专利名称：检测唾液中乙醇含量的试剂条和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测乙醇的试剂条和试剂盒，具体地说涉及一种检测唾液中乙醇含量的试剂条和试剂盒。
背景技术：
近年来，酒后引起的刑事案件和酒后驾车引起的交通事故案件不断上升。目前，许多国家都制定了血液中乙醇浓度与交通事故责任认定的关系，建立了多种能够检测血液中乙醇含量的方法。如GM/MS等仪器检测乙醇成分，虽然这些方法可以准确定量，但是存在着购买仪器价格昂贵，检测成本高，需专门培训，无法在案发现场快速检测的缺点。呼气式乙醇测定仪可以在现场使用，但是价格也十分昂贵，而且不卫生，容易发生交叉感染疾病。
因此，近年来市场上出现了很多便于携带的检测试剂条，如专利公开号CN1749751揭示了其中一种检测试剂条，但是这些试剂条都存在高温下活性不稳定，保存时间短，不利于现场室外检测的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测唾液中乙醇含量的试剂条和试剂盒，以解决现有技术中的缺陷。
本发明根据唾液和血液中乙醇含量一致性的实验基础，在酶学反应的基础之上的建立显色反应，首先，乙醇氧化酶(ALO)将乙醇氧化成乙醛同时释放出过氧化氢，在过氧化物酶(HRP)存在的情况下，TMB(N，N，N’，N’-四甲基联苯胺)发生氧化而显色，具体的反应原理如下
在以上反应中，TMB蓝色的深浅和显色速度的快慢与样品中乙醇的含量成线形关系，并最终作为一种半定量的检测的指标。
具体制备时采用1M的Tris-丙二酸作为缓冲系统，以褐藻胶和明胶作为稳定剂，在这种条件下，乙醇氧化酶在37℃的情况下可以保持活性达一个月。而在没有稳定剂存在的条件下，乙醇氧化酶在37℃的情况下仅仅能保持活性不到24小时。
本发明首先提供了一种检测唾液中乙醇含量的试剂条，该试剂条是通过如下方法制备的①配制乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液活性单位比为1∶2-10的乙醇氧化酶与辣根过氧化物，溶于pH 7.2的1M Tris-丙二酸缓冲液中，使每毫升的缓冲液中酶的总活性单位为150-550，再加与缓冲液等体积的水；②配制TMB/二甲苯溶液将TMB盐酸盐溶于水中，配制成10-30mg/ml的水溶液，用10mg/ml的盐酸色氨酸进行脱色处理，然后加入与TMB盐酸盐水溶液等体积的二甲苯，用NaOH中和其中的盐酸；溶液静置后分层，弃去水溶液，得到TMB/二甲苯溶液；③酶和底物的固相化将滤纸浸入①的酶混合液中，取出滤纸干燥；将TMB/二甲苯溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；④制备试剂条把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5-1cm的长条，即制成检测试剂条。
其中步骤①中的乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液中还含有褐藻胶和明胶，其中酶溶液中褐藻胶的含量为0.25-0.75mg/ml，明胶含量为5-15mg/ml。优选的每20ml的酶溶液中褐藻胶和明胶的含量分别为10mg和200mg。
乙醇检测试剂条最终是通过TMB的显色来判断乙醇的含量，此反应体系中TMB的用量直接导致反应后的颜色的不同，如果使用大剂量的TMB，则结果显示从绿色到蓝色，与乙醇浓度呈比例的梯度变化，如果使用小剂量的TMB，高浓度乙醇显示为棕色或黑色，而低浓度则显示为蓝色。本发明根据我国有关乙醇含量的规定，调整了TMB的量，使显色结果明显区分0，0.2，0.8，1.5和3.0mg/ml，从而制备了用于乙醇检测的标准比对卡。
本发明的另外目的在于提供一种用于检测唾液中乙醇含量的试剂盒，该试剂盒包括上述试剂条，标准比对卡和和反应终止液，所述的反应终止液为重量百分比浓度为0.2％的SDS(十二烷基磺酸钠)溶液。
TMB(N，N，N’，N’-四甲基联苯胺)是一种非致癌性显色剂，经过氧化物酶作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时可消退至无色。SDS是酶的抑制剂，可以使反应终止，而且使颜色维持12-24小时不褪，是肉眼判断的良好终止剂。本产品配备SDS终止剂后，检测结果在24小时后没有发生改变，十分有利于现场物证的保存。
本产品具有以下特点1.高度的热稳定性，便于常温下使用和保存。本发明的产品在常温下可以保存一年，在50℃下可以保存24小时以上，其检测的灵敏度仍可以达到0.1mg/ml。与国外的其它同类产品进行比较，国外产品在50℃高温下都只能保存1-3小时。
2.灵敏度高，本试纸条的灵敏度可以达到0.1mg/ml。并且不产生假阳性。
3.反应速度快。在20秒钟就可以完成一个人份的检测。
4.色差好。不但阴性和阳性0.2mg/ml的样品存在明显的颜色不同，而且凭肉眼也能很容易判断0.2mg/ml和0.8mg/ml的色差。
5.标本多样化。根据使用者的需要，本产品可以用来检测尿液或其它体液或渗出物中的乙醇浓度，虽然显色与唾液略有不同，但同样可以明显区分阴性(0.0O)和阳性(0.4mg/ml)和0.8mg/ml的色差。(尿液中的乙醇浓度高于唾液中的浓度)通过下表中可见本发明的乙醇测试条的特点表1唾液乙醇含量测试条与呼气检测议的比较
具体实施方式
实施例1制备检测试剂条
①配制乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液取褐藻胶10mg，乙醇氧化酶500单位，辣根过氧化物2500单位，明胶200mg溶于10ml pH7.2的1M Tris-丙二酸缓冲液中，再加10ml的双蒸水。
