胞类型，或不相关的裸露或纯化的分子，酌情而定。
在所有这些方法中(除了下面将详细描述的AffiSelect方法)，通过使用能识别在表达文库成员上某种类型的标签或标记的试剂，有助于结合的候选结合体的检测。例如，如果所述表达文库为噬菌体文库，可通过使用噬菌体包被蛋白质的抗体，例如，抗-Fd抗体进行检测。如果使用其他类型的展示文库或可溶性文库，那么同样地，通过使用整合入文库成员中标签的抗体，例如myc标签的抗体进行检测。在本领域中适合的标签和检测系统为公知并被描述。
在任何阶段，通过对编码DNA的限制性酶切并随后进行测序或PAGE分析，可检测所述候选结合伴侣的分化度。同样，在本领域中这些方法为公知并被描述(Hoogenboom等人，见前，Ridgway等人，见前)。
在本发明的实施例中，当靶体为未知的分子时，例如未知的细胞表面分子，尤其是未知的肿瘤表面分子，那么其性质也可被容易地分析，并且使用从所述表达文库鉴别出的特异性结合伴侣作为工具来识别靶体。当所述结合伴侣为抗体分子，例如scFv分子时，这尤为方便。例如，如上面讨论的，来自所述表达文库的这些结合伴侣通常被改造为含有标签或标记，所述标签或标记能有助于检测，以及例如能被用于分析未知分子的组织分布，如通过与组织切片结合(Pereira等人，J.Immunol.Methods，1997，20311-24)。可选择地，所述结合伴侣可固定至固相并用于纯化所述未知分子，如通过亲和层析。一旦完成纯化，根据该分子性质通过适当的试验可对所述未知分子进行鉴别。例如，如果所述未知分子为蛋白质，那么该纯化后的蛋白质可被鉴别且采用本领域已知并已描述的方法通过肽段测序和克隆测定编码其的DNA序列。可选择地，通过使用经鉴定的结合伴侣筛选cDNA文库可以容易地确定编码未知蛋白质的DNA。关于这点，可使用来自适当来源的高度分化的cDNA文库。然而，优选地，可使用较小的、经限制性酶切的cDNA文库。例如，如果所述未知蛋白质被表达在特定细胞类型的表面，那么可方便地从这些细胞中制得cDNA文库(如，cDNA展示文库，诸如噬菌体展示文库)并用所述结合伴侣进行筛选(例子见Ridgway等人，见前)，例如对在固体支持物上的展示文库进行淘洗，在所述固体支持物上附着有经鉴定的结合伴侣。此外，如果从所述表达文库中鉴别出的所述结合伴侣为抗体，那么可进行基于抗体的其他分析，诸如免疫沉淀、Western Bolt、表达谱或免疫组织化学，以分离或表征所述靶体。
因而，可以看出本发明的方法不仅可用于从适当的表达文库中选择和鉴别靶体的结合伴侣，其还可用于鉴别新型的和未知的靶体。因为其可导致鉴定出应用于治疗和诊断的新型细胞靶，以及在治疗和诊断中具有潜在用途的新试剂，即结合伴侣，所以非常重要。
因而，本发明还提供一种分离和/或鉴别未知靶体的方法，所述方法包括此处定义的步骤(a)至(c)(以及可选的附加步骤)，(d)分离与所述未知靶体结合的一种或多种表达文库成员，以及(e)使用所述文库成员分离和/或鉴别与其结合的所述靶体。
因而，本发明的方法可用于筛选、鉴别或分离靶体的结合伴侣，或新型的靶体本身，其可被分离、产生或生产以用于各种下游的使用。同样地，使用本发明的方法鉴别或筛选结合伴侣/蛋白质或靶体构成本发明的另一方面。由此，本发明从另一方面提供从表达文库中选择、鉴别和/或分离作为靶体的特异性结合伴侣的文库成员的方法，或者选择、鉴别和/或分离靶体本身的方法，所述方法包括下列步骤使用上述定义的步骤(a)至(c)(以及可选的附加步骤)筛选表达文库以选择显示一定性质的分子，以及可选地(e)鉴别和/或分离作为所述靶体的特异性结合伴侣的相关文库成员，以及可选地(f)使用所述文库成员鉴别与其结合的所述靶体。
一旦鉴别了编码具有特定性质的结合伴侣或靶体的适当的核苷酸片段，如果需要，编码所述多肽的核苷酸可经历亲和力成熟，例如试验和鉴别具有进一步改进性质的结合伴侣。在重复筛选循环之前，可通过实施任何常规的诱变形式，包括但不限于以受控制(如定点诱变)的或随机的方式增加、删除和/或取代一个或多个核苷酸，错配PCR、结构域交换、盒式突变以及链重组等而实施该亲和力成熟。如果需要，该亲和力成熟可在前述确认步骤之后、进行单克隆分析之前进行。
当使用本发明的方法选择、鉴别、分离和/或纯化了一种或多种结合伴侣或靶体时，可生产出这些候选物，或其部分、片段、变体，或衍生物，且如果需要，可与至少一种制药学可接受的载体或赋性剂配成制剂。生产出的该分子，或其部分、片段、变体，或衍生物也包括在本发明的范围内。可选择地，这些分子可采取编码所述蛋白质分子的核苷酸的形式，所述核苷酸可被依次整合到适当的表达载体和/或含在合适的宿主细胞中。因而，编码所述结合伴侣或靶体的核苷酸，或者含有所述核苷酸分子的表达载体构成本发明的另一方面。
一旦根据本发明对特定的结合伴侣或靶体，或者其部分、片段、变体，或衍生物进行了选择、鉴别等，通过在适当的宿主细胞或系统中表达，并相应地从该宿主细胞或系统中或从生长培养基或其上清液中分离所述结合分子，酌情而定，可容易地使用编码该选择的结合伴侣或靶体的表达载体生产足够量的分子。可选择地，所述结合分子或靶体可通过其他适当的方法生产，例如通过化学合成编码所述结合分子的核苷酸，以及在合适的宿主中或在体外转录系统中表达。
这样，本发明在更进一步的方面提供一种生产特异性结合伴侣或靶体的方法，包括下列步骤根据如上所述的本发明的方法鉴别或选择靶体的特异性结合伴侣或靶体本身，生产所述经鉴别的结合伴侣或靶体，或其部分、片段、变体或衍生物，以及可选地用至少一种制药学上可接受的载体或赋性剂将所述生产的结合伴侣或靶体配成制剂。
所述结合伴侣或靶体的变体或衍生物包括胜肽衍生物(peptoid)的等价物、具有非肽的合成骨架的分子，以及与最初鉴别的多肽相关或从其中得到的多肽，其中所述氨基酸序列已通过对单独或多个氨基酸的取代、增加和/或删除而被修改，其可选择地或额外地包括用已被化学修饰的氨基酸取代或增加，例如通过去糖基化或糖基化。这些衍生物或变体可方便地具有与其源自的最初的多肽至少60、70、80、90、95或99％的序列一致性。
当所述结合伴侣为抗体分子时，所述变体或衍生物进一步包括抗体分子从一种形式到另一种形式的变换(例如，从Fab变换至scFv，反之亦然，或本文其他部分描述的抗体分子的任何形式之间的变换)，或者抗体分子至特定类型的抗体分子的变换(例如，抗体分子变换至IgG或其亚型，如IgG1或IgG3，它们尤其适于作为治疗抗体)。
所述变体或衍生物进一步包括结合伴侣分子或靶体与其他的功能成分的联合，例如所述功能成分可在所述结合伴侣或靶体的下游应用中有用。例如，所述结合伴侣或靶体可与功能成分相关联并被功能成分导向至身体特定位点，或与可检测的部分相关联用于例如在成像或其他诊断中的应用。
显然，对于这些部分、片段、变体，或衍生的结合伴侣分子或靶体的主要要求是它们保持其最初的在结合力方面的功能活性或具有改进的功能活性。
使用本发明的方法分离、检测、选择、鉴别或生产的所述结合伴侣分子(优选地，抗体分子)或靶体可用于需要靶体特异性的结合伴侣(如特定抗原特异性的抗体)的任何方法中。因而，所述结合伴侣(优选地为抗体分子)或靶体可用作分子工具，且本发明在另一方面提供一种包含此处定义的这些结合伴侣分或靶体分子的试剂。此外，这些分子可用于体内治疗或预防应用、体内或体外诊断应用，或体外分析。
以或者从所述表达文库中分离的形式，或者经改造或变换的形式，例如可适当地将scFv分子变换成IgG或者多聚体肽，所述结合伴侣可用于治疗应用。通过诱导表现出与所述靶体/配体呈激动结合或拮抗结合的治疗性分子的生物活性，可影响治疗效果，例如，通过阻止天然配体结合(因而抑制肿瘤的生长和/或传播)，诱导细胞凋亡(如肿瘤或病毒感染的细胞)，抑制生长或促进从基质中分离。根据所述靶体/配体本身的，或其多聚体(一些受体通过交叉连接被激活)的性质，可达到该治疗效果。
当被选择或鉴别等的结合伴侣为抗体多肽时，这些可用于体内治疗和预防应用，例如使特定易感染个体被动免疫(例如，免疫受损的患者、儿童、孕妇的胎儿、处于地方病区域的人们，等等)。例如，如果所述抗体能中和感染性或疾病相关因子，那么其可用药于适当的对象以抗击疾病。可选择地，抗体(或其他形式的结合伴侣)可附着于其他有治疗效应分子上，如细胞毒素因子(小分子或蛋白质)、前毒素(pre-toxin)或其他药物，并被导向病变组织或特定细胞类型，如肿瘤细胞或病毒感染性细胞。通过应用在因子中设计的其他功能，像激活巨噬细胞、补体或细胞毒T细胞的能力，例如通过将scFv变化为Ig，产生双特异性分子，例如连接肿瘤细胞和杀伤细胞，之后因子获得了所述激活能力，可以达到进一步的治疗效果。
