专利名称：流式细胞术细胞因子检测法检测乙肝病毒特异性t细胞的方法
技术领域：
流式细胞术细胞因子检测法检测乙肝病毒特异性T细胞的方法，属于免疫学分析检测技术领域。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染后，决定病情严重程度及病程转归的一个主要因素是机体的免疫反应能力。其中患者体内乙肝病毒特异性T细胞(cytotoxic Tlympho-cyte，CTL，下称HBV特异性CTL)在清除病毒方面发挥重要的功能。T细胞中CD4+细胞在抗原刺激下可分化为特异性T辅助细胞(Th)，Th能促进HBV特异性CTL产生，并对维持HBV特异性CTL活性、产生持续性细胞免疫起重要作用。T细胞中CD8+细胞在抗原刺激下可分化为HBV特异性CTL。研究表明HBV特异性CTL在控制HBV感染中起关键作用(1)在机体的防御体系中，CTL是清除细胞内病原体的主要因素；(2)HBV持续感染均伴有HBV特异性CTL的缺乏，病毒感染的控制与HBV特异性CTL数量和活性呈正相关；(3)通过DNA疫苗免疫、DC疫苗治疗等方法可以激活HBV特异性CTL，进而清除病毒感染；(4)直接过继免疫输入HBV特异性CTL可以清除感染病毒。
研究表明急性HBV感染的患者中，HBV特异性CTL反应是强有力的，但在临床恢复及血清转换发生后，很低水平的HBVDNA仍可持续存在几十年。长期存在的微量HBV DNA与长期存在的HBV特异性CTL有关。与急性自限性HBV感染相比较，慢性乙肝患者，通过51Cr释放法，外周血中很难检测出HBV特异性CTL反应。通过同样的技术，病毒复制活跃、肝脏炎症明显的慢性HBV感染患者血液中HBV特异性CTL缺乏，肝组织中HBV特异性CTL频度较低；而病毒复制不活跃、肝脏炎症轻微的慢性HBV感染者，血液和肝组织中HBV特异性CTL频度较高。国外研究还发现慢性乙肝在经历自发的或干扰素诱导的部分或完全恢复的患者，能形成在强度和特异性方面类似于急性乙肝患者具有的CTL对乙肝的反应。在经过拉米夫定治疗的患者，通过51Cr释放法和Te-tramer技术，发现HBV特异性CTL频度明显地升高，差异显著。这个提高的HBV特异性CD8+细胞活性可以导致CD4+细胞的活性恢复，同时导致HBV病毒载量的下降。因此拉米夫定对慢性乙肝患者的治疗，能够使HBV特异性CTL功能恢复。在拉米夫定治疗后，通过获得多种抗原表位的特异性，使HBV特异性CTL功能得到恢复。以上结果提示，通过提高HBV特异性CTL反应为乙肝的免疫治疗提供了可能。
常用的CTL检测法有同位素细胞毒性分析，如51Cr释放法、125I-UdR释放法及3H-UdR释放法等；单细胞水平测定CTL活性，如细胞内细胞因子染色、特异T细胞受体(TCR)的PCR、有限稀释分析法(limiting dilution analysis，LDA)等。由于特异性CTL在外周血淋巴细胞中的比率很低，检测这些低水平的特异性CTL需要有高度敏感的方法。传统的51Cr释放分析法和LDA法，间接检测抗原特异性CTL，需要大量的CTLs作为效应细胞，必须在体外先进行扩增，整个过程周期长、敏感性低、费时、费力，难以广泛应用。
近年发展起来的检测γ干扰素(IFN-γ)等细胞因子分泌细胞数量的酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunospot assay，Elispot)和检测T细胞特异性抗原受体数量的四聚体检测法(Te-tramer)因其具有很高的灵敏度，可以检出(15～20)/106的低频度特异性CTL，越来越受到重视和较广泛的应用。但在实际运用中还存在一些不足。ELISPOT检测阳性细胞的条件更为严格，刺激时间长，需要不断补充细胞生长物质；Te-tramer检测特异性，但是不作用于T细胞。
运用流式细胞术细胞因子检测法(cytokine flow cytometry，CFC)是指流式细胞仪细胞内因子检测法，此法的特点是利用流式细胞仪的多参数同时分析的功能，精确识别目标细胞并检测其内因子的分泌情况。
