专利名称：一种鉴定大豆种子真实性和/或品种纯度的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定农作物种子真实性和/或品种纯度的方法，特别涉及一种鉴定大豆种子真实性和/或品种纯度的方法。
背景技术：
种子是有生命的特殊产品，种子检验是对种子质量进行全面控制和评定的主要手段。近年来，我国先后颁布了一系列指导农作物种子工作的法律、法规，例如《农作物种子检验规程》(中华人民共和国国家标准，GB/T 3543.1～3543.7-1995)，《中华人民共和国植物新品种保护条例》(1997年)、《中华人民共和国种子法》(2000年)等。目的在于确保农业生产安全用种，保护用种者的合法权益。在我国《农作物种子检验规程》中规定，种子净度分析、发芽试验、真实性和品种纯度鉴定、水分测定是四个必检项目，而真实性和品种纯度鉴定尤为重要，是鉴别伪、劣种子的关键环节。《农作物种子检验规程》中对种子真实性和品种纯度鉴定项目提出了四项标准鉴定方法，即种子形态鉴定、快速测定法(含小麦、大麦醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺电泳法)、幼苗鉴别和田间小区种植鉴定。其中种子形态鉴定简单直观但准确性差；幼苗鉴定所用的鉴定指标较少，不能准确反映品种的特征特性；田间小区种植鉴定被视为最准确、最可靠的方法，但该方法周期长费用高，不能及时满足种子经营者的需要，并且受环境条件影响较大。快速测定法中有一定的生化技术，特别是聚丙烯酰胺电泳法，用于检测种子中贮藏蛋白和同工酶遗传组成的差异，是目前使用较多的室内检测方法，但由于蛋白质和同工酶是基因表达的产物，产生的多态性不多，对某些品种尤其是亲缘关系较近的品种难以鉴别。因此急需寻找一种分辨率高且不受环境条件影响的新方法来弥补上述方法的不足，保障种子法规的顺利实施，为农业生产服务。
SSR(Simple Sequence Repeat)标记是近年来发展起来的一种新型分子标记，属于显性标记，在基因组中分布平均、多态性高、实验程序简单而逐渐被重视，与其他分子标记(RFLP、RAPD、AFLP等)相比，具有所需样品DNA量少，结果准确，操作简便，易于推广等特点，已在许多农作物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究、标记和定位基因以及分子标记辅助选择等方面得到应用。特别在大豆上，已经在新品种DNA指纹鉴定上应用。但是，目前使用的SSR分子标记技术的程序复杂、技术含量和检测费用较高，直接移植用于种子真实性和品种纯度的鉴定不易被种子生产经营单位所接受。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定大豆种子真实性和/或品种纯度的方法。
本发明所提供的鉴定大豆种子真实性和/或品种纯度的方法，包括以下步骤1)按照如下方法提取每粒待检测种子的基因组DNA将待检测种子进行单粒机械粉碎，加入CTAB缓冲液，65℃水浴20-40分钟，再加入DNA提取液，提取得到每粒待检测种子的基因组DNA；2)按照如下方法对每粒待检测种子分别进行PCR扩增以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将所得到的PCR扩增产物进行6-9％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每粒待检测种子的电泳图谱；3)将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，如待检测种子与标准种子的谱带组成(带型)一致，则该待检测种子与标准种子为同一品种，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。
所述SSR引物对标准种子可产生特异的谱带，可从现有的大豆SSR引物中选取。
所述标准种子为品种已知的种子。
所述CTAB缓冲液的组成如下，每100ml水溶液中含有2g CTAB，10ml 1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.74g EDTA，8.18g NaCl，1mlβ-巯基乙醇。
所述DNA提取液可为由体积比为24∶1的三氯甲烷和异戊醇配成的混合液。
所述PCR扩增的扩增程序为先95℃变性5-10min；然后进行如下30-45个循环95℃变性20-30s，50℃、55℃或60℃(根据引物所适温度)复性20-30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5-10min。
所述大豆种子具体为晋大75。所述SSR引物可为由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对寡核苷酸序列，即SSR引物Sat_344。所述PCR扩增的扩增程序为先95℃变性5min；然后进行如下35个循环95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。