可选择地这些抗体(或实际上和关联于特定组织或身体位点，或细胞类型如肿瘤细胞或病毒感染细胞的靶体相互作用的其他类型的多肽)可带标记，例如染料、荧光或放射性标记或酶可检测的标记，并用于体外或体内诊断，例如通过成像或标准的免疫组织化学步骤。其他优选的用途包括治疗诊断(theranostic)用途(即在诊断和治疗中都使用的抗体或结合伴侣)。此外，该抗体分子或其他结合伴侣可用于亲和层析过程以分离靶体。
尤其地，细胞表面表达的蛋白质的抗体为成功开发新的诊断和治疗药物提供一种被详细描述的的出发点。在癌症领域尤其是这样，其中对特异性的细胞表面标志以及与其结合的抗体的了解无疑是药品的研发中的瓶颈，而本发明方法可用于鉴别或选择新型的细胞表面标志(靶体)和抗体(结合伴侣)。目前，仅仅知道非常有限数量的细胞表面表达的与肿瘤相关的或肿瘤特异性的抗原决定部位。因而，这些类型的每个新型抗原决定部位-当然还有与其结合的特异性抗体-将在癌症的治疗中提供新的可能。可能的应用包括用于基于ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒)的治疗的裸露的全IgG抗体产品，重组的低聚-特异性/低聚化合价的结构成分，用于组织特异性和靶向治疗的融合蛋白免疫毒素和放射性标记抗体片段，以及用于体外和体内诊断的偶联染料或放射标记的抗体。
所述靶体，或其片段可用作疫苗，尤其用于癌症和感染疾病的治疗(当然依赖于涉及的靶体)中的疫苗。所述靶体采以肽、蛋白质或小分子药物的形式，可用作激动剂和拮抗剂，例如其可阻止或诱导像凋亡或调节细胞生长的功能。所述靶体还可用作进一步筛选的靶子，以鉴别更多的能起上述作用的分子。在一些情况中，所述靶体或其片段还可对本身起作用，如与其天然与其结合的分子的竞争性结合。
如果这些使用中需要，例如用于治疗的IgG1或IgG3类型的转换、用于成像的适合标记的整合或增加等等，对抗体分子的适当和合适的修改为本领域普通技术人员公知。
使用本领域普通技术人员能够设计的适当的试验，可容易地鉴别用于如上所述的各种使用的最合适的抗体。例如，在抗体或结合伴侣的高亲和力或亲合力非常之重要的应用中，使用标准的分析技术(如Biacore分析)可在候选的抗体中容易地测试这些标准。此外，当已鉴定出抗特异性感染因子，如细菌、病毒等的抗体时，可进行适当的试验以评价何种抗体能最有效中和所述感染因子。例如，对于细菌而言，可评价对所涉及细菌的杀菌和调理吞噬(opsonophagocytic)活性。类似地，对于病毒而言，可进行病毒的中和研究以鉴别最佳的候选物。
因而，本发明在更进一步的方面提供一种如此处所定义的抗体表达文库的应用以分离、检测、鉴别、选择或生产一种或多种特异性结合于一种或多种目标抗原的抗体分子，例如与特定的疾病、细胞、组织或外源因子相关的一种或多种目标抗原。例如，可通过用所述目标靶体筛选所述抗体表达文库来进行。
本发明又在另一方面提供了这种经分离、检测、鉴别、选择或生产的抗体分子(或其他结合伴侣)，或靶体用于治疗或体内诊断或用于如前所述任何其他应用。这种抗体分子(或其他结合伴侣)，或靶体在生产用于治疗(尤其是癌症或感染疾病的治疗)或体内诊断或用于如前所述任何其他应用的药剂或组合物中的使用也包括在本发明的范围内。还提供了患者的治疗方法，包括该抗体分子(或其他结合伴侣)或靶体的合适剂量的给药。
当所述的抗体分子(或其他结合伴侣)或靶体用于如前所述的用途和方法时，它们可以任何适合的方式给药。例如，该抗体分子(或其他结合伴侣)或靶体可在需要作用的位点局部给药，或者可附着于或者是相关联至有助于将所述抗体分子(或其他结合伴侣)或靶体导向至身体内适当位置的单元。
含有此处定义的所述抗体分子(或其他结合伴侣)或靶体，连同一种或多种制药学上可接受的载体或赋型剂的药物组合物构成本发明的又一个方面。
又一个方面是为对患者进行的诊断或成像方法，包括以此处定义的抗体分子(或其他结合伴侣)或靶体向患者适量给药，并检测在患者体内所述抗体分子的存在、定位和/或含量。
如果适当，从本发明所述的表达文库中经鉴别、选择等操作得到的所述抗体分子(或其他结合伴侣)或靶体可同样地用于在体外进行的诊断方法，例如，针对从患者体内获得或衍生于病人的组织样品或一些其他类型的样品如血液实施检测。
进行处理或诊断等操作的疾病优选为癌症、由感染性因子造成的感染性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病或变性的疾病。
此处使用的术语“治疗”或“处理”包括预防治疗。术语“治疗”和“处理”包括疾病或感染的抗击或治愈，也包括疾病或感染或者与此相关症状的控制或缓和。
AffiSelect(亲和选择)方法AffiSelect方法提供一种通过检测其配体(或至少通过检测与该配体相关联的实体)而不是检测所述文库成员(候选结合伴侣)以间接地鉴别所述文库成员(候选结合伴侣)的新技术。在筛选抗复杂配体如活细胞的小文库时尤其有价值，尽管本方法的适用性不限于这些应用。
因而，一言以蔽之，AffiSelect方法提供一种筛选分子文库(在这种情况中是指将要经受进一步分析的所述候选结合伴侣)以鉴别和/或选择文库中的一种或多种，作为一种或多种配体(靶体)的候选结合伴侣的成员，所述方法包括a)使候选结合伴侣的表达文库在溶液中与一种或多种配体接触；b)将已经与所述表达文库的一种或多种成员结合的配体捕获至固相；以及c)检测配体的存在，因而检测所述表达文库的一种或多种所述配体的候选结合伴侣的成员的存在。
因而，当与本发明的筛选方法结合使用，以为了对经鉴定的所述候选结合伴侣作进一步分析时，AffiSelect方法包括以下步骤i)使一种或多种所述候选结合伴侣在溶液中与一种或多种靶体接触；ii)将已经与一种或多种所述候选结合伴侣结合的靶体捕获至固相；以及iii)检测靶体的存在，因而检测靶体的一种或多种候选结合伴侣的存在。
因此，结合在本发明的筛选方法的描述中使用的术语，在下面AffiSelect方法的讨论中，对表达文库的任何提及可被认为是指将接受进一步分析的一种或多种候选结合伴侣，以及对配体的任何提及可被认为是指靶体。
对在AffiSelect方法中使用的表达文库(在这种情况中是指将接受进一步分析的候选结合伴侣)的主要要求之一是当它们开始与抗被筛选物的配体(靶体)接触时，其必须在溶液中。“在溶液中”是指当所述表达文库开始与抗筛选物的配体接触时，所述表达文库不附着于固相，即初始的表达文库为非固定化表达文库。
在AffiSelect方法中使用的表达文库(候选结合伴侣)结构成分(并且也指构成本发明方法步骤(a)中所筛选的表达文库的候选接合伴侣结构成分)可选地额外含有其他适当的成分，例如复制起点、诱导或非诱导的初始转录的启动子、增强子、抗生素抗性基因和标记、常规标签或报导分子、能通过如PCR扩增的所述结构成分的引物结合位点，或其他所需的序列元件。适当来源和在所述文库结构成分内定位这些附加的成分，以使得其表现出所需的功能属于本领域普通技术人员的常规实践范围。
在所述文库的结构成分内以及在所述表达的文库成员(候选结合伴侣)中所包含的常规标签或标记在AffiSelect方法中使用的表达文库中尤为重要，且这些标记被用于在所述方法的捕获步骤中帮助将文库成员(候选结合伴侣)结合至固相，即用于帮助捕获步骤。在这点上，可使用任何适合的标记，只要其能有助于将所述文库成员(候选结合伴侣)结合至固相。然而这些标记为亲和分子时较为方便，所述亲和分子通过与直接或间接固定在所述固相上的伴侣亲和分子结合，可以有助于与固相结合。典型的标记为c-myc标签(例如其能通过抗c-myc抗体而被捕获)或His标签(例如其能通过镍(Nickel)表面而被捕获)或生物素(例如其能通过链霉素亲和素分子而被捕获)，或噬菌体表面蛋白质如gp8(例如其可通过抗gp8抗体而被捕获)，或可被抗体识别的抗原肽标签如FLAG或HA。这些标记或标签也可方便地被直接或间接地检测。这些标记或标签是典型地存在于在全部所述文库结构成分中的常规标签，且能用于将所述文库成员捕获至固相上。这些标记或标签并不需要AffiSelect方法的检测步骤(因为通过检测配体而不是所述文库成员进行检测，见下面更详细的描述)。然而，如果需要，这些标记可用于检测文库成员的存在。在测定文库成员的配体的亲和力中，它们的存在尤为有效。
