专利名称：从孕妇血浆中检测胎儿父系dna单核苷酸差异的方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA检测方法，特别是一种检测游离DNA单核苷酸差异的方法。
(二)、技术背景伴随着我国人口与疾病模式的转变，出生缺陷问题日益突出，已成为我国新生儿和婴儿死亡、儿童和成人残疾的主要原因。据国家卫生部统计，出生缺陷的发生率约为13.05‰，其中单纯由遗传因素引起的出生缺陷所占的比例高达25％。遗传性出生缺陷没有有效的治疗方法，目前只好通过产前诊断有效避免患儿的出生，从而有利于优生优育和提高人口素质。
传统的羊膜腔穿刺和绒毛吸取是目前许多医院较为常用的产前诊断技术，因其操作易导致宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿损伤及死亡等，使其在临床的推广和应用受到了限制，因此发展一种有效无创性的产前诊断方法，避免羊膜腔穿刺和绒毛吸取的并发症，受到了科学家们的关注。近年来研究发现在妊娠过程中，孕妇血浆中存在游离胎儿DNA，而且胎儿DNA在孕妇血浆总游离DNA中的比率大约为3～6％，这一发现为无创性产前诊断开辟了新领域。
所述的单核苷酸差异一般包括单核苷酸突变和单核苷酸多态性(SNP)。孕妇血浆中的胎儿父系DNA，把它称之为目的DNA；孕妇血浆中的孕妇DNA或胎儿母源性DNA，把它称之为背景DNA。
现有的从孕妇血浆中检测胎儿DNA单核苷酸差异的方法一般采用的是等位基因特异性聚合酶链式反应(ASPCR)技术，它是在DNA序列一端的核苷酸差异位点处设计一个引物，该位点位于引物的3′端，再在DNA另一端设计一个引物，用聚合酶链反应(PCR)对突变基因进行检测。但这种方法存在着如下的不足众所周知，影响检测可靠性是由核苷酸差异的类型、样品中目的DNA的含量和目的DNA与背景DNA之间的比例等因素决定。在背景DNA过量干扰下，就会增加检测微量目的DNA的难度，对单个核苷酸差异的检测极容易出现误诊。因此，该方法仅限于如突变位点为几个核苷酸缺失的一些特殊突变类型。
在2004年，美国国家科学院进展杂志第101卷29期发表了名称为“游离核酸单个核苷酸差异的质谱分析在无创性产前诊断中的应用”的论文(MS analysis of single-nucleotide differences incirculating nucleic acidsApplication to noninvasive prenataldiagnosis.Proc Natl Acad Sci USA.2004，101(29))，它是利用质谱阵列分析技术平台(Sequenom公司)成功地检测了胎儿父系单个核苷酸突变，拓展了孕妇血浆中胎儿DNA的突变检测范围。该技术平台基于具有高特异性的单碱基延伸反应(single base extensionreaction，SBER)和具有高灵敏度的基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time offlight MS，MALDI-TOF-MS)，将有潜力应用于无创性产前诊断，但该方法有以下缺点1)当突变DNA的浓度低于野生型DNA浓度的1％时，单碱基延伸反应可出现不依赖模板性扩增，将SBER技术检测母体血浆尤其血清中胎儿DNA突变可能引起误诊，因此胎儿DNA占血浆总DNA的比例严重影响着该方法的诊断结果；2)仪器价格昂贵，检测费用高。由于存在上述缺点，从而限制了该方法在母体血浆中的应用。
(三)、发明内容本发明的目的就是提供一种简便可靠、经济实用的检测游离DNA单核苷酸差异的方法，在过量背景DNA干扰的情况下，它可以准确地检测出微量目的DNA中的单核苷酸突变及单核苷酸多态性。
本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它步骤如下(1)样品处理抽取孕妇外周血8～15ml，提取血浆游离DNA，取5～10μl，含量为1～100ng的游离DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)技术从血浆游离DNA中扩增目的DNA片段和背景DNA片段。
(2)标记靶序列取聚合酶链式反应(PCR)产物5～10μl，加入碱性磷酸酶，37℃反应20～30分钟后，使过量的脱氧核苷酸(dNTP)去磷酸化，加入与所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)1～2μl，浓度为500～2000μmol/L，以目的DNA片段为模板，采用单碱基延伸反应(SBER)技术，标记含有所需检测的游离DNA突变或单核苷酸多态性目的DNA片段——靶序列；(3)磁珠分离靶序列向上述单碱基延伸反应(SBER)产物中，加入连有配基的磁珠50～100μl，直径为1～10μm，浓度为1～5mg/ml，同时须保证所有磁珠上的配基数目比上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体要多