专利名称：氨诊断/测定试剂盒及氨浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨浓 度的测定方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。 目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析 法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3,用酸滴定释放出的氨，或用 Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内 源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少 应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8X 13X;离子选择电极 法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定， 该方法的CV为3.5X 4.8Q/^，回收率高。结合具体实际，应以酶法测 定为实用。
检索中国专利，仅査出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定 速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nrn波长处吸光度的变化，得以测定氨浓度的方法，同时，本发明
还将给出用以实现该方法的氨诊断/测定试剂盒，采用该试剂盒不仅可 以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨浓度的测 定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明氨浓度测定方法原理如下 氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶丙氨酸+
水+辅酶
这种方法应用丙氨酸脱氢酶酶促反应终点比色法。丙氨酸脱氢酶酶
解氨的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧 化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度， 可以测算氨浓度的大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨诊断/测定
试剂盒较为理想
缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸 12mmol/L
丙氨酸脱氢酶 12000 U/L
本发明的氨诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成
液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶。
还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可 以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶。
还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中 的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的氨诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸 12 mmol/L
丙氨酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；
使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始
吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨样
品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方
法为终点法，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨浓度
的大小。
实施例二
本实施例的氨诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
100mmol/L 50 mmol/L 16000U/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙氨酸脱氢酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨样 品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反 应)，检测方法为终点法，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟 左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨的浓 度大小。 实施例三
本实施例的氨诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
试剂2 缓冲液 100mmol/L 丙酮酸 8 mmol/L
试剂3
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
丙氨酸脱氢酶 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定氨浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长 405nm，被测氨样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5， 反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为终点法，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨浓度 的大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化 分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外 源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种氨浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972240002C1.gif" wi="134" he="16" top= "37" left = "32" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的大小程度，测算出氨浓度大小测定结果。
2. —种氨诊断/测定试剂盒，主要成分包括-缓冲液 20-500 mmol/L稳定剂 1——50mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L丙酮酸 1——50mmol/L丙氨酸脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC1.4丄1)组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC1.4丄1)组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸组 成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、 丙酮酸、丙氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不 限。
6. 根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1~4000 mmol/L或0.1。/o-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸 铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的大小程度，从而测算出氨的浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/53GK101169408SQ20061009722
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司