一旦获得了核苷酸水平的适合的表达文库(备选结合伴侣)结构成分，则其可在适当的表达体统中被表达，用于筛选以及用于本方法的步骤(i)。表达的适当条件和方法为本领域普通技术人员所公知。
在AffiSelect方法中使用的靶体可采以在前文对本发明的筛选方法中所描述的任何形式。因此，例如，所述靶体可以是作为整个细胞的一部分或作为细胞膜片段的细胞表面分子，也可以是附着于适当固相的相关的单独靶体。优选地，所述靶体为细胞表面分子。方便地，因为AffiSelect方法被用于进一步分析由本文所描述的有机相分离筛选方法初步鉴定的候选结合伴侣，所述靶体可与它们一样被用于这些方法的步骤(a)。
无论所述配体(靶体)为细胞表面分子或附着于适当固相的相关分子，为在AffiSelect方法中使用，所述配体含有报导部分或与之相关联以能够检测所述配体。这些报导部分优选地为核苷酸分子、更加优选地为DNA分子，其随后能通过基于核苷酸的方法检测。检测的一个优选方法是通过PCR，但是可使用任何适当的方法，例如标记探针的杂交。可选择地，所述配体可附着于非磁性荧光珠，或附着于具有可在显微镜下或通过Coulter CounterZM仪(Coulter Electronics公司)进行计数/检测的可区别型号的另一类珠体。因而，可以看出这些报导部分可采以大量的各种不同的形式，只要能够检测所述报导部分。
这些报导部分可与所述配体(靶体)内在相关联。例如，如果所述配体(靶体)为细胞表面分子，那么优选地被检测的报导部分可为DNA分子，如在表达/展示配体的细胞中存在的基因(即，报导基因)。因而，适合且优选的报导部分是在全部细胞类型中都存在的部分，例如，管家基因如β-actin(β-肌动蛋白基因)。
可选地，外源报导部分可与配体(靶体)相关联。例如，对于细胞而言，外源的报导部分(如报导基因)可通过标准的方法被导入至细胞内，例如转染，包括但不限于脂质转染法、逆病毒系统或电穿孔。
如果所述配体(靶体)为裸露的分子，如裸露的多肽，那么可使用本领域公知且有描述的方法用适当的报导部分标记或与之相关联，例如，如果所述配体与其的编码核苷酸或其他基于核苷酸的标记相关联，例如，根据前述，在该核苷酸分子范围内可方便地提供所述报导部分。如果所述配体是分子，例如多肽，附着于特定固相上，那么，例如使用上文描述的类似方法，所述报导部分可独立于所述多肽，附着于所述固相。尤其是，如果使用链霉素亲和素珠，那么所述报导部分优选地为含有可有助于检测所述报导部分的位点或区域的生物素化的DNA片段，例如能使所述报导基因的片段进行PCR扩增的引物位点或探针结合位点。那么各珠体可带有生物素化的报导部分和生物素化的多肽(或其他配体)的混合物。
因而可以看出，在报导部分和所述配体(靶体)之间的这种“相关联”可包括所述报导部分和所述配体之间的直接相互作用，即所述报导部分和所述配体是相同分子的一部分，例如所述配体蛋白质和所述报导部分相互连接作为同一分子整体的一部分。可选择地，这些“相关联”可为间接的，例如所述报导部分附着于或被包含于所述配体也附着于的部分内，例如被包含在表达或展示所述配体的细胞内，或被固定在所述配体所附着的固相上。
这些报导部分优选地为常规的报导部分，所述报导部分与被展示的所有配体(靶体)相关联，因而可用作常规试剂以检测任何和全部目标配体的存在(以及由此的备选结合伴侣的存在)。
在AffiSelect方法中使所述配体(靶体)与所述表达文库(候选结合伴侣)接触的步骤，反之亦然，可在一定条件下以任何适当的方法进行，以使得合适的候选结合伴侣可与所存在的配体(靶体)相互作用或结合。这种条件通常根据所述表达文库(候选结合伴侣)、所述配体(靶体)以及与配体(靶体)相关联部分的性质而变化。然而，本领域普通技术人员可容易地确定有助于结合的适当条件。这种“接触”步骤通常发生在适当的溶液或含水基质中。因而，如果所述配体存在于以单层培养的细胞上或从哺乳动物受试对象中获得的，例如来源于哺乳动物器官或组织的细胞上，那么在与所述表达文库接触之前，那些细胞通常以适当的技术在含水基质中收获并重新悬浮。
重要的是，人们发现在AffiSelect方法中，所述接触步骤可在细菌的表达培养基中进行，例如L Broth，以及在标准水基质如PBS中。由于这意味着文库成员(备选结合伴侣)可在细菌中表达(如通过在细菌表达培养基如L Broth中培养它们)以及可从表达平板中直接克隆以在AffiSelect筛选方法中使用，因而是重要的，也是令人吃惊的。优选地，在所述配体(靶体)被加入之前，及所述文库成员的表达已被诱导之后，这些细菌表达培养基被制成等渗透压的(例如，至大约140mM NaCl，(LB通常约171mM NaCl))。当所述配体(靶体)是位于活细胞而不是珠体上的细胞表面分子时，将所述细菌基质制成等渗透压的步骤尤为优选。
示例性的“接触”条件可包括在冰上或在4℃下孵育30分钟至4小时。然而，这些条件可依所述配体、表达文库等的性质而适当的变化。所述表达文库-配体混合物可选择地并优选地经受轻柔的摇晃、混合或旋转。此外，可加入其他适当的试剂如阻断试剂以降低非特异性结合。例如可使用1-4％BAS或其他合适的阻断试剂(如牛奶)。然而，应当意识到的是本领域普通技术人员依所述筛选方法的目的可改变所述接触条件。例如，如果增加孵育温度，如至室温，可增加鉴别与配体不同亚型的结合物的可能性，如与易于内在化的细胞表面蛋白质的结合物。对所述条件的这些调节亦属于本领域普通技术人员的实践范围。
通过改变与所述配体相关联部分的存在数量，可方便地改变配体(靶体)的拷贝数量。例如，当所述配体为细胞表面分子或附着于固相载体的分子，那么通过增加或降低细胞或固相载体在所述接触混合物中的数量可调节目标配体的数量。通过反复实验可容易地确定需要的配体量，但是，例如当所述配体为细胞表面分子时，使用5000至200000个细胞较为方便。实际上AffiSelect方法的优点在于其对于低至5000或1000个细胞(或甚至更低，例如使用PCR作为检测方法潜在地能检测单个细胞)进行操作也足够敏感。关于这点，尤其是用来自哺乳动物受试对象，如病人的活细胞进行筛选时，这些细胞通常为稀有资源且不能够大量获得。因而，能在如此少量的细胞上进行筛选是重要的优点。已经显示，当通过PCR进行检测且所述候选结合伴侣为抗体时，仅需要40pg抗体就能检测。这意味着AffiSelect方法适于分析以极低水平表达的配体分子的候选结合伴侣，例如当表达了低于1000个分子时。
在相同的反应容器或分析室(如分析孔)中可存在一个或多个类型的候选结合伴侣(即，一种或多种候选结合伴侣)以用于AffiSelect方法的接触步骤(i)(以及所述方法的随后步骤中)。然而，优选地在反应容器或分析室中仅存在一种类型的候选结合伴侣，以用于接触步骤(i)。
一旦配体(靶体)在一定条件下与表达文库(候选结合伴侣)接触，以使得所述配体与所述表达文库的一种或多种成员结合，随后以这种方法结合的所述配体被捕获至固相上以有助其从反应混合物的其他成员如非结合的配体中分离或移除或纯化。换句话说，在捕获步骤中，仅仅与表达文库成员(候选结合伴侣)结合的配体(靶体)被捕获至所述固相上。
关于这点，优选的固相为容易操作和清洗的微粒固相。磁性固相且尤其是微粒磁性微粒/珠体尤其优选。为了区别这些固相和配体(靶体)所附着的所述固相(如前所述)，这些固相被称为“捕获固相”。可以从利尼史特朗(Lillestrm)的Dyno Specialty Polymers AS公司，挪威和戴诺生物科技有限公司(Dynal Biotech ASA)商业获得合适的磁性珠体。可用于此处描述的方法的磁性珠体的具体例子为来自挪威的戴诺生物科技有限公司(Dynal Biotech ASA)的M-450、M-270或M-280珠体。
配体(靶体)-文库成员(候选结合伴侣)复合物可通过任何适当的方法被捕获至固相。根据AffiSelect方法的优选的方法涉及到所述固相上的捕获分子与表达文库成员(候选结合伴侣)相关联的伴侣分子或标签的相互作用，即所述候选结合伴侣上的分子或标签有助于所述捕获步骤。以这种方式，仅仅与所述表达文库成员结合的配体被捕获至所述固相。如果需要，未与所述表达文库成员结合的所有配体可通过一次或多次清洗所述固相的步骤被移除，或仅仅在捕获发生之后从反应混合物中分离所述固相。因而，可以看出，由于通过表达文库成员而不是所述配体促进捕获步骤，从剩余的混合物中分离所述固相可以移除未与文库成员结合的配体。
