专利名称：样品的高效侧流免疫测定的制作方法
背景技术：
已有一些公知的免疫测定方法，其使用了用可检测成分标记的免疫反应物从而可分析性地检测被分析物。例如，“夹层型”测定一般涉及使测试样品与可检测探针(例如染色胶乳或放射性同位素)混合，这些探针与被分析物的特异性结合成员结合。结合的探针与被分析物形成复合物。这些复合物随后到达固定有抗体的区域，在此处抗体和被分析物之间发生结合从而形成三元的“夹层复合物”。夹层复合物位于检测被分析物的区域。这种技术可用于得到定量或半定量的结果。另一种供选的技术为“竞争型”测定。在“竞争型”测定中，标记物一般为与存在于样品中的任何未标记被分析物进行结合抗体竞争的经标记的被分析物或被分析物类似物。一般使用竞争型测定来检测被分析物，例如半抗原，每个半抗原为单价的且仅能结合一个抗体分子。
另一种测定为抑制/溢流测定，其中用被分析物划第一条线形成条带，且用对结合颗粒上的抗体具有特异性的抗体(例如山羊抗小鼠或“GAM”)划另一条线形成条带。在这种测定中，所存在的任何被分析物都将与具有对被分析物具有特异性的抗体(或其他结合剂)的结合颗粒结合。在被分析物含量低于某一阈限量的情况下，颗粒不会由被分析物完全覆盖，即不会被完全抑制，因此其仍能在划有被分析物的第一条线处形成复合物。当被分析物低于阀限含量时，这种抑制线基本上起除去/结合结合物的作用。下一条线(其由识别结合颗粒上的抗体的抗体组成)将作为“溢流”线。仅在被分析物含量高于阈限含量的情况下，其才结合颗粒(从而使得形成有色线(colored line))。另外，可使用阳性对照线，例如划羊抗兔(“GAR”)线以捕获不同种群的结合颗粒(例如那些在其上具有兔抗体的颗粒)。只要测试可行且已适当地进行，这种线就将总是形成。
流通(flow through)或侧流(lateral-flow)测定已越来越常用于多种被分析物，但是许多情况需要相对大的样品量以使样品和标记物或结合颗粒流动，这是侧流测定的特征。更详细地讲，现用的侧流测定使用位于样品沉积点下游和检测区上游的结合物。依靠样品本身再悬浮结合物且携带它们到检测区。或者，可与样品一起加入其他稀释剂以携带样品到结合垫，帮助再悬浮结合颗粒，随后到达检测区。在两种情况下，样品加入通常施加在结合颗粒上游以帮助颗粒再悬浮。应注意，“上游”和“下游”是指在测定装置上物质相对于样品流动方向的位置。
尽管由这些装置可实现各种益处，但是其不总是产生所要的信号(线)强度。这限制了可使用这些装置的情况，因为在被分析物含量低的情况下信号可能不明显。常规测定还可能提供较低可靠性，这是因为(血液)样品的强烈红色或者因为可能引起样品流动问题的样品粘度。因此，存在对于在不需要大量样品的情况下可提供更强信号(线)强度以及可靠结果的改进的测定技术的需要。
发明概述根据本发明的一个实施方案，公开了一种用于检测存在于测试样品中的被分析物的存在或量的侧流测定装置。该测定装置包括与多孔膜液体连通的结合垫，该多孔膜还与芯吸垫连通。应注意到，结合垫、多孔膜和芯吸垫可为具有所有三个区域的功能的单种材料。
多孔膜可由使检测探针能够通过的多种材料中的任一种(例如硝化纤维)制造。多孔膜具有其中固定有第一捕获试剂的检测区。将该第一捕获试剂构建成与被分析物和被分析物-结合物复合物的至少一部分结合以产生一定的检测信号。第一捕获试剂可选自抗原、半抗原、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、一次或二次抗体及其复合物。第一捕获试剂例如可与被分析物与结合的检测探针之间形成的复合物结合。
对照区位于多孔膜上检测区下游。第二捕获试剂固定在对照区内，构建该第二捕获试剂以使其与结合物、结合物-被分析物复合物或纯探针结合，以表明测定正常进行。在一个实施方案中，第二捕获试剂选自抗原、半抗原、聚电解质、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、一次或二次抗体及其复合物。
结合垫含有存在被分析物时产生信号的检测探针。结合垫还可包含其他不同的探针类群，包括用于在对照区指示的探针。如果需要，检测探针可包括选自以下的物质发色体、催化剂、发光化合物(例如荧光、磷光等)、放射性化合物、可见标记、颗粒(例如染料、金、银或其他光密(optically-dense)材料)、脂质体及其组合。特异性结合成员可选自抗原、半抗原、适配体、一次或二次抗体、生物素及其组合。
存在缓冲液释放区，其远离该膜与结合垫末端液体连通。在样品已沉积在结合区和检测区之间的装置上后，缓冲液从上游缓冲液释放区释放。缓冲液将探针从结合垫洗涤到检测区，在此处探针将由被分析物(如果存在)捕获在检测区上，并且产生阳性结果。如果样品不含被分析物，那么检测线将是阴性的。缓冲液混合物(还含有一些探针(其可包括与检测探针不同的探针))继续到对照区，在此处试剂捕获了结合物、结合物-被分析物复合物或纯探针以表明测定进行正常。
芯吸垫与膜液体连通且提供使液体移动的驱动力。
