专利名称：稀土元素金属螯合标记定量蛋白质组的方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质组学中蛋白质定量的方法与试剂盒。具体的说，涉及一种用于定量蛋白质组学的稀土元素金属螯合标记蛋白质的新方法与试剂盒。
背景技术：
定量蛋白质组学是通过某种方法或技术，对某些过程中生物样品(细胞、组织或体液等)中蛋白质的含量进行比较分析，是从蛋白质组水平上对基因表达进行准确的定量分析，是当前研究重大疾病致病机制以及药理控制机制的必要手段及研究前沿。
当前，蛋白质组研究中广泛应用的相对定量方法主要有依赖双向凝胶电泳(Twodimensional electrophoresis，2-DE)的染色方法和稳定同位素标记的质谱检测技术。2-DE相对定量方法可以通过染色强度直观地反映蛋白质表达的差异，但是染料的存在，容易给后续的质谱检测带来干扰。另外，2-DE分离的效果不是很好，许多蛋白质点包含了一个以上的蛋白；并且不能对分子量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和呈现，因此已不能适应目前蛋白质组研究深入发展的需要。
第二种定量策略是引进稳定同位素化学标记结合质谱技术的定量策略。近年来，定量蛋白质组学主要以质谱检测为核心的稳定同位素化学标记方法。但是受到同位素试剂合成困难，价格高等因素的制约。
Meares C.F.等人避开以稳定同位素为质量标签，而以化学性质很相近的稀土金属元素作为质量标签，提出了“元素标记亲和标签”(ECAT，Element-coded affinity tags，WhetstoneP.A.，Butlin N.G.，Corneillie T.M.，and Meares C.F.，Bioconjugate Chem.，2004；153-6)的新方法，并且合成了一个标准肽段验证了分别标记有稀土元素钇和铽的肽段混合物的色谱共洗脱和质谱中的响应。但是他们并没有能够将该方法用来解决蛋白质组学中的定量问题。
发明内容
本发明提供了一种以化学性质很相近的稀土金属为质量标签的蛋白质组学相对定量方法。本发明人发现结合多维液相色谱分离手段和多级串联质谱，使用价格远远低于稳定同位素的稀土元素作为定量蛋白质组学中的质量内标准是可行的，可以用来解决蛋白质组学的相对定量问题。
具体的说，本发明提供了一种用于定量稀土元素金属螯合标记蛋白质的方法，该方法包括(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱定量；其特征在于所述步骤(3)的处理方法为(a)用一种或多种双功能螯合剂对肽段进行修饰，使其带上螯合基团；(b)分别用两种不同的或多种单同位素稀土元素金属盐离子，与标记在肽段上的螯合剂发生螯合作用；(c)将两种分别标记有不同稀土金属离子的待比较样本的肽段混合物合并，用一维或多维色谱分离手段将合并肽段进行分离；(d)用质谱定量与鉴定肽段，进行质谱数据的解析及蛋白质的鉴定。
其中，步骤(a)所述双功能螯合剂优选为分子内带氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或异硫氰酸基多羧酸活性联接基团的化合物，特别优选为二乙三胺五乙酸双酸酐。
步骤(b)所述稀土元素优选为三氯化钇和三氯化铽。
步骤(d)所述质谱优选LC-Q-TOF-MS/MS电喷雾离子化串联质谱，或MALDI TOF/TOF基质辅助激光解离飞行时间串联质谱，更优选使用液质联用；质谱数据的解析及蛋白质的鉴定优选采用数据库搜索方法。
该方法可对两种不同生理状态的蛋白质酶切产生的肽段进行双功能螯合基团的修饰；再用两种不同单同位素的稀土元素金属离子进行螯合标记，然后将标记有不同稀土金属离子的不同生理状态的肽段混合物合并在一起，通过多维色谱分离和串联质谱分析测定。标记有不同稀土金属离子的同一肽段在液相分离中能够被共洗脱，并且一级质谱的离子峰对的质谱响应与预期的一致。在一级质谱图中质量数相差值为稀土元素金属的质量数差值的一对肽段的离子强度比例，也就是相应的两种比较蛋白质的相对比例，单电荷的离子峰对的质量数差异为单同位素稀土元素金属的质量数差，双电荷的离子对的质量数差异为单同位素稀土元素金属的质量数差的二分之一，依此类推。通过二级质谱生成的peak list文件进行数据库检索来鉴定蛋白质。在一级质谱响应信号中，发明人发现标记有金属铽的肽段对标记有金属钇的肽段有离子抑制现象。当设定的两种蛋白样本的混合比例为1∶1时，从一级质谱图中标记钇金属离子与标记有铽金属离子肽段的离子强度的平均比例为0.65∶1，重复性好。并且在设定比例1.0到10之间是呈线性变化的，线性关系良好，相关系数为0.99以上。
