血管内皮生长因子受体1^＋细胞在治疗和监测癌症以及在筛选化疗药中的用途的制作方法

专利名称：血管内皮生长因子受体1^＋细胞在治疗和监测癌症以及在筛选化疗药中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及血管内皮生长因子受体r细胞在治疗和监 测癌症以及在筛选化疗药中的用途。
背景技术：
癌症在美国是仅次于心脏病发作的第二大死因。在开 发治疗这类破坏性疾病的新疗法中已经取得了重大进步。这些进步 大部分归功于对正常细胞与癌细胞的细胞增殖的更多了解。 正常细胞的增殖是通过生长因子受体各自的配体高度 控制生长因子受体活化的结果。这类受体的实例是生长因子受体酪 氨酸激酶。 癌细胞的增殖是正常细胞的DNA突变或肿瘤抑制基因 功能丧失的结果。这些遗传变化产生许多新的蛋白质产物，例如过 量表达的肿瘤相关生长因子或趋化因子或受体，这可刺激其它细胞(例 如内皮细胞)的增殖，并在肿瘤内形成新血管以供其继续生长并促进 肿瘤转移。在非肿瘤细胞中发现的能支持肿瘤生长、并且在某些
环境下本身就在肿瘤细胞表面的某些生长因子受体的实例包括血管
内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、胰 岛素样生长因子受体(IGFR)、神经生长因子受体(NGFR)和成纤维细 胞生长因子受体(FGF)。 在胚胎发育期间，造血细胞和早期内皮细胞(成血管细 胞)起源于共同的前体细胞，称为成血成血管细胞(hemagioblast)。因 为它们具有共同的细胞来源，所以造血细胞和血管细胞共享一些信 号转导途径。 一个这样的途径是VEGFR信号转导途径。VEGF受体 (VEGFR)包括VEGFR1 (也称为FLT-1,由Shibuya M.等人测序 (Shibuya M,等，(9wcoge"e 5:519-524 (1990))和VEGFR2 (也称为KDR 或FLK-l,参见Terman等，6:1677-1683 (1991);并由 Matthews W.等人测序(Matthews W.等，尸rac. Jcaof. 88:9026-9030 (1991》。除非上下文中另有说明或有明确表示，否则本说明书 将会遵循VEGF受体的习惯命名法。KDR是指VEGFR2的人形式。 FLK-1是指VEGFR2的鼠同系物。FLT-1与KDR/FLK-1受体不同， 但与之相关。 VEGFR能结合VEGFR1和VEGFR2,对内皮细胞和造 血细胞发挥增殖和迁移效应。过去认为VEGRF2只由内皮细胞表达。 然而，近来发现VEGFR2也存在于多能造血干细胞亚群上(Ziegler等, Sc/e"ce 285 (5433):1553-8 (1999))。若干研究已经表明，某些白血病 细胞也表达VEGFR1和VEGFR2 (Fiedler等，S/ood 89(6):1870-5 (1997》。 介导VEGF的不同生物学效应的两种主要信号转导酪 氨酸激酶受体是VEGFR2和VEGFR1。尽管VEGFR1与VEGF的结 合亲和性非常高，Kd值为10-70pM (Klagsbmn等，GrawA Factor 7(3):259-70 (1996)),但是大多数研究表明，VEGFR2是传 送用于内皮细胞增殖和分化的细胞信号的关键性受体(Ortega等， /
尸a^oZ 151(5):1215-24 (1997))。 VEGFR1看来对血管重塑更加重要。 在通过同源重组破坏鼠胚胎干细胞的VEGFR2基因和VEGFR1基因 的研究中，已经确定VEGF受体在调节血管发生和血管生成中的相 对重要性。VEGFR2缺陷型小鼠是在血管发生、血管生成和血细胞 生成中具有重大缺陷的小鼠(Shalaby等，A^m" 376(6535):62-6 (1995))。相比之下，VEGFR1敲除小鼠发育异常血管通道，表明该 受体在调节细胞相互作用和血管稳定方面的作用(Fong等，A^wre 376(6535):66-70 (1995》。 通过破坏VEGFR2信号转导而抑制血管生成，导致对 实体瘤生长和转移的抑制。例如，在鼠模型中，中和抗鼠VEGFR2 的单克隆抗体(MoAb)，抑制肿瘤侵袭(Skobe等，Ato 3(11):1222-7 (1997)和Prewett等，C匿w i ^ 59(20):5209-18 (1999》。此外，在 VEGFR2显性失活的小鼠中，成胶质细胞瘤的生长受到抑制(Millauer 等，367(6463):576-9 (1994))。这类对肺瘤生长的抑制，归功于 对血管生成的抑制，有效限制了对肿瘤的血液供应。 白血病起源于其成熟和分化的不同时期的造血干细 胞。目前已经清楚地知道，急性白血病起源于具有自我更新能力的 未成熟的造血干细胞，而某些攻击性较弱的白血病(例如慢性白血病) 则似乎起源于更成熟的定型造血祖细胞。 —些研究表明，VEGF几乎总是由所有已确定的白血病 细胞系以及新分离的人类白血病细胞系(包括已充分研究的HL-60白 血病细胞系)表达(Fiedler等，祝ood 89(6):1870-5 (1997), Bellamy等, C朋cer化s 59(3):728-33 (1999》。利用RT-PCR, —些研究已经表明， VEGFR-2和VEGFR-1仅由某些人类白血病表达(Fiedler等，说ood 89(6):1870國5 (1997), Bellamy等，C離er脑59(3):728-33 (1999》。然 而，这些研究都没有说明，VEGF表达是否与任何平行表面 VEGFR2/VEGFR1表达或功能性反应相关。骨髓(BM)衍生细胞(BMDC)可促进恶性转化(Coussens
等,"MMP-9 Supplied by Bone Marrow-derived Cells Contributes to Skin Carcinogenesis (骨髓衍生细胞所供应的MMP-9能促进皮肤癌的发 生)"Ce〃 103:481-490 (2000》、肺瘤血管形成(Lyden等，"Impaired
Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨fi书亍生的内
皮细胞和造血祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长),"A^. A/W. 7:1194-1201 (200l)和Autiero等，"Placental Growth Factor and its
Receptor, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1: Novel Targets for Stimulation of Ischemic Tissue Revascularization and Inhibition of Angiogenic and Inflammatory Disorders (胎盘生长因子及其受体，血管
内皮生长因子受体-l:刺激缺血组织的血管再形成并抑制血管生成及 炎性疾病的新把标),"Jowma/o/772raw6./faewoW. 1:1356-1370(2003)) 和肿瘤细胞迁移(Neson等，"Lymphocyte-facilitated Tumor Cell Adhesion to Endothelial Cells: the Role of High Affinity Leukocyte Integrins (淋巴细胞促进肿瘤细胞粘附内皮细胞高亲和力白细胞整 联蛋白的作用),"35:50-55 (2003))。先前已经鉴定了表达血 管内皮生长因子受体1 (VEGFR1)的造血祖细胞(HPC)群体，其干细 胞驻留在BM的特异性生态位依赖区内。在新血管生成过程中，这 种小于0.01%总BM细胞的正常小群体增殖并与BM衍生的VEGFR2+ 内皮祖细胞(EPC)—起被动员到外周循环中，这两种细胞都是原发性 肿瘤血管形成和生长必不可少的(Lyden等，"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓4汙生的内皮细月包和造血 祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长),"Ato. A/". 7:1194-1201 (2001)和Hattori等，"Placental Growth Factor Reconstitutes Hematopoiesis by Recruiting VEGFR1(+) Stem Cells from Bone-marrow Microenvironment (胎盘生长因子通过从骨髓」徵环境募集VEGFRl(+) 干细胞而重建血细胞生成),"A^. Med 8:841-9 (2002))。这些骨髓单 核细胞来源的VEGFRl+细胞定位于肿瘤床的血管周围部位，为新形
成血管起到支持和稳定的作用(Lyden等，"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓衍生的内皮细胞和造血
祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长),"A^. A/eof. 7:1194-1201 (2001))。已经发现这些细胞和其它肿瘤相关细胞能增强原发性 肺瘤生长并促进肿瘤扩散，但是它们对肿瘤转移的精确作用目前尚 不清楚(Pollard, " Tumor-educated Macrophages Promote Tumor Progression and Metastasis (肿瘤驯化巨喧细月包促进肿瘤发展和转 移),"iV饥i^v. Ca"cer. 4:71-78 (2004)和Himtsuka等，"MMP9 Induction by Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 is Involved in Lung-specific Metastasis (血管内皮生长因子受体-1的MMP9诱导，参与肺 特异性肺瘤转移)，"C朋cer 0〃. 2:289-300 (2002))。 本发明涉及利用这些现象监测和治疗癌症和肿瘤转移。
发明概述 本发明涉及抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部 位肿瘤形成的方法。该方法包括在有效抑制癌症患者远离胂瘤原 先形成部位的部位肺瘤形成的条件下，给予癌症患者血管内皮生长
因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂。 本发明的另 一 方面涉及预防癌症患者肿瘤转移的方 法。该方法包括在有效抑制癌症患者肿瘤转移的条件下，给予癌
症患者血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂。 本发明的另一方面涉及用于抑制癌症患者肿瘤形成或 预防癌症患者肺瘤转移的候选化合物的鉴定方法。该方法包括提供
试验化合物，并将试验化合物与血管内皮生长因子受体r骨髓衍生 细胞一起孵育。鉴定能结合血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞 的试验化合物，作为用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者胂 瘤转移的候选化合物。
本发明的另 一 方面涉及监测癌症患者肿瘤转移的方
法。该方法包括评价患者样品的血管内皮生长因子受体r骨髓衍生 细胞水平，并将血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的水平与血 管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞先前的水平进行比较，其中血 管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞水平增加，就表明未来会有肿 瘤转移。 本发明的另 一 方面涉及抑制患者的远离肺瘤原先形成 部位的部位纤连蛋白表达的方法。该方法包括在有效抑制患者的 远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的条件下，给予患者血 管内皮生长因子受体l+骨髓衍生细胞抑制剂。目前，对完全切除或部分切除实体瘤并进行辅助化疗
后又发生肿瘤转移的患者进行确定，是非常困难的。在任何指定肿 瘤转移频发部位(例如结肠癌患者的肝脏、骨肉瘤患者的肺部、乳癌
患者的淋巴结)测定VEGFRl+骨髓衍生细胞的体系，可有助于预测患 者是否需要针对这些VEGFRr骨髓衍生簇的额外辅助治疗以及更常 规疗法，例如在切除后用化疗提前治疗，而不是等待出现转移或复 发之后才开始治疗。这些细胞簇作为表达VEGFR1或VLA的循环或 动员细胞在血流中也可以被示踪。另外，有可能在将来可以标记这 些VEGFRl+造血祖细胞，这样可以通过造影研究以跟踪对治疗的反 应或评价未来的转移危险性。它可用于改变最小残余疾病的分期和 监测方法。这样的标记和潜在治疗策略将证明对原发性肿瘤患者以 及那些患者的照顾是非常有用的。可以预知的是，该策略也可用于 患有缺血性疾病和炎性疾病(例如类风湿性关节炎和炎性肠病)的患者。 胂瘤扩散之前，这些VEGFRl+骨髓衍生细胞在转移部 位的存在，导致形成利于导入VEGFR2+内皮细胞和胂瘤细胞的微环 境，这提供证据表明这些细胞产生新趋化因子或生长因子，这可 解释这些特性。新蛋白质/基因的分离/鉴定包括VEGFRl+细胞和转移