该方法涉及将样品加到颗粒下游，而不是颗粒上游的常规位置。样品沉积之后，稀释剂在颗粒上游的测试条带的点处释放。稀释剂随后提供所需流体以再悬浮颗粒，从而使颗粒可从测试条带流下。在接触颗粒之后，稀释剂-颗粒混合物流下到达接触样品(例如血液)的点从而进行其余测定。已经发现这种方法在某些情况下增加线信号强度。
根据本发明的另一个实施方案，公开了用于检测存在于测试样品中的被分析物的存在或量的方法。该方法包括以下步骤i)提供具有与结合垫和芯吸垫液体连通的多孔膜的侧流测定装置，该结合垫具有与被分析物的特异性结合成员结合的检测探针，该多孔膜限定了其中固定有第一捕获试剂的检测区和其中固定有第二捕获试剂的对照区，其中对照区位于检测区下游，结合垫位于多孔膜上游且缓冲液释放区在结合垫上游；ii)使含有被分析物的测试样品在结合垫下游与装置接触；iii)从缓冲液释放区释放缓冲液从而使缓冲液携带检测探针到样品施加区域，随后到检测区和对照区；iv)检测检测信号。
以下更详细地论述本发明的其他特征和方面。
附图简述
图1为本发明的侧流测定装置的一个实施方案的透视图。
发明详述本文所用的术语“被分析物”通常是指有待检测的物质。例如，被分析物可包括抗原物质、半抗原、抗体及其组合。被分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括那些出于治疗目的而施用的药物以及那些出于非法目的而施用的药物)、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒、酵母、真菌、原生动物和上述物质中任一种的代谢产物或抗体。一些被分析物的具体实例包括铁蛋白；肌酸酐激酶MB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥(phenobarbitol)；卡马西平(carbamazepine)；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼丁；促黄体生成激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇、黄体酮；C-反应性蛋白；脂质运载蛋白(lipocalin)；IgE抗体；细胞因子；维生素B2微球蛋白；糖化血红蛋白(Gly.Hb)；皮质醇；毛地黄毒苷；N-乙酰普鲁卡因胺(NAPA)；普鲁卡因酰胺；对风疹的抗体，例如风疹IgG和风疹IgM；弓形体病的抗体，例如弓形体病IgG(Toxo-IgG)和弓形体病IgM(Toxo-IgM)；睾丸激素；水杨酸酯；醋氨酚；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；乙型肝炎核心抗原的抗体，例如抗乙型肝炎核心抗原IgG和IgM(Anti-HBC)；人类免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人类T细胞白血病毒1和2(HTLV)；乙型肝炎e抗原(HBeAg)；乙型肝炎e抗原的抗体(Anti-HBe)；流感病毒；促甲状腺激素(TSH)；甲状腺素(T4)；总三碘甲腺原氨酸(Total T3)；游离三碘甲腺原氨酸(Free T3)；癌胚抗原(CEA)；脂蛋白、胆固醇和甘油三酯；和甲胎蛋白(AFP)。滥用的药物和受控制的物质包括但不限于安非他明；甲苯丙胺；巴比妥酸盐，例如异戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮杂革，例如利眠宁和安定；大麻素，例如印度大麻和大麻；古柯碱；芬太尼；LSD；安眠酮；鸦片剂，例如海洛因、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、氧可酮、氧吗啡酮和鸦片；苯环利定；和丙氧芬。其他可能的被分析物可描述于美国专利第6,436,651号中。
本文所用的术语“测试样品”通常是指被怀疑含有被分析物的材料。例如，测试样品可包括直接从来源获得的材料，以及使用一些技术预处理的材料，这些技术例如但不限于过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰成分的钝化、加入试剂、溶胞作用(lasing)等等。测试样品可来自生物来源，例如生理流体，包括血液、间质液、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹腔积液、粘液、滑液、腹膜液、阴道液、羊膜液等等。除了生理流体之外，可使用其他液体样品，例如水、食品等等。另外，被怀疑含有被分析物的固体材料也可用作测试样品。
通常，本发明涉及用于检测存在于测试样品中的被分析物的存在或量的侧流测定装置。
在常规侧流方法中，样品一般施加在固定结合颗粒的位置的上游，从而使样品可帮助再悬浮颗粒以使测试进行。然而，相反地，本发明公开了为了减少或消除与小量样品(例如在基于血液的测定中)相关的问题而施加样品的新方法和/或位置。在其中样品量可能更有限的特殊应用(例如基于血液或基于拭子的应用)的情况下，可使用稀释剂与样品混合，从而降低所需的体液量。在这些情况下，稀释剂本身可使固定的颗粒再悬浮。
