专利名称：一种提高血清特异性生长因子免疫学测定灵敏度的技术的制作方法
技术领域：
免疫学诊断技术 技术背景
肿瘤可以通过自分泌和旁分泌的方式产生一系列生长因子，包括表皮生长因子 (EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍 生生长因子(PDGF)、肿瘤生长因子a (TGF-a )和促血管生成素(angiopoietin， ANG)等许多因子。这些生长因子，可以进入血液循环，成为血清特异性生长因子 (specific growth factors, SGF)，能不断刺激肿瘤生长、转移和血管生成，加快 了肿瘤的发展。而不断增大的肿瘤组织又进一步分泌更多的生长因子，进一步刺激 肿瘤生长和转移，形成恶性循环。因此，体内血清特异性生长因子的表达水平与肿 瘤的生长转移和恶性程度密切相关。定量检测血液或体液中血清特异性生长因子可 用于恶性肿瘤的早期诊断，判断肿瘤转移与否及治疗效果。
VEGF、 PDGF、 ANG等许多生长因子通常以同源二聚体或三聚体形式存在。这种 结构往往会干扰只能识别生长因子某个表位的单克隆抗体与抗原分子的结合，影响 免疫检测的灵敏度。此外，肿瘤患者体内还存在一定浓度的，能与相应生长因子结 合的分泌性受体。这些分泌性受体也能与相应的生长因子结合，阻碍生长因子与抗 体的结合，也在一定程度上影响到生长因子免疫检测的灵敏度。如果对待测样品进 行适当的预处理，破坏生长因子的二聚体结构及其与分泌性受体复合体结构，使之 变成游离单体，利于与检测抗体结合。然后再用相应的抗体通过免疫学方法检测生 长因子，则能够显著提高生长因子的免疫检测灵敏度。
在蛋白质亲和层析纯化技术中，常采用酸性缓冲液(多为甘氨酸缓冲液)破坏 抗体与抗原、抗体与A蛋白、G蛋白、配体与受体之间的结合，从固相层析介质中 分离洗脱目的蛋白。酸性甘氨酸缓冲液化学性质温和，只破坏抗体与抗原、配体与 受体的结合，不会使目的蛋白变性，用碱性缓冲液中和PH后，不影响目的蛋白的免 疫学活性和生物学活性。
发明内容
本发明专利描述了一种利用酸性解离方法对待测样品进行预处理，破坏生长因 子的二聚体结构及其与分泌性受体复合体结构，使之变成游离单体，利于与检测抗 体结合。然后再用特异性抗体通过酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光测定法或免 疫比浊法检测血液和体液中的血清特异性生长因子，提高血清特异性生长因子免疫 检测的灵敏度。下面以免疫比.浊法检测血清促血管生成素UNG)为例，介绍样品预 处理的具体方法和检测步骤
(1) 常规方法抽取肿瘤患者外周血2ml，室温静置30分钟使血液凝固，U00转/ 分钟(rpm)离心，吸取清亮血清，-18'C冻存备用；
(2) 取15|u 1缓冲液(Rl ) (5%聚乙二醇6000, 20mM Tris-HC1缓冲液，PH6. 0 ) 和15nl处理液(R2 ) ( 600mM甘氨酸、0.2% Towen-20， PH2.5)加入到酶 标板的微孔中，使缓冲液的PH值低于3.5, 37'C反应20min，破坏待测血清特 异性生长因子二聚体结构及与分泌性受体复合物，使形成游离型单体；
(3)加入200 p 1抗休试剂(R3) ( 50mMTris-HC1缓冲液，200nM NaCl悬浮的10 Hg/ml聚苯乙烯微球交联的生长因子抗体，粒径为200nm, PH8. 0,)混勾，中 和预处理样品，使反应液PH值达到7. 4左右。30秒钟内在340nm处测定反 应液的吸光度值(OD值)Al,然后37'C再反应20min, 30秒钟内在340nm处 测定反应液的吸光度值(OD值)A2;
(4 )样品吸光度值(OD值)△ A = A2-A1
(5) 绘制标准曲线标准SGF溶液(初始浓度64 U/ml)用缓冲液R1梯度稀释， 获得SGF终浓度分别为32 U/ml、 16 U/ml、 8U/ml、 0. 0 U/ml的液体，按上 述(l) - (4)方法测得AA，以SGF浓度为横坐标，以AA值为纵坐标，绘 制标准曲线；