前生态位引起肿瘤细胞迁移和粘附的增加，这将为预防肿瘤扩散提 供重要靶标。
附图简述

图1A-E显示骨髓衍生细胞形成转移前生态位。在图1A 中，在辐射后和LLC细胞植入前，在肺部罕见(3-gal+骨髓细胞(左图， n=6)。到第14天，(3-gal+骨髓衍生簇出现在肺实质中(左中图和箭头 区域的放大插图；11=25)并在第23天与微小转移联合(右图，箭头)并 且在总体转移中(右图，插图；n=12)。也显示了与终末细支气管和支 气管静脉间基质(常见的转移部位)联合的簇(右中图)。B是终末细支 气管，V是支气管静脉。图1B显示在辐射后和DsRed-标记的B16 细胞植入前的肺部GFP+骨髓(左图；n=6)。在第14天，可见GFP+ BMDC 没有DsRed+肿瘤细胞(左中图和插图；n=12)。从第18天开始，少量 单个DsRed+ B16细胞粘附到GFP+骨髓簇上(右中图)，到第23天， DsRed+肿瘤细胞在簇部位增殖(右图；n=8)。 DAPI染色显示细胞核。 图1C是曲线图，表示肺部骨髓衍生的GFP+ BMDC和DsRed+ B16 细胞的流式细胞术数据(11=30)，以及第14天(左图)和第18天(右图) 的两幅流向图。图ID显示与仅接受培养基的动物相比(左图； P<0.01),用B16条件培养基时GFP+ BMDC的动员，然后在粘附24 小时后通过尾静脉注射DsRed标记的肺瘤细胞(右图，箭头)。插图表 示4天后簇中增殖的肿瘤细胞(右图插图；n=6)。图IE显示具有皮内 LLC或B16肿瘤的动物中，每100X物镜视野中簇的数量(1^12)。右 下角的比例尺适用于图1A(左，左中，右中，80mm;左中插图，8mm; 右图，20mm;右插图，47mm),适用于图IB (左，左中，80mm; 左中插图，8mm;右中，右，40mm)，适用于图lD(40mm;右插图， 20mm)。转移前簇包括VEGFRl+造血祖细胞。图1F-I显示转移前簇 包括VEGFR1造血祖细胞。图1F显示在辐射过的肺中，在肺瘤植入 之前的VEGFR1染色(左图和插图；n=10),以及在LLC细胞植入后
14天显示肺部的簇(右图，箭头；r^l8,每100X物镜视野中3.9 ±0.2% 细胞带有VEGFR1染色，P<0.05)。图1G和H显示带有第14天LLC 肿瘤的动物肺部的双重免疫荧光。VEGFRl+和GFP+骨髓细胞(左图)、 VEGFRl+和CD133+ (右图)见图1G。 VEGFRl+和CD117+见图1H。 图II显示在生命的第40天和肿瘤发生之前，c-Myc转基因淋巴结中 的VEGFRl+簇(中图和插图显示VEGFRl+细胞)，相比之下，野生型 同窝出生幼仔淋巴结没有转基因(左图)，在第120天，c-Myc转基因 结具有淋巴瘤(右图)。在右图的插图中，箭头指淋巴瘤周围围绕的 VEGFRl+蔟(n-6)。右下角的比例尺适用于图IE (80mm;左插图， 40mm)、图1G(20mm)、图1H (20mm)和图II (80mm;插图，8mm)。
图2A-B显示对骨髓细胞归巢的抑制可预防肿瘤转移。 图2A显示在LLC植入后第24天，VEGFRr-选择的骨髓(Rl-pos)允 许微小转移(箭头，中图)，但能预防血管形成良好的大转移，正如在 野生型中所见(左图)。插图显示CD31 (内皮标记)表达。VEGFRl+细 胞的骨髓耗尽(非Rl)消除簇和转移(右图)(经ANOVA, PO.Ol)。该 表显示每100X物镜视野下簇和^L小转移的数量。*表示转移填充在 肺部。(Rl-pos， n=4;非Rl, n=4;野生型，n=6;非Rl加上野生 型，n=4)。图2B显示在带有LLC肿瘤的小鼠中用抗VEGFRl抗体(抗 Rl)和抗VEGFR2抗体(抗R2)进行治疗，能阻止簇和肿瘤转移(经 ANOVA, PO.01;对于所有组，n=5)。野生型肺部中的箭头指大的 LLC转移。抗R2中的箭头指簇，插图显示簇内微小转移。T，肿瘤 细胞。该表显示肺部每100X物镜视野下簇和LLC微小转移的数量。 *表示转移填充在组织中。右下角的比例尺适用于图2A (20mm;野 生型插图，26mm; Rl-pos插图，32mm)和图2B (40mm;抗R2插图， 20mm)。 图3A-F显示VLA4/纤连蛋白途径介导簇的形成。图 3A-C显示野生型小鼠在肿瘤移植后第14天出现能表达VLA-4 (插 图，VEGFRl和VLA-4)、 MMP9和Id3的簇(插图，VEGFRl和Id3)。
图3D显示给予VEGFR1+GFP+ BMDC的带有LLC肿瘤的Id3敲除(KO) 小鼠的肺部组织(经ANOVA, PO.01; n=6)。箭头指上插图区域。箭 头(下插图)显示用GFP+VEGFRl+细胞的转移部位。图3E显示野生型 肺部的基线纤连蛋白表达(11=6)(左图)。在第3天，转移前肺部的支 气管周围基质纤连蛋白增加(中图，箭头)，在第14天达到最大表达(右 图)。插图，PDGRFoc表达表明驻留的成纤维细胞释放纤连蛋白。图3F 显示定量RT-PCR,表明与野生型相比，带有LLC肿瘤小鼠肺部的 纤连蛋白表达增加(经ANOVA, *P<0.05; n=6)，而且带有B16黑素 瘤动物肺部也有类似的早期趋势。右上角的比例尺适用于图3A-C (40mm;插图，8mm)、图3D (80mm;右上插图，20mm;右下插图 80mm)和图3E(40mm;插图，20mm)。 图4A-E显示LLC转移改道向非典型部位。图4A-B显 示与野生型并用LCM-治疗小鼠相比，通过定量RT-PCR分析，在给 予MCM的小鼠中可见输卵管(图4A)和肠(图4B)内纤连蛋白表达增 加。与野生型相比，对于输卵管，第3-5天，经ANOVA， *P<0.05， 第7-9天，**P<0.001;而与野生型相比，对于肠道，第7画9天，*P<0.001 (n=6)。图4C显示条件培养基中VEGF和P1GF水平的ELISA测定(一 式三份)(当与L-LCM相比，经ANOVA， *P<0.05,而当与培养基单 用相比，**P<0.01)。图4D显示transwell迁移测定(一式三份)，证明 VEGFRl+细胞向LCM和MCM的迁移增加(经ANOVA, **P<0.001)。 图4E显示用MCM处理，使LLC的转移扩散改道B16黑素瘤转移 部位，例如脾(左图)、肾(左中图)、肠(右中图)和输卵管(右图)。箭头 指转移边界区，见插图(11=6)。 T, LLC肿瘤细胞。右下角的比例尺 适用于图4E (200mm;插图，20mm)。 图5A-E显示肿瘤和VEGFR2+细胞在VEGFR1+HPC之 后到达。图5A显示第8、 14、 18和23天的流式细胞术分析，表明 肺部GFP+ BMDC群体和DsRed B16黑素瘤肿瘤细胞(n-30)。图5B 显示VEGFR1和CD34 (中图)、VEGFR1和这些造血标记共表达的频
率(右图)。图5C显示在第12、 14、 18和27天通过流式细胞术对肺 部CD117+祖细胞和荧光GFP+-LLC肿瘤细胞进行分析，表明这些细 胞的存在先于肿瘤细胞到达。图5D显示骨髓衍生的VEGFR2+循环 内皮祖细胞在VEGFRl+造血祖细胞之后到达转移前生态位。VEGFR1 与VEGFR2的双重免疫荧光(左图)。VEGFR1和CD31/PECAM (中图) (箭头指内皮细胞)。VEGFR2+细胞和GFP的双重免疫荧光，表明已 建立和生长的转移生态位内的这些细胞起源于骨髓(右图)。图5E是 曲线图，表明VEGFR-2+细胞到达转移生态位的时间，其与带有16 天和24天胂瘤的动物肺部组织中可见的肺瘤细胞的到达是一致的(细 胞/蔟/100x视野)(n-6)。比例尺20pm (图5B);左，左中20拜，右 10ium(图5D)。 图6A-F显示转移前人体组织中VEGFR1的表达。在患 有乳癌(11=15)、肺癌(11=15)和胃肠癌(11=3)的个体中，在恶性和非恶性 组织中，细胞簇用VEGFR1染色。图6A显示具有乳腺癌转移证据 的淋巴结(箭头指肺瘤)，而图6B显示同一患者没有恶性肿瘤的淋巴 结。图6C显示原发性肺腺癌，而图6D显示没有肿瘤的邻近"正常" 肺(箭头指VEGFRl+细胞)。无肿瘤个体的淋巴结(图6B插图；11=6)和 肺组织(图6D插图；11=3)中未见VEGFRl+蔟。也显示胃食管连接的 原发性腺鳞状上皮癌(图6E)和无癌肝淋巴结(图6F)。图6E-F中的插 图显示VEGFR1和c-Kit的共免疫荧光。右下角的比例尺适用于所有 图(40mm; 4#图，40mm)。 图7A-C显示肿瘤在其趋化因子特性和纤连蛋白表达模 式方面是不同的。图7A显示，与培养基对照相比(左图和中图插图) (n=12)，用LLC条件培养基(LCM)治疗的WT小鼠诱导肝(左图)和肺 (中图)的纤连蛋白表达。LCM支持肺部P-gar BM簇(右图，TB二终末 细支气管，BV:支气管静脉)(n=6)。图7B显示与培养基对照的肠中 纤连蛋白表达相比(中图插图)(n=12),用MCM处理的小鼠显示出在 肝(左图)和肠(中图)以及肾、睾丸和肺中纤连蛋白表达增加。带有(3-gar
BM并用MCM处理的WT小鼠，表现出局限于富含纤连蛋白区域的 邻近簇形成。(右图)(n=6)。图6C显示对于得自14天肿瘤的动物的 LLC和B16黑素瘤来说，肿瘤衍生血浆中VEGF和P1GF的ELISA 水平(一式三份，与WT血浆相比，对于肿瘤衍生血浆，经单侧 ANOVA, *p<0.05)。图7A-B的比例尺为左图和中图40|um,插图 35.2|um，右图20prn。 图8A-D显示骨髓衍生的VEGFRl+细胞吸引肿瘤细胞。 图8A显示VEGFRl+细胞分离自BM,并与B16肺瘤细胞共培养， 形成聚集和增殖，用抗VEGFRl抗体(中图)或抗VLA-4抗体(右图) 进4亍治疗，可消除该效应。图8B显示transwell迁移测定，证明B16 胂瘤细胞向VEGFRl+选择群体的迁移增力o(—式三份，与非Rl和培 养基相比，对于Rl ，p<0.001%)。图8C显示低和高放大倍数的VEGFR1+ 细胞簇的SDF-1 (CXCL12)免疫荧光染色。SDF-la和VEGFR1的共 免疫荧光，对于SDF-la表达，VEGFRl+细胞簇染色阳性。图8D显 示LLC和B16肿瘤细胞表达CXCR4。比例尺对于图8A, 50拜， 插图120|Lim,对于图8C，左图和右图40拜，中图8拜，对于图8D, 20|tim。 图9显示Id3敲除小鼠缺乏HPC动员，而Id3缺陷型 小鼠的CDllb+ VEGFRl+造血祖细胞动员增加。 图10显示VEGFR1抗体抑制B16肿瘤转移。在用抗 VEGFR1和/或VEGFR2的中和抗体处理的小鼠中可见B16肿瘤(右 图)。WT脾脏中的实心箭头指有活性的黑素瘤，也见于插图，而空 心箭头指坏死和黑素颗粒。抗Rl (抗VEGFR1)中的箭头指脾脏中典 型的生发中心。抗Rl+抗R2组的插图代表动物肺部分离的转移瘤。 比例尺为20|iim:插图WT脾811m，抗Rl+抗R2 66|iun。 图11A-D显示对VLA-4和MMP-9的抑制能抑制肿瘤 转移。B16黑素瘤诱导肺部纤连蛋白表达。图像显示LLC植入后14 天，用抗VLA-4抗体治疗的WT小鼠的肺组织((3-gal用伊红复染，
n=8,经学生氏t检验，p<0.01)(图IIA)和MMP9V-小鼠的肺组织 (VEGFR1 DAB,用苏木精复染，n=6)(图IIB)。给予VLA-4抗体的 WT小鼠或MMP-9缺陷型小鼠的p-gal和VEGFR1细胞簇形成减少， 见图IIC的下图，定量测定的簇或转移/100x视野(经学生氏t检验， pO.Ol)。图11D显示B16黑素瘤肺瘤植入后第3和14天的肺组织 的纤连蛋白表达。第14天的箭头指簇部位的纤连蛋白表达。比例尺 为80fim(图IIA)和左图、中图40jxm,右图8|um (图IID)。
发明详述 本发明涉及抑制癌症患者远离肺瘤原先形成部位的部 位肿瘤形成的方法。该方法包括在有效抑制癌症患者远离肿瘤原 先形成部位的部位肿瘤形成的条件下，给予癌症患者血管内皮生长
因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂。该抑制剂也可用于预防原发肿瘤
部位的肿瘤复发。 该方法的给药步骤是在刺激血管内皮生长因子受体r 骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。由于化疗、应激、手
术、癌症患者的骨髓重建(bone marrow recovery)、炎症、辐射或生长 因子，可发生这样的刺激。在刺激生长因子(例如粒细胞集落刺激因 子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和红细胞生成素)中，可以刺激造 血细胞被动员进入血流中并促进肿瘤生长和转移。
在实施本发明时，选择血管内皮生长因子受体r骨髓
衍生细胞抑制剂，以结合血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞。
选择血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂， 以预防或减少血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的形成。合适 的抑制剂可以是血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞特异性生物