已知的测定需要样品中的目标被分析物从沉积点移动到其可被检测出的点。已知的测定使样品移动使其通过含有结合颗粒的区域，随后到达检测区。一些已知的测定使用液体稀释剂或“缓冲液”以将样品移动到结合颗粒且到达检测区。
与已知测定形成对比，本发明的装置使样品沉积到结合颗粒下游。此后使稀释剂(例如缓冲液)释放且使最初位于结合垫上的颗粒移动到位于颗粒和检测区之间的样品处。
本发明者发现了用稀释剂使检测颗粒移动到已加在颗粒下游的样品处，这使得能够使用极小量的样品。稀释剂用以非常有效地再悬浮检测探针，从而使其可进一步移动到结合垫下游且沿着该膜移动以提供测试结果。这种方法是反直觉的，因为在常规侧流装置中使用液体样品来再悬浮结合颗粒。另外，为了使免疫测定和结合发生，通常希望样品和颗粒接触。然而，已经令人惊讶地发现，本发明的方法(其中将样品施加到颗粒下游，随后通过再悬浮在稀释剂中的结合颗粒“追逐”)有时可实际上增加信号强度。
该装置利用具有结合垫、样品施加区和检测区的多孔膜。检测区具有固定的捕获试剂。样品施加区可位于固定颗粒下游的结合垫材料上的某处，或者其可位于膜的前部位置(检测区上游)，或者其可为位于结合垫和具有检测区的膜之间的单独材料。该装置还使用在样品施加区之前在装置上游端的稀释剂释放区和位于该稀释剂释放区和样品之间的结合垫。芯吸垫在装置下游端与多孔膜的相对端液体连通。在使用时，将样品施加在样品施加区中，且一段时间之后，释放稀释剂。稀释剂再悬浮和携带结合颗粒到样品处且更进一步往下游到达检测区，产生存在被分析物的指示。
可使用本发明检测的合适被分析物的实例包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括那些出于治疗目的而施用的药物以及那些出于非法目的而施用的药物)、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒、酵母、真菌、原生动物和上述物质中任一种的代谢产物或抗体。一些被分析物的具体实例包括铁蛋白；肌酸酐激酶MB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡马西平；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼丁；促黄体生成激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇，黄体酮；C-反应性蛋白；脂质运载蛋白；IgE抗体；细胞因子；维生素B2微球蛋白；糖化血红蛋白(Gly.Hb)；皮质醇；毛地黄毒苷；N-乙酰普鲁卡因胺(NAPA)；普鲁卡因酰胺；对风疹的抗体，例如风疹IgG和风疹IgM；弓形体病的抗体，例如弓形体病IgG(Toxo-IgG)和弓形体病IgM(Toxo-IgM)；睾丸激素；水杨酸酯；醋氨酚；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；乙型肝炎核心抗原的抗体，例如抗乙型肝炎核心抗原IgG和IgM(Anti-HBC)；人类免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人类T细胞白血病毒1和2(HTLV)；乙型肝炎e抗原(HBeAg)；乙型肝炎e抗原的抗体(Anti-HBe)；流感病毒；促甲状腺激素(TSH)；甲状腺素(T4)；总三碘甲腺原氨酸(Total T3)；游离三碘甲腺原氨酸(Free T3)；癌胚抗原(CEA)；脂蛋白、胆固醇和甘油三酯；和甲胎蛋白(AFP)。滥用的药物和受控制的物质包括但不限于安非他明；甲苯丙胺；巴比妥酸盐，例如异戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮杂革，例如利眠宁和安定；大麻素，例如印度大麻和大麻；古柯碱；芬太尼；LSD；安眠酮；鸦片剂，例如海洛因、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、氧可酮、氧吗啡酮和鸦片；苯环利定；和丙氧芬。其他潜在的被分析物可描述于美国专利第6,436,651号中。
参考图1，将更详细地描述可形成的侧流测定装置20的一个实施方案。应注意到，术语“侧流”意欲描述且不是限制，因为可以其他方式配置具有相同作用的装置。在不偏离本发明的精神的情况下，例如使用与本发明相同的原理可容易地想象径向(radical)或垂直(vertical)流动装置。如所示，装置20包含任选地由刚性材料24支撑的多孔膜22。多孔膜22具有检测区(或线)30。多孔膜22还可具有对照区(或线)32。