②配制TMB溶液称取400mgTMB盐酸盐溶于20ml的双蒸水中，用0.1ml的10mg/ml盐酸色氨酸进行脱色处理，再加入20ml的二甲苯，用NaOH中和其中的盐酸。混合后TMB溶于二甲苯，静置后溶液分层，弃去水溶液。得到TMB/二甲苯溶液。
③酶和底物的固相化将0.5CM宽的滤纸浸入以上的酶混合液中，取出滤纸在30℃热风、避光下干燥20分钟。将TMB/二甲苯溶液均匀地滴在已干燥的滤纸上，再经30℃热风、避光下干燥20分钟。
④制备试剂条把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5cm的长条，即制成检测试剂条。
然后将该试剂条、标准比色卡和反应终止液配成试剂盒。
实施例2试剂条现场检测结果1.唾液乙醇检测试剂条与气相色谱顶空法血液检测数据的比较派发试剂条在上海市4个交警支队进行推广应用，进行现场测试，所有测试的结果与气相色谱顶空法(GC/MS)检测比较。结果显示，唾液乙醇检测试剂条检测结果与血液中气相色谱顶空法检测基本相符。准确率为98.0％。
2.样品收集方式1)将测试条直接放入嘴中，等10秒钟后取出，观察颜色变化；或2)将唾液吐入检测器皿中。
权利要求
1.一种检测唾液中乙醇含量的试剂条，其特征在于该试剂条是由以下方法制备成的①配制乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液活性单位比为1∶2-10的乙醇氧化酶与辣根过氧化物，溶于pH 7.2的1MTris-丙二酸缓冲液中，使每毫升缓冲液中酶的总活性单位为150-550，再加与缓冲液等体积的水；②配制TMB/二甲苯溶液将TMB盐酸盐溶于水中，配制成10-30mg/ml的水溶液，用10mg/ml的盐酸色氨酸进行脱色处理，然后加入与TMB盐酸盐水溶液等体积的二甲苯，用NaOH中和其中的盐酸；溶液静置后分层，弃去水溶液，得到TMB/二甲苯溶液；③酶和底物的固相化将滤纸浸入①的酶混合液中，取出滤纸干燥；将TMB/二甲苯溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；④制备试剂条把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成长条，即制成检测试剂条。
2.根据权利要求1所述的试剂条，其特征在于步骤①中的乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液中还含有褐藻胶和明胶，其中酶溶液中褐藻胶的含量为0.25-0.75mg/ml，明胶含量为5-15mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的试剂条，其特征在于步骤②中，TMB盐酸盐溶于水中的含量为20mg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的试剂条，其特征在于步骤③中浸入酶混合液后的滤纸在30℃热风、避光下干燥20分钟；滴过TMB/二甲苯溶液的已干燥滤纸再经30℃热风、避光下干燥20分钟。
5.一种制备权利要求1所述的试剂条的方法，其特征在于该方法包括如下步骤①配制乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液活性单位比为1∶2-10的乙醇氧化酶与辣根过氧化物，溶于pH 7.2的1MTris-丙二酸缓冲液中，使每毫升缓冲液中酶的总活性单位为150-550，再加与缓冲液等体积的水；②配制TMB/二甲苯溶液将TMB盐酸盐溶于水中，配制成10-30mg/ml的水溶液，用10mg/ml的盐酸色氨酸进行脱色处理，然后加入与TMB盐酸盐水溶液等体积的二甲苯，用NaOH中和其中的盐酸；溶液静置后分层，弃去水溶液，得到TMB/二甲苯溶液；③酶和底物的固相化将滤纸浸入①的酶混合液中，取出滤纸干燥；将TMB/二甲苯溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；④制备试剂条把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成长条，即制成检测试剂条。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤①中的乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液中还含有褐藻胶和明胶，其中酶溶液中褐藻胶的含量为0.25-0.75mg/ml，明胶含量为5-15mg/ml。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于步骤②中，TMB盐酸盐溶于水中的含量为20mg/ml。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于步骤③中浸入酶混合液后的滤纸在30℃热风、避光下干燥20分钟；滴过TMB/二甲苯溶液的已干燥滤纸再经30℃热风、避光下干燥20分钟。
9.一种检测唾液中乙醇含量的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括权利要求1所述的试剂条、标准比对卡和反应终止液，所述的反应终止液为重量百分比浓度为0.2％的SDS溶液。
全文摘要
本发明公开了一种检测唾液中乙醇含量的试剂条和试剂盒，通过试剂条中乙醇氧化酶、过氧化物酶将N，N，N’，N’－四甲基联苯胺氧化后颜色改变的深浅，半定量地检测唾液中乙醇的含量。该方法简便、易携带，灵敏度高、反应速度快、稳定性高，尤其适合现场检测。
文档编号G01N33/52GK1904619SQ200610029610
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月1日 优先权日2006年8月1日
发明者吴献斌, 胡小龙, 王学生, 黄建东, 张艳, 顾琳, 周华山 申请人:上海唯卓生物科技有限公司