分子或者抑制RNA或DNA的小分子。 生物分子包括所有脂质和分子量大于450的单糖、氨 基酸和核苷酸的聚合物。因此，生物分子包括例如寡糖和多糖、寡
肽、多肽、肽和蛋白质；以及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多 核苷酸包括例如DNA和RNA。 生物分子还包括任何上述分子的衍生物。例如，生物 分子的衍生物包括脂质以及寡肽、多肽、肽和蛋白质的糖基化衍生 物。生物分子的衍生物还包括寡糖和多糖的脂质衍生物，例如脂多 糖。 最典型的生物分子是血管内皮生长因子受体r骨髓衍 生细胞特异性抗体或所述抗体的功能性等价物。这样的功能性等价 物包括例如嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体及其片段。 抗体的功能性等价物优选为嵌合抗体或人源化抗体。 嵌合抗体包含非人类抗体的可变区和人类抗体的恒定区。人源化抗 体包含非人类抗体的超变区(CDR)。人源化抗体的可变区(不是超变 区)，例如构架可变区，以及恒定区，都是人类抗体的。 为了本申请的目的，非人类抗体的合适可变区和超变 区可来自任何非人类哺乳动物产生的抗体，其中制备了单克隆抗体。 哺乳动物(而不是人类)的合适实例包括例如兔、大鼠、小鼠、马、山 羊或灵长类动物。优选小鼠。 功能性等价物还包括结合特性与完整抗体相同或相当 的抗体片段。 这样的片段可以例如含有F(ab')2片段中的一个或两个 Fab片段。优选的抗体片段含有完整抗体的全部6个互补决定区，尽 管也包括功能性片段，含有少于所有这样的区域，例如包含3、 4或 5个CDR。优选的片段是单链抗体或Fv片段。单链抗体是多肽， 其至少包含抗体重链可变区及与其相连的抗体轻链可变区，含有或 不含相互连接的接头。因此，Fv片段包含完整抗体结合位点。可在 细菌或真核细胞中产生这些链。抗体和功能性等价物可以是任何类别的免疫球蛋白成
员，例如IgG、 IgM、 IgA、 IgD或IgE及其亚类成员。优选的抗体是 IgGl亚类成员。功能性等价物也可以是任何以上类别或亚类的组合。
本发明的抗体能够结合血管内皮生长因子受体r骨髓 衍生细胞，并能起到抑制其活性的作用。通过抑制血管内皮生长因
子受体r骨髓衍生细胞的功能，这类抗体可具有治疗潜力，尤其是
在癌症治疗中。 本发明的抗体能结合VLA-4 (ot4(31)整联蛋白，抑制这 些骨髓衍生簇的形成。通过抑制VEGFRl+和VLA-4+骨髓衍生细胞的 功能，这类抗体可具有治疗潜力，尤其是在癌症治疗中。 本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。 单克隆抗体可通过本领域众所周知的技术来制备。概 括地讲，该方法包括首先用目标抗原在体内或体外免疫哺乳动物(例 如小鼠)，再从其脾脏获取免疫细胞(淋巴细胞)。然后，将分泌抗体 的淋巴细胞与能在细胞培养物中无限增殖的(小鼠)骨髓瘤细胞或转化 细胞融合，由此产生无限增殖的、分泌免疫球蛋白的细胞系。培养 所得融合细胞即杂交瘤，筛选所得集落，用于制备所需单克隆抗体。 克隆能产生这类抗体的集落，在体内或体外培养以产生大量抗体。 有关融合这类细胞的理论基础和实践方法的描述参见Kohler等, M^re 256:495 (1975),所述文献通过引用全部结合到本文中。 通过用血管内皮生长因子受体r体内免疫动物(例如小 鼠)，免疫哺乳动物淋巴细胞。如有必要，间隔数周重复进行这样的 免疫，以得到足够效价的抗体。在最后一次抗原加强免疫之后，处 死动物，取出脾细胞。 采用标准和公知的技术，可以与在细胞培养时能无限 增殖的哺乳动物骨髓瘤细胞或其它融合伙伴进行融合，所述技术例 如通过使用聚乙二醇("PEG")或其它融合剂(Milstein等，￡wr丄 /ww柳o/. 6:M1 (l976)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。选择 这种无限增殖细胞系(优选鼠，但也可来自其它哺乳动物细胞，包括
但不限于大鼠和人)，所述细胞系缺乏利用某些营养物质的酶，能够 快速生长，并具有良好融合性能。许多这样的细胞系是本领域技术 人员已知的，其它细胞系也有常规描述。多克隆抗体的制备方法也是众所周知的。通常，可通
过将血管内皮生长因子受体r皮下给予新西兰白兔(其事先已经采血
以获取免疫前血清)，产生这类抗体。在6个不同部位注射抗原，每 个部位总体积为lOOpl。各注射材料含有合成表面活性剂佐剂泊洛沙 姆多聚醇(pluronic polyol),或经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后含有蛋 白质或多肽的研磨过的丙烯酰胺凝胶。第一次注射后2周给兔子放 血，然后每6周定期用相同抗原加强免疫3次。每次加强免疫后10 天，采集血清样品。然后，通过亲和色i普，使用相应抗原捕获抗体， 从血清中回收多克隆抗体。最终，用150mg/Kg IV戊巴比妥麻醉兔 子。产生多克隆抗体的上述方法和其它方法都公开于Harlow等(主编), 爿w"6oWw爿丄aZ)0rato7 A/朋wa/ (1988),所述文献通过引用全部结合 到本文中。 原本是人抗体的抗体可由转基因哺乳动物、尤其是转 基因小鼠产生，所述动物经基因修饰以产生人抗体。嵌合抗体和人 源化抗体的制备方法也是本领域已知的。例如，嵌合抗体的制备方 法可参见美国专利第4,816,397和4,816,567号，所述文献通过引用 全部结合到本文中。人源化抗体的制备方法参见美国专利第5,225,539 号，所述文献通过引用全部结合到本文中。 抗体人源化的优选方法称为CDR移植法。在CDR移 植中，将直接参与抗原结合的小鼠抗体区(即CDR互补决定区)移植 到人可变区上，产生"重构人"可变区。这类完全人源化的可变区 再拼接到人恒定区上，产生完整的"完全人源化"抗体。 为了产生与抗原结合良好的完全人源化的抗体，最好 是仔细设计重构的人可变区。应该仔细选择用于移植CDR的人可变 区，通常在人可变区的构架区(FR)内关键位置上有必要改变几个氨基酸。 例如，重构的人可变区在所选人轻链可变区FR内可包 含至多10个氨基酸改变，在所选人重链可变区FR内可包含至多12 个氨基酸改变。将编码这些重构的人重链和轻链可变区基因的DNA 序列与编码人重链和轻链恒定区基因的DNA序列(分别优选yl和k) 连接起来。再在哺乳动物细胞中表达重构的人源化抗体，将其对其 耙标的亲和力与相应鼠抗体和嵌合抗体进行比较。 选择人源化抗体中有待取代的残基并进行取代的方法 是本领域众所周知的。参见例如Co等，M rt^e 351:501-502 (1992); Queen等，尸rac. A^/.爿cad "&4 86:10029-1003 (1989)和Rodrigues 等，/"A C朋cw,增刊7:45-50 (1992),所述文献通过引用全部结合 到本文中。225种抗EGFR单克隆抗体的人源化和重构方法参见WO 96/40210，所述文献通过引用全部结合到本文中。该方法可用于针对
其它蛋白质的抗体的人源化和重构。 单链抗体的制备方法也是本领域众所周知的。 一些实 例包括以下文献中描述的例子欧洲专利申请第502 812号和Wels 等，, Ca"cw 60:137-144 (1995)，所述文献通过引用全部结合到本 文中。单链抗体也可通过筛选噬菌体展示文库而制备。 产生上述功能性等价物的其它方法公开于WO 93/21319、欧洲专利申请第239 400号、WO 89/09622、欧洲专利申 请第338 745号、美国专利第5,658,570号、美国专利第5,693,780号 和欧洲专利申请第332 424号，所述文献通过引用全部结合到本文 中。在本发明方法的实践中，可通过口服、皮内、肌内、 腹膜内、静脉内、皮下或鼻内给予患者抑制剂而进行给药步骤。本 发明的抑制剂可单独给予或与合适的药用载体一起给予，可以呈固 体或液体形式，例如片剂、胶嚢剂、粉剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。本发明的抑制剂可口服给予，例如与惰性稀释剂或与
可吸收的可食用载体一起给予，或者可将其包入硬壳或软壳胶嚢中， 或者可将其压制成片剂，或者可将其直接混入食物中。对于口服治 疗性给予，本发明的抑制剂可以与赋形剂混合，以片剂、胶嚢剂、
酏剂、混悬剂、糖浆剂等形式使用。这类组合物和制剂应含有至少0.1%
的本发明抑制剂。这些组合物中抑制剂的比例当然可以不同，通常
介于约2%至约60%的单位重量。这类治疗用组合物中本发明抑制剂 的用量使得能达到合适剂量。 片剂、胶嚢剂等也可含有粘合剂，例如西黄蓍胶、阿 拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸钩；崩解剂，例如玉 米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂， 例如蔗糖、乳糖或糖精。当单位剂型是胶嚢剂时，除了以上类型的 材料之外，它还可含有液体载体，例如脂肪油。 各种其它材料可以包衣或改良剂量单位的物理形式的 方式存在。例如片剂可以用虫胶、糖或这两者来包衣。糖浆剂中除 了活性成分之外，还可含有蔗糖(作为甜味剂)、对羟基苯曱酸曱酯和 对羟基苯曱酸丙酯(作为防腐剂)、染料和矫味剂(例如櫻桃味或橘子 味)。 本发明的抑制剂也可通过胃肠外给予。可以用与表面 活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水来制备抑制剂的溶液剂或混 悬剂。也可以用甘油、液体聚乙二醇及其混合物的油溶液来制备分 散剂。说明性的油是石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如， 花生油、大豆油或矿物油。 一般而言，水、盐水、含水葡萄糖和相 关糖溶液和二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇)都是优选的液体载体，尤 其是用于注射液。在通常的贮藏和使用条件下，这些制剂含有防腐 剂，以防止^f效生物生长。 适于注射用的药物形式包括无菌水溶液剂或分散剂以 及临用时制备成无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉针剂。在所有 情况下，其形式必须是无菌的，而且其流动性必须易于注射。它在
生产和贮存条件下必须稳定，必须防止细菌和真菌等^t生物的污染 作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例 如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物和植物油。 本发明的抑制剂也可以气溶胶的形式直接给予呼吸 道。对于气溶胶而言，溶液剂或混悬剂中的本发明抑制剂可与合适 的抛射剂以及常规辅料一起包装在加压的气溶胶容器中，所述抛射 剂例如烃类抛射剂，例如丙烷、丁烷或异丁烷。本发明的抑制剂也 可以以非加压形式给予，例如喷雾器或雾化器。 本发明可用于治疗各种癌症。本文所用的治疗癌症特 别是指将治疗药给予经诊断患有癌症的患者(即已确诊患有癌症的患 者)，以抑制癌组织中恶性细胞的进一步生长或扩散，和/或引起恶性 细胞的死亡。具体地讲，乳癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和皮肤癌 以及许多儿科癌症都适于用本发明的方法进行治疗。癌症治疗也包 括治疗患有癌变前病症的患者，以阻止癌变前病症的发展或引起消 退。癌变前病症包括增生、发育异常和化生。 本发明的治疗药可单独使用或与其它癌症疗法(例如化 疗药、辐射或其组合)联用。 化疗药的实例包括烷化剂(例如氮芥、吖丙啶化合物和 磺酸烷基酯)；抗代谢药(例如叶酸、。票呤或嘧啶类拮抗剂)；有丝分 裂抑制剂(例如长春花属生物碱和鬼臼毒素衍生物，以及细胞毒性抗 生素)；以及破坏或干扰DNA表达的化合物。
化疗药或化疗的具体实例包括顺铂、达卡巴溱(DTIC)、 放线菌素D、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司 汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、 阿糖胞苷、依托泊苷、曱氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、 博来霉素、紫杉醇(商品名泰素(taxol))、多西他赛(商品名泰索帝 (Taxotere))、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉曲滨、 达卡巴溱、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素a、亮