，37℃反应20～50分钟，使磁珠上的配基与上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)的配体通过配基配体反应导致磁珠与靶序列相连，采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)反复悬浮并充分洗涤数次，直至将结合有靶序列的磁珠和未与靶序列结合的磁珠分离出来；(4)生物条形码信号放大及检测加入连上生物条形码DNA序列和一种与靶序列互补的寡核苷酸片段的纳米级微粒50～100μl，直径为20～40nm，浓度为0.2～2μmol/L，使其与磁珠结合的靶序列通过碱基配对原理进行DNA杂交1～2小时，然后采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮和充分洗涤数次，至除去未与靶序列结合的纳米级微粒和与靶序列非特异性结合的纳米级微粒为止，最后加入双蒸消毒水40～50μl，加热至45℃～60℃，使生物条形码DNA序列充分脱离纳米级微粒，再使用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术或分子杂交技术或生物芯片技术来检测生物条形码DNA序列，从而间接达到检测靶序列含量，实现检测出游离DNA突变或单核苷酸多态性的目的。
在上述的技术方案中，所述的“聚合酶链式反应(PCR)技术”、“实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术”、“磁性分离技术”、“分子杂交技术”和“生物芯片技术”均是现有的成熟技术。所述的“单碱基延伸反应”是现有技术，它是指将引物合成到所需要检测的突变位点和单核苷酸多态性前一个碱基，加入与所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)，以目的DNA片段为模板，使引物得以延伸一个碱基。所述的“磁珠”是指由具有较好磁响应性的磁性材料如三氧化二铁、四氧化三铁及铁钴合金等和高分子骨架材料如聚苯乙烯、硅烷及聚一烯等制备而成的磁性微球，直径为1～10μm，它是磁性分离技术的必备部分，目前已经商业化。所述的“生物条形码DNA序列”是指一段特异DNA序列，长度为40～70个碱基，只能与纳米级微粒上的一种寡核苷酸片段运用碱基配对原理相结合，不能与检测过程中其他序列相结合，作为辨识靶序列用的标签。所述的“纳米级微粒”可以是纳米金颗粒，其直径可以为30nm左右，也可以是高分子材料颗粒，如聚苯乙烯、聚氯乙烯等构成的颗粒，还可以是其它的纳米级颗粒。目前已经商业化，也可参考相关文献自行制备。纳米级微粒上连接有两种寡核苷酸片段，一种用于与靶序列互补，另一种则与生物条形码DNA序列互补，将生物条形码DNA序列通过分子杂交与纳米级微粒上的寡核苷酸片段相连，以构成连上生物条形码DNA序列和一种与靶序列互补的寡核苷酸片段的纳米级微粒。将纳米级微粒连接生物条形码DNA序列和与靶序列互补的寡核苷酸片段可参考相关文献自行操作。
在本发明中，把所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)加入后，进行单碱基延伸反应，反应的结果是如果目的DNA片段存在单核苷酸差异，如单核苷酸突变或单核苷酸多态性(SNP)，引物得以延伸一个脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)；如果目的DNA片段不存在单核苷酸差异，引物就不会延伸。这样一来，使得目的DNA片段中存在单核苷酸差异时，引物将带上配体标记，以利于下一步的磁性分离，保证检测的特异性。加入连有配基的磁珠，磁珠上的配基能与上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)的配体发生配基配体反应，使磁珠与靶序列相连，采用磁性分离技术将靶序列分离出来。加入连上生物条形码DNA序列和一种与靶序列互补的寡核苷酸片段的纳米级微粒，使其与磁珠结合的靶序列杂交，充分反应后，在磁场作用下，经过悬浮与洗涤，除去未与靶序列结合的纳米级微粒和与靶序列非特异性结合的纳米级微粒，接着加热使生物条形码DNA序列脱离纳米级微粒，这时只需要检测生物条形码DNA序列数量，就可以间接达到检测靶序列含量。由于每一纳米级微粒能接上大约360条寡核甘酸片段，其中，生物条形码DNA序列互补的寡核甘酸片段数量与跟靶序列互补的寡核甘酸片段数量之比可以控制为70∶1，从而把检测信号扩大了70倍，提高了检测的灵敏度，显著降低了误诊率。而且本发明因不涉及到特殊昂贵仪器而成本非常低廉。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点1.成本比较低廉，涉及到各项仪器均不超过20万人民币；2.可以准确地从孕妇血浆中检测出胎儿父系DNA中的单核苷酸突变及单核苷酸多态性；3.可以从孕妇血浆中检测出胎儿DNA含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明本发明的步骤如下(1)样品处理抽取孕妇外周血8～15ml，提取血浆游离DNA，取5～10μl，含量为1～100ng的游离DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)技术从血浆游离DNA中扩增目的DNA片段和背景DNA片段。
