专利名称：一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的试纸，特别涉及一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，还涉及其制备方法。
背景技术：
鼻疽是由鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallie)引起的一种致死性和传播性均很强的细菌性疾病。鼻疽菌曾命名为鼻疽费氏杆菌(Pfeifferellamallei，1918)、鼻疽恶病杆菌(Malleonydes mallei，1933)、鼻疽放线菌(Adtinoei mallei，1933)、鼻疽吕氏杆菌(Loefferella mallei，1935)、鼻疽不动杆菌(Acinetobacter mallei，1964)和鼻疽假单胞菌(Pseudomonas，mallei1966)，1993年命名为鼻疽伯克霍尔德氏菌。
由于鼻疽菌容易获得，致病性强，致死率高，如未及时治疗，病死率高达100％。被公认为经典的生物战剂，已被列入《国际禁止生物武器公约》核查清单。第一次世界大战期间，德国间谍在东部战场蓄意用鼻疽菌感染了大批俄罗斯的马和牛，使战后俄罗斯人鼻疽的发病数增加；第二次世界大战期间，日本人在中国的哈尔滨研究可能使用的生物武器，蓄意将马、平民和战俘感染上鼻疽；二战后美国和前苏联一直将鼻疽菌作为潜在的生物武器研究。“9.11”以后，美国国家反恐预案将鼻疽菌列为可能用于生物恐怖袭击的烈性病原微生物。因此，鼻疽菌的快速检测是反生物恐怖的重要内容(Bossi P，Guihot A，Bricaire F.Emerging or re-emerging infections that can be used for bioterrorismPresse Med.2005 Jan 29；34(2Pt 2)149-155)。
鼻疽菌检测的经典方法鼻疽的临床表现复杂易变，不易诊断，必须借助实验室的试验结果做判断，包括细菌学检查和血清学试验。
临床采集患者鼻腔分泌物、痰、皮肤溃疡分泌物或脓肿穿刺物，直接涂片镜检，同时接种4％甘油肉汤琼脂，按照分离培养、生化反应、玻片血清凝集和动物感染试验程序检验。
鼻疽菌为两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，3～5μm长，0.5～1μm宽，散在分布，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。鼻疽菌为需氧菌，在4％甘油琼脂上生长良好。根据生化反应和动力试验可将鼻疽菌与类鼻疽菌和绿脓假单胞菌区别开。
聚合酶链反应(PCR)是鼻疽菌快速检测方法中最常用的技术，最初根据鼻疽菌23S rRNA基因设计引物CVMP2315′AAA CCG ACA CAG GTG G 3′；M2325′CAC CGA AAC TAG CA 3′，用于鼻疽菌的鉴定(Adolf Bauernfeind，CarstenRoller Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia malleiand Burkholderia pseudomallei.J.Clin.Microbiol，1998，362737-2741)；应用鼻疽菌23S rRNA基因设计引物，也可获得明确的鼻疽菌鉴定结果(Gee JE，Sacchi CT，Glass MB，De BK.Use of 16S rRNA gene sequencing for rapididentification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and B.mallei.J Clin Microbiol.2003，41(10)4647-4654)；近年来将实时定量PCR(real-time PCR)技术用于临床标本中鼻疽菌的检测，可检出1～10cfu/ml鼻疽菌(Tomaso H，Scholz HC，Al Dahouk S，Eickhoff M Development of a5’-nuclease real-time PCR assay targeting fliP for the rapididentification of Burkholderia mallei in clinical samples.Clin Chem.2006，52(2)307-310；Novak RT，Glass MB，Gee JE，Gal D，Mayo MJ.Developmentand evaluation of a real-time PCR assay targeting the type III secretionsystem of Burkholderia pseudomallei J Clin Microbiol.200644(1)85-90)。
免疫胶体金技术是近年来迅速发展的快速检测技术，该技术与其它方法比较，优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。
目前尚无见到免疫层析试纸检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。
本发明所提供的检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的一条检测线和一条质控线，所述检测线为鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体，所述质控线为能与所述鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体特异结合的抗抗体。
所述鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体优选为兔抗体，所述质控线优选为抗兔抗抗体。
检测样品时可将检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的样品垫直接浸于样品中；为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板，背板的材料可以是多种多样的，如塑料、聚氯乙烯板(PVC板)等。再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的方法。