丙立德、magastrol、美法仑、巯基嘌呤、奥沙利铂(oxaloplatin)、普 卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链 佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫 司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、紫杉醇和它们的组合。 本发明的抑制剂也可与放疗联用。放射源可以来自待 治疗患者外部或内部。当来源是患者外部，该疗法就称为外部束放 射疗法(EBRT)。当来源是患者内部，该疗法就称为近距离放射治疗 (brachytherapy, BT)。 按照众所周知的标准技术和供该目的而生产的标准设 备(例如AECL Theratron和Varian Clinac)给予放疗。辐射剂量取决于 本领域众所周知的诸多因素。这些因素包括待治疗的器官、在辐射 途径中可能因疏忽而受到不利影响的健康器官、患者对放射疗法的 耐受性和需要治疗的身体部位。剂量通常介于l-100Gy,更特别介于 2-80Gy。已经报道的一些剂量包括35Gy (对于脊髓)、15Gy (对于肾 脏)、20Gy (对于肝脏)和65-80Gy (对于前列腺)。然而，应该强调的
是，本发明不限于任何具体剂量。剂量将由主治医师根据既定情况 下的具体因素(包括上述因素)来确定。 外部放射源和患者进入点之间的距离可以是代表杀伤 靶细胞与最小副作用之间可接受的平衡的任何距离。通常外部放射 源与患者进入点之间的距离介于70-100cm。 通常在患者体内放置放射源，进行近距离放射治疗。 通常放射源放置在离待治疗组织约0-3cm远处。已知技术包括间质、 空腔和表面近距离放射治疗。放射性种子形小管可以永久性或暂时 性植入。已用于永久性植入的一些典型的放射性原子包括碘-125和 氡。已用于暂时性植入的一些典型的放射性原子包括镭、铯-137和 铱-192。已经用于近距离放射治疗的一些放射性原子包括镅-241和金 -198。用于近距离放射治疗的辐射剂量可以与上述外部束放
射治疗所用的剂量相同。确定外部束放射治疗的因素除了上述因素 之外，还要考虑放射性原子的性质，以确定近距离放射治疗剂量。 本发明具体优选的实施方案包括其与辅助治疗方案联 合使用。具体地讲，这包括化疗以及在手术之前和/或手术之后、以 及在整个常规辅助化疗疗程期间使用其它抗VEGFR1和/或VLA-4的
单克隆抗体，或者用基本化疗(没有辅助)疗程(没有手术)。另外，本 发明也可用于在基本手术之后、对没有接受其它治疗的患者进行治 疗(即这些患者进行了基本的完全切除，没有证据表明残余疾病或一 段时间过后才会出现的疾病)，以预防转移扩散。此外，本发明可用 作诊断工具，并确定患者是否处于转移扩散的最高危险中。 本发明的另 一方面涉及预防癌症患者肿瘤转移的方 法。该方法包括在有效预防癌症患者肿瘤转移的条件下，给予癌
症患者血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂。本发明的该
方面包括使用与如上所述的基本相同的治疗药和治疗方式。为了实施本发明的该方面，抑制剂预防或减少血管内
皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞的形成或增殖。这类抑制剂也可预
防所述细胞迁移或肿瘤在其它部位的形成或增殖。本发明的另 一 方面涉及用于抑制癌症患者肿瘤形成或
预防癌症患者肿瘤转移的候选化合物的鉴定方法。该方法包括提供
试验化合物，将试验化合物与血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细 胞一起孵育。鉴定能结合血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的 试验化合物，作为用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤 转移的候选化合物。本发明的另 一 方面涉及监测癌症患者肿瘤转移的方
法。该方法包括评价患者样品的血管内皮生长因子受体r骨髓衍生 细胞水平，并将血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的所测水平 与血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的其它水平进行比较。这 样的其它水平可以是患者先前的水平，其中如果血管内皮生长因子
受体r骨髓衍生细胞水平增加，则表明未来会有胂瘤转移。或者， 其它水平可以是标准或正常水平，其中所测水平高于正常或标准时， 则表明有肿瘤转移。 为了实施本发明的该方面，患者样品可以是组织样品 或血液样品。尤其希望通过给予治疗药，并根据血管内皮生长因子
受体r骨髓衍生细胞的现有水平与血管内皮生长因子受体i+骨髓衍 生细胞的先验水平进行比较的步骤，来实施本发明的该方面。这样 的给药包括如上所述的辅助治疗方案。或者，治疗药可以是化疗药， 根据血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的现有水平与血管内皮 生长因子受体r骨髓衍生细胞的先验水平进行比较，来选择所述化 疗药的规格。 该方法可以在体外或体内实施。对于本发明的体内方 面，评价和比较步骤包括对癌症患者的某一部位进行造影。采用对 血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞具有特异性的标记物或标记 的血管内皮生长因子受体l+骨髓衍生细胞，将其中任一种导入癌症 患者体内，可以完成该方法。 本发明的又 一 方面涉及抑制患者的远离肿瘤原先形成 部位的部位纤连蛋白表达的方法。该方法包括在有效抑制患者的 远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的条件下，给予患者血 管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞抑制剂。本发明的该方面包括 使用与如上所述的基本相同的治疗药和治疗方式。
实施例
实施例1 -骨髓bm移植 对野生型C57B1/6小鼠进行致死性辐射(950拉德)，然 后移植1 x 106 (5-半乳糖苷酶+或GFP+ BM细胞(Rosa-26小鼠)(Lyden 等,"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and
Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓衍生的内皮细胞和造血祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成 和生长),"A^.MW. 7:1194-1201 (2001)，所述文献通过引用全部结合 到本文中)。4周后，给小鼠皮内注射2x106 LLC (ATCC)或B-16细 胞(ATCC)。
实施例2-P-半乳糖苷酶染色 组织和股骨在4。/o低聚曱醛(PFA)中固定4小时。样品
在X-gal溶液中在37。C染色36小时，参见Tam等，"The Allocation of
Epiblast Cells to the Embryonic Heart and other Mesodermal Lineages: The Role of Ingression and Tissue Movement during Gastrulation (上胚
层细胞定位于胚心和其它中胚层谱系原肠胚形成期间内移和组织 运动的作用),"Dev却画t 124:1631-1642 (1999)，所述文献通过引 用全部结合到本文中。X-gal染色的肿瘤和BM按照以下文献所述进 行包埋Lyden等,"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓衍生的内皮细胞和造血祖细胞的募集 减少能阻断肺瘤血管生成和生长),"M^.MW. 7:1194-1201 (2001),所 述文献通过引用全部结合到本文中。
实施例3 -荧光肿瘤转染 在转染前24小时，接种B16和LLC细胞(2 x 105)。然 后沉淀细胞并重悬于含有DsRed报道基因或GFP基因的慢病毒载体 上清液的无血清培养基中。如前所述，效价为l-2x 10s感染颗粒/ml 的浓缩病毒构建体用于感染2xlOS细胞/lml (感染复数为50)。进行 流式细胞术分析，证实荧光强度。给C57B1/6小鼠接种2xl06 LLC/GFP+或B16/DsRed+细胞。
实施例4-免疫组织化学 按照先前所述的文献，固定组织并包埋在OCT中或石 蜡块中Lyden等，"Idl and Id3 are Required for Neurogenesis, Angiogenesis and Vascularization of Tumor Xenografts (Idl和Id3是月中 瘤异种移植物神经发生、血管发生和血管形成所必需的),"A^wm. 401:670-677 (1999),所述文献通过引用全部结合到本文中。对于所 有抗原来说，可使用以下抗体VEGFRl (Flt-1,克隆mF-l, ImClone Systems, New York, New York和Flt-1克隆C-17, Santa Cruz Biotechnology)、 CD31 (PEC扁，SC-1506, Santa Cruz Biotechnology), VEGFR2 (Flk-l/KDR, dclOl, ImClone Systems), MMP-9 (D19557, Oncogene)、 Id3 (C-20， Santa Cruz Biotechnology),纤连蛋白(TV國l, Chemicon)、 CDllb (CBRMl/5, eBioScience)、 CD34 (RAM34, BD Pharmigen)、 ckit (ACK2， eBioScience) 、 PDGFRa (CD49d, VL-4, PS—2, Southern Biotech)、 aV (Chemicon)、 CD133 (13A4, eBioScience)、 a4 (CD49d, VLA-4, PS—2, Southern Biotech) 、 a5 (CD49e, 5H10画27)、 a6 (CD49f, GoH3， BD Pharmingen)、(M (9EG7， BD Pharmingen)、p2 (M18/2, BD Pharmingen)、 (34 (Santa Cruz Biotechnology) 、 (37 (M293, BD Pharmingen)、 SDF画1 (79018.111， R+D systems)、 CXCR4 (2B11, BD Pharmingen)。
实施例5-双重免疫荧光 在OCT中将组织切片，然后用丙酮固定。用0.1% BSA/PBS洗涤，非特异性抗体用抗生物素蛋白和生物素(Vector Laboratories)封闭。将第一基本抗体(如上所述)在4'C孵育过夜。种属 特异性生物素化笫二抗体(Vectastain ABC Kit, Vector)在室温下孵育 30分钟。然后将得克萨斯红抗生物素蛋白D或荧光素抗生物素蛋白 D (Vector)孵育30分钟。对笫二基本抗体重复该步骤。将切片浸入含 有DAPI的荧光封固介质(Vectashield, Vector)中，如上所述进行观察。 实施例6-选择性骨髓移植 在第0、 4和8天，Rosa-26小鼠接受腺病毒-VEGF^ (AdVEGF) (Avecilla 等，"Chemokine-mediated Interaction of Hematopoietic Progenitors with the Bone Marrow Vascular Niche is Required for Thrombopoiesis (趋化因子介导的造血祖细胞与骨髓血管 生态位的相互作用，是血小板生成所必需的),"A^. 10:64-71 (2004)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。在第12天，分离BM 并用生物素化鼠VEGFR1抗体和抗生物素磁珠(Miltenyi Biotec)进行 标记，用MACS (Miltenyi Biotec)分离。在3个连续步骤后， VEGFR1+BM的纯度为95%。负选择群体代表非Rl细胞(Hattori等， "Placental Growth Factor Reconstitutes Hematopoiesis by Recruiting VEGFRl(+) Stem Cells from Bone-marrow Microenvironment (月台盘生长 因子通过从骨髓孩史环境募集VEGFRl(+)干细胞而重建血细胞生成)," Ato. Afed 8:841-9 (2002),所述文献通过引用全部结合到本文中)。如 上所述，对WT小鼠进行辐射并移植选择性BM。每3天一次经静脉 内注射105细胞，给Id3 KO (Idl7+Id3一)小鼠移植选择性Id3活性 VEGFR1+BM,共23天。对照动物接受VEGFRl+细胞，没有肿瘤。