本发明对常规SSR分子标记技术的一些操作环节进行了改进和修改，修改后的实验方法保留SSR标记的特色和关键技术，简化了实验步骤，降低了技术含量，用于鉴定大豆种子真实性和/或品种纯度。该方法操作简单，能够在短时间内对大量样品进行快速测定，符合种子检验的方法应具备样品在同等条件下测定的要求，甚至比《农作物种子检验规程》中提出的小麦、大麦醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺电泳法更容易掌握，节省时间和费用。具体优点如下1.本发明以大豆种子基因组DNA为鉴定样品，单粒测定，达到《农作物种子检验规程》中规定的标准。而常规的SSR分析多用植物营养器官的DNA，如茎、叶等，提取DNA时，需用液氮研磨粉碎。本发明提取种子DNA时，用小型粉碎机或钳子单粒粉碎，省略液氮研磨的环节。液氮不易保存和运输，本发明可在缺乏液氮资源的地区推广使用。
2.针对SSR扩增对DNA的质量要求不高的特点，简化了DNA提取程序。与常规SSR分析相比，省略了DNA纯化和降解RNA等步骤，节约时间和试剂的费用。
3.常规SSR分析时一般用测序胶，即变性聚丙烯酰胺凝胶。制胶技术要求高，电泳上样前须对样品DNA进行变性处理，电泳缓冲液和电泳后胶板的染色与显色试剂用量大。本发明采用6-9％非变性聚丙烯酰胺凝胶，制胶简便，如果用灌胶器辅助则更快速方便。电泳前不需变性，操作简单，胶量、电泳缓冲液和染色与显色的试剂节约一半。
4.与《农作物种子检验规程》中提出的小麦、大麦醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺电泳法相比，只增加了样品DNA扩增的环节，但技术简单，一般的生物工程公司可提供扩增反应液的试剂，甚至扩增试剂盒。制胶和染色较易掌握，图谱清晰。由于基因组DNA中SSR的多态性要远远多于蛋白质组成的多态性，遗传性不受种子生长环境的影响，其结果准确。
图1为部分待检测样品种子和标准种子(晋大75)的电泳图谱具体实施方式
一、本发明所用的主要试剂的配制1、1mol/L Tris-HCl(pH8.0)100ml∶12.1g Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，加去离子水至100ml，NaOH(氢氧化钠)调pH到8.0。
2、CTAB缓冲液100ml∶2g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.74g EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，8.18g NaCl(氯化钠)，1mlβ-巯基乙醇，4℃保存备用。
3、0.5mol/L EDTA(pH8.0)100ml∶18.6g EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，2g NaOH，4℃保存备用。
4、DNA提取液(三氯甲烷∶异戊醇/24v∶1v)100ml∶4ml异戊醇溶于96ml三氯甲烷。
5、5×TBE(Tris-硼酸)电泳缓冲液1000ml∶270g Tris(三羟甲基氨基甲烷)，135g硼酸，20ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加去离子水至1000ml。
6、10％硫代硫酸钠10ml∶1g硫代硫酸钠，加去离子水至10ml。
7、20％过硫酸铵10ml∶2g过硫酸铵，加去离子水至10ml。
8、丙烯酰胺凝胶液(1)40％丙烯酰胺1000ml∶380g丙烯酰胺，20g N，N-甲叉双丙烯酰胺，加离子水定溶到1000ml。
(2)8％丙烯酰胺30ml(每块胶)∶6ml 40％丙烯酰胺，6ml 5×TBE，300μl 20％过硫酸铵，20-30μl TEMED(N，N，N’-四甲基乙二胺)，18ml去离子水。
9、加样缓冲液100ml∶0.25g溴酚蓝，0.25g二甲苯青FF，40g蔗糖，加去离子水至100ml。
10、固定液(10％冰乙酸)500ml∶50ml冰乙酸加去离子水至500ml。
11、染色液(0.1％硝酸银)500ml∶0.5g硝酸银，750μl甲醛，加去离子水至500ml。
12、显色液500ml∶15g无水碳酸钠，750μl 37％甲醛，120μl 10％硫代硫酸钠，加去离子水至500ml(注15g无水碳酸钠加水500ml溶解后，预冷，显色前加甲醛和硫代硫酸钠试剂)。
二、鉴定大豆种子真实性和品种纯度的方法1、种子样品选取真实性鉴定从送验样品中随机数取50粒种子；品种纯度鉴定随机数取100粒(参照《农作物种子检验规程》(GB/T 3543.1～3543.7-1995)中聚丙烯酰胺电泳法测定大麦、小麦纯度样品选取的方法)。
2、每粒待检测种子基因组DNA的提取(1)用小型粉碎机将种子样品逐粒粉碎或钳子夹碎，每粒分别置于一个1.5ml离心管中。
(2)向每个1.5ml离心管中加入600μl CTAB缓冲液，65℃水浴20-40min。
(3)常温下向每个1.5ml离心管中加入600μl DNA提取液，轻柔混匀5-10min，5000-12000rpm离心10-5min。
(4)上清液转入另一个1.5ml离心管，加入二倍体积预冷无水乙醇，轻柔混匀，4℃静置20min。
(5)挑出絮状DNA，或10000rpm离心2-5min，DNA沉淀于管底。
(6)DNA风干后溶于纯水，DNA稀释后，用于PCR扩增。