所述固相上的捕获分子和所述表达文库成员上的伴侣分子或标签之间的相互作用方便地基于亲和相互作用，尽管可使用任何其他适当的反应。例如，所述表达文库的成员可被设计为表达亲和相互作用的一个组分，且另一组分可通过任何适当的方法附着于固相。这种亲和相互作用优选的例子为抗体-抗原相互作用、链霉素亲和素-生物素相互作用。
链霉素包被的珠体可商业获得，且通过在配体-文库成员结合物中的文库成员部分存在有生物素分子，这些珠体可用于捕获配体-文库成员结合物。可选择地，如果表达文库为噬菌体文库，那么使用附着了抗噬菌体表面蛋白质的抗体的固相，如抗gp8，可容易地完成捕获。可选择地，所述文库成员可被设计为表达能被亲和伴侣识别的标签，所述亲和伴侣有助于与所述固相的结合。适当标签的例子为能分别被抗c-myc抗体(或其他适当的抗体)和金属离子(例如Ni2+)识别的c-myc(或其他抗原肽标签)或His标签，它们可以依次促进捕获至所述固相。当使用抗体促进捕获时，这些抗体可直接或间接地附着于所述固相，例如通过适当的二级或三级抗体如抗IgG抗体。根据使用的试剂，捕获可以任何适当的方式实现。因而，这些抗体可附着于固相，随后使所述固相与含配体(靶体)-文库成员(备选结合伴侣)复合物的混合物接触。可选择地，在所述抗体与所述固相结合之前，可使所述抗体与反应混合物中的文库成员结合(如通过二级抗体)以促进配体-文库成员的捕获。实际上，这是AffiSelect方法优选的实施例。本领域普通技术人员可容易地确定在温度和时间方面的适当的捕获条件。然而，示例性的条件可包括在室温或4℃孵育10分钟至2小时(取决于所述配体或文库成员的稳定性)，优选地伴随轻柔的摇晃、混合或旋转。本领域普通技术人员可容易地确定为了促进所述配体-文库成员复合物的捕获，应包含的固相的量，或应包含的固相对配体的比例。
在AffiSelect方法中，可在任何适当的阶段进行一次或多次清洗步骤。例如，如前所述，在步骤(ii)之后进行清洗步骤(或至少是分离步骤)以移除未与表达文库成员(候选结合伴侣)结合的配体(靶体)。在步骤(i)之后也可对与所述配体相关联的部分进行一次或多次清洗步骤(如清洗与配体相关联的细胞或固相)，以移除未与配体结合的表达文库成员。实际上，这些清洗步骤是优选的。在所述方法过程中的其他适当时候，也可对与配体相关联的部分进行一次或多次清洗步骤，例如以除去非结合实体。本领域普通技术人员可容易地确定应包括多少清洗步骤。
通过直接检测所述配体或至少通过检测与配体相关联的实体(非所述文库成员)来进行检测配体(靶体)存在的步骤。该步骤与现有方法形成对照，在现有方法中检测步骤通常通过检测与配体结合的所述文库成员而不是检测配体而进行。通过检测位于配体上或与所述配体相关联的报导部分的存在，可方便地进行对配体/靶体(以及由此的配体-文库成员复合物的存在，因为非复合的配体不能与固相结合、已经通过捕获步骤移除)存在的检测。适合的报导部分如前所述。如前面的描述，所述报导部分通常存在于全体配体上或与之相关联，即为全体配体的常规标记。因而，由于在各配体上(或与之相关联)存在相同的报导部分，阳性信号的存在显示配体-文库成员结合物的存在，以及由此的作为配体的候选结合伴侣的文库成员的存在。然而，应当注意的是，如果所述报导部分位于细胞内，即在配体为细胞表面分子的实施例中，那么在进行检测之前，其必须被暴露，如通过细胞溶解或其他细胞裂解方法。因此，在本发明的这些实施例中，当使用AffiSelect方法进行候选结合伴侣的进一步分析的情况中，阳性信号的存在进一步提示了与有关的靶体潜在结合的候选结合伴侣的存在。如果在检测反应中发现多于一种的候选结合伴侣，那么可进行进一步的分析以确定何种候选结合伴侣与所述靶体结合。然而，优选地，如前所述在检测反应中仅出现一种类型的候选结合伴侣，因此阳性信号的出现提示存在有与有关靶体潜在地结合的候选结合伴侣溶解/破裂细胞的适当的方法，以暴露例如存在于包含在细胞中的核苷酸中的所述报导部分，在本领域中公知且已被描述。在AffiSelect方法中使用的优选地裂解缓冲液试剂含真核细胞的蛋白酶K，在检测步骤之前，其消化蛋白质并可从DNA中除去组蛋白。在裂解缓冲液中也可以包括其它蛋白酶以用于AffiSelect方法。
如前所述，在AffiSelect方法中PCR是优选的检测方法。然而，可使用其他适当的检测报导部分的方法，如探针杂交、荧光珠体、不同大小的珠体等等(见前文)。PCR之所以为优选的是因为该方法的高度的敏感性(即使一个配体(或细胞)也可使用PCR检测)，还因为其可以获得关于所述配体的信息，例如序列信息(例如，如果所述配体与编码其的核苷酸相关联)，或所述配体的鉴定，例如，如果所述配体带有能鉴别所述配体的DNA分子标签，如带不同大小的DNA分子标签或者带有能用于特异性鉴定所述配体的具有特异性序列的DNA分子标签。
便利地是，所述PCR反应在溶液中进行(尽管其也可在固相上进行)，以及以标准方法检测PCR产物的存在与否，诸如在琼脂糖凝胶上(如E-gel 96系统，Invitrogen公司，可在20-30分钟内分析96个样品)。通常所述样品在进行PCR(或其他检测步骤)之前被充分混合。
通过本领域公知且已有描述的方法，根据所述报导部分的序列，选择适当的PCR引物以扩增全部或部分的所述报导部分。如果分析孔的核苷酸量合适，例如，如果配体由使用适当的表达载体已被转化至细胞的核苷酸编码(其含有适当的报导部分)，或者所述配体与编码其的DNA相关联，那么可选择PCR引物以扩增编码所述配体序列以及所述报导部分的核苷酸。其优势在于所述PCR产物可直接克隆至适当的载体进行测序，由此导致对所述配体序列的确定。
通过PCR或别的方式，阳性信号的检测对需要进一步研究的固相具有指示性。例如，如果在分析板孔的溶液中进行PCR，阳性信号表示所涉及的一个孔或多个孔含有配体(靶体)的至少一种潜在结合伴侣，其随后接受进一步的分析和研究。例如，在该孔中出现的细菌克隆(或其他文库成员)可接受彻底的筛选，如通过细胞-ELISA以鉴别表达配体的候选结合伴侣的所述克隆(文库成员)。随后，可进行适当的分析以进一步在基因和蛋白质水平对所述结合伴侣进行鉴别和定性。
通过与背景信号或已知的阴性信号进行比较，可方便地测定由PCR或其他方法产生的阳性信号。对所述阳性、背景，和/或阴性信号进行测量和比较的方式和方法为本领域普通技术人员所公知。在当所述靶体为细胞表面分子的实施例中，通过在不相关或阴性细胞上例如，在其表面不表达所述靶体的细胞，或仅以极低水平表达所述靶体的细胞上进行筛选而提供用于比较的优选的阴性信号。


下面，参考附图在随后非限制性的实施例中对本发明进行更详细的描述，其中图1表示根据本发明的方法在哺乳动物肿瘤细胞中选出的候选抗体克隆1(scFv1)和2(scFv2)的FACS分析，并说明这些克隆都与哺乳动物肿瘤细胞结合，因而说明两克隆的靶抗原都在哺乳动物肿瘤细胞中表达。
图2表示评价候选抗体克隆1(第1列)和2(第2列)与不同细胞系结合的FACS分析结果的表格。该结果示出克隆1对所测试的乳癌细胞系具有特异性，而克隆2与不同来源的肿瘤细胞系结合。
图3表示在使用2次清洗和有机相离心(org)以及外源凝集素包被磁性珠(beads)淘洗1-4回合(R1-R4)之后，用稀释噬菌体对肺癌细胞系A-549上进行的多克隆噬菌体ELISA。
图4表示AffiSelect PCR结果的一个实施例，在当被测试的scFv表达物与细胞结合的情况中(A-549，HUVEC和PBL)，AffiSelect PCR的结果示出扩增的β-actinDNA。根据三种细胞类型显示了相同的scFv表达物样品的结果(以相同的顺序)。
图5表示在使用2次清洗和有机相离心之后发现的一种scFv的FACS结果。根据在淘洗和预淘洗步骤中使用的相同的细胞类型(A-549，HUVEC和PBL)对该scFv进行测试。
图6表示用scFv2鉴别抗原的荧光筛选结果。5个肿瘤cDNA表达样品表现出对scFv包被的过滤器的高度结合性(圆圈)。这些样品在PBS/3％BSA包被的过滤器上为阴性(未显示)。
具体实施例方式