实施例7-抗体打靶 给WT小鼠接种2 x 107 LLC细胞或B-16细胞。为了 封闭VEGFR-1，给小鼠腹膜内注射抗VEGFR1的大鼠抗小鼠抗体 (mf-l, IgGl， 400|ug, ImClone)或抗VEGFR2的大鼠抗小鼠抗体(DC101, IgGl, 800|ig, ImClone)或组合，在第7-22天内每48小时一次，在第 24天处死小鼠。为了封闭VLA-4的a4亚基，在第4、 8和12天， 给小鼠静脉内注射抗CD49d的大鼠抗小鼠抗体(克隆R1-2, IgG2bK, 200fxg, BD Biosciences Pharmingen)。在笫14天处死动物，评价蔟的 形成。为了在肿瘤发育后期靶向转移，在第6、 10、 14、 18和22天 注射抗ot4抗体，在笫24天处死动物。所有组都与大鼠抗小鼠IgG2aK
同种型对照(KLH/G2al-1， Southern Biotech)进行比较，该对照是按照 与实验组相同的时间表来给药的。
实施例8 - MMP-9 KO 得自Jackson Laboratory的小鼠具有C57BL6背景。
实施例9-体外聚集测定 在笫14天，从植入B16细胞的小鼠分离出BM衍生的 VEGFRl+细胞。对Rl+细胞(5 x 105)进行焚光红(PKH26-GL, Sigma, St. Louis, MO)染色，并培养在含0.2%明胶的M199培养基(补充10% FCS) 中，与rhVEGF (10 ng/mL, R&D Systems)、抗VEGFR1 (10吗/ml， mf-1, ImClone)或抗a4 (CD49, PS_2, 20)ug/ml, Southern Biotec)—起孵育14 小时。同样，将VEGFRl+细胞与rhVEGF、抗VEGFR1、抗a4 —起 孵育1小时，然后与肿瘤细胞一起孵育14小时，进行研究。将R1+ 细胞与B-16肿瘤细胞或LLC肿瘤细胞、标记的荧光绿(PKH2-GL, Sigma)共培养(Lee等，"In Situ Labeling of Adherent Cells with PKH26 (贴壁细月包与PKH26的原位标记),"/" FzYra Ce〃. Dev.说o/,Jm'ma/. 36:4-6 (2000)，所述文献通过引用全部结合到本文中)，分析聚集和增 殖。
实施例10-条件培养基研究 按照以下文献，从在B-16细胞或LLC细胞上培养18 小时的无血清培养基中过滤出条件培养基(0.22)i): Kessinger等,
"Circulating Factors may be Responsible for Murine Strain-specific Responses to Mobilizing Cytokines (循环因子负责针对游动细胞因子的 鼠品系特异性反应)，"Ex/ , /femato/ogy. 29:7"-778 (2001),所述文献 通过引用全部结合到本文中)。如上所述，每天将CM (300|11)经腹膜 内注射给4周前已经接受Rosa-26 BMT的WT小鼠，共注射9天。
对组织的纤连蛋白(TV-l, Chemicon)和(3-gal进行染色。对于胂瘤改道 研究，腹膜内注射黑素瘤CM (300pl)或PIGF (300jxl, Peprotec), 2天 后皮内植入LLC细胞，再每日继续注射21天。给予有或无胂瘤的对 比对照组无血清培养基。为了抑制胂瘤改道，按照抗体打靶研究所 述，将抗VEGFR1抗体注射给具有LLC肿瘤接受MCM的实验组。 第22天检查组织。如上所述，有或无肿瘤的以上对比对照组用或不 用抗体进行治疗。 每天给WT动物注射黑素瘤条件培养基(300jLiL),共7 天，然后尾静脉注射B16黑素瘤肿瘤细胞。将MCM或无血清RPMI 给予小鼠，然后每天注射B16，直到它们在给予静脉内肿瘤后24小 时或4天#1处死。用PBS灌注肺部，然后冷冻包埋在OCT内。
实施例11 -迁移测定 接下来研究了 VEGFR1细胞响应条件培养基的迁移。 如上所述分离出VEGFR1细胞，将悬浮于无血清培养基中的lx105 细胞放入5)tim pore transwells (Costar, Corning Incorpomted)的上室。 让细胞在条件培养基或相应对照培养基中迁移18小时，每6小时将 细胞从膜下和下室中刮下并捣碎，并用血球计数器和锥虫蓝对细胞 计数进行分析。如先前所述，用12|tim pore transwells进行B16肿瘤 细胞或LLC肿瘤细胞向VEGFR1+细胞的迁移(Redmond等，
"Endothelial Cells Inhibit Flow-induced Smooth Muscle Cell Migration: Role of Plasminogen Activator Inhibitor-1 (内皮细胞才卬制流动i秀导的平 滑肌细胞迁移纤溶酶原激活物抑制剂-1的作用),"C/rcw/a^w 103:597-603 (2001)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。将焚光 标记的肿瘤细胞(PKH2-GL, Sigma)以1 x 105细胞接种在上室中，将1
xlO5 VEGFR1细胞接种在下室的无血清培养基中。上下室没有浓度 梯度。每6小时进行一次分析，用倒置荧光显耀:镜(Nikon Eclipse TE 2000-U)进行直接观察和手工统计每200x视野下的细胞数目。
实施例12 -多种组织中纤连蛋白的定量PCR分析 如前所述，用组织匀浆器在TriZol中将肺组织匀浆， 抽提RNA (Hashimoto等，"Bone Marrow-derived Progenitor Cells in Pulmonary Fibrosis (肺纤维化中的骨髓衍生祖细胞)."77^ Jowma/ o/ C//wc"//m^对/g加朋113:243-252 (2004),所述文献通过引用全部结 合到本文中)。如前所述，用TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems) 定量测定纤连蛋白基因表达，并归一化至GAPDH (Jensen等，"The Human Herpes Virus 8-encoded Chemokine Receptor is Required for Angioproliferation in a Murine Model of Kaposi's Sarcoma (人疱渗病毒
8编码的趋化因子受体是卡波西肉瘤鼠模型中血管增殖所必需的)," Jowma/ q/7附mw"o/ogy 174:3686-94 (2005)，所述文献通过引用全部结 合到本文中)。
实施例13-趋化因子测定 按照各制造商使用说明书，用ELISA (Quantikine, R&D Systems)分析条件培养基和无血清培养基以及肿瘤衍生血浆的VEGF 和P1GF浓度。胂瘤衍生血浆得自LLC肿瘤细胞或B16肿瘤细胞后 第14天的小鼠。
实施例14 -流式细胞术研究 按照以下文献，将外周血单核细胞与荧光缀合的单克 隆抗体CDllb (Ml/70, PE抗小鼠，BD Pharmingen)、 Sca-1 (E13-161.7, PE和FITC抗小鼠Ly-6A/E, Becton Dickinson)和VEGFRl (克隆mf國 1, FITC, ImClone Systems)—起醉育Gill等，"Vascular Trauma Induces Rapid But Transient Mobilization of VEGFR2+AC133+ Endothelial Precursor Cells (血管创伤诱导VEGFR2+AC133+内皮祖细胞的快速而 瞬时动员)，"Orw/加ow We; earc/2 88:167-174 (2001)，所述文献通过 引用全部结合到本文中。如前所述，在用PBS通过右心室注射对肺
进行灌注后，对整个右肺也进行流式细胞术，再将肺切成小块，用
lOOpm和40fim滤器(BD BioSciences)过滤，形成单细胞悬液。得到 单细胞悬液之后，对于cKit流式分析，将细胞用perCP cKit直接染 色，无需固定，再放入PBS中，在Coulter FC500细胞计数器上进行 分析。
实施例15-人体标本 人体标本包括肿瘤、近端正常(胂瘤边界之外)、远端正 常和淋巴结。如上所述,将组织包埋在石蜡中，冷冻固定，用抗VEGFR1 (FB5, ImClone Systems)和Flt-l (Calbiochem)的抗体染色。按照已批准 IRB申请获取和处理组织样品。
实施例16 -定量免疫组织化学分析 利用IP Lab和Adobe Photoshop 7.0,随机得到100x视 野，通过选择标准颜色范围分析(3-gal或免疫组织化学染色。 一旦描 绘该边界，就可求出pixilation直方图下面积，将总染色面积与总组 织面积进行比沣交。
实施例17 -统计学分析 结果用平均值士标准误差表示。采用学生检验分析数 据，用GmphPad Prism统计学程序进行方差分析。P值O.05为显著。 误差条(Error bar)描述了平均值的标准误差。 申请人:分析了在皮内原发性胂瘤注射后(3-半乳糖苷酶+ (P-gar)骨髓(BM)衍生细胞的命运。采用Lewis肺癌(LLC)肿瘤细胞(其 通常转移至肺部，很少转移至肝脏)，或B16黑素瘤肿瘤细胞(其具有 更广泛的播散性转移潜力)。在皮内注射各肿瘤类型之后，将肺、肝、 脾、肾和性腺切片并染色，用于观察(3-gar BM细胞是否存在，或者 筛选GFP+BM细胞。辐射后但在肿瘤植入前，在小鼠肺部极少或未
见P國gar (0.01%±0.01 (3誦gal染色/100x视野)或GFP+ BM衍生细胞(图 1A&1B左图)。到肿瘤植入后笫14天、肿瘤细胞到达之前，在终末 细支气管和远端肺泡附近检测到P-gar (3.2%±1.2 (3-gal染色/100x视 野，经学生氏t检验，口<0.05)或0 + BM衍生细胞的外渗和簇形成， 终末细支气管和远端肺泡都是未来转移的常见部位(图1A&1B,左中 图&插图)。到第16天，P-gal+簇(包含20-100个具有组织化的基质元 件的细胞)显示出未来转移性病灶的外廓(图1A，右中图)。在第18 天可见各个红色荧光肿瘤细胞，与先前存在的BM衍生簇相结合(图 1B,右中图)，到第23天发展成微小转移(图1A&1B,右图)。甚至 在已确定肿瘤转移时仍保持p-gal+BM细胞的存在(图1A,右图插图)。
实施例18-骨髓衍生细胞在肿瘤细胞扩散前到达 为了进一步确定胂瘤细胞到达的时间，进行流式细胞 术研究，以确定GFP+骨髓衍生细胞和红色荧光标记的肿瘤细胞的存 在。在第8天之前，肺部可见最小GFP+ BM衍生细胞(图1C左图& 表格)。自第12天开始，BM衍生细胞开始迁移到肺部，这与经显耀: 镜观察到的BM衍生簇是一致的(图1C)。这些细胞数增加，在第18 天与肿瘤细胞结合(图1C)。在16天之前，经显樹:镜或流式细胞术都 未检出肺部的肿瘤细胞。随时间延长，通过流式细胞术鉴定出肺部 肿瘤细胞的数量增加，与显微照片图像中可见的已建立的骨髓衍生 蔟部位的肿瘤细胞粘附和增殖是相互对应的(图1B&1C)。检出肿瘤 细胞与GFP+ BM衍生簇的共成簇频率大于95%(97%±1.1，图1B, 右图)。尽管用该方法可能会漏失少量肿瘤细胞，但是给予来自培养 的B16黑素瘤细胞的条件培养基的小鼠，进一步实验表明，条件培 养基单用可引起骨髓衍生细胞的动员和转移前生态位的形成。采用 尾静脉胂瘤转移模型，用条件培养基刺激后引入肿瘤细胞(图1D)与 单用培养基进行比较(图1D),在注射后1天，增加了肺部肿瘤细胞 数(图1D, 141.3士10.2肿瘤细胞，对比2.7土0.6肿瘤细胞/肺横切片，经
学生氏t检验，p<0.01)。静脉内肿瘤细胞注射4天后，肺部转移小结 的频率和大小增加(207肿瘤细胞±5.6/肺横切片，对比14肿瘤细胞±1.7/ 肺横切片，经学生氏t检验，p<0.01)。红色荧光肿瘤细胞针对GFP+ 簇的共定位分析是在各时间点都大于93%,表明这些BM衍生细胞 有助于肿瘤细胞粘附和增殖。因此，在原发性胂瘤所释放因子的影 响下，BM衍生细胞进入血流并运动到远端特异性转移前部位。
实施例19 - BM衍生细胞蔟位点是肿瘤类型特异性的 检查了肿瘤细胞类型是否决定BM簇在机体内特异性 转移前部位的分布(图1E)。皮内注射LLC肿瘤细胞，导致BM簇的 形成仅限于肺部(47.5土2.6/100x视野)和肝(10.8士U)，而在睾丸、脾 或肾未见簇，这是因为该类肿瘤细胞的转移特异性。相比之下，B16 黑素瘤肿瘤细胞导致多器官形成BM簇，例如肺(103.8士6.9)、肝(41.8 ±2.4)、睾丸(36.6士3.1)、脾(25±3.2)和肾(20.6±1.8)，对应于该肿瘤 转移的常见器官(图1E)。此外，与B16黑素瘤细胞更具攻击性转移 特性一致的是，它们诱导比LLC肿瘤细胞明显更多的簇(经学生氏t 检验，pO.Ol)。
实施例20國这些BM衍生细胞的表征表明itifiL祖细胞的状况 接下来表征了 BM衍生簇的细胞组成。肿瘤细胞类型 所诱导的簇表达VEGFR1 (图1F, 3.9±0.2,高于野生型)。在单用辐 射之后，肺实质中GFP+ BM衍生簇共表达VEGFR1 (图1F),相比之 下，VEGFR1只有极少表达(图1F)。对这些细胞簇进一步表征，显 示大多数BM衍生细胞是VEGFR1+共表达CD133 (图1G)、 CD34 (图 1G)和CD117 (cKit)(图1G&图1H)，这表明这些细胞亚类来源于原 始造血细胞。BM衍生簇也显示出一定程度的成熟异质性，因为某些 细胞上存在骨髓单核细胞标记CDllb。原发性肿瘤植入后，对肺部 祖细胞进行分析，概括了先前研究的时间进程。正如流式细胞术所