3、PCR扩增分别以步骤2提取的每粒种子的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如下扩增体积为10μl，其成分为1μl 10×PCR buffer，1μl 15mM MgCl2，1μl 2mM dNTP，1μl 20ng/μl引物，1μl 25-50ng/μl基因组DNA，1Unit Taq酶，加纯水至10μl。
PCR扩增程序先95℃变性5min；然后35个循环(95℃变性30s，50℃、55℃或60℃复性30s，72℃延伸30s)；最后72℃延伸5min。
4、凝胶制备将配好6-9％非变性聚丙烯酰胺凝胶灌入事先做好的20×20cm的两块玻璃板的间隙中(1mm厚)，立即插入样品梳，3-5min内聚合，聚合后小心抽出样品梳，并用洗瓶冲洗样品胶孔。
5、凝胶电泳扩增产物加入2-3μl加样缓冲液，上样电泳。电泳缓冲液为1×TBE(每个电泳槽500ml左右，可同时电泳二块胶)，恒定电压120-150V，电泳4h左右。
6、凝胶银染(1)电泳完毕后，取下胶板，在500ml 10％冰乙酸中固定20-30min(可同时固定2-4块胶)。
(2)去离子水漂洗2次，每次5min。
(3)0.1％硝酸银染色液染色20-30min(可同时染色2-4块胶)。
(4)去离子水快速漂洗10-20s。
(5)放入预冷的500ml显色液显色，不断摇动，至谱带显出(可同时显色2-4块胶)。
(6)加入10％冰乙酸终止反应，用蒸馏水漂洗1次。
(7)把染色后的凝胶进行带型分析或扫描记录，或放入5％的甘油溶液中浸泡30-60min左右制成干胶，室温干燥后，进行带型分析或扫描记录。
7、鉴定将待检测样品的每粒种子的SSR扩增产物的电泳图谱，与按照上述步骤1至6的方法获得的标准种子的电泳图谱相比较，根据待检测种子样品SSR扩增产物和标准种子SSR扩增产物的DNA谱带的组成(带型)的一致性，鉴定种子真实性和计算品种纯度。
本发明的方法可对任一大豆品种有效，但SSR引物有别，下面以晋大75和Sat_344为实用范例。
实施例1、以晋大75种子为标准种子鉴定大豆种子真实性和品种纯度鉴定前对来源于山西省的20余个大豆品种(含晋大75)进行了SSR标记的筛选，发现SSR引物Sat_344对晋大75的基因组DNA可产生特异的谱带，因此，用引物Sat_344对晋大75供检样品的DNA进行分析。
1.种子样品选取从大豆品种晋大75中随机数取95粒种子，为检验鉴定效果，再掺入3粒晋大74和2粒晋大701品种的种子，共100粒种子作为检验样品。
2.种子样品DNA提取(1)用钳子将大豆种子逐粒夹碎，每粒分别置于一个1.5ml离心管中，样品约占离心管体积的1/3。
(2)向每个1.5ml离心管中加入600μl CTAB缓冲液，65℃水浴30min。
(3)向每个1.5ml离心管中加入600μl DNA提取液，轻摇混匀10min，10000rpm离心10min。
(4)上清液约300μl转入另一1.5ml离心管，加入600μl预冷无水乙醇，轻柔混匀，4℃静置20min。
(5)10000rpm离心5min沉淀DNA，弃上清。
(6)DNA风干5h后溶于200μl纯水，稀释10-20倍，用于PCR扩增。
3、SSR引物PCR扩增分别以步骤2提取的每粒种子的基因组DNA为模板，用SSR引物Sat_344进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如下每个反应体系为10μl，其中含有2μl 25ng/μl样品DNA、1μl 10×PCR缓冲液(含20mM Mg2+)、1μl 2mM dNTP、1μl 20ng/μl SSR引物对(Sat_344)、0.2μl DNA Taq酶(5U/1μl)，加纯水至10μl。(dNTP、Taq酶和10×PCR缓冲液购自北京鼎国生物公司，SSR引物由北京赛百盛基因技术公司合成)。
扩增的程序为变性95℃5min；以后为35扩增循环，每个循环中95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后72℃延伸保温5min。
4.凝胶制备8％非变性聚丙烯酰胺凝胶30ml，加入20％过硫酸铵300μl、TEMED 30μl。混匀后灌入事先做好的20×20cm的两块玻璃板的缝隙中(1mm厚，玻璃板两侧及底部用胶条密封，并用夹子加紧，以防漏胶)，立即插入样品梳，3-5min内聚合，聚合后小心抽出样品梳，并用洗瓶冲洗样品胶孔。
5.凝胶电泳凝胶板装入电泳槽(JY-SCZ6)，加入约500ml 1×TBE电泳缓冲液。扩增产物加入3μl加样缓冲液，加样6μl。恒定电压130V，电泳4h。
6.凝胶银染程序(1)电泳完毕后，分开玻璃板，取下胶板于500ml 10％冰乙酸固定30min。在摇床上固定和染色。
(2)去离子水500ml漂洗2次，每次5min。
(3)染色液500ml染色30min。
(4)去离子水500ml快速漂洗10-20s。
(5)立即放入4℃预冷的500ml显色液，(用前加750μl 37％甲醛和120μl 10％硫代硫酸钠)显色，不断摇动，至谱带显出清晰时加入10％冰乙酸终止反应，然后用蒸馏水500ml漂洗1次。
(6)漂洗后的凝胶放入5％的甘油溶液中浸泡60min左右制成干胶，室温干燥后进行带型分析或扫描记录。