(2)标记靶序列取聚合酶链式反应(PCR)产物5～10μl，加入碱性磷酸酶，37℃反应20～30分钟后，使过量的脱氧核苷酸(dNTP)去磷酸化，加入与所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)1～2μl，浓度为500～2000μmol/L，以目的DNA片段为模板，采用单碱基延伸反应(SBER)技术，标记含有所需检测的游离DNA突变或单核苷酸多态性目的DNA片段——靶序列；(3)磁珠分离靶序列向上述单碱基延伸反应(SBER)产物中，加入连有配基的磁珠50～100μl，直径为1～10μm，浓度为1～5mg/ml，同时须保证所有磁珠上的配基数目比上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体要多，37℃反应20～50分钟，使磁珠上的配基与上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)的配体通过配基配体反应导致磁珠与靶序列相连，采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)反复悬浮并充分洗涤数次，直至将结合有靶序列的磁珠和未与靶序列结合的磁珠分离出来；(4)生物条形码信号放大及检测加入连上生物条形码DNA序列和一种与靶序列互补的寡核苷酸片段的纳米级微粒50～100μl，直径为20～40nm，浓度为0.2～2μmol/L，使其与磁珠结合的靶序列通过碱基配对原理进行DNA杂交1～2小时，然后采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮和充分洗涤数次，至除去未与靶序列结合的纳米级微粒和与靶序列非特异性结合的纳米级微粒为止，最后加入双蒸消毒水40～50μl，加热至45℃～60℃，使生物条形码DNA序列充分脱离纳米级微粒，再使用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术或分子杂交技术或生物芯片技术来检测生物条形码DNA序列，从而间接达到检测靶序列含量，实现检测出游离DNA突变或单核苷酸多态性的目的。
在本发明中，把所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)加入后，进行单碱基延伸反应，反应的结果是如果目的DNA片段存在单核苷酸差异，如单核苷酸突变或单核苷酸多态性(SNP)，引物得以延伸一个脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)；如果目的DNA片段不存在单核苷酸差异，引物就不会延伸。这样一来，使得目的DNA片段中存在单核苷酸差异时，引物将带上配体标记，以利于下一步的磁性分离，保证检测的特异性。加入连有配基的磁珠，磁珠上的配基能与上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)的配体发生配基配体反应，使磁珠与靶序列相连，采用磁性分离技术将靶序列分离出来。加入连上生物条形码DNA序列和一种与靶序列互补的寡核苷酸片段的纳米级微粒，使其与磁珠结合的靶序列杂交，充分反应后，在磁场作用下，除去未与靶序列杂交的纳米级微粒，接着加热使生物条形码DNA序列脱离纳米级微粒，这时只需要检测生物条形码DNA序列数量，就可以间接达到检测靶序列含量。由于每一纳米级微粒能接上大约360条寡核甘酸片段，其中，生物条形码DNA序列互补的寡核甘酸片段数量与跟靶序列互补的寡核甘酸片段数量之比可以控制为70∶1，从而把检测信号扩大了70倍，提高了检测的灵敏度，显著降低了误诊率。
为减少碱性磷酸酶处理后可能剩余微量脱氧核苷酸(dNTP)的引起延伸反应，在上述的步骤(2)中，在加入所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)同时，加入与野生型核苷酸互补的双脱氧核苷酸(ddNTP)。
在上述的步骤中，所述的碱性磷酸酶可以是牛小肠碱性磷酸酶。
在上述的步骤中，所述的碱性磷酸酶可以是虾碱性磷酸酶。
在上述的步骤中，所述的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体可以是生物素，磁珠上的配基可以是亲和素、链霉亲和素或亲和素类似物。
在上述的步骤中，所述的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体也可以是荧光素，磁珠上的配基也可以是荧光素抗体。
权利要求