(6) 结果计算样品中SGF含量根据其AA值与标准曲线中对应的SGF浓度计算 得到。
采用酸性甘氨酸缓冲液解离方法处理血清样品，可以破坏SGF的二聚体结构， 解离SGF与分泌性受体的复合体，使SGF变成游离单体，利于与检测抗体结合，而 不会不影响SGF的免疫学活性和生物学活性。用碱性缓冲液中和反应液PH后，可以 提高抗体与待测SGF的结合效率，克服了 二聚体结构和分泌性受体对SGF与抗体结 合的干扰，显著提高血清SGF.免疫检测的灵敏度。我们已经进行的大量实验检测及 临床试验结果也证明了此方法对于提高SGF检测灵敏度的有效性。具体结果以ANG 检测为例，见下表。
免疫比浊法检测预处理与未处理样品血清ANG实验结果比较表
样品例数OD340 (X土SD)预处理未处理
标准品(32U/ml)60. 35 ± 0. 070. 26 ± 0. 05
正常人血清1300. 28 ± 0. 160. 18 ± 0. 12
癌症患者血清1750. 58 ± 0. 230. 36 ± 0. 18
从上面实验结果可以看出，经过预处理的标准品和血清样品，平均0D340值比 未处理组明显增大。已有的调查数据显示，预处理法测定正常人血清ANG含量低于 32U/ml, 90%的肝癌、肺癌和大肠癌患者，60%以上的鼻咽癌患者，血清ANG含量 增高。而如果采用未处理法检测血清ANG,有25 - 30。/。血清ANG阳性癌症患者会漏 检。可见酸性甘氨酸缓冲液预处理样品后，能显著提高肿瘤患者SGF免疫检测的灵 敏度。
实现方式
上述技术可配制成样品处理缓冲液，作为各种SGF免疫检测试剂盒的组成成分
之一，用于恶性肿瘤的筛查、早期诊断、肿瘤转移与否及恶性程度评判、预后评判 及治疗效果评价等。也可作为许多科学研究中对SGF的检测。比如，我们介绍的样 品处理方法和缓冲液配方可作为SGF酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒、免疫荧光 检测(IFA)试剂盒、免疫比浊检测试剂盒的组成成分，用于临床及科研对SGF的检测。
此外，上述酸性甘氨酸缓冲液样品预处理技术方法同样适用于其他存在聚合体 结构和复合体的蛋白质的免疫学检测，应用于临床诊断及科研检测。
权利要求
1.本发明技术涉及一种采用酸性解离方法对待测样品进行预处理，提高血清特异性生长因子(SGF)免疫学测定灵敏度的技术。其主要特征是采用酸性缓冲液破坏SGF的二聚体结构及其与分泌性受体的复合体结构，使其变成游离单体，利于与检测抗体结合，提高检测的灵敏度。本项技术可作为免疫学检测试剂盒的组成成分，用于SGF的检测，适用于恶性肿瘤的诊断、预后及疗效评判。
2. 权利要求l所述的发明技术，其特征是酸性缓冲液的化学成分可以是甘氨 酸，或柠檬酸、乙酸等各种酸性化学物质，都可以达到预期的破坏SGF的二 聚体及配体、受体复合体结构，提高血清特异性生长因子免疫学测定灵敏 度效果。
3. 权利要求l所述的发明技术，其特征是酸性缓冲液在低盐的条件下破坏生长 因子的二聚体结构及其与分泌性受体的复合体结构，使其变成游离单体， 利于与检测抗体结合。
4. 权利要求l所述的发明技术，其特征是酸性缓冲液样品预处理技术同样适用 于科学研究对SGF的免疫学测定。
5. 权利要求l所述的发明技术，其特征是酸性缓冲液样品预处理技术方法同样 适用于其他存在聚合体或复合体结构的蛋白质的免疫学测定，应用于临床 诊断及科研检测。
全文摘要
本发明技术介绍了一种采用酸性解离方法对待测样品进行预处理，提高血清特异性生长因子(SGF)免疫学测定灵敏度的技术。其主要内容是采用酸性甘氨酸缓冲液破坏生长因子的二聚体结构及其与分泌性受体的复合体结构，使之变成游离单体，利于与检测抗体结合，提高血清特异性生长因子免疫学测定的灵敏度。此技术及试剂配方可作为生长因子免疫学检测试剂盒的组成成分，用于临床和科学研究对SGF的检测，适用于恶性肿瘤的诊断、预后及疗效评判。
文档编号G01N33/531GK101097217SQ20061009396
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者王珊珊 申请人:王珊珊