7.鉴定将待检测样品每粒种子DNA的Sat_344扩增产物的电泳图谱，与按照上述步骤1至6的方法获得的标准种子晋大75的电泳图谱相比较，根据Sat_344对样品DNA和晋大75DNA扩增产物的谱带组成(带型)一致性的分析，鉴定种子真实性和计算品种纯度。结果表明100粒待检测种子中有95粒与晋大75品种的种子带型相同，5粒种子带型有差异，与预选掺杂的情况相符，说明前者为晋大75品种的种子，后者为混杂种，该样品的品种纯度为95％。其中，部分待检测样品种子和标准种子(晋大75)的电泳图谱如图1所示，图1中，M标准分子量；1-7，9-10和12为大豆品种晋大75种子，其中12为标准种子，1-7，9-10为待检测样品中的种子；8和11分别为待检测样品中的混杂种子晋大74和晋大701；箭头所示为晋大75的特异带型。
序列表<160>2<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcggctggtc aaaaacttca tagtcat 27<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcgcaatgtg taacgaaatc ttatgtctaa a 3权利要求
1.一种鉴定大豆种子真实性和/或品种纯度的方法，包括以下步骤1)按照如下方法提取每粒待检测种子的基因组DNA将待检测种子进行单粒机械粉碎，加入CTAB缓冲液，65℃水浴20-40分钟，再加入DNA提取液，提取得到每粒待检测种子的基因组DNA；2)按照如下方法对每粒待检测种子分别进行PCR扩增以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将所得到的PCR扩增产物进行6-9％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每粒待检测种子的电泳图谱；3)将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，如待检测种子与标准种子的谱带组成一致，则该待检测种子与标准种子为同一品种，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述SSR引物对标准种子能产生特异的谱带。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述CTAB缓冲液的组成为每100ml水溶液中含有2g CTAB，pH 8.0的10ml 1mol/L Tris-HCl，0.74g EDTA，8.18g NaCl，1ml β-巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA提取液是由体积比为24∶1的三氯甲烷和异戊醇配成的混合液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的扩增程序为先95℃变性5-10min；然后进行如下30-45个循环95℃变性20-30s，50℃、55℃或60℃复性20-30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5-10min。
6.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述大豆品种为晋大75。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述SSR引物为由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对寡核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的扩增程序为先95℃变性5min；然后进行如下35个循环95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。
9.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中将所得到的PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
10.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)中水浴时间为30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定大豆种子真实性和/或品种纯度的方法。该方法包括以下步骤将待检测种子进行单粒机械粉碎，加入CTAB缓冲液，1)65℃水浴20－40分钟，再加入DNA提取液，提取得到每粒待检测种子的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将所得到的PCR扩增产物进行6－9％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每粒待检测种子的电泳图谱；3)将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。该方法保留SSR标记的特色和关键技术，简化了实验步骤，降低了技术含量，能够在短时间内对大量样品进行快速鉴定，方法相对简单，鉴定费用较低，结果准确。
文档编号G01N27/26GK1900317SQ200610088869
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者谢皓, 陈学珍, 于同泉, 秦岭, 路苹, 杨柳, 王建立, 冯永庆, 南张杰 申请人:北京农学院