专利名称：食品中河弧菌的pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食品中河弧菌的PCR检测方法。
背景技术：
目前，国内关于致病性弧菌的检测方法还是传统的微生物学检测方法，尚不够完善，每种检测方法仅能检测一种致病性弧菌，而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以单一或少数目标菌为目的设计的程序。因此，几乎每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂，耗时又耗力。在分子生物学检测方法方面，FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序，检测不同的弧菌需要不同的反应条件。国内的检测人员设计PCR检测方法时也是以毒力基因为待扩增序列，而且关注的大都是O1型和O139型霍乱弧菌与副溶血弧菌，PCR方法检测创伤弧菌的报道只有2000年有过1例，拟态弧菌、溶藻弧菌和河弧菌至今仍未见到过。
发明内容
本发明提供了一种食品中河弧菌的PCR检测方法，在不影响检出率的条件下，较以往传统检测方法的检测速度更快，而且减少了工作量和检测成本。
本发明所提供的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于其检测步骤为待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
本发明所提供的食品中河弧菌的PCR检测方法，采用河弧菌的溶血素基因(AF348455)为目的基因检测河弧菌，其优点在于在不影响检出率的条件下，较以往传统检测方法的检测速度更快，而且减少了工作量和检测成本。
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的引物序列表图。
图3为本发明的V.fl PCR检测结果示意图。
图4为本发明实施例的V.fl PCR检测结果图。
其中，图3中，1Marker(100bp-1000bp)；2-5河弧菌产生的446bp的条带；6少于10cfu/ml的河弧菌没有产生条带；7-8无河弧菌；9阴性对照。
图4中，1100bp Marker，2河弧菌，3、4面包虾，5、6文蛤，7阴性对照。
具体实施例方式
本发明所提供的一种食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于其检测步骤为待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有9倍量的3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h。
所述的水煮法提取弧菌基因组DNA，其操作步骤为取培养的菌液加入离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用。
所述的PCR反应，其反应体系为H2O14.6μl，Buffer2.0μl，DNTP0.4μl，P(0.4*2)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，总体积为20μl。其反应循环参数为94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min。
所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min。
所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有河弧菌的存在。
以下结合具体实施例子说明实施例一面包虾的检测1.无菌操作，取25g面包虾样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。
6.加样，做PCR7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析谱图实施例二文蛤的检测1.无菌操作，取25g文蛤样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。
6.加样，做PCR7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析谱图针对上述两个实施例的谱图分析根据图4可见，四份样品均无河弧菌的特征条带出现，由此可见，四份样品全部不含河弧菌。
权利要求
1.一种食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于其检测步骤为待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
2.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有9倍量的3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h。
3.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于所述的水煮法提取弧菌基因组DNA，其操作步骤为取培养的菌液加入离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用。
4.根据权利要求4所述的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于所述的PCR反应，其反应体系为H2O14.6μl，Buffer2.0μl，DNTP0.4μl，P(0.4*2)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，总体积为20μl。
5.根据权利要求4所述的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于所述的PCR反应循环参数为94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min。
6.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min。
7.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
8.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有河弧菌的存在。
全文摘要
一种食品中河弧菌的PCR检测方法，其特征在于其检测步骤为待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明所提供的食品中河弧菌的PCR检测方法，采用河弧菌的溶血素基因(AF348455)为目的基因检测河弧菌，其优点在于在不影响检出率的条件下，较以往传统检测方法的检测速度更快，而且减少了工作量和检测成本。
文档编号G01N21/84GK1967236SQ20061006856
公开日2007年5月23日 申请日期2006年8月26日 优先权日2006年8月26日
发明者黄晓蓉, 郑晶, 陈彬, 吕海沧 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心