1.一种从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，其步骤如下(1)样品处理抽取孕妇外周血8～15ml，提取血浆游离DNA，取5～10μl，含量为1～100ng的游离DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)技术从血浆游离DNA中扩增目的DNA片段和背景DNA片段。(2)标记靶序列取聚合酶链式反应(PCR)产物5～10μl，加入碱性磷酸酶，37℃反应20～30分钟后，使过量的脱氧核苷酸(dNTP)去磷酸化，加入与所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)1～2μl，浓度为500～2000μmol/L，以目的DNA片段为模板，采用单碱基延伸反应(SBER)技术，标记含有所需检测的游离DNA突变或单核苷酸多态性目的DNA片段——靶序列；(3)磁珠分离靶序列向上述单碱基延伸反应(SBER)产物中，加入连有配基的磁珠50～100μl，直径为1～10μm，浓度为1～5mg/ml，同时须保证所有磁珠上的配基数目比上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体要多，37℃反应20～50分钟，使磁珠上的配基与上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)的配体通过配基配体反应导致磁珠与靶序列相连，采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)反复悬浮并充分洗涤数次，直至将结合有靶序列的磁珠和未与靶序列结合的磁珠分离出来；(4)生物条形码信号放大及检测加入连上生物条形码DNA序列和一种与靶序列互补的寡核苷酸片段的纳米级微粒50～100μl，直径为20～40nm，浓度为0.2～2μmol/L，使其与磁珠结合的靶序列通过碱基配对原理进行DNA杂交1～2小时，然后采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮和充分洗涤数次，至除去未与靶序列结合的纳米级微粒和与靶序列非特异性结合的纳米级微粒为止，最后加入双蒸消毒水40～50μl，加热至45℃～60℃，使生物条形码DNA序列充分脱离纳米级微粒，再使用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术或分子杂交技术或生物芯片技术来检测生物条形码DNA序列，从而间接达到检测靶序列含量，实现检测出游离DNA突变或单核苷酸多态性的目的。
2.如权利要求1所述的从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，所述步骤(2)中，在加入所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)同时，加入与野生型核苷酸互补的双脱氧核苷酸(ddNTP)。
3.如权利要求1或2所述的从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，所述的碱性磷酸酶可以是牛小肠碱性磷酸酶。
4.如权利要求1或2所述的从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，所述的碱性磷酸酶可以是虾碱性磷酸酶。
5.如权利要求1或2所述的从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，所述的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体是生物素，磁珠上的配基是亲和素、链霉亲和素或亲和素类似物。
6.如权利要求1或2所述的从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，所述的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体是荧光素，磁珠上的配基是荧光素抗体。
全文摘要
一种从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，它是依次通过常规PCR扩增、单碱基延伸反应标记靶序列、磁珠分离靶序列和生物条形码信号放大及检测的四个步骤，来实现从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的目的。本发明具有成本比较低廉和经济实用等优点，可以准确地从孕妇血浆中检测出胎儿父系DNA中的单核苷酸突变及单核苷酸多态性，还可以从孕妇血浆中检测出胎儿DNA含量。
文档编号G01N33/533GK1978668SQ20061009530
公开日2007年6月13日 申请日期2006年12月18日 优先权日2006年12月18日
发明者李力, 易萍, 陈竹钦, 郭建新 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院