通常，多孔膜22可由使检测探针能够通过的多种材料中的任一种制造。例如，用于形成多孔膜22的材料可包括但不限于天然的、合成的或经合成性改性的天然材料，例如多糖(例如纤维素材料，如纸和纤维素衍生物，例如醋酸纤维素和硝化纤维)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；硅石；无机材料，例如钝化的矾土、硅藻土、MgSO4或其他均匀地分散在多孔聚合物基质中的无机细分散的材料，聚合物例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；布，天然的(例如棉花)和合成的(例如尼龙或人造纤维)；多孔凝胶，例如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；聚合物薄膜，例如聚丙烯酰胺；等等。在一个特定实施方案中，多孔膜22由硝化纤维和/或聚醚砜材料形成。应当理解的是，术语“硝化纤维”是指纤维素的硝酸酯，其可以是单独的硝化纤维或硝酸和其他酸的混合酯，其他酸例如具有1到7个碳原子的脂族羧酸。合适的膜包括得自Billerica，MA.，USA的Millipore Corporation的硝化纤维膜HF075和HF120。
装置20还可包含芯吸垫26。芯吸垫26通常接受已迁移通过整个多孔膜22的流体。如本领域中所公知，芯吸垫26可有助于促毛细管作用和流体流过膜22。
装置20具有稀释剂释放区34。在一个实施方案中，稀释剂释放区34具有在其内可储存稀释剂38的稀释剂贮存器36。或者，稀释剂38可由单独的贮存器供应。稀释剂38可为将带走用于本发明的检测探针的任何液体。合适稀释剂的实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH 7.2)、tris-缓冲盐水(TBS)溶液(pH 8.2)或2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)(pH 5.3)。这些稀释剂可含有有助于该测定的性能的其他添加剂，例如表面活性剂、水溶性聚合物、蛋白质、防止非特异性结合的阻断剂和防腐剂。
结合垫40与稀释剂释放区34液体连通且位于稀释剂释放区34和多孔膜22之间，使得在稀释剂38从稀释剂释放区34移动时，其可穿过结合垫40且携带结合颗粒到在多孔膜22上的检测区30和对照区32。结合垫40由使稀释剂能够通过的材料形成。例如，结合垫40可由玻璃纤维形成。虽然仅展示了一个结合垫40，但是应理解的是在本发明中还可使用另外的结合垫。
为了开始进行测试样品中被分析物的检测，使用者可直接将测试样品施加、接触或沉积到结合垫40和多孔膜22的检测区30部分之间的施加区42上。一旦样品已与施加区42接触，稀释剂38就将释放到稀释剂释放区34中。稀释剂38可借助于一体的贮存器或通过单独的来源例如吸管或本领域技术人员已知的任何其他有效方式施加。稀释剂38穿过与多孔膜22液体连通的结合垫40到达施加区42、检测区30和对照区32。
为了便于精确地检测测试样品内被分析物的存在与否，将预定量的至少一种结合颗粒施加到结合垫上。通常能够产生视觉上或通过仪器装置可检测的信号的任何物质都可用作检测探针。各种适合的物质可包括发色体；催化剂；发光化合物(例如荧光、磷光等等)；放射性化合物；可见标记，包括胶体金属颗粒(例如金)和非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、或有机聚合物胶乳颗粒；脂质体或其他含有信号产生物质的泡囊(vesicle)；等等。在美国专利第4,275,149号中公开了一些适合用作检测探针的酶。酶/底物体系的一个实例是酶为碱性磷酸酶，底物为硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐或其衍生物或类似物，或底物为4-甲基伞形基(umbelliferyl)-磷酸盐。其他合适的结合颗粒可描述于美国专利第5,670,381号和第5,252,459号中。在一些实施方案中，结合颗粒可包含产生可检测信号的荧光化合物。该荧光化合物可为荧光分子、聚合物、树状聚体、颗粒等等。例如，合适荧光分子的一些实例包括但不限于荧光素、铕螯合物、藻胆蛋白、罗丹明及其衍生物和类似物。
结合颗粒(例如以上描述的结合颗粒)可单独使用或与微粒(有时称为“珠(bead)”或“微珠(microbead)”)一同使用。例如，可使用天然的微粒，例如核、支原体、质粒、质体、哺乳动物细胞(例如红细胞血影)、单细胞微生物(例如细菌)、多糖(例如琼脂糖)等等。此外，还可使用合成的微粒。例如，在一个实施方案中，使用以荧光或有色染料标记的胶乳微粒。虽然在本发明中可使用任何胶乳微粒，但是胶乳微粒一般由聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸乙烯基三聚物(styreneacrylic-vinyl terpolymer)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等等或其醛、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物形成。其他合适的微粒可描述于美国专利第5,670,381号和第5,252,459号中。市售可得的合适荧光颗粒的实例包括MolecularProbes，Inc.出售的荧光羧化微球，商品名“FluoSphere”(Red 580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)，以及“Texas Red”和5-和6-羧基四甲基罗丹明，其也由MolecularProbes，Inc.出售。另外，市售可得的合适有色胶乳微粒的实例包括Bang′s Laboratory，Inc.出售的羧化胶乳珠。