本发明所提供的制备上述检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤1)制备鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，将鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-5.5小时，然后将其粘贴在吸水纸垫上。
2)制备含有鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记免疫胶体金探针溶液；取5ml，加入0.5-0.65g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，-20℃～-50℃放置10-11小时后，冻干机抽干，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端。
3)将在步骤2)中得到的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸。
为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴背板。
本发明所述鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记胶体金探针可由下述方法制备1)将HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；2)用K2CO3或HCl调pH值为9.2-9.5，按30μg/ml加入鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体。搅拌20-25分钟，然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-25分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，2800-2900rpm离心10-15分钟，吸出上清，10000-12000rpm离心25-35分钟，弃上清；沉淀用四硼酸钠洗涤一次后用四硼酸钠保存液收集，得到胶体金标探针。
所述调节pH值的K2CO3的浓度可为0.15-0.25M，优选为0.2M；所述调节pH值的HCl的浓度可为0.05-0.2M，优选为0.1M。
免疫胶体金技术检测鼻疽菌抗原的基本原理是用鼻疽菌特异性抗体包被硝酸纤维素(NC)膜，用以捕捉标本中的鼻疽菌或鼻疽菌抗原，然后用标记了特异性抗体的免疫胶体金探针检测。标本中的鼻疽菌或鼻疽菌抗原经过5分钟左右的纸层析后，即出现肉眼可见的沉淀线。
鼻疽伯克霍尔德氏菌多糖抗原是鼻疽菌的特异性抗原。因此，用鼻疽伯克霍尔德氏菌有毒株制备含丰富多糖抗原的全菌体抗原免疫动物，可以得到鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体。本发明的免疫层析试纸采用双抗体夹心法，将抗鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体包被在硝酸纤维素膜上，用于捕捉标本中的鼻疽伯克霍尔德氏菌抗原，然后用特异性抗体标记的免疫胶体金探针进行检测。
本发明研制的鼻疽菌抗原快速检测试剂(胶体金法)实验室考核结果显示，可检测标本中鼻疽菌106cfu/ml，并且不与相关细菌发生交叉。
本发明的优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。
图1为鼻疽伯克霍尔德氏菌免疫层析试纸的结构示意图。免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。
具体实施例方式
主要材料氯金酸(HAuCl4)(购自Sigma公司，1g/瓶包装)；硝酸纤维膜(NC膜)、样品垫和吸水滤纸(购自Millipore公司)。
实施例中所用到的菌种均由军事医学科学院微生物流行病研究所菌种库提供鼻疽伯克霍尔德氏菌(保藏号350018)，引自农林部中监所；类鼻疽4株(越南株、广东株、广西株、海南株各1株)、绿脓假单胞菌3株。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的制备1、鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体的制备1)鼻疽伯克霍尔德氏菌抗原的制备鼻疽菌(保藏号350018)接种含4％甘油普通琼脂平板上，37℃孵箱培养，观察平板上菌落形态，挑取典型的单个菌落，转种4％甘油普通琼脂斜面，37℃孵箱中培养24-28小时。用5％甲醛盐水洗下粘稠菌苔于盐水瓶中，放置37℃过夜。无菌试验观察7-8天，证明无活菌后，将菌液10,000g-12,000g离心10-15分钟，收集沉淀，用无菌生理盐水配制成2倍比浊浓度(约109cfu菌/ml)，即为鼻疽伯克霍尔德氏菌抗原。
2)鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体的制备选用体重2kg健康雌性大耳白家兔(购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心)，皮下多点注射免疫福氏完全佐剂鼻疽菌菌体抗原2×108cfu菌/1ml/只，分别于初次免疫后的第20日、第30日、第40日追加免疫水剂1针，追加剂量和途径与初次相同，末次免疫后10天试血，玻片凝集试验检测血清效价达到1∶1280以上采血。
采用常规的饱和硫酸铵盐析法对血液中的鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体进行纯化，经琼脂双向扩散法鉴定获得的抗体具有较好的特异性和亲和性。
2、制备免疫胶体金探针1)制备胶体金溶液采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为将HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶液。
2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度用0.2M K2CO3调节胶体金溶液pH9.2，准备5支洁净试管，分别加入1ml胶体金溶液。将经纯化的鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体稀释为1mg/ml，分别向4支试管中加入20μl、25μl、30μl、35μl，另一支为对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定1ml胶体金所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量，即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果表明维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为25μl，即25μg/ml，选择偶联抗体浓度为30μg/ml。