双功能螯合剂为分子内或带氨基多羧酸，或带芳香胺多羧酸，或带异硫氰酸基多羧酸活性联接基团的化合物。如二乙三胺五乙酸双酸酐(bicyclic anhydride diethylenetriamine-N，N，N’，N”，N”-pentaacetic dianhydride，DTPAA)为双功能螯合试剂，它一端能够与肽段的胺基偶合，一端能够与稀土金属离子螯合。双功能螯合剂被广泛应用于放射免疫分析和靶向放疗中，价格相对低廉。另外，稀土金属量大价廉，化学性质极为相似，所以以稀土金属元素为质量标签结合质谱检测方法在蛋白质组学定量中的应用潜力巨大。
另一方面，本发明还提供了用于定量蛋白质组学中稀土元素金属螯合标记蛋白质的试剂盒，该试剂盒的组分包含(a)一种或多种对肽段进行修饰，使其带上螯合基团的双功能螯合剂；(b)两种或多种单稀土元素三氯化物；(c)能进行肽段色谱分离的色谱柱。
其中，组分(a)优选分子内或带氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或带异硫氰酸基多羧酸活性联接基团的化合物；组分(c)优选反相柱或离子交换柱，更优选在线联用色谱柱。
为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种用于打开蛋白质分子中二硫键的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封闭巯基防止其重新形成二硫键的烷基化试剂，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白质消化剂，如胰蛋白酶；侧链氨基保护试剂，如O-甲基异脲；此外还可含有一种或多种用于肽段色谱分离的缓冲体系；国家行政机关批准的使用说明等。
本发明的新方法和试剂盒适用于对两种或多种不同状态的组织或细胞的蛋白质差异表达进行相对的定量，该方法快速，使用方便。可同时比较不同生理病理条件下两种或多种样本的蛋白质表达水平上的差异，从而简便快速准确地筛选到表征该生理病理条件的生物标志物，是疾病诊断及药物筛选简单快速的分析工具。蛋白质定量与定性分析可在一个实验周期中同步完成。特别适用于生物学、医学和药物学领域中进行差异蛋白质组或比较蛋白质组分析。
本方法是蛋白质差异表达相对定量分析工具，大大降低蛋白质组学中相对定量的成本。并且反应条件相对温和，操作简单，容易实现。蛋白质定量与定性分析可在一个实验周期中同步完成。本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质组研究。
图1.A图为胰岛素GFFYTPK分别标记了Y和Tb标签的带两个正电荷的共洗脱肽段的一级质谱图，共洗脱时间为29.87分钟，可以看到m/z为660.58和695.55的一组峰，它们的质量数相差35Da。B图为理论比例设定为0.5∶1.0时，一级质谱图中离子强度Y/Tb为0.38∶1.0。
图2.胰岛素胰酶酶切肽段FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER标记了Tb标签的带三个正电荷肽段的二级质谱图。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1 标准蛋白胰岛素的相对定量1.1取0.1mg胰岛素，溶于100μL 50mM pH 7.0的碳酸氢三乙胺缓冲溶液中。加入0.2μL100mM还原剂三羧乙基磷(TCEP)，37℃反应4小时后冷却至室温，加入0.5μL 100mM碘乙酰胺(IAA)，室温避光反应1小时后加入10mM DTT终止反应。加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切2小时。再补加2ug胰蛋白酶，37℃酶切10小时。将酶切得到的胰岛素肽段混合物加入到360μg二乙三胺五乙酸双酸酐的固体粉末中，剧烈涡震1min后，常温放置1小时。然后将该反应溶液放入真空干燥机中完全干燥后，加入0.1M醋酸胺溶液中重新溶解，按照体积平均分为两份，其中一份加入40μL浓度为0.15M的YCl3，另一份中加入同样浓度和体积的TbCl3水溶液。37℃温孵2小时。然后将两种反应溶液按照不同的比例(1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，2∶1，5∶1，10∶1)混合。