在使用时，颗粒的形状通常可以变化。在一个特定实施方案中，例如，所述颗粒的形状是球形的。然而，应当理解的是，其他形状也包含在本发明内，例如板形、棒形、盘形、柱形、管形、不规则的形状等。另外，颗粒的大小也可以变化。例如，颗粒的平均大小(例如直径)可在约0.1纳米到约1,000微米的范围，在一些实施方案中，从约1纳米到约100微米，且在一些实施方案中，从约10纳米到约10微米。例如，“微米大小”的颗粒常常是所要的。在使用时，这种“微米大小”的颗粒可具有从约1微米到约1,000微米的平均大小，在一些实施方案中，从约1微米到约100微米，且在一些实施方案中，从约1微米到约10微米。同样地，也可使用“纳米大小”的颗粒。这类“纳米大小”的颗粒可具有从约0.1纳米到约80纳米的平均大小，在一些实施方案中，从约0.1纳米到约5纳米，且在一些实施方案中，从约1纳米到约20纳米。
在一些情况下，期望以某些方式修饰颗粒，使得其能更容易地与被分析物结合。在这种情况下，颗粒可以用附着其上的某些特异性结合成员来修饰以形成结合颗粒。特异性结合成员通常是指特异性结合对的成员，特异性结合对即两个不同的分子，其中分子之一化学地和/或物理地与第二分子结合。例如，免疫反应性特异性结合成员可包括抗原、半抗原、适配体、抗体(一次或二次)及其复合物，包括由重组DNA方法或肽合成法形成的那些复合物。抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体、重组蛋白或其混合物或片段以及抗体和其他特异性结合成员的混合物。这种抗体的制备和其作为特异性结合成员的适用性的详细情况是本领域技术人员所公知的。其他常见的特异性结合对包括但不限于生物素和抗生物素蛋白(或其衍生物)；生物素和链霉抗生物素蛋白；碳水化合物和凝集素；互补的核苷酸序列(包括探针和捕获核酸序列，用于DNA杂交测试来检测目标核酸序列)；互补的肽序列，包括那些由重组方法形成的互补肽序列；效应物和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅因子和酶；酶抑制物和酶等等。此外，特异性结合对可包括作为原始特异性结合成员的类似物的成员。例如，可使用被分析物的衍生物或片段，即被分析物类似物，只要其具有与被分析物相同的至少一个表位即可。
特异性结合成员通常可使用各种公知技术中的任一种附着于颗粒上。例如，特异性结合成员共价附着到检测探针(例如颗粒)上，这点可通过使用羧基、氨基、醛、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇、环氧基和其他反应性或连接功能基团以及残余自由基和自由基阳离子来实现，通过其可实现蛋白的偶联反应。表面官能团还可作为官能化共聚单体来掺入，因为颗粒的表面可包含相对高的表面浓度的极性基团。另外，虽然结合颗粒常常是在合成后官能化的，但是在某些情况下，例如聚(苯硫酚)，微粒能够直接与蛋白共价连接而不需要进一步的修饰。
再参考图1，测定装置20包含在其内固定有能够与被分析物或结合颗粒-被分析物复合物结合的第一捕获试剂的检测区30。被分析物的结合产生说明被分析物存在的可检测的指示且如下所论述，该指示可为可见的或可通过其他方式(例如各种检测器或读取器(例如荧光读取器))检测。读取器还可经设计以基于检测区中信号的强度测定被分析物在检测部位的相对量。
在一些实施方案中，第一捕获试剂可为生物学捕获试剂。这类生物学捕获试剂在本领域中公知且可包括但不限于抗原、半抗原、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、一次或二次抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体等)及其复合物。在很多情况下，期望这些生物学捕获试剂能够与存在于结合颗粒上的特异性结合成员(例如抗体)结合。
还可能期望使用各种非生物学材料用于捕获试剂。例如，在一些实施方案中，该试剂可包括聚电解质。聚电解质可具有净正电荷或负电荷或通常为中性的净电荷。具有净正电荷的聚电解质的一些合适实例包括但不限于聚赖氨酸(可从St.Louis，MO的Sigma-AldrichChemical Co.，Inc.购得)、聚乙烯亚胺；表氯醇功能化的多胺和/或聚酰胺型胺类，例如聚(二甲胺-co-表氯醇)；聚二烯丙基二甲基-氯化铵；阳离子纤维素衍生物，例如接枝有季铵水溶性单体的纤维素共聚物或纤维素衍生物等等。在一个特定的实施方案中，可使用为包含季铵水溶性单体的纤维素衍生物的CelQuatSC-230M或H-100(可从National Starch & Chemical，Inc.购得)。具有净负电荷的聚电解质的合适实例包括但不限于聚丙烯酸，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，钠盐)等等。还应当理解的是也可使用其他聚电解质。一些聚电解质例如两亲聚电解质(即具有极性和非极性部分)可具有通常为中性的净电荷。例如，合适的两亲聚电解质的一些实例包括但不限于聚(苯乙烯-b-N-甲基2-乙烯基碘化吡啶)和聚(苯乙烯-b-丙烯酸)，两者都可从Dorval，Canada的Polymer Source，Inc.获得。