3)金标垫2的制备按上述方法配制含有浓度为30μg/mL的鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体的免疫胶体金探针溶液50ml。搅拌20-25分钟，然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-25分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，2800-2900rpm离心10-15分钟，吸出上清，10000-12000rpm离心25-35分钟，弃上清；沉淀用四硼酸钠洗涤一次后用四硼酸钠保存液收集沉淀5ml。取金标探针5ml加入0.5-0.65g蔗糖，充分溶解均匀加在玻璃纤维膜上，-20℃～-50℃放置10-11小时小时，冻干机抽干，得到金标垫2。
3、检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的制备如图1所示，检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。制备方法包括以下步骤1)NC膜3的包被鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体和羊抗兔IgG的包被用0.01M pH7.2PB稀释鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体至终浓度为2mg/ml，用于包被检测线。用0.01M pH 7.2的PBS稀释羊抗兔IgG至终浓度为4mg/ml，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于300mm长、25mm宽硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥2.5-5.5h。
2)检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的制备将吸水纸垫4用双面胶粘贴于上述包被有鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体和羊抗兔IgG的NC膜3靠近质控线的一端；将在步骤2中制备的金标垫2用双面胶粘贴于NC膜3靠近检测线的一端；再在金标垫2的上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫1；最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。
4、检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试剂盒的制备为了方便使用，将步骤3制备的检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于对照带和测试带的部位设有观测窗。
5、检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的使用方法和原理测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗原，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相二抗结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
实施例2、鼻疽菌的检测及与其它相关细菌的交叉试验1、鼻疽菌的检测1)由军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心提供、鼻疽菌350018株，鼻疽菌350019株，浓度均为1×106cfu/ml，菌悬液作为样品检测液备用。
2)经实施例1制备的包被鼻疽菌特异性抗体和羊抗兔IgG的免疫层析试纸检测均为阳性结果。
2、其他相关细菌的交叉试验1)由军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心提供、类鼻疽菌350102株，绿脓假单胞菌430023株，浓度均为1×108cfu/ml，菌悬液作为样品检测液备用。
2)经实施例1制备的包被鼻疽菌特异性抗体和羊抗兔IgG的免疫层析试纸检测均为阴性结果。
实施例3、实验室考核1、样品制备将不同细菌分别接种各自适宜的培养基，并在不同的条件下培养，长出菌苔后用无菌生理盐水洗下，比浊法配制鼻疽菌菌悬液1×106cfu/ml、1×107cfu/ml和1×108cfu/ml，其它细菌菌悬液1×108cfu/ml，作为检测液备用。
2、实验方法取鼻疽菌抗原快速检测试剂，分别于样品垫上加入上述样品检测液3滴(约150μl)，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果报告质控线处出现1条沉淀线为阴性，即无鼻疽菌抗原检出；检测线和质控线处出现2条沉淀线为阳性，即有鼻疽菌抗原检出。
实施例二不同水环境浓度下采样检测装置富集速率的恒定性在不同的水环境浓度下，采样检测装置放在其中3天后，分析其中富集极性内分泌干扰物的量。具体方法设置一系列浓度剃度，含极性内分泌干扰物浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000ng/L的水，采用与实例1相同的水箱系统，将采样检测装置(3个)放置该流动水箱系统中3天后取出，同时每天取水样监测水中极性内分泌干扰物的量；采样检测装置和水以实例1中所描述的方法进行预处理和检测其中所含有极性内分泌干扰物的量。公式Cw＝Ms/Rzt，通过该公式可计算采样检测装置的富集速率Rz，结果如表1所示。
从表1中可知，随着水体浓度自10ng/L到1000ng/L，采样检测装置对污染物BPA、E1、E2、EE2在不同浓度下的富集速率平均值分别为0.04、0.04、0.037、0.051L/d，在7个浓度范围内，其富集速率的相对标准偏差为13-28％，可认为该采样检测装置对四种极性内分泌干扰物的采样富集速率基本上不随外界水环境浓度而发生变化，保持恒定，是个常数。