未见运用流式细胞术细胞因子检测法检测慢性乙肝(CHB)患者外周血和肝组织中HBV特异性CTL的应答的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种流式细胞术细胞因子检测法检测乙肝病毒特异性T细胞的方法，是一种灵敏度高，检测对象不受限制，成本低的用于HBV特异性CTL的检测。
本发明的技术方案运用流式细胞术细胞因子检测法(cytokine flowcytometry，CFC)对全血进行检测。在有细胞因子封闭剂布雷菲德菌素A的环境下，在全血中加刺激抗原和协同刺激剂进行抗原刺激。通常在刺激的六小时后洗涤，识别淋巴细胞并裂解红细胞。随后进行洗涤和破膜。最后使用荧光标记抗体对细胞内细胞因子进行荧光标记染色，完成后上流式细胞仪分析。
我们的检测方案是基于使用协同刺激剂(CD28/CD49d)、多色试剂(CD8PerCP-Cy5.5)检测及两种细胞因子(INF-r与CD69)的检测。
仪器Beckman coulter-3XL流式细胞仪，二氧化碳培养箱(HRCP-海尔公司)，离心机。
主要试剂①细胞因子封闭剂布雷菲德菌素A(Brefeldin A)，Sigma公司产品。
②协同刺激剂CD28/CD49d，Sigma公司产品。
③刺激抗原HBcAg特异性多肽18-27，(氨基酸序列FLPSDFFPSV)，上海森工生物技术有限公司合成，并向公众出售。
④淋巴细胞CD8探针CD8PerCP-Cy5.5，(异硫氰酸-CY5.5复合荧光素标记CD8抗体)，BD公司产品。
⑤溶血素Lysing Solution，BD公司产品。
⑥破膜剂permeabilizing solution，BD公司产品。
⑦r-干扰素抗体荧光标记IFN-r FITC，BD公司产品。
⑧淋巴细胞CD69细胞活化探针CD69-PE，(PE标记的CD69抗体)，BD公司产品。
⑨阴性对照剂IgG2a FITC/IgG1 PE，BD公司产品。
⑩磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)，自配。
检测过程①抗原刺激在流式细胞测定管中加入全血100μl，布雷菲德菌素A10μl，CD28/CD49d 2.5μl和HBcAg特异性多肽1μl，将测定管置于二氧化碳培养箱中，5％CO2、37℃条件下增殖6小时。
②洗涤用预冷的PBS液2ml洗涤1次，离心1500rpm/分，弃上清液。去除剩余的布雷菲德菌素A、CD28/CD49d和HBcAg特异性多肽，留下淋巴细胞和红细胞。
③淋巴细胞识别加CD8PerCP-Cy5.510μl、CD69 PE 10μl避光30分钟，识别CD8阳性且已被抗原活化的淋巴细胞。
④裂解红细胞加溶血素2ml，避光15分钟。
⑤离心、洗涤离心1500rpm/分，弃上清液，用预冷的PBS液2ml重复洗涤2次，去除红细胞。
⑥破膜加破膜剂0.5ml，避光10分钟。对淋巴细胞的细胞膜进行打孔，使得细胞因子抗体能够自由出入细胞，同时保证细胞内物质并不外泄。
⑦洗涤用预冷的PBS液洗涤1次，离心1500rpm/分，弃上清液。去除破膜剂。
⑧染色加IFN-r FITC 10μl，避光30分钟，使胞浆内的γ-干扰素被抗γ-干扰素荧光抗体标记染色。
⑨流式细胞仪测定。调节流式细胞仪前向(FS)、侧向(SS)两参数的电压值，使绝大多数淋巴细胞显示在FS/SS双参数点图中。构建CD8PerCP-Cy5.5与CD69PE直方图，在图中识别出已被活化的CD8+/CD69+细胞。构建IFN-rFITC单参数直方图，并设定阴性区域后检测阳性样本，如出现阳性颗粒，便识别为对乙肝抗原肽有特异性反性的T细胞本发明的有益效果
CFC和ELISPOT比较CFC法是指流式细胞仪细胞内因子检测法，此法的特点是利用流式细胞仪的多参数同时分析的功能，精确识别目标细胞并检测其内因子的分泌情况。CFC和ELISPOT检测细胞因子都是基于单个细胞。两者的区别是(1)信号输出的技术(流式细胞仪为多参数)；(2)刺激的时间长短和条件(通常在ELISPOT膜底部刺激PBMCs 24小时；CFC检测用的聚丙烯管中刺激全血或PBMCs6小时)。(3)CFC检测到的阳性细胞是ELISPOT的三到四倍。这可能部分因为ELISPOT检测阳性细胞的条件要更为严格。