第一捕获试剂充当在被分析物和结合颗粒之间形成的复合物的固定结合部位。具体地说，被分析物(例如抗体、抗原等)一般具有两个或多个结合部位(例如表位)。在到达检测区30后，这些结合部位中的一个由探针的特异性结合成员占据。然而，被分析物的自由结合部位可与固定的捕获试剂结合。在与固定的捕获试剂结合后，复合的探针形成新的三元夹层复合物。
检测区30通常可提供任意数目的不同的检测区域使得使用者可更好地测定在测试样品内的特定被分析物的浓度。每个区域可含有相同的捕获试剂或可含有用于捕获多种被分析物的不同捕获试剂。例如，检测区30可包括两个或多个不同的检测区域(例如线、点等)。检测区可在大体垂直于测试样品流过测试装置20的流动方向上以线的形式排列。同样地，在一些实施方案中，检测区可在大体平行于测试样品流过测定装置的流动方向上以线的形式排列。
在常规侧流夹层装置中，未复合的被分析物将与复合的被分析物竞争位于检测区的捕获试剂，引起存在被分析物的指示减弱。在信号强度对时间的图形表示中，这种减弱类似于钩，由此这种现象被称为“钩效应(hook effect)”。在与结合颗粒接触之前，在结合颗粒下游沉积测试样品导致一些被分析物与捕获试剂复合。这通常导致所有的或大体上所有的试剂捕获部位由被分析物占据。在结合颗粒到达检测区后，结合颗粒随后形成新的三元夹层复合物。这种顺序帮助消除在先前测定中出现的“钩效应”，因为被分析物与几乎所有捕获试剂结合(条件是存在足够的被分析物)并且过量的检测探针保证几乎所有捕获试剂部位都含有复合的被分析物。
再参考图1，多孔膜22还可包含安置在检测区30下游的对照区32。对照区32通常提供单个不同区域(例如线、点等)，但多个区域的情况当然也包含在本发明内。例如，在例举的实施方案中，使用单条线。对照区32可在大体上垂直于缓冲液和检测探针流过装置20的流动方向上排列。同样地，在一些实施方案中，区域32可在大体上平行于流过装置20的流动方向上排列。
不考虑其配置，第二捕获试剂可固定在多孔膜22上对照区32内。第二捕获试剂充当任何结合颗粒和/或被分析物/结合颗粒复合物的固定结合部位，其在检测区30没有与第一捕获试剂结合。因为期望第二捕获试剂与复合的和未复合的结合颗粒都结合，所以第二捕获试剂通常不同于第一捕获试剂。在一个实施方案中，第二捕获试剂为不同于第一捕获试剂的生物学捕获试剂(例如抗原、半抗原、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、一次或二次抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体等)及其复合物)。例如，第一捕获试剂可为单克隆抗体(例如CRP Mab1)，而第二捕获试剂可为抗生物素蛋白(高阳离子的66,000-道尔顿糖蛋白)、链霉抗生物素蛋白(非糖基化的52,800-道尔顿蛋白)、中性抗生物素蛋白(去糖基化的抗生物素蛋白衍生物)和/或captavidin(硝化的抗生物素蛋白衍生物)。在这个实施方案中，第二捕获试剂可与生物素结合，其为生物素化的或包含在检测探针上，所述检测探针与不同于第一捕获试剂的单克隆抗体的单克隆抗体(例如CRP Mab2)结合。
另外，对于对照区32的第二捕获试剂来说，还可期望利用各种非生物学材料。在许多情况中，可特别期望这种非生物学捕获试剂以更好地保护(ensure)所有余下的结合检测探针和/或被分析物/结合探针复合物。实例有聚电解质材料。荧光检测可用来检测检测区和对照区中被分析物的存在且通常利用波长过滤来从激发光子中分离发射光子，并利用检测器，检测器记录发射光子且产生可记录的输出，通常为电信号或照相图像。这种检测器的实例包括荧光分光光度计和微量培养板读取器；荧光显微镜；荧光扫描器；和流动血细胞计数器。用于本发明的合适荧光检测器为FluoroLog III荧光分光光度计，其由Edison，NewJersey的SPEX Industries，Inc.出售。
如果需要，在本发明中也可利用被称为“时间分辨荧光检测”的技术。时间分辨荧光检测利用某些荧光材料，例如镧系金属铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的螯合物的荧光特性来降低来自发射源或来自散射过程(由激发辐射的散射引起)的本底信号。在大体上更短波长激发螯合物之后，这种螯合物可展现出强烈红移的、窄带的、长久寿命的发射。一般来说，由于在分子中发色体紧挨着镧系元素，所以该螯合物具有强紫外吸收。在发色体吸收光之后，激发能量可从激发的发色体转移到镧系元素。随后进行镧系元素特征的荧光发射。使用脉冲式激发和时间门控检测，结合窄带发射滤光器，容许特异性检测仅来自镧系元素螯合物的荧光，排除样品中存在的其他物质的发射，二其他物质的发射一般是更短寿命的或具有更短波长的发射。