见，CD117+细胞先于GFP标记的肿瘤细胞到达肺部(图1H)。早期 VEGFR1+BM蔟缺乏VEGFR2 (图5A)和CD31的表达(图5A)。进一 步的动力学研究表明，VEGFR2+ CEP迁移到BM衍生簇，与肿瘤细 胞的到达是一致的(图5B)。完全形成的转移前生态位含有骨髓衍生 的VEGFR2+内皮祖细胞(图5)。这些发现确定，BM衍生的VEGFRr 造血细胞促使和维持转移前生态位，并提供允许的微环境，以促使 和维持肺瘤转移。
实施例21 -在自发肿瘤模型中出现BM衍生簇 将植入肺瘤的发现与用自发肿瘤模型的发现进行比 较。选择过量表达c-Myc的转基因小鼠，用于其早期发作和高侵袭 性肿瘤扩散到淋巴系统。在生命的笫40天，在肿瘤发作之前，在淋 巴结中明显检出VEGFRl+簇(145.1士16.4簇/100x视野，图II,中图 和插图)，相比之下，野生型同窝出生幼仔可见缺乏蔟(0.4 ± 0.3簇/100x 视野，图II,左图，经学生氏t检验，pO.OOl)。在肺和肝等其它器 官中未见这些簇。到生命的第4个月，VEGFRl+簇持续扩散到已建 立的淋巴瘤中，但比转移前状态的程度更小(c-Myc小鼠中为67.8 ±9.5 簇/100x视野，对比同窝出生幼仔中为0.7±0.5簇/100x视野，图II， 右图和插图，经学生氏t检验，pO.OOl)。显然，VEGFRl+细胞簇周 围的淋巴瘤细胞并不表达VEGFR1 (图II,右图插图)。
实施例22-人体组织中的常见转移部位出现BM衍生细胞簇为了证实在小鼠模型中得到的数据说明VEGFRl+细胞
簇的肿瘤特异性形成，分析来自原发性实体瘤患者的人体组织。在 人原发性胂瘤和胂瘤转移组织中都可见VEGFRl+簇(图6A;乳癌-腋 窝淋巴结，图6C;肺癌，图6E;食道癌)。胂瘤扩散之前，在转移 常见部位细胞簇增加，说明该组织的恶性化潜力(图6,簇/100x视野 图6B;腋窝淋巴结21士5，图6D;肺19±4,图6F; GE连接25 ±4)。得自没有恶性肿瘤的患者的正常人淋巴结和肺组织不显示形成 VEGFRl+蔟(图6B， 6D插图)。
实施例23 -靶向选择性BM群体，揭示肿瘤转移中VEGFRl+细胞 的功能作用 通过将纯化VEGFR1+BM细胞选择性移植给受过辐射 的小鼠，评价这些祖细胞促进转移前簇的潜力。在LLC植入后24天， 移植完整BM的对照小鼠(WT)显示出明显的肺转移(图2A,左图)， 与良好建立的血管相关(图2A，左图插图)。然而，移植纯化 VEGFR1+BM群体的小鼠在肺部形成多个由少量肺瘤细胞组成的微小 转移(图2A,中图箭头&表格，25±9微小转移/100x视野)并具有异 常血管系统(图2A，中图插图)。该结果表明，VEGFR1+HPC能够促 进转移前簇，其可吸引肿瘤细胞，形成纟敛小转移。相比之下，VEGFR1 + 细胞的BM耗尽，就不能产生转移前簇(图2A右图&表格，经单侧 ANOVA， p<0.01)。 为了确定破坏VEGFRl+细胞簇是否能阻断良好建立的 肿瘤的转移，接种LLC或B16肿瘤的小鼠用特异性抗鼠VEGFR1、 VEGFR2或这两者的单克隆抗体进行治疗。该方法允许选择性把向 VEGFR1+HPC,因为这些肿瘤细胞不表达VEGFR1或VEGFR2。在 第24天，对两种肿瘤类型来说，广泛扩散的转移都是明显的，正如 在具有LLC的动物肺部所见(图2B，左图&表^^或在具有B16黑素 瘤的动物脾脏所见(图2B右图和插图)。单用抗VEGFR1抗体治疗消 除了对簇的引发作用并预防转移(图2B&表格，经单侧ANOVA， p<0.01),而抗VEGFR2抗体不改变VEGFRl+簇的形成，但能预防孩i 小转移的发展(15士11微小转移/簇/100x)(图2B,插图&表格)。两种 抗体的组合能阻断簇的建立，与抗VEGFR1治疗类似；然而，在一 只动物肺部观察到分离的B16转移性病灶(图2B,插图)。总起来说， 这些结果表明，靶向VEGFRl+细胞簇形成，可预防胂瘤细胞粘附、
增殖和转移扩散。
实施例24 - VLA4、 MMP-9和Id3参与转移前生态位的形成接下来研究了 HPC因其与转移前微环境之间相互作
用，而从细胞蔟迁移的细胞机制和分子机制。整联蛋白a4pi (VLA-4) 与其配体纤连蛋白的相互作用对骨髓基质内早期造血细胞的迁移是
必不可少的(Burger等，"CXCR4 Chemokine Receptors (CD184) and
ot4pl Integrins Mediate Spontaneous Migration of Human CD34+ Progenitors and Acute Myeloid Leukaemia Cells Beneath Marrow Stromal Cells (pseudoemperipolesis) (CXCR4趋化因子受体(CD184)和
a邻l整联蛋白介导人CD34+祖细胞和急性骨髓性白血病细胞下骨髓 基质细胞的自发迁移(假伸入运动)),"5n'to/ Jowma/ o/ //aemato/ogy 122:579-589 (2003)和Scott等，"Deletion of oc4 Integrins from Adult Hematopoietic Cells Reveals Roles in Homeostasis, Regeneration, and Homing (从成体造血细胞中缺失a4整联蛋白，揭示了a4整联蛋白在 体内平衡、再生和归巢中的作用),"Mo/ecM/ar a"<af Ce〃w/ar B/o/ogy 23:9349-9360 (2003),所述文献通过引用全部结合到本文中)以及对循 环中成熟的白细胞的迁移也是必不可少的(Neeson等，"Lymphocyte-Facilitated Tumour Cell Adhesion to Endothelial Cells: The Role of High Affinity Leukocyte Integrins (淋巴细胞促进肿瘤细胞粘附到内皮细胞
上高亲和性白细胞整联蛋白的作用),"尸a^o/ogy 35:50-55 (2003) 和Jonjic等,"Molecules Involved in the Adhesion and Cytotoxicity of Activated Monocytes on Endothelial Cells (参与内皮细月包上活4匕单才亥细 胞粘附和细胞毒性的分子),"T^Jow77a/o/7mww"o/ogv 148:2080-2083 (1992)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。因此，可以评价 VEGFRl+细胞是否也可表达整联蛋白，因而促进该细胞类型与转移 前生态位的相互作用。已经发现，在转移前簇的VEGFR1+HPC表达 VLA-4(图3A和插图，VEGFR1的共表达)，但对av整联蛋白却是阴 性的。这表明这些细胞上VLA-4的表达允许BM衍生细胞粘附到转
移前生态位上。簇形成后，在骨髓细胞及其相关基质内也是重要的
a4(37整联蛋白以及a6(34在转移生态位内是明显弥散性分布的。造血 细胞所产生的基质金属蛋白酶9 (MMP-9)等蛋白酶可通过释放可溶性 Kit-配体和VEGF-A用于分解基底膜并改变局部微环境，以支持新引 入的细胞表达cKit (Hessig等,"Recruitment of Stem and Progenitor Cells
from the Bone Marrow Niche Requires MMP-9 Mediated Release of Kit-ligand (来自骨髓生态位的干细胞和祖细胞的募集需要MMP-9介导的 Kit-配体的释放),"CW/ 109:625-37 (2002)和Bergers等，"Matrix Metalloproteinase-9 Triggers the Angiogenic Switch During Carcinogenesis (在肿瘤发生期间，基质金属蛋白酶-9触发血管生成开 关),"iWzf Ce〃说o/ 2:737-744 (2000),所述文献通过引用全部结合到 本文中)。另外，因为纤连蛋白结合，通过oc邻l信号转导可增加金属 蛋白酶表达(Huhtala等，"Cooperative Signalling by alpha 5 beta 1 and alpha 4 beta 1 Intergrins Regulates Metalloproteinase Gene Expresson in Fibroblasts Adhering to Fibronectin (a5(31和a4(31整联蛋白协同信号转 导，调节粘附于纤连蛋白的成纤维细胞中的金属蛋白酶基因表达)," Zowma/ o/ CW/ 129:867-879 (1995)和Yakubenko等，
"Differential Induction of Gelatinase B (MMP-9) and Gelatinase A (MMP-2) in T Lymphocytes Upon alpha(4)beta(l)-mediated Adhesion to VCAM画l and the CS-l Peptide of Fibronectin (在a(4)p(l)介导的与 VCAM-l和CS-l纤连蛋白肽的粘附时，T淋巴细胞中的明胶酶B (MMP-9)和明胶酶A (MMP-2)的差异诱导),"Ce〃 i 仏260:3-84 (2000),所述文献通过引用全部结合到本文中)。在转移前簇中可见 MMP-9的表达以及VLA-4分布，表明MMP-9的产生可能是在这些 VEGFR1+HPC中的整联蛋白结合和活化的结果(图3A)。这些发现与 Hiratsuka等先前的工作是一致的并扩展了该工作，证明在转移前肺 部VEGFR1介导的对MMP-9表达的诱导(Hiratsuka等，"MMP9 Induction by Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 is Involved in Lung-specific Metastasis (血管内皮生长因子受体-1对MMP9的诱导，参与肺特异性转移),"C朋cw Ce〃. 2:289-300 (2002)，所述文献通
过引用全部结合到本文中)。 先前已经知道，Id基因的上调对于原发性肿瘤生长的 祖细胞动员是至关重要的(Ruzinova等，"Effect of Angiogenesis Inhibition by Id Loss and the Contribution of Bone-marrow-derived Endothelial Cells in Spontaneous Murine Tumours (自发鼠肿瘤中,Id
缺失的血管生成抑制效应和骨髓衍生内皮细胞的贡献),"C朋cw Ce〃. 4:277-289 (2003)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。与VLA-4 的分布一致，在簇内也可见Id3的表达(图3A和插图，VEGFR1和Id3 的共表达)。该结果表明，Id3上调可促进VEGFRl+细胞向转移前生 态位运动。另外，特异性整联蛋白的表达受到Id基因活化的调节， 并可负责BM衍生细胞和基质细胞相互作用、运动性和募集(Ruzinova 等，"Effect of Angiogenesis Inhibition by Id Loss and the Contribution of Bone-marrow-derived Endothelial Cells in Spontaneous Murine Tumours (自发鼠肿瘤中，Id缺失的血管生成抑制效应和骨髓衍生内皮细胞的 贡献),"Ca"ce厂Ce〃. 4:277-289 (2003)，所述文献通过引用全部结合
到本文中)。 为了证实这些蛋白质在已建立的转移前生态位内的功 能作用，在MMP-9和Id3敲除小鼠中抑制VLA-4的表达(用抗a4抗 体)或研究VEGFRl+细胞簇的形成。这些模型中的每一种都用肿瘤攻 击，在肿瘤植入后3周，发现簇的形成减少(图3)，转移扩散也减少。 与野生型对照相比(3,283 VEGFRl+CDllb+细胞/itU)，在响应肿瘤接种 后，在Id突变型小鼠循环中的被动员的VEGFRl+细胞减少，说明HPC 动员减少(654 VEGFRl+CDllb+细胞/nl)(经学生氏t检验，p<0.01， 图9)。这证明先前在这些动物中所见到的原发性肿瘤生长减少，可 用于解释它们的转移性表型减少。 在Id3-Z-小鼠中，为了正式检查野生型VEGFRl+细胞恢 复转移缺陷的潜力，将W3活性GFP+ VEGFR1+HPC静脉内注射给带 有LLC肿瘤的Id3 KO小鼠。在肿瘤植入后21天，单独引入野生型 VEGFRl+细胞，重建簇形成和微小转移(图3B)。值得注意的是，LLC 转移性病灶与预先设定的GFP+ BM衍生蔟相关(图3B)。这些发现进 一步强调了建立簇和转移所需的VEGFR1+BM衍生细胞的功能作用。
