专利名称：一种快速微量检测组织乙酰胆碱酯酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速微量检测组织乙酰胆碱酯酶的方法。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶水解碘化硫代乙酰胆碱(ATCh·I)生成硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱与DTNB反应生成5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量(414nm)，水解产物硫代胆碱的数量可反应胆碱酯酶活性的水平。在使用该方法中通常用组织匀浆液与乙酰胆碱碘化物水浴孵育一段时间后使用三氯乙酸(TCA)等终止剂终止反应。局限性是一次可检测样品数量少、所需样品体积大、实验周期长且需要水浴锅等实验设备，另外终止剂TCA极易潮解，配置时浓度不易准确掌握，且TCA的使用影响最终显色。本发明采用微量加样及动态读数检测法，不需要使用显色终止剂，用酶反应速率反应组织中乙酰胆碱酯酶的活性。在96孔板中完成反应及检测过程，实现了对动物组织乙酰胆碱酯酶的高通量、快速、微量的检测。
技术方案下面以大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶测定为例对本发明的技术方案进行说明1)称取约0.05克组织，按1∶10(质量/体积)比例加入冰冷的匀浆缓冲液(20毫摩尔/升Tris·Cl，0.15毫摩尔/升NaCl，pH 7.4)，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
2)10000rpm，4℃离心30分钟，取上清。
3)在96孔板中加入140微升磷酸钠缓冲液(100毫摩尔/升，pH7.4)，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液(用磷酸钠缓冲液配制)，此为样品组。相应对照组中每孔加入160微升磷酸钠缓冲液，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液。各孔均用移液器吹打，使之充分混匀，室温放置10分钟。
4)设置于酶标仪参数，动态法测量414nm吸光度值，总读数时间为3分钟，每隔20秒读数一次，每次读数之前震动5秒。
5)步骤3)到时间后，用排枪向样品组每孔同时加入20微升30毫摩尔/升碘化硫代乙酰胆碱(用磷酸钠缓冲液配制)，马上进行读数。
6)另取20微升上清匀浆液，稀释25倍，取100微升进行蛋白定量。
7)结果以(样品组每分钟吸光度变化值-相应对照组每分钟吸光度变化值)/毫克蛋白表示。
特征1、采用动态法检测，显色不受终止剂的干扰，且孵育时间大大缩短；2、反应直接在96孔板中进行，缩短了检测周期；3、采用微量加样法，所需样品及试剂消耗减少。
权利要求
1.一种快速微量检测组织乙酰胆碱酯酶的方法。其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行(以小鼠肝脏乙酰胆碱酯酶测定为例)1)称取约0.05克组织，按1∶10(质量/体积)比例加入冰冷的匀浆缓冲液(20毫摩尔/升Tris·Cl，0.15毫摩尔/升NaCl，pH7.4)，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。2)10000rpm，4℃离心30分钟，取上清。3)在96孔板中加入140微升磷酸钠缓冲液(100毫摩尔/升，pH 7.4)，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液(用磷酸钠缓冲液配制)，此为样品组。相应对照组中每孔加入160微升磷酸钠缓冲液，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液。各孔均用移液器吹打，使之充分混匀，室温放置10分钟。4)设置于酶标仪参数，动态法测量414nm吸光度值，总读数时间为3分钟，每隔20秒读数一次，每次读数之前震动5秒。5)步骤3)到时间后，用排枪向样品组每孔同时加入20微升30毫摩尔/升碘化硫代乙酰胆碱(用磷酸钠缓冲液配制)，马上进行读数。6)另取20微升上清匀浆液，稀释25倍，取100微升进行蛋白定量。7)结果以(样品组每分钟吸光度变化值—相应对照组每分钟吸光度变化值)/毫克蛋白表示。
2.根据权利要求1所述的组织乙酰胆碱酯酶的检测方法，其特征在于采用动态法检测。
3.根据权利要求1所述的检测组织乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于采用微量加样法，所需样品及试剂消耗减少。
全文摘要
一种快速微量检测组织乙酰胆碱酯酶的方法。在96孔板中加入140微升磷酸钠缓冲液，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液。动态法测量414nm吸光度值，总读数时间为3分钟，每隔20秒读数一次，每次读数之前震动5秒，再加入20微升30毫摩尔/升碘化硫代乙酰胆碱(用磷酸钠缓冲液配制)，马上进行读数。本发明采用动态法检测，显色不受终止剂的干扰，且反应直接在96孔板中进行，缩短了检测周期；采用微量加样法，所需样品及试剂消耗减少。
文档编号G01N33/543GK1818654SQ200610049808
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月14日 优先权日2006年3月14日
发明者朱欣, 刘慧刚, 徐立红 申请人:浙江大学