CFC和MHC-Ig四聚物(或二聚物)染色比较MHC-肽段四聚物和MHC-Ig二聚物是肉眼观察抗原特异性T细胞的有力工具。四聚物和二聚物与CFC检测观察的区别是(1)四聚物和二聚物检测T细胞特异性反应只通过一个肽-MHC抗原决定簇，但是CFC能用于测量复杂抗原的反应；(2)四聚物和二聚物检测有特异性，但是不作用于T细胞，反之，CFC检测抗原特异性细胞产生的细胞因子。
本发明建立新型免疫分析技术，用于HBV特异性CTL的检测，明显优于51Cr测定法、有限稀释法(LAD)、MHC-四聚体(二聚体)法，本发明方法不仅灵敏度高，检测对象不受限制，成本低，还能直接检测特异性CTL的功能性细胞因子的表达，可广泛用于临床检测。
具体实施例方式
实施例1取正常对照者全血100μl，按说明书上述测定方法进行检测操作。测得HBV特异性CTL值为0.2％。
实施例2取急性乙型肝炎患者全血100μl，按说明书上述测定方法进行检测操作。测得HBV特异性CTL值为1.8％。
实施例3取慢性乙型肝炎患者全血100μl，按说明书上述测定方法进行检测操作。测得HBV特异性CTL值为0.8％。
权利要求
1.一种流式细胞术细胞因子检测法检测乙肝病毒特异性T细胞的方法，其特征是运用流式细胞术细胞因子检测法对全血进行检测，在有细胞因子封闭剂布雷菲德菌素A的环境下，在全血中加刺激抗原和协同刺激剂进行抗原刺激，刺激六小时后洗涤，识别淋巴细胞并裂解红细胞，随后进行洗涤和破膜，最后使用荧光标记抗体对细胞内细胞因子进行荧光标记染色，完成后上流式细胞仪分析；①抗原刺激在流式细胞测定管中加入全血100μl，布雷菲德菌素A10μl，CD28/CD49d 2.5μl和HBcAg特异性多肽1μl，将测定管置于二氧化碳培养箱中，5％CO2、37℃条件下增殖6小时；②洗涤用预冷的PBS液2ml洗涤1次，离心1500rpm/分，弃上清液，去除剩余的布雷菲德菌素A、CD28/CD49d和HBcAg特异性多肽，留下淋巴细胞和红细胞；③淋巴细胞识别加CD8PerCP-Cy5.5 10μl，CD69 PE10μl避光30分钟，识别CD8阳性且已被抗原活化的淋巴细胞；④裂解红细胞加溶血素2ml，避光15分钟；⑤离心、洗涤离心1500rpm/分，弃上清液，用预冷的PBS液2ml重复洗涤2次，去除红细胞；⑥破膜加破膜剂0.5ml，避光10分钟，对淋巴细胞的细胞膜进行打孔，使得细胞因子抗体能够自由出入细胞，同时保证细胞内物质并不外泄；⑦洗涤用预冷的PBS液洗涤1次，离心1500rpm/分，弃上清液，去除破膜剂；⑧染色加IFN-r FITC，避光30分钟，使胞浆内的γ-干扰素被抗γ-干扰素荧光抗体标记染色；⑨流式细胞仪测定调节流式细胞仪前向FS、侧向SS两参数的电压值，使绝大多数淋巴细胞显示在FS/SS双参数点图中，构建CD8PerCP-Cy5.5与CD69PE直方图，在图中识别出已被活化的CD8+/CD69+细胞，构建IFN-rFITC单参数直方图，并设定阴性区域后检测阳性样本，如出现阳性颗粒，便识别为对乙肝抗原肽有特异性反性的T细胞。
全文摘要
流式细胞术细胞因子检测法检测乙肝病毒特异性T细胞的方法，属于免疫学分析检测技术领域。本发明运用流式细胞术细胞因子检测法对全血进行检测，在有细胞因子封闭剂布雷菲德菌素A的环境下，在全血中加刺激抗原和协同刺激剂进行抗原刺激，刺激六小时后洗涤，识别淋巴细胞并裂解红细胞。随后进行洗涤和破膜。最后使用荧光标记抗体对细胞内细胞因子进行荧光标记染色，完成后上流式细胞仪分析。本发明建立新型免疫分析技术，用于HBV特异性CTL的检测，明显优于51Cr测定法、有限稀释法(LAD)、MHC－四聚体(二聚体)法，本发明方法不仅灵敏度高，检测对象不受限制，成本低，还能直接检测特异性CTL的功能性细胞因子的表达，可广泛用于临床检测。
文档编号G01N21/00GK1811452SQ20061003781
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月13日 优先权日2006年1月13日
发明者裴豪, 杨小娟, 钱金娟 申请人:无锡市传染病医院