实施例25 -组织实质中纤连蛋白以VLA-4+ BM衍生细胞的趋触性 配体的形式存在 在注射原发性胂瘤之后、81^衍生的￥1^-4+ VEGFR1+ 细胞归巢之前，检查组织实质，以确定组织特异性配体的表达是否 可介导粘附和这些BM簇的形成。的确，通过免疫组织化学分析和 定量PCR,在LLC注射之后，随时间延长，从第3-14天可见在肺部 的未来转移生态位附近纤连蛋白表达增加，相比之下，在WT肺可 见基线纤连蛋白表达(图3C和3E)。此外，响应原发性肿瘤而增殖的 驻留成纤维细胞样基质细胞(图3)可促进局限性纤连蛋白。对于植入 B16的小鼠而言，可见肺部纤连蛋白表达与接种LLC的小鼠的分布 类似(图3D)。此外，看来纤连蛋白在VEGFRl+簇中表达(图3D)。在 暴露给黑素瘤条件培养基的多种组织(例如肠和输卵管)中，纤连蛋白 表达明显增加，这与B16肿瘤对这些部位的更具侵袭性的转移特性 是一致的(经单侧ANOVA，对于来自给予MCM的小鼠输卵管与LCM 处理的或WT组织进行比较，对于笫3-5天的纤连蛋白表达，p<0.05, 对于第7-9天的纤连蛋白表达，pO.001;经单侧ANOVA,对于来 自给予MCM的小鼠肠组织与LCM处理的或WT组织进行比较，对 于第7-9天的纤连蛋白表达，p<0.001，图7A和7B)。
实施例26-VEGFRl+细胞促进肺瘤细胞迁移、粘附和增殖 为了证实VEGFRl+祖细胞促进肿瘤细胞的趋化性和附 着，分离来自植入肿瘤小鼠的VEGFRl+细胞，并进行红色荧光标记 (PKH26-G1)(图8)。在与绿色焚光标记的(PKH2-GL) B16或LLC细
胞体外共孵育1小时中，造血祖细胞聚集并增殖(升高150%),促进 肿瘤细胞的附着和增殖。相比之下，先前在抗VEGFR1或抗VLA-4 抗体存在下培养的VEGFR1+HPC阻断该结合亲和性和扩增(图8A)。 此外，进行transwell迁移测定，其中与非VEGFR1细胞(11.2±0.4) 和单用培养基(9.9±0.9)相比，荧光标记的肿瘤细胞运动性增加，以 响应骨髓衍生的VEGFRl+细胞(29.6士1.4胂瘤细胞/200x)(图8B，经 单侧ANOVA, pO.OOl)。已知SDF-1/CXCR4轴在BM祖细胞归巢 和保留在骨髓的某些生态位中起到突出作用(Ratajczak等，"Stem Cell
Plasticity Revisted: CXCR4-positive Cell Expressing mRNA for Early Muscle, Liver and Neural Cells 'Hide Out' in the Bone Marrow (干细 胞可塑性Revisted:在骨髓中，CXCR4阳性细胞表达mRNA,用于 早期肌肉、肝脏和神经细胞"藏匿"),，，丄e由m/a. 18:29-40 (2004)， 所述文献通过引用全部结合到本文中)。在许多生理过程中，类似于 来自骨髓的造血干细胞和祖细胞的动员利用该轴，表达CXCR4的特 异性肿瘤细胞类型也以此方式迁移，以响应局部趋化因子梯度(Lapidot 等,"Current Understanding of Stem Cell Mobilization: The Roles of Chemokines, Proteolytic Enzymes, Adhesion Molecules, Cytokines and Stromal Cells (目前对干细胞动员的理解趋化因子、蛋白水解酶、
粘附分子、细胞因子和基质细胞的作用)"五义penwewto/ /fewato/ogy. 30:973-981 (2002), Balkwill, F.， "The Significance of Cancer Cell Expression of the Chemokine Receptor CXCR4 (癌细胞表达趋化因子受 体CXCR4的重要性),"Sew/wara ," Cawcer B/o/ogy. 14:171-179 (2004) 和Muller等,"Involvement of Chemokine Receptor in Breast Cancer Metastasis (趋化因子受体参与乳癌转移)，"M^wre. 410:50-56 (2001), 所述文献通过引用全部结合到本文中)。在完全形成的转移前簇内， 含有VEGFRl+细胞、成纤维细胞和纤连蛋白(参见图1A,左图)，SDF-1 (CXCL12)被高表达(图8C)。鉴定了 CXCR4以扩散形式遍布于已建 立的原发性黑素瘤中，但对于LLC是在"活性"边缘的局部区域(图8D)。起源于转移前生态位的趋化因子梯度的存在，可用于吸引 CXCR4+肿瘤细胞。这些发现表明，由肿瘤类型决定的纤连蛋白上调， 使VLA-4+ VEGFRl+造血簇能够结合，是形成转移前生态位所必需 的。另外，这些簇与肿瘤细胞之间通过VEGFR1和VLA-4和SDF-1 和CXCR4的表达相互作用，支持转移前生态位发展成为转移。
实施例27 -肿瘤衍生的条件培养基有助于决定肿瘤转移扩散的具体 模式 为了进一步研究LLC细胞和B16细胞的选择性转移潜 力，从这两类培养中的肿瘤细胞中得到条件培养基。腹膜内注射LLC 条件培养基(LCM),使得可能从驻留的成纤维细胞表达纤连蛋白并形 成BM衍生簇(图4A)，与单用培养基相比(图4),以类似方式，但比 原发性皮内LLC更快。相当于皮内B16肿瘤效果，但是更快；黑素 瘤条件培养基(MCM)决定了肝脏中纤连蛋白表达比LCM更高(图 4B)。与单用培养基相比(图4B), MCM也引起成纤维细胞增殖和纤 连蛋白表达增加，同时在许多器官中形成簇，正如在肠中所见的一 样(图4B和图7A和7B)。与带有LLC的动物相比，在带有B16肿 瘤的动物中，观察到增加的簇(图1)。假如MCM以比LCM更普遍 的方式促进簇的形成，随后研究生长因子的不同是否有助于解释这 两种条件培养基的转移潜力和特性(图4C)。在这两组条件培养基中 都发现高水平的VEGF，比来自荷瘤动物的血浆更高。然而，对于两 种条件培养基，检出胎盘生长因子(P1GF)水平的明显差异，其信号转 导仅通过VEGFR1。 MCM和黑素瘤衍生的血浆含有显著较高水平的 P1GF，相比之下，在LCM和LLC衍生血浆中发现极少或没有P1GF (图 4C)。此外，在低转移性变异体LLC中，与其更具侵袭性的对应物相 比，对于条件培养基和血浆来说VEGF和P1GF都低得多。在transwell 测定中，与其它生长因子条件相比，LCM和MCM最有效地增加 VEGFR1+骨髓衍生细胞的迁移(LCM 55% ±0.4, MCM 68.1% ±5,培
养基10.8%±1.7，图4D，经单侧ANOVA， pO.OOl)。考虑到这些 结果，有个疑问就是在MCM中细胞因子(例如P1GF)是否能将LLC 转移改到非常规转移部位。在LLC皮内肿瘤植入之前，通过腹膜内 注射给予MCM,此后每天注射，结果LLC转移从肝和肺改为B16 黑素瘤中常见的部位，例如肾、脾、肠和输卵管(图4E)。在带有LLC 肿瘤植入物和进行MCM注射的小鼠中，VEGFR1抗体阻断簇的形 成并阻止LLC转移的改道。这些结果证明，条件培养基中存在的胂 瘤特异性趋化因子和/或细胞因子以及VEGFR1细胞簇在肿瘤扩散的 复杂的多维生物化学和细胞程序中形成另一决定子。 决定具体胂瘤转移到预定转移位置的精确的细胞和分 子机制尚不知道。许多肿瘤偏好转移到特定部位。根据目前的知识， 相信转移倾向反映了肿瘤细胞本身固有的分子差异，并受周围基质 细胞的潜在影响，其包括血管结构、结締组织和免疫细胞(Hynes，R.O.,
"Metastatic Potential: Generic Predisposition of the Primary Tumour or Rare, Metastatic Variants-or Both (转移潜力原发性肿瘤或稀有转移 变异体或这两者的普遍倾向？ )," Ce〃. 113:821-3 (2003), Bergers等，
"Benefits of Targeting Both Pericytes and Endothelial Cells in the Tumour Vasculature with Kinase Inhibitors (在肿瘤血管系统中，用激 酶抑制剂靶向周细胞和内皮细胞的益处," / C//" /wve成111:1287-95 (2003)， Fidler， I., "The Organ Microenvironment and Cancer Metastasis (器官微环境与癌转移),"Dz#em "a"OM. 70:498-505 (2002), Duda等，
"Differential Transplantability of Tumour-associated Stromal Cells (肿 瘤相关基质细胞的不同移植力)."Ca"cwi^yearch 64:5920-5924 (2004) 和Folkman, J., "Role of Anigiogenesis in Tumour Growth and Metastasis (血管生成在肿瘤生长和转移中的作用),"0"co/. 29:515-8 (2002),所述文献通过引用全部结合到本文中)。以上结果导出新概 念肿瘤转移按明确定义的事件顺序启动，依赖于分子书签(molecular bookmarking),即通过将VEGFR1+细胞发送以在革巴器官中形成特异
性允许的生态位。以上数据进一步表明，肿瘤分泌体液因子的区别 促进转移扩散到特定远端器官中。在肿瘤植入后几天内，在某些位 置，纤连蛋白受到靶器官内驻留的成纤维细胞和成纤维细胞样细胞 的上调，所述靶器官已知是对应于特定原发性肺瘤的未来转移部位。
同时，造血祖细胞从骨髓被动员进入外周循环中，参见Hessig等, "Recruitment of Stem and Progenitor Cells from the Bone Marrow Niche Requires MMP曙9 Mediated Release of Kit-ligand (募集骨髓生态位中的 干细胞和祖细胞，需要MMP-9介导的Kit配体的释放),"Ce〃. 109:625-37 (2002),所述文献通过引用全部结合到本文中)。作为来自 纤连蛋白的生态位特异性方向的提示，表达VLA-4并产生MMP-9 的VEGFR1+HPC可穿过已建立的内皮，以便在肿瘤和VEGFR2+内皮 细胞到达之前形成转移前生态位。随着MMP-9的产生并改变微环境， 这些簇增加了 SDF-1表达，产生趋化因子梯度，而Id3活化导致整 联蛋白上调，允许吸引肿瘤细胞，它们结合到生态位上，因而发展 成完整转移性病灶。正如所见到的，由VEGFRr抗体造成的抑制或 将VEGFRr细胞从骨髓中去除，会阻止转移前簇的形成并因此转移。 此外，阻断VEGFR1或VLA-4，可防止造血簇细胞和肿瘤细胞的结 合和建立。将野生型VEGFRl+细胞引入Id3敲除小鼠中，恢复转移 前生态位和转移，表明Id3的表达诱导包括MMP-9、整联蛋白和可 能的趋化因子在内的必要元件的表达，其提供VEGFRl+细胞归巢的 路径图，这是建立转移前生态位必不可少的。 目前，许多关注都集中在炎性细胞在辅助肿瘤粘附和 侵袭远端器官中的作用方面(Coussens等，"Inflammation and Cancer (炎 症与癌症),"A^wre. 420:860-867 (2002), Borsig等，"Synergistic Effects of L- and P國selectin in Facilitating Tumour Metastasis can Involve Non-mucin Ligands and Implicate Leukocytes as Enhancers of Metastasis (L醫 选择蛋白和P-选择蛋白在促进肺瘤转移上的协同效应，可包括非粘 蛋白配体并暗示白细胞作为转移的促进剂)，"Prac. M "爿cad
99:2193-2198 (2000), Lin等，"Colony Stimulating Factor 1 Promoted Progression of Mammary Tumours to Malignancy (集落刺、激因子1促进 乳腺肿瘤发展成为恶性肿瘤)，"Exp. 139:727-740 (2001)和Qian 等,"L國selectin can Facilitate Metastasis to Lymph Nodes in a Transgenic Mouse Model Model of Carcinogenesis (在转基因小鼠致癌模型中，L-选择蛋白可促进肿瘤转移到淋巴结),"尸rac. Ato/. Sci. [/&4