材料和方法细胞两种人乳腺癌细胞系(PM-1和MT-1，由挪威奥斯陆的挪威肿瘤医院，肿瘤生物学部(Department of Tumorbiology，Norwegian RadiumHospotal(DNR))惠赠)，肺癌细胞系(A-549，ATCC CCL-185，由Viventia Biotech Inc.惠赠；SW900，ATCC HTB-59，由DNR的肿瘤生物学部惠赠)，以及内皮细胞系(HUVEC，ATCC CRL-1730，由Viventia Biotech Inc.惠赠)被用于淘洗实验。两种乳癌细胞系培养于添加了10％FCS(Gibco BRL公司)，2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES(Cambrex公司)的RPMI-1640培养基(Cambrex公司)中。A-549培养于添加了10％FCS和2mM谷氨酰胺的Ham’s F12(Bio Whittaker公司)中。所述内皮细胞系培养于添加了10％FCS，15mg/l内皮生长因子添加剂(Sigma公司)和50mg/l肝素(Sigma公司)的RPMI-1640培养基中。细胞在37℃、5％CO2和湿润的环境中培养。对于各种实验细胞用PBS清洗，用含1mM EDTA的PBS收获，用PBS清洗一次并计数。对于淘洗实验，细胞或者重新悬浮于PBS/3％BSA(Sigma公司)或PBS/4％脱脂牛奶(Merck公司)中。
外周血淋巴细胞(PBL)是通过使用lymphoprep(Axis-Shield公司；详见制造商的操作手册)从新鲜的人血或血液黄层(buffy coats)中分离。细胞用PBS清洗一次，计数，以及重新悬浮于PBS/3％BSA或PBS/4％脱脂牛奶中。
外源凝集素包被磁珠根据制造商的操作手册，将M-450环氧树脂珠体与外源凝集素(WGA小麦胚芽，Triticum vulgaris，Calbiochem公司)连接。简而言之，清洗环氧树脂珠体，随后在含有10μg外源凝集素/107珠体的0.1M硼酸缓冲液中，pH8.5孵育，在室温下旋转过夜。珠体用PBS/0.1％BSA清洗三次，并以4×108珠体/ml在4℃下、于PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮钠中贮存。
噬菌体单链抗体(scFv)展示文库IgM scFv文库被用于淘洗实验由6个健康的捐赠人的PBL构建所述IgM scFv文库，在N末端移动连接子的HindIII位点，造成21个氨基酸的连接序列，之后，被克隆至基于pSEX81的噬粒展示文库中(Welschof等人，1997，PNAS，941902-1907，Lset，等人，2005，J.Immunol.Methods 29947-62)。
淘洗/接触步骤为移除与普通细胞蛋白结合的噬菌体，将3.75×1012的噬菌体(150μl文库，约2.5×1013cfu/ml)与2×105-2×106/ml非肿瘤细胞在被阻断的试管中4℃下旋转1hr(阴性预淘洗)进行孵育。PBS/3％BSA或PBS/4％脱脂牛奶被用作阻断剂。
在一个方案中，PBL被用于阴性预淘洗步骤。在阴性预淘洗之后，所述PBL用阻断溶液清洗两次，之后，所述减少的噬菌体文库加上两次清洗的上清液与乳腺癌细胞如上所述(淘洗)进行孵育。
在另一个方案中，两个阴性预淘洗步骤依次进行。在第一预淘洗步骤中，所述文库如上所述与PBL进行孵育。在所述第一预淘洗之后，所述PBL用阻断溶液清洗两次，随后，作为第二阴性预淘洗步骤，所述减少的噬菌体文库加上两次清洗的上清液与HUVEC在阻断的试管中4℃下旋转1-2hr进行孵育。对所述第二阴性预淘洗进行两次清洗之后，所述上清液加上两次清洗的上清液与肺癌细胞按照上面的描述(淘洗)进行孵育。
清洗/分离测试四种方法以从细胞结合的噬菌体中分离出游离噬菌体1)根据BRASIL方法的单步骤有机相分离(Giordano等人，2001，见前)淘洗之后，2×150μl的肿瘤细胞悬浮液被直接地在2×300μl有机相溶液(双丁基邻苯二甲酸酯∶环己烷9∶1[v∶v]；d＝1.03g ml-1)顶部分层。在以10,000g离心10min后，在室温下(RT)，试管在液氮中进行速冻，随后该试管的底部被切割，细胞团块被转移至另一个(被阻断)试管中。
2)如方法1，但在重新悬浮于300μl PBS/0.4％BSA以及有机相离心之前，有用1ml PBS/0.4BSA一次或两次的清洗步骤。
3)经典方法淘洗之后，所述肿瘤细胞被离心沉积(500g，5min，4℃)，且所述团块用1ml PBS/0.4％BSA冲洗5次。
4)使用磁珠淘洗之后，所述肿瘤细胞被离心沉积(500g，5min，4℃)，以5×106个细胞/ml重新悬浮在PBS/0.1％BSA中，并与外源凝集素包被珠(1∶4的细胞∶珠体比率)在4℃下，旋转孵育20分钟。使用磁铁，用1ml PBS/0.1％BSA将所述珠体清洗10次，并被重新悬浮于200μlPBS/0.1％BSA中。
感染将细胞团块或珠体加入至10ml对数生长期的大肠杆菌XL1blue中，并在37℃下以60rpm孵育15min，随后以200rpm进行45min。细菌以不同的浓度涂布于LBTAG平板(添加30μg/ml四环素(T)，100μg/ml氨苄青霉素(A)和100mM葡萄糖(G)的LB)用于评估，以及涂布于两块矩形大平板(243×243×18mm；Nunc公司)以用于随后的包装。所有的平板在37℃下孵育过夜。
包装刮获两块大平板的细菌。该细菌在液体培养基中繁殖，这些细胞中的噬粒与M13辅助噬菌体(Stratagene公司)被包装成噬菌体颗粒，在30℃过夜。第二天，用PEG/NaCl沉淀噬菌体，并重新悬浮于1mlPBS中，其中的100μl噬菌体(约1013cfu)被用于新一轮的淘洗。
多克隆噬菌体ELISA在4℃下用PBS/3％BSA阻断30min之后，肿瘤细胞和PBL与来自各轮淘洗的100μl噬菌体(1∶10-1∶106稀释)在4℃下孵育1hr。在用PBS清洗3次之后，所述细胞与100μl兔抗-Fd(Sigma公司；1∶4000)抗体在4℃下孵育1hr。在用PBS清洗3次之后，以单克隆辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig抗体(Dake公司；1∶4000)和底物ABTS(Calbiochem公司)进行ELISA。在405nm测量光吸收。(相对于多克隆噬菌体，当以单噬菌体进行ELISA分析时，使用类似的方法)。
大肠杆菌中scFv的表达和纯化来自淘洗回合的，在肿瘤特异性结合上表现出增长(多克隆噬菌体ELISA)的scFv被克隆至分泌型载体pHOG21(Kiprivanov等人，1997，J.Immunol.Methods，20067-77)内，且如前所述，单独的scFv克隆被表达在大肠杆菌XL-1-Blue中(Drsam等人，1997，FEBSLetters，4147-13)或者在96深孔板(100-200微升体积)中。用1mMIPTG(Sigma公司)在30℃过夜进行深孔板表达。第二天，所述平板以4000rpm，4℃离心10min，且该上清液(含表达后的scFv)被用于进一步的实验。在所述表达样品用于AffiSelect的情况下，被克隆的scFv DNA的多克隆集合被转化入符合要求的XL-1 Blue大肠杆菌中，并且涂布于LB-TAG 22×22cm生物分析板(Corning公司)上。用QPix2自动仪(Genetix，ltd.，英国)挑选单个克隆置入含添加～4％甘油的LB-TAG生长培养基[30μg/ml四环素(T)，100μg/ml氨苄青霉素(A)和1％(w/v)葡萄糖(G)]的384孔平板中并在37℃下培养过夜。单个的scFv克隆被重新接种于含LB-TAG培养基的384孔平板中，且以100μM IPTG诱导表达。第二天，在离心平板之前，将50μl PBS/3％BSA加入至各孔(含100μl表达物)中。
用5种不同的方法检测表达的scFv与细胞的结合性1)ScFv ELISA4℃以PBS/3％BSA阻断30min之后，肿瘤细胞和PBL与scFv(100μl深孔表达物或10μg/ml纯化的scFv)在4℃下孵育1hr。用PBS清洗3次之后，所述细胞与100μl鼠单克隆HRP标记的抗c-mys(Invitrogen公司；1∶4000)抗体在4℃下孵育1hr。用PBS清洗3次之后，以底物ABTS进行ELISA且在405nm测量光吸收。