实施例三采样检测装置应用于河流中极性内分泌干扰物的监测选一特定河流，沿水流方向布设三个点位，将本发明的采样检测装置悬浮放在水中，每个站位放置3个，过1周后取回，同时在每个点位利用玻璃瓶取3个水样带回实验室分析。其分析方法如实例1中所述。测定所得的采样检测装置中Ms量，可籍以通过公式Cw＝Ms/Rzt(利用实验室模拟状态下获得的Rz值)，计算得水中极性内分泌干扰物的浓度Cw。将通过采样检测装置测得和采集水样测定所得的污染物浓度列于表2，其中A*、B*、C*表示利用本发明装置测定河流水中三个点位的极性内分泌干扰物浓度值，而A、B、C则表示直接利用玻璃瓶取三个对应的水样回实验室通过固相萃取小柱预处理后测定所得的水中极性内分泌干扰物浓度数据，从中可见，本发明监测获得的数据与现场采水样方法所测得的BPA、E1、E2、EE2浓度数据，从痕量有机污染物监测方面而言，该两组数据具有很强的可比性，其污染水平接近，表明该采样检测装置可应用于实际水环境中极性内分泌干扰物的有效监测。
权利要求
1.一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，包括样品垫(1)、紧密连接于所述样品垫一端的含有鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记胶体金探针的金标垫(2)、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(3)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫(4)；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线(5)和质控线(6)，所述检测线为鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，所述质控线为能与所述鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体特异结合的抗抗体。
2.根据权利要求1所述的检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，其特征在于质控线优选为抗兔抗抗体。
3.根据权利要求1所述的检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，其特征在于所述样品垫、吸水垫、金标垫均由吸水材料制成；所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。
4.一种制备检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤1)制备鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，将鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；抗兔抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-5.5小时，然后将其粘贴在吸水纸垫上。2)制备胶体金标探针，采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为将HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶液。用0.2M K2CO3调节胶体金溶液pH9.2-9.5，按30μg/ml加入鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，搅拌20-25分钟，然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-25分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，2800-2900rpm离心10-15分钟，吸出上清，10000-12000rpm离心25-35分钟，弃上清；沉淀用四硼酸钠洗涤一次后用四硼酸钠保存液收集沉淀5ml。所述百分含量均为质量百分含量。3)制备含有鼻疽菌抗体标记免疫胶体金探针溶液；取5ml，加入0.5-0.65g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，-20℃～-50℃放置10-11小时后，冻干机抽干，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端。4)将在步骤2)中得到的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体的浓度为2mg/ml；抗兔IgG浓度为4mg/ml；所述吸水垫的下面还粘贴有背板；所述调节pH值的K2CO3的浓度为0.2M。。
6.含有权利要求1-3中任一所述的检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸及其制备方法。该检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，包括样品垫1、紧密连接于所述样品垫一端的含有鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记胶体金探针的金标垫2、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)3和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫4；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线5和质控线6，所述检测线为鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，所述质控线为抗兔抗抗体。本发明用于临床标本、污染物和环境中鼻疽伯克霍尔德氏菌抗原的检出，也可用于纯培养鼻疽伯克霍尔德氏菌的鉴定。
文档编号G01N33/532GK1834650SQ200610072299
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月18日 优先权日2006年4月18日
发明者端青, 朱虹, 何君, 檀华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所