实施例这种思想用以下实验设计来测试将山羊抗小鼠抗体(“GAM”)用磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH 7.2)稀释成0.1mg/ml，且使用Kinematic 1600涂覆机以1μl/cm的分配率和5cm/s的床速度(bed speed)在微孔硝化纤维HF120膜上划线。将ScipacC-反应性蛋白(CRP)(Sittingboume，Kent，UK)在水中稀释以得到2.6mg/ml的最终浓度且将其以1μl/cm的分配速率在GAM测试线下划线。将卡片在37℃下干燥1小时。
使用手动操作闸刀式切割机将34mm的VF2(来自WhatmanCorp.，Clifton，NJ)和GF33(玻璃纤维)结合垫材料(来自Millipore Corp.，Billerica，MA)带切割成30mm。用于结合的单克隆抗体为Mab1商品目录号10-C07，来自Concord，MA 01742-3049 USA的FitzgeraldIndustries International，Inc.)。使这种CRP抗体与直径为20nm的金颗粒结合。将所得结合物与羊抗兔(GAR)结合金颗粒(直径为40nm)以1∶1混合。Anti-CRP储备结合物的光密度(OD)为32，因此当使其与GAR以1∶1比率混合时，其OD降低到16。将其进一步在2mMBorax(pH 7.2)和50％蔗糖中稀释(最终蔗糖含量为10％)以使最终OD为10。Borax是几种有效缓冲液中的一种，蔗糖或其他亲水物质由于其在水中具有高溶解度而帮助干颗粒再悬浮。
使用Kinematic 1600涂覆机以5μl/cm、5cm/s将结合物喷洒到VF2带上，离带边缘10mm且离对照带(control band)的相对边缘3mm。将这些带保持在小于20％相对湿度和室温下干燥过夜。将结合带和芯吸材料(来自Whatman的CF6)切割成20mm宽的带且将其层压到已划条带的HF120膜上。随后使用Kinematic 2360将夹层带切割成4mm宽的条以制造试剂条(dipstick)。
将EDTA处理的全血或校准的血清(Kamaya standards，Seattle，WA)用于这些实验中。将Scipac CRP掺加到全血中以得到2.5、10、20、40、80和160μg/ml的最终浓度。将Kamaya标准血清用于GF33实验。对于对照测试条带，使用正移式吸管将1μl量的全血以直线加到距离VF2垫端部约13mm处，而对于本发明测定，将lμl血液直接加到喷雾的结合带(自带末端约13mm)之后。随后将具有2％TWEEN20表面活性剂(来自Sigma-Aldrich Chemical Co.)的PBS加到在芯吸条带相对端的缓冲液贮存器中且将壳的盖在适当位置夹住。使测试条带保持测试30分钟，随后读出可见结果。
本发明的测定在测试线处产生更强的信号。例如，对于这种“抑制/溢流测定”的特定情况来说，当使用这种方法时，GAM线(其充当信号线，因为其强度随被分析物(在这种情况下为CRP)的量增加而增加)具有更强的信号。
除如上所述在距离测试条带底部13mm处施加血液样品之外，评估在其他位置施加血液样品的情况。如从测试条带的底部开始测量，这些距离为5mm到29mm不等。所有这些位置都能影响测试信号的结果(例如线强度或品质)。具体来说，发现样品(例如血液)越靠近底部施加，本底变得越清晰，从而改善在测试线处的信号。这种信号改善或者表现为线更强线、线质量更好；或者表现为测试条带的其他区域上的本底信号更低。
虽然已经根据本发明的具体实施方案详细地描述了本发明，但本领域技术人员应当理解的是，在通过上述内容了解了本发明之后，可以容易地构想出这些实施方案的替换物、变形物和等价物。因此，本发明的范围应当由所附的权利要求书及其任何等价物来确定。
权利要求
1.一种用于检测存在于测试样品中的被分析物的存在或量的侧流测定装置，所述侧流测定装置包括多孔膜，所述多孔膜与结合垫和芯吸垫连通，所述多孔膜限定了其中固定有第一捕获试剂的检测区，将所述第一捕获试剂构建成与所述被分析物和被分析物-结合物复合物的至少一部分结合以产生具有一定强度的检测信号；且所述结合垫位于所述检测区上游，所述结合垫具有含有被分析物的特异性结合成员的检测颗粒；且缓冲液释放区位于所述结合垫上游并且使缓冲液加到所述装置中，所述缓冲液起移动所述检测探针到所述检测区的作用，且；所述样品沉积在所述结合垫和所述检测区之间。
2.权利要求1的侧流测定装置，其中所述结合检测颗粒包括选自发色体、催化剂、发光化合物、放射性化合物、可见标记、脂质体及其组合的物质。
3.权利要求1的侧流测定装置，其中所述结合检测颗粒包括发光化合物。
4.权利要求1的侧流测定装置，其中所述结合检测颗粒包括可见标记。
5.权利要求1的侧流测定装置，其中所述特异性结合成员选自抗原、半抗原、适配体、一次或二次抗体、生物素及其组合。