2)8200细胞检测系统(Applied biosystems公司)在含5×10e4肿瘤细胞(PM-1)或PBL和抗c-myc-FMAT Blue(AppliedBiosystems公司)或鼠抗c-myc抗体(Invitrogen公司；1.25μg/ml)与羊抗鼠IgG-Alexa Fluor R647(Molecular Probes公司；2.5μg/ml)的组合的384孔平板中检测5μl 96深孔scFv表达物。在2-4小时的孵育之后，使用8200细胞检测系统测量scFv与细胞的结合性。，以仅具有二级抗体的信号强度和不相关的scFv结合的信号强度作为阴性对照的。
3)AffiSelect通过使用所述AffiSelect方法，根据肿瘤细胞(A-549)，PBL和HUVEC检测5μl 96深孔scFv表达物。为此，2.2×104细胞被离心成团块(1600rpm，4℃，5min)且与5μl表达样品和45μl PBS/3％BSA在4℃摇晃孵育1小时。所述细胞用150μl PBS/3％BSA清洗并离心(1600rpm，4℃，5min)。在向细胞团加入50μl抗c-myc抗体(Invitrogen公司；1∶500)后，所述细胞团在4℃摇晃孵育1小时。
细胞如前所述被清洗两遍，并与25μl 5×106珠体/ml(细胞∶珠体＝1∶5)的M-450淘洗鼠IgG珠体(Dynal公司)悬浮液在4℃下摇晃孵育1小时。用磁体以100μl PBS/3％BSA清洗珠体两遍之后，其被重新悬浮于100μl PBS/3％BSA中并转移至PCR平板。
所述珠体样品在含蛋白酶K(200μg/ml)，0.45％吐温和0.45％NP40的30μl PCR缓冲液中，55℃下，孵育过夜，并之后贮存于-20℃备用。在95℃下，30min热失活蛋白酶K之后，所述样品置于磁体上，且使用人类β-actin特异引物，5μl上清液用于PCR。在这个分析中，孔内存在β-actin PCR产物表明可能存在与细胞结合的scFv表达克隆。
4)FACS在4℃下，50μl scFv深孔表达物与1-5×105个细胞染色1小时。以150μl PBS清洗3次并离心(1600rpm，5min，4℃)之后，所述细胞与50μl FITC标记的抗c-myc抗体(Invitrogen公司；1∶30)在4℃下培育1小时。细胞如前所述被清洗3次，用200μl PBS/1-2％甲醛(Sigma公司)固定并贮存在4℃等待FACS仪(Coulter公司)测量。
5)Guava(单细胞微量分析仪)如在FACS中描述的那样，50μl scFv深孔表达物与1×105细胞染色1小时。为避免内在化，在一些情况下，在将细胞与scFv表达物进行孵育之前，细胞用50μl PBS/1-2％甲醛(30min，4℃)固定并用PBS清洗三次(1600rpm，5min，4℃)。结合的scFv的可视化以如在FACS中所述的用FITC标记的抗c-myc抗体进行或者用与抗c-myc抗体的组合进行(1小时，4℃；5μg/ml；Sigma公司)，随后如在FACS中所述以PBS清洗3次，以及与FITC标记的抗鼠IgG抗体进行孵育(1小时，4℃；1∶200；Dako公司)。三次PBS清洗并如FACS中所述的固定之后，该样品在4℃贮存等待Guava EasyCyte仪(GuavaTechnologies公司)测量。
细胞的过滤筛选实验测试条(Test-strips)为了测定固定在硝化纤维素膜(Schleicher & Schuell公司)上的细胞的最优化浓度，测试条(约6×4cm)用在PBS中不同含量的细胞(5×104-5×106细胞/ml)在RT包被2hr。用PBS清洗两次之后，该膜在RT用鼠单克隆抗MHC class I抗体(Dako公司；1∶600)孵育1hr。被包被的细胞通过与HRP标记的兔抗鼠Ig抗体(Dako公司；1∶10,000)进行孵育并用ECL测定仪(Amersham公司)而被直观化。
测试分析之前在细胞ELISA中显示阳性的scFv克隆在过滤筛选分析(filterscreening assay)(Stacy等人，2003，J.Immunol.Methods，283247-259)中进行测试。简而言之，scFv克隆被排列在硝化纤维素过滤器上。在有IPTG存在的情况下表达过夜之后，测试所述scFV被与细胞包被的过滤器的结合性。所述过滤器用鼠单克隆抗MHC class I抗体(1∶600)进行孵育，且通过HRP标记的抗c-myc抗体(1∶10,000)和ECL测定仪而被直观化。对5种不同的阻断剂(PBS/2％BSA，PBS/4％脱脂牛奶，SuperBlock(Pierce)，Casein Blocking缓冲液(Sigma)，2％BlotBlock(BDH))所引起的背景信号的降低进行了测试。
抗原鉴定肿瘤cDNA文库的构建和淘洗根据在先的记载(Foss等人，2004，Cancer Immunol.Immunother.，53431-438)，由肿瘤细胞系SW900构建cDNA噬菌体展示文库。为了找到对应于scFv的相关抗原，对scFv包被的maxisorp试管(Nunc.公司)进行生物淘洗。简而言之，用在PBS/3％BSA或PBS/4％牛奶中的10μg/mlscFv包被maxisorp试管，在4℃旋转过夜。第二天，在被加入所述scFv包被的试管之前，所述cDNA噬菌体展示文库在PBS/3％BSA或PBS/4％牛奶中阻断15分钟。在所述文库以RT旋转孵育2hr之后，该试管以PBS/0.05％吐温清洗10次，随后以PBS清洗10次。通过将该试管与500μl 100mM TEA(Sigma公司)旋转孵育5分钟，而洗脱结合的噬菌体。用500μl 1M Tris-HCl pH7.5中和该洗脱的噬菌体之后，500μl被用于感染10ml XL1-Blue(如前所述)。在如前所述的包装之后，所述噬菌体被用于对scFv包被的试管进行新一轮的淘洗。在scFv包被的maxisorp平板(Nunc.公司)上以多克隆噬菌体ELISA来测试由3轮淘洗中回收的噬菌体。
表达的肿瘤cDNA克隆的过滤筛选通过PCR扩增在scFv特异性结合(多克隆噬菌体ELISA)上表现出增强的来自淘洗步骤的肿瘤cDNA，并被克隆入含HA标签的改进的分泌型载体pHOG21中。肿瘤cDNA克隆被排列在硝化纤维素过滤器上，过夜后，检测含IPTG的表达物，与scFv包被的过滤器的结合性(de Wildt，RM等人，Nat.Biotechnol.2000，18(9)，989-994)。该过滤器与鼠单克隆抗HA抗体(0.2μg/ml；Roche公司)进行孵育，结合性通过HRP-标记的兔抗鼠抗体(1∶10000；Dako公司)和ECL测定仪而被直观化。
实施例1-测试BRASIL方法在与所述噬菌体文库孵育1-2小时之后，两种乳腺癌细胞系和PBL被离心穿过有机相，且在进行了有机相离心之后，对其在含水层(上面的相)和有机层(团块)中的回收物进行检测。作为阴性对照，1011个噬菌体被离心以评价进入所述有机相的游离噬菌体的数量。
检测对人肿瘤细胞系(PM-1和MT-1)和PBL进行淘洗之后的回收物。表明PBL必须被新鲜分离。从冰冻的等分试样中解冻的PBL在淘洗步骤中易于变粘。离心之后，在有机相的细胞团块中测得75％(PM-1)，97％(MT-1)和71％(PBL)。其百分比太高以致不具有生物显著性人们所期望的是整个天然抗体文库的仅仅有少量的百分比将与给定的细胞类型的细胞表面蛋白质结合。穿过有机相的游离噬菌体的数量仅为2×10-5％，在以后可以忽略。
因此，证明BRASIL方法不实用仅使用有机相离心作为分离步骤，在所述细胞团块中发现大量的(非特异性)结合物。
实施例2-从细胞结合的噬菌体中分离游离噬菌体的四种方法的比较1)基于BRASIL方法的单步骤有机相分离(Giordano等人，2001)在淘洗之后，2×150μl的肿瘤细胞悬浮液直接在2×300μl的有机相溶液(双丁基邻苯二甲酸酯∶环己烷9∶1[v∶v]；d＝1.03gml-1)的顶部分层。在以10,000g离心10min后，在室温(RT)下，试管在液氮中进行速冻，随后该试管的底部被切割掉，细胞团块被转移至另一个(阻断)试管中。
