专利名称：离子钙诊断/测定试剂盒及离子钙浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种离子钙诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定 离子钙浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
血液中的钙几乎全部存在于血浆中，血浆钙有两种形式l非扩散 性钙，也称结合钙。它同蛋白质结合，不能透过毛细血管壁，不具有生 理活性，约占钙的40%; 2可扩散性钙，包括离子化钙，约占总f丐的 46%，是具有生理活性的部分。与碳酸氢根、磷酸盐、柠檬酸、乳酸等 阴离子结合的钙，约占总钙的14%。非扩散性钙与扩散性钙可以互相 转变并保持动态平衡。
钙的生理功能主要为1构成骨骼和牙齿，维持和修补骨骼的完整
性；2保持神经肌肉的正常应激性；3传导神经冲动；4维持细胞的正
常生理通透性；5参与血疑过程；6激活某些酶的活性，如琥珀酸脱氢
酶、ATP酶等；7对心肌收縮的影响，ca2+有利于心肌收縮，它和有利于 心肌舒张的K+相拮抗，从而维持心肌正常的收縮与舒张。血转与骨骼中
的钙保持动态平衡。血钙含量的变化常能反映出骨组织的代谢情况，因 此测定血钙对某些疾病的诊断有帮助。
总钙的测定方法很多，概括起来有滴定法(氧化还原滴定法、络合滴 定法)，比色法(方法很多，最常用又便与自动化操作的是邻甲酚酞合
络酮法、甲基麝香草酚蓝法、偶氮胂in法等)，火焰光度法、原子吸收
分光光度法、同位素稀释质谱法、酶法。国际临床化学联合(IFCC)推 荐的钙测定决定性方法为同位素稀释质谱法(IDMS)，参考方法为原子 吸收分光光度法。世界卫生组织(WHO)推荐的中等实验室用的常规方法 为邻甲酚酞络合酮法(O-CPC)。
离子钙的测定方法大致有生物学法、透析法、超滤法、金属指示 剂法、离子选择性电极法.目前应用最多的是离子选择性电极法(ISE)。 此方法简便、迅速、重复性好，正确和敏感性高。测定结果不受血浆 蛋白质的影响，能反映机体钙代谢的实际情况。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶扩增法(Enzymatic doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定离子钙浓度的方法，同时， 本发明还将给出用以实现该方法的离子钙诊断/测定试剂盒，采用该试 剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行离子 钙浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广 应用。
本发明离子钙浓度测定方法原理如下
还原型辅酶+氧NAD(P)H氧化酶/(>2+辅酶+过氧化氢 过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+ 2水
这种方法应用NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase ; EC 1.6.3.l)需
要钙离子才能激活酶活性的酶促反应速率比色法，加上利用NADH过 氧化物酶(NADH peroxidase ; EC 1.11.U ; EC 1.11.1.2)的加倍扩增作 用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在 340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度 下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算离子钙 浓度的大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明离子钙诊断/ 测定试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
NAD(P)H氧化酶 12000 U/L
NADH过氧化物酶 16000 U/L
本发明的离子钙诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧
化物酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶。 还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1或试 剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、NADH过氧化物酶。
还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定离子钙浓度的方法，其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的离子钙诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 还原型辅酶
50 mmol/L
0.25 mmol/L
NAD(P)H氣化酶 12000 .
NADH过氧化物酶 16000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测离子 钙样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延 迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出离子钙 的浓度大小。 实施例二
本实施例的离子钙诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂 还原型辅f
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
50 mmol/L
NAD(P)H氧化酶 10000 U/L
NADH过氧化物酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测离子 钙样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下 降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出离子钙 的浓度大小。 实施例三
本实施例的离子钙诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 还原型辅酶
50 mmol/L
0.25 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmd/L
稳定剂
NAD(P)H氣化酶 试剂3
50 mmol/L 16000 U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
NADH过氣化物酶 20000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定离子钙浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反 应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波 长405nm，被测离子钙样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出离子钙 的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种利用酶扩增法、酶比色法及酶联法技术的离子钙浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972040002C1.gif" wi="132" he="16" top= "49" left = "36" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出离子钙的浓度大小测定结果。
2. —种离子钙诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-稳定剂 1-还原型辅酶 o.i-NAD(P)H氧化酶 1OOO—-500 mmol/L -50 mmol/L-0.35 mmol/L-80000 U/LNADH过氧化物酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧 化物酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧 化物酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧 化物酶组成。还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶 在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧 化物酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组 成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶组成；试剂3， 由缓冲液、稳定剂、NADH过氧化物酶组成。还原型辅酶、NAD(P)H 氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。
6. 根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶扩增法、酶比色法及酶联法技术的离子钙诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定离子钙浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出离子钙的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/84GK101169436SQ20061009720
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司