6.权利要求1的侧流测定装置，其中所述第一捕获试剂选自抗原、半抗原、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、一次或二次抗体及其复合物。
7.权利要求1的侧流测定装置，其中所述第二捕获试剂选自抗原、半抗原、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、一次或二次抗体及其复合物。
8.权利要求1的侧流测定装置，其中所述被分析物为选自沙门氏菌种(Salmonella species)、脑膜炎奈瑟氏菌群(Neisseria meningitidesgroup)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、曲霉属(aspergillua)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)、HIV、毛滴虫属(Trichomonas)和疟原虫属(Plasmodium)的大病原体。
9.权利要求1的侧流测定装置，其中所述被分析物选自毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒和上述物质中任一种的代谢产物或抗体。
10.权利要求1的侧流测定装置，其中所述多孔膜、结合垫和芯吸垫由单种材料制成。
11.一种用于检测存在于测试样品中的被分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供包括与结合垫和芯吸垫液体连通的多孔膜的侧流测定装置，所述结合垫具有含有被分析物的特异性结合成员的检测颗粒，所述多孔膜限定了其中固定有第一捕获试剂的检测区和其中固定有第二捕获试剂的对照区，其中所述对照区位于所述检测区下游，所述结合垫位于所述多孔膜上游且所述缓冲液释放区在所述结合垫上游；ii)使所述含有被分析物的测试样品在所述结合垫和所述检测区之间接触；iii)从所述缓冲液释放区释放缓冲液从而使所述缓冲液携带所述检测颗粒到所述检测区和对照区；iv)检测检测信号。
12.权利要求11的方法，其中所述结合检测颗粒包括选自发色体、催化剂、发光化合物、放射性化合物、可见标记、脂质体及其组合的物质。
13.权利要求11的方法，其中所述结合检测颗粒包括可见标记。
14.权利要求11的方法，其中所述特异性结合成员选自抗原、半抗原、适配体、一次或二次抗体、生物素及其组合。
15.权利要求11的方法，其中所述第一捕获试剂选自抗原、半抗原、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、一次或二次抗体及其复合物。
16.权利要求11的方法，其中所述第二捕获试剂选自抗原、半抗原、蛋白A或G、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、一次或二次抗体及其复合物。
17.权利要求11的方法，其中所述第二捕获试剂包括聚电解质。
18.权利要求11的方法，其中所述被分析物为选自沙门氏菌种(Salmonella species)、脑膜炎奈瑟氏菌群(Neisseria meningitidesgroup)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、曲霉属(aspergillua)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)、HIV、毛滴虫属(Trichomonas)和疟原虫属(Plasmodium)的大病原体。
19.权利要求11的方法，其中所述被分析物选自毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒和上述物质中任一种的代谢产物或抗体。
20.一种用于检测存在于测试样品中的被分析物的存在的侧流测定装置，其中使最初位于结合垫上的检测颗粒移动到位于具有捕获试剂的检测区的病原体处。
全文摘要
本发明提供用于检测存在于测试样品中的被分析物的存在或量的侧流测定装置，其中该侧流测定装置具有与结合垫和芯吸垫连通的多孔膜。该多孔膜具有固定有第一捕获试剂的检测区，将该第一捕获试剂构建成与被分析物和被分析物－结合物复合物的至少一部分结合以产生检测信号。对照区可位于多孔膜上检测区下游且具有固定在该对照区内的第二捕获试剂。该结合垫位于检测区上游且具有含有被分析物的特异性结合成员的检测探针。样品沉积在对照区和检测区之间。缓冲液释放区位于结合垫上游且使缓冲液加到该装置中，该缓冲液起移动检测探针到检测区和对照区的作用。
文档编号G01N33/543GK101076731SQ200580042637
公开日2007年11月21日 申请日期2005年9月28日 优先权日2004年12月15日
发明者R·M·凯洛, 卫宁, C·蔡德贝卢－埃泽, S·R·费斯特, P·克里斯托菲 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司