2)如方法1，但在重新悬浮于300μl PBS/0.4％BSA以及有机相离心之前，有一次或两次用1ml PBS/0.4BSA清洗的步骤。
3)经典方法淘洗之后，所述肿瘤细胞被离心沉积(500g，5min，4℃)，且所述团块以1ml PBS/0.4％BSA冲洗5次。
4)磁珠淘洗之后，所述肿瘤细胞被离心沉积(500g，5min，4℃)，重新悬浮在PBS/0.1％BSA中，并与外源凝集素包被珠(1∶4的细胞∶珠体比率)在4℃下，旋转孵育20分钟。使用磁铁，所述珠体在1ml PBS/0.1％BSA中被清洗10次，并被重新悬浮于200μl PBS/0.1％BSA中。
在第一次实验中，新方法(2)与BRASIL方法(1)和5次清洗步骤的经典方法(3)进行了比较。使用的肿瘤细胞为PM-1乳腺癌细胞系，且使用PBL的阴性预筛选按照如材料和方法部分的描述进行。
在另一个实验中，对方法(2)和使用外源凝集素包被的磁珠从细胞结合的噬菌体中分离游离噬菌体(方法4)进行了直接的比较。使用的肿瘤细胞为A-549肺癌细胞系，且使用PBL和HUVEC的阴性预筛选按照如材料和方法部分的描述进行。
方法1、2和3的比较在4轮淘洗、分离(视情况使用方法1、2或3)、转染和包装之后，对从4个轮中的每轮回收的噬菌体分别进行多克隆噬菌体ELISA以检测与所述肿瘤细胞而非PBL结合的噬菌体的增加量。仅进行2轮淘洗后，在方法2中观察到了这种增加，然而，方法1和方法3分别在第4和3轮之后才表现出富集。在亚克隆入表达载体pHOG21之后，对来自各方法第3轮的95个克隆进行scFv ELISA。不仅考虑富集的时间点(第2轮)，而且考虑相比较于方法1(第4轮，11/94)和方法3(第3轮，27/95)的scFv结合物(39/95)的数量，证明方法2为最佳的方法。
方法2和4的比较多克隆噬菌体ELISA的结果显示，仅经过2轮淘洗，在方法2和4中都观察到与肿瘤细胞结合的噬菌体的增加。不同的是，当与方法4相比(图3)，在第3和4轮淘洗之后，方法2表现出增加的富集效果(将噬菌体稀释10-2倍后，曲线上升)。
因此，方法2(即，本发明的方法)相对于现有技术的方法具有显著的优点，尤其是在能进行更少的淘洗回合而鉴定更多的阳性克隆方面。
实施例3-在1或2次清洗后，采用有机相分离的成功的淘洗方案两种淘洗方案成功地采用1或2次清洗和有机相分离的组合。
1)乳腺癌方案乳癌细胞系(PM-1)被用于淘洗噬菌体scFv展示文库。按照在材料和方法部分的描述，用新鲜的人PBL进行阴性预淘洗。在这些实验中，研究了在有机相离心之前清洗的影响和其与经典方法的比较(见上文)。
在一次清洗和有机相离心之后，测试单独的噬菌体和来自第三轮淘洗的scFv在细胞ELISA和FACS测量方法中相对于PBL和所述肿瘤细胞系的特异性。发现了三种独特的、肿瘤细胞系特异性的克隆(克隆1，2和3)。用8200细胞检测系统和Guava分析仪测试单scFv的表达，又发现5种更为独特的、肿瘤细胞特异性的克隆(数据未显示)。在挪威肿瘤医院(DNR，奥斯陆，挪威)，以FACS实验对第一批的3种克隆进一步的研究，结果显示一个scFv克隆(1)主要与乳腺癌细胞系结合，而其他scFv克隆(2)与不同来源的肿瘤细胞系结合，如，前列腺、神经胶母细胞瘤、肺和直肠的肿瘤细胞系(图1和2)。结果还显示两类克隆在肿瘤细胞的目标抗原不是Her-2/neu、EGF-R或CEA，因此意味着其可识别一新型的肿瘤抗原。FACS和共聚焦显微镜的数据显示，在这种情况下，scFv克隆1和2都与内在化的抗原结合。
因此，能够观察到本发明的方法能用于鉴定在细胞表面表达的分子的特异结合伴侣(在这里是scFv抗体片段)。
2)肺癌方案肺癌细胞系(A-549)被用于淘洗噬菌体scFv展示文库。按照在材料和方法部分的描述，用新鲜的人PBL和内皮细胞系(HUVEC)进行阴性预淘洗。在这些实验中，对有机相离心之前采用2次清洗的方法(方法2)和采用外源凝集素磁珠从细胞结合的噬菌体中分离游离噬菌体的方法(方法4)进行直接比较。
在两次清洗和有机相离心之后，测试来自第3轮淘洗的scFv表达物在AffiSelect和细胞ELISA中相对于PBL、HUVEC和肿瘤细胞系A-549的特异性(图4)。如在图4的例子中所示，所检测的8个抗肿瘤细胞系的scFv表达样品显示出PCR扩增出的β-actinDNA，然而采用HUVEC和PBL未观察到这些产物。这显示出，在这种情况下，8种被测试的scFv样品结合于肿瘤细胞系，而不是HUVEC或PBL。在由FACS(图5示出了一示例克隆)和Guava分析(数据未显示)验证肿瘤细胞系特异性的结合之后，发现10种独特的、肿瘤细胞系特异性的克隆。
因此，再一次能够观察到本发明的方法能用于鉴定在细胞表面表达的分子的特异结合伴侣(在这里是scFv抗体片段)。
实施例4-测试不同品牌的PCR薄壁管对不同品牌0.5ml薄壁PCR管在有机相离心和冷冻后的切割过程中的稳定性进行检测。
在测试的PCR薄壁管中，0.5ml薄壁的Eppendorf PCR管(#0030124.502)和Axygen PCR-05-C管(#321-05-051)是最佳的管。在速冻所述有机相之后，从V-形区域的正上方切割管体以避免该管裂开。
实施例5-有机相对噬菌体转染的影响采用108和1011的噬菌体以及100和200μl的有机相来转染10ml在对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene公司)。在37℃，以60rpm，对细菌进行15min的孵育，此后以200rpm进行45min并在LBTAG平板上以不同浓度进行涂布。在37℃孵育过夜后，计算菌落的数量。
使用较低的噬菌体滴度(较之1011的108)进行操作时，有机相的存在对于转染率具有负面影响(大约降低50％)。使用较高的噬菌体滴度时，未观察到这种影响。
正如从结果和此处的讨论中可见，采用以细胞筛选抗体表达文库的所述方法，抗体的筛选不依赖于纯化的和/或重组抗原的可获得性，且甚至能发现新的细胞类型特异性的抗原。因此，使用本发明方法的细胞淘洗，结合细胞过滤器筛选或其他方法，如AffiSelect或8200细胞检测系统(Applied Biosystems公司)的组合，为高通量的筛选和选择抗细胞表面抗原的抗体，提供了技术平台。
实施例6-对来自成功的淘洗方案的肿瘤特异性克隆的目标靶的鉴定，所述成功淘洗方案采用1或2次清洗后的有机相分离方法。
使用来自乳腺癌淘洗方案的两种scFv克隆(克隆1和2，见图1和2)鉴定其靶体，该乳腺癌淘洗方案采用1次清洗后有机相离心。
为了目标靶鉴定，由阳性细胞系(SW900；scFv1和2的高表达抗原)构建肿瘤cDNA噬菌体展示文库。随后，该文库被用于对分别包被了scFv1和2的薄壁管进行淘洗。在3轮淘洗之后，由过滤器筛选来测试单个的肿瘤cDNA克隆的表达物对scFv1和2包被的过滤器的结合。在鉴定scFv2抗原的情况中，发现5个肿瘤cDNA克隆与scFv-2涂覆的过滤器结合(图6)。序列分析显示全部5种克隆对应于相同的核苷酸序列。
在鉴定scFv1抗原的情况中，12个肿瘤cDNA克隆表现出与scFv1包被的过滤器的结合(数据未示出)。
通过在scFv包被的平板上进行ELISA，验证scFv与肿瘤cDNA克隆的结合。此外，scFv1和2现在都被用于免疫沉淀实验、1维和2维的PAGE，多肽萃取和质谱分析中。
因此，可以看出，本发明的方法能进一步用于鉴定与所述结合伴侣相互作用的目标靶体(在这里为目标抗原)，所述结合伴侣经过本文所述的改进的有机相分离方法鉴定。
权利要求
1.一种筛选分子文库以鉴别或选择所述分子文库中的作为一种或多种靶体的候选结合伴侣的一种或多种成员的方法，所述方法包括(a)使表达文库与一种或多种靶体接触；(b)使所述靶体接受至少一次清洗步骤；(c)通过贯穿有机相的分离，从所述表达文库未结合的成员中分离与所述表达文库的一种或多种成员结合的靶体，因而从其他文库成员中分离所述靶体的候选结合伴侣。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达文库是噬菌体展示文库。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达文库是抗体表达文库。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗体表达文库包括scFv抗体。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述靶体是细胞表面分子或者附着于固相的分子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞表面分子以完整细胞的组分或以细胞的膜片段的形式提供。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述靶体为抗原。