1.2各取0.6μL不同比例混合后的样品直接在液质联用(LC-Q-TOF Micro Waters，美国)仪器上进行测定分析。LC-Q-TOF Micro的分析条件为液相采用Waters CapLC液相色谱系统，用2％乙腈，0.1％甲酸溶液上样，流速为20μL/min，样品在320μm i.d.×1mm的PepMap C18预柱上脱盐4分钟。分析柱采用C18毛细管柱(75μm i.d.×15cm，LC Packings)。色谱分离的梯度洗脱为溶液A(水/乙腈为95/5，v/v，含0.1％甲酸)；溶液B(水/乙腈为15/85，v/v，含0.1％甲酸)，分流后流速约为200nl/min。梯度4％B——50％B，45min；50％B——100％B，10min；100％B保持10min，再用6min回到4％B，平衡15min。液相洗脱液直接进入Q-TOF Micro(Waters)质谱仪的纳升喷雾源(nanoflow source)，质谱在正离子模式下工作，源温80℃，cone gas氮气流速50L/h，毛细管纳升喷头电压为3.2kV，鞘气压力5psi，检测器MCP电压2850V。采用数据依赖的信号采集方式(survey scan)，信号阈值设为7counts，一次选择3或5个丰度最高的离子自动进行串联质谱数据采集，一级MS扫描范围m/z(400-1500)，1秒/scan，二级MSMS扫描范围m/z(80-1500)或m/z(80-2000)，1秒/scan，二级碰撞电压根据母离子的带电荷情况和荷质比大小自动调整，MS和MS/MS数据在连续模式下获得。所有的数据用MassLynx 4.0软件处理。所有的MSMS数据生成数据文件peak list用于数据库检索鉴定。搜索参数包括可变修饰在肽段的N端或赖氨酸标记了DTPA-Y标签的质量数加上464Da，在肽段的N端标记了DTPA-Tb标签的质量数加上534Da。
1.3在一级质谱图上可以看到m/z为660.58和695.55的一组峰，它们的质量数相差35Da，为胰岛素GFFYTPK分别标记了Y和Tb标签的带两个正电荷的共洗脱肽段。见说明书附图1。在这些肽段中标记有Y和Tb的比例为设定值的0.65倍。胰岛素的另外一个胰酶酶切肽段FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER标记Tb标签的带三个正电荷肽段的耳机质谱图如说明书附图2所示。
实施例2 标准蛋白马心肌红蛋白的相对定量2.1取0.1mg马心肌红蛋白，溶于100μL 50mM pH 7.0的碳酸氢三乙胺缓冲溶液中。肌红蛋白的氨基酸序列中没有半胱氨酸残基，故不需要还原烷基化步骤。加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切2小时。再补加2ug胰蛋白酶，37℃酶切10小时。将酶切得到的肌红蛋白肽段混合物加入到360μg二乙三胺五乙酸双酸酐的固体粉末中，剧烈涡震1min后，常温放置1小时。然后将该反应溶液放入真空干燥机中完全干燥后，加入0.1M醋酸胺溶液中重新溶解，平均分为两份，其中一份加入40μL浓度为0.15M的YCl3，在另外一份中加入同样浓度和体积的TbCl3水溶液。37℃温孵2小时。然后将两种反应溶液按照不同的比例(1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，2∶1，5∶1，10∶1的比例混合。
2.2各取0.6μL不同比例混合后的样品直接在液质联用的LC-Q-TOF Micro(Waters，美国)仪器上进行测定分析。LC-Q-TOF Micro的分析条件为液相采用Waters CapLC液相色谱系统，用2％乙腈，0.1％甲酸溶液上样，流速为20μL/min，样品在320μm i.d.×1mm的PepMap C18预柱上脱盐4分钟。分析柱采用C18毛细管柱(75μm i.d.×15cm，LCPackings)。色谱分离的梯度洗脱为溶液A(水/乙腈为95/5，v/v，含0.1％甲酸)；溶液B(水/乙腈为15/85，v/v，含0.1％甲酸)，分流后流速约为200nl/min。