98:3976-3981 (2002),所述文献通过引用全部结合到本文中)。该研究 中鉴定的VEGFR1+HPC表达的特性为炎症生理途径所共有，即通过 提供必要的粘附分子、蛋白酶、趋化因子和生长条件，以产生对肿 瘤细胞移植有利的微环境(Bergers等，"Matrix Metalloproteinase-9 Triggers the Angiogenic Switch During Carcinogenesis (在肺瘤发生期 间，基质金属蛋白酶-9触发血管生成开关),"M^Ce〃A'o/. 2:737-744 (2000), Muller等, "Involvement of Chemokine Receptor in Breast Cancer Metastasis (趋化因子受体参与乳癌转移),"M^wm. 410:50-56 (2001 )和Schoppman等,"Tumour-associated Macrophages Express Lymphatic Endothelial Growth Growth Factors and are Related to Peritumoural Lymphaniogenesis (肿瘤相关巨喧细胞表达'淋巴内皮生长 因子，并与肿瘤周围的淋巴发生相关),"力附.尸"&o/. 161:947-956 (2002)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。尽管与炎症相似， 但转移前生态位保持未分化状态，当观察VEGFRl+祖细胞群体时。 这是第一个直接证据，表明非肿瘤细胞群体可预示未来的转移部位。 此外，人体组织中造血簇的鉴定先于肿瘤扩散的证据，这清楚表明， 使用抗VEGFR1和VLA-4，在临床环境下鉴定和预防转移。该概念 将对肿瘤分期产生巨大影响，并将改变辅助化疗的前景。 本文尽管已经详细说明了优选的实施方案，但是对于 所属领域的技术人员显而易见的是，只要不偏离本发明的精神，就 可以对本发明进行各种修改、添加、取代等，因此这样的修改、添 加、取代也被视为落入本发明所附权利要求书限定的范围之内。
权利要求
1.一种抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的方法，所述方法包括在有效抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的条件下，给予所述癌症患者血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞抑制剂。
2. 权利要求1的方法，其中所述给予是在刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。
3. 权利要求2的方法，其中通过化疗、应激、手术、炎症、辐射或生长因子刺激血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞动员。
4. 权利要求3的方法，其中通过化疗来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
5. 权利要求3的方法，其中通过应激来剌激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
6. 权利要求3的方法，其中通过手术来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
7. 权利要求3的方法，其中通过炎性细胞的动员来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
8. 权利要求3的方法，其中通过辐射来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
9. 权利要求3的方法，其中通过生长因子来刺激血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞动员。
10. 权利要求9的方法，其中所述生长因子选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子和刺激骨髓细胞生长的生长激素。
11. 权利要求i的方法，其中所述血管内皮生长因子受体r骨 髓衍生细胞抑制剂能结合血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞。
12. 权利要求i的方法，其中所述血管内皮生长因子受体r骨 髓衍生细胞抑制剂能预防或减少血管内皮生长因子受体r骨髓衍生 细胞的形成。
13. 权利要求i的方法，其中所述血管内皮生长因子受体r骨 髓衍生细胞抑制剂是血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞特异性 抗体或其结合部分。
14. 权利要求13的方法，其中给予多克隆抗体。
15. 权利要求13的方法，其中给予单克隆抗体。
16. 权利要求13的方法，其中给予抗体的结合部分。
17. 权利要求13的方法，其中所述抑制剂是能结合VLA-4 (oc4(31) 整联蛋白的抗体。
18. 权利要求l的方法，其中所述给予是辅助治疗方案的组成部分。
19. 一种预防癌症患者肿瘤转移的方法，所述方法包括在有效预防癌症患者肿瘤转移的条件下，给予所述癌症患者血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂。
20. 权利要求19的方法，其中所述给予是在刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。
21. 权利要求20的方法，其中通过化疗、应激、手术、炎症、辐射或生长因子剌激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
22. 权利要求21的方法，其中通过化疗来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
23. 权利要求21的方法，其中通过应激来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
24. 权利要求21的方法，其中通过手术来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
25. 权利要求21的方法，其中通过炎性细胞的动员来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
26. 权利要求21的方法，其中通过辐射来刺激血管内皮生长因 子受体1+骨髓衍生细胞动员。
27. 权利要求21的方法，其中通过生长因子来刺激血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞动员。
28. 权利要求27的方法，其中所述生长因子选自粒细胞集落刺 激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子和刺激骨髓细胞生长的生长激素。
29. 权利要求19的方法，其中所述血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂能结合血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞。
30. 权利要求19的方法，其中所述血管内皮生长因子受体r骨 髓衍生细胞抑制剂能预防或减少血管内皮生长因子受体r骨髓衍生 细胞的形成。
31. 权利要求19的方法，其中所述血管内皮生长因子受体r骨 髓衍生细胞抑制剂是血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞特异性 抗体或其结合部分。
32. 权利要求31的方法，其中给予多克隆抗体。
33. 权利要求31的方法，其中给予单克隆抗体。
34. 权利要求31的方法，其中给予抗体的结合部分。
35. 权利要求31的方法，其中所述抑制剂是能结合VLA-4(a4(31) 整联蛋白的抗体。
36. 权利要求19的方法，其中所述给予是辅助治疗方案的组成 部分。
37. —种用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤转移的 候选化合物的鉴定方法，所述方法包括提供试验化合物；将所述试验化合物与血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞一 起孵育；和鉴定能结合血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的试验化合 物，作为用于抑制癌症患者肺瘤形成或预防癌症患者肺瘤转移的候 选化合物。
38. —种监测癌症患者肿瘤转移的方法，所述方法包括评价患者样品的血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞水平，和将血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的上述水平与血管内 皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的其它水平进行比较，从而监测癌 症患者的肿瘤转移。
39. 权利要求38的方法，其中所述其它水平是癌症患者血管内 皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞的先验水平，其中血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的水平增加了 ，就表明未来会有肿瘤转移。
40. 权利要求38的方法，其中所述其它水平是标准水平或正常水平，其中血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的水平超出标准 或正常水平，就表明有肿瘤转移。
41. 权利要求38的方法，其中所述患者样品是组织样品。
42. 权利要求38的方法，其中所述患者样品是血液样品。
43. 权利要求38的方法，所述方法还包括根据血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞的所测水平与血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的其它水平进行的所述比较，给 予治疗药。
44. 权利要求43的方法，其中所述给予包括辅助治疗方案。
45. 权利要求43的方法，其中所述治疗药是化疗药，根据血管 内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞的所测水平与血管内皮生长因子受体r骨髓限定细胞的其它水平进行的所述比较，来选择所述化疗药的规格。
46. 权利要求38的方法，其中所述方法在体外实施。
47. 权利要求38的方法，其中所述方法在体内实施。
48. 权利要求47的方法，其中所述评价和所述比较包括对癌症 患者的某一部位进行造影。
49. 权利要求48的方法，其中所述方法是用对血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞具有特异性的标记物来进行的。
50. 权利要求48的方法，其中所述方法是将标记的血管内皮生 长因子受体1+骨髓衍生细胞导入癌症患者体内来进行的。
51. —种抑制患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达 的方法，所述方法包括在有效抑制所述患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白 表达的条件下，给予所述患者血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细 胞抑制剂。
52. 权利要求51的方法，其中所述给予是在刺激血管内皮生长 因子受体1+骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。
53. 权利要求51的方法，其中所述血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞抑制剂能结合血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞。
54. 权利要求51的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞抑制剂能预防或减少血管内皮生长因子受体r骨髓衍生 细月包的形成。
55. 权利要求54的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞抑制剂是血管内皮生长因子受体1+骨髓衍生细胞特异性 抗体或其结合部分。
56. —种抗血管内皮生长因子受体r骨髓衍生细胞的抗体。
全文摘要
本发明涉及抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的方法，也涉及预防肿瘤转移的方法。这些方法包括在有效抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成或预防肿瘤转移的条件下，给予癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。可根据候选化合物是否能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞，并将血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的所测水平与先验水平进行比较，来筛选用于上述目的的候选化合物。
文档编号G01N33/53GK101107011SQ200580046852
公开日2008年1月16日 申请日期2005年11月21日 优先权日2004年11月19日
发明者D·利登, R·D·里巴, R·N·卡普兰, S·拉菲 申请人:康乃尔研究基金会有限公司