8.根据权利要求5至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述细胞被编码所述靶体的核酸转化或转染，或者被编码靶体文库的核酸转化或转染，或者是过量表达所述靶体的细胞。
9.根据权利要求5至8中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述细胞为真核细胞。
10.根据权利要求5至9中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述细胞与疾病状态相关。
11.根据权利要求5至10中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述细胞为癌细胞。
12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固相为微粒固相。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中提供了多于一种的靶体。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中进行至少2次、至少3次、或至少4次的清洗步骤。
15.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中进行1、2、3或4次清洗步骤。
16.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其特征在于，通过离心进行所述贯穿有机相的分离。
17.根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述方法步骤(a)之前进行的一次或多次预淘洗步骤，其中所述表达文库与一种或多种非相关的实体进行接触。
18.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(a)至(c)被重复一次或多次。
19.根据权利要求1至18中任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(a)至(c)被重复1、2或3次。
20.根据权利要求1至19中任一权利要求所述的方法，其特征在于，与所述表达文库的一种或多种成员结合的所述靶体被进行进一步的分析。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述进一步的分析是对所述候选结合伴侣和/或所述靶体的进一步分析。
22.根据权利要求1至21中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述候选结合伴侣从所述靶体中被分开、移出、洗脱，或分离，或者独立于所述靶体被表达或产生。
23.根据权利要求21或22中所述的方法，其特征在于，对所述候选结合伴侣的所述进一步分析包括如下步骤i)使一种或多种所述候选结合伴侣在溶液中与一种或多种靶体接触；ii)将与一种或多种所述候选结合伴侣结合的靶体捕获至固相；以及iii)检测靶体的存在，因而检测靶体的一种或多种候选结合伴侣的存在。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶体如在任一前述的权利要求中的定义。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述候选结合伴侣包括有助于捕获步骤(ii)的标签或标记。
26.根据权利要求23至25中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的靶体含有报导部分或与之相关联以能够检测所述靶体。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述报导部分为DNA分子。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述靶体为细胞表面分子，且所述报导分子为存在于细胞内的DNA分子，在所述细胞上表达有所述靶体。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述DNA分子为外源管家基因或者为外源报导部分。
30.根据权利要求23至29中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中所述的固相为磁性的且优选地为微粒。
31.根据权利要求23至30中任一权利要求所述的方法，其特征在于，通过在所述固相上的捕获分子和与所述候选结合伴侣相关联的标签或分子之间的相互作用促进所述捕获步骤。
32.根据权利要求23至31中任一权利要求所述的方法，其特征在于，通过检测所述靶体上或与所述靶体相关联的报导部分的存在而进行所述检测步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述检测步骤通过PCR进行。
34.一种分离和/或鉴别未知靶体的方法，所述方法包括在权利要求1至33中的任一权利要求定义的步骤，且进一步包括(d)分离与所述未知靶体结合的一种或多种表达文库成员，以及(e)使用所述文库成员分离和/或鉴别与其结合的靶体。
35.一种从表达文库中选择、鉴别和/或分离作为靶体的特异性结合伴侣的文库成员，或者选择、鉴别和/或分离靶体的方法，所述方法包括在权利要求1至33中的任一权利要求定义的步骤以选择显示一定特性的分子，以及可选择地(e)鉴别和/或分离作为所述靶体的特异性结合伴侣的相关文库成员，以及可选地(f)使用所述文库成员鉴别和/或分离与其结合的靶体。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，权利要求34所述的步骤(e)或权利要求35的步骤(f)包括使用所述文库成员以筛选由所述未知靶体在其上表达的细胞制备的cDNA文库。
37.根据权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法还包括生产或表达所述结合伴侣或靶体，或者其部分、片段、变体，或衍生物的步骤，以及可选地将所述结合伴侣或靶体与至少一种制药学可接受的载体或赋性剂配成制剂的步骤。
38.使用权利要求1至37中的任一权利要求限定的方法鉴别、选择、分离、生产、表达或配成制剂的结合伴侣或靶体。
39.使用权利要求1至37中的任一权利要求限定的方法鉴别、选择、分离、生产、表达或配成制剂的结合伴侣或靶体在体外分析或在体外诊断分析中的用途。
40.使用权利要求1至37中的任一权利要求限定的方法鉴别、选择、分离、生产、表达或配成制剂的结合伴侣或靶体在用于治疗或体内诊断的药物或组合物的生产中的应用。
41.一种对患者的治疗方法，包括使用权利要求1至37中的任一权利要求限定的方法鉴别、选择、分离、生产、表达或配成制剂的结合伴侣或靶体的适当剂量的用药。
全文摘要
本发明提供一种筛选分子文库以鉴别或选择所述分子文库中的作为一种或多种靶体的候选结合伴侣的一种或多种成员的改进方法，包括(a)使表达文库与一种或多种靶体接触；(b)使所述靶体接受至少一次清洗步骤；(c)通过贯穿有机相的分离，从所述表达文库未结合的成员中分离与所述表达文库的一种或多种成员结合的靶体，因而从其他文库成员中分离所述靶体的候选结合伴侣。
文档编号G01N33/68GK101052879SQ200580034143
公开日2007年10月10日 申请日期2005年10月7日 优先权日2004年10月8日
发明者马里克·若泽·雅内克·格特鲁德·斯塔萨, 赫勒尔德·雷厄瑟夫 申请人:奥菲技术科学院