梯度4％B——50％B，45min；50％B——100％B，10min；100％B保持10min，再用6min回到4％B，平衡15min。液相洗脱液直接进入Q-TOF Micro(Waters)质谱仪的纳升喷雾源(nanoflow source)，质谱在正离子模式下工作，源温80℃，cone gas氮气流速50L/h，毛细管纳升喷头电压为3.2kV，鞘气压力5psi，检测器MCP电压2850V。采用数据依赖的信号采集方式(survey scan)，信号阈值设为7counts，一次选择3或5个丰度最高的离子自动进行串联质谱数据采集，一级MS扫描范围m/z(400-1500)，1秒/scan，二级MSMS扫描范围m/z(80-1500)或m/z(80-2000)，1秒/scan，二级碰撞电压根据母离子的带电荷情况和荷质比大小自动调整，MS和MS/MS数据在连续模式下获得。所有的数据用MassLynx 4.0软件处理。所有的MSMS数据生成数据文件peak list用于数据库检索鉴定。搜索参数包括可变修饰在肽段的N端或赖氨酸标记了DTPA-Y标签的质量数加上464Da，在肽段的N端标记了DTPA-Tb标签的质量数加上534Da。
2.3在一级质谱图上可以看到m/z为1034.20和1069.25的一组峰，它们的质量数相差35Da，为肌红蛋白肽段VEADIAGHGQEVLIR分别标记了Y和Tb标签的带两个正电荷的共洗脱肽段。除此之外的还可以看到m/z为857.71和892.73的一组峰，为肌红蛋白肽段TEAEMK分别标记了Y和Tb标签的带两个正电荷的共洗脱肽段，等等。在这些肽段中标记有Y和Tb的比例为设定值的0.65倍。
实施例3 六种标准蛋白混合物的相对定量3.1配置每种蛋白的浓度为0.1mmoL/L的六种蛋白溶液(牛血清白蛋白、转铁蛋白、α-乳球白蛋白、β-乳球白蛋白、肌红蛋白和溶菌酵素蛋白)，缓冲溶液为50mM pH 7.0的碳酸氢三乙胺。各取70μL混合在一起。加入0.8μL 500mM还原剂三羧乙基磷(TCEP)，37℃反应4小时后冷却至室温，加入1μL 1M碘乙酰胺(IAA)，室温避光反应1小时后。加入5ug胰蛋白酶，37℃酶切2小时。再补加5ug胰蛋白酶，37℃酶切10小时。将酶切得到的肌红蛋白肽段混合物加入到360μg二乙三胺五乙酸双酸酐的固体粉末中，剧烈涡震1min后，常温放置1小时。然后将该反应溶液放入真空干燥机中完全干燥后，加入等量的0.1M醋酸胺溶液中重新溶解，平均分为两份，其中一份加入168μL浓度为0.15M的YCl3，在另外一份中加入同样浓度和体积的TbCl3水溶液。37℃温孵2小时。然后将两种反应溶液按照不同的比例1∶1的比例混合。
3.2各取0.6μL不同比例混合后的样品直接在液质联用的LC-Q-TOF Micro(Waters，美国)仪器上进行测定分析。LC-Q-TOF Micro的分析条件为液相采用Waters CapLC液相色谱系统，用2％乙腈，0.1％甲酸溶液上样，流速为20μL/min，样品在320μm i.d.×1mm的PepMap C18预柱上脱盐4分钟。分析柱采用C18毛细管柱(75μm i.d.×15cm，LC Packings)。色谱分离的梯度洗脱为溶液A(水/乙腈为95/5，v/v，含0.1％甲酸)；溶液B(水/乙腈为15/85，v/v，含0.1％甲酸)，分流后流速约为200nl/min。梯度4％B——50％B，45min；50％B——100％B，10min；100％B保持10min，再用6min回到4％B，平衡15min。液相洗脱液直接进入Q-TOF Micro(Waters)-质谱仪的纳升喷雾源-(nanoflow source)，质谱在正离子模式下工作，源温80℃，cone gas氮气流速50L/h，毛细管纳升喷头电压为3.2kV，鞘气压力5psi，检测器MCP电压2850V。采用数据依赖的信号采集方式(survey scan)，信号阈值设为7counts，一次选择3或5个丰度最高的离子自动进行串联质谱数据采集，一级MS扫描范围m/z(400-1500)，1秒/scan，二级MSMS扫描范围m/z(80-1500)或m/z(80-2000)，1秒/scan，二级碰撞电压根据母离子的带电荷情况和荷质比大小自动调整，MS和MS/MS数据在连续模式下获得。所有的数据用MassLynx 4.0软件处理。所有的MSMS数据生成数据文件peak list用于数据库检索鉴定。搜索参数包括可变修饰在肽段的N端或赖氨酸标记了DTPA-Y标签的质量数加上464Da，在肽段的N端标记了DTPA-Tb标签的质量数加上534Da。
3.3在质谱测定的结果中，所有的MSMS数据生成数据文件peak list通过数据库检索鉴定出了这六个标准蛋白，在它们的一级质谱中带电荷数不同的标记有Y和Tb标签的一组组肽段的平均离子强度比为0.65。是设定比例1的0.65倍。
权利要求
1.一种用于定量稀土元素金属螯合标记蛋白质的方法，该方法包括(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱定量；其特征在于所述步骤(3)的处理方法为(a)用一种或多种双功能螯合剂对肽段进行修饰，使其带上螯合基团；(b)分别用两种不同的或多种单同位素稀土元素金属盐离子，与标记在肽段上的螯合剂发生螯合作用；(c)将两种分别标记有不同稀土金属离子的待比较样本的肽段混合物合并，用色谱分离手段将合并肽段进行分离；(d)用质谱定量与鉴定肽段，进行质谱数据的解析及蛋白质的鉴定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)所述双功能螯合剂为分子内带氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或异硫氰酸基多羧酸活性联接基团的化合物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)所述双功能螯合剂为二乙三胺五乙酸双酸酐。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)所述稀土元素为三氯化钇和三氯化铽。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(d)所述质谱是LC-ESI-MS/MS电喷雾离子化串联质谱，或MALDI TOF/TOF基质辅助激光解离飞行时间串联质谱。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(d)所述质谱数据的解析及蛋白质的鉴定方法为使用数据库搜索。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)的处理方法为(a)用二乙三胺五乙酸双酸酐对肽段进行修饰，使其带上螯合基团；(b)分别用三氯化钇和三氯化铽与标记在肽段上的螯合剂发生螯合作用；(c)将两种分别标记有不同稀土金属离子的待比较样本的肽段混合物合并，用一维或多维色谱分离手段将合并肽段进行分离；(d)用基质辅助激光解离飞行时间串联质谱定量与鉴定肽段，使用数据库搜索进行质谱数据的解析及蛋白质的鉴定。
8.一种用于定量蛋白质组学中稀土元素金属螯合标记蛋白质的试剂盒，其特征在于该试剂盒的组分包含(a)一种或多种对肽段进行修饰，使其带上螯合基团的双功能螯合剂；(b)两种或多种单稀土元素三氯化物；(c)能进行肽段色谱分离的色谱柱。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于组分(a)所述双功能螯合剂为分子内或带氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或带异硫氰酸基多羧酸活性联接基团的化合物。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于组分(c)所述色谱柱为反相柱或离子交换柱。
全文摘要
本发明提供了一种稀土元素金属螯合标记蛋白质，用于定量蛋白质组学研究的新方法和试剂盒。该方法涉及蛋白质的还原烷基化和胰酶酶切、肽段的双功能试剂修饰、稀土元素金属的鳌合、多维液相色谱分离与多级串联质谱联用定量与鉴定。通过一级质谱峰离子信号强度来定量，蛋白质的鉴定通过串联二级质谱和数据库搜库。本发明还提供了便于该方法实施的试剂盒。
文档编号G01N30/06GK101042375SQ20061006507
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月20日 优先权日2006年3月20日
发明者钱小红, 刘慧玲